FI72145B - Foerfarande och reagens foer bestaemning av kreatinkinas mb - Google Patents
Foerfarande och reagens foer bestaemning av kreatinkinas mb Download PDFInfo
- Publication number
- FI72145B FI72145B FI800577A FI800577A FI72145B FI 72145 B FI72145 B FI 72145B FI 800577 A FI800577 A FI 800577A FI 800577 A FI800577 A FI 800577A FI 72145 B FI72145 B FI 72145B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antibodies
- enzyme
- fragments
- subunit
- monovalent fragments
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Ι·<*§^·Ί KUULUTUSJULKAISU 791Ar 1¾ (11' UTLÄGG NINGSSKRIFT /Ζ I 40 ^ (45) * ' t 2 W t 1 1,1.- .J-'. — <,<·'/ ^cg£gj P" * v*.t ::. i’ »olit 13 04 1027 (51) Kv.lk//lnt.CI.‘ C 12 Q 1/50 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 800577 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 27-02.80 (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 27-02.80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 03 -09-80
Patentti, ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - 31.12.86
Patent- och register Styrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 02-03-79
Saksan 1i i ttotasavalta-Förbundsrepubli ken Tyskland(DE) P 2908053-3 (71) Boehringer Mannheim GmbH., Sandhofer Strasse 112-132, Mannheim-Wa1dhof, Saksan 1iittotasava1ta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Wolfgang Gruber, Tutzing-Unterzeismering, Helmut Lenz, Tutzing, Siegfried Looser, Weilheim, Hans-Ralf Linke, Raisting,
Saksan 1iittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7^) Berggren Oy Ab
(5^) Menetelmä ja reagenssi kreatiinikinaasin MB määrittämiseksi - Förfarande och reagens för bestämning av kreatinkinas MB
Keksinnön kohteina ovat menetelmä ja reagenssi kreatiinifosfo-kinaasin MB, josta seuraavassa käytetään lyhennettä CK-MB, aktiivisuuden määrittämiseksi veriherassa.
Ihmiskehossa esiintyy kaksi erilaista lajia tämän entsyymin alayksiköitä, nimittäin alayksiköt M ja B. Koska aktiivinen entsyymi on kulloinkin koostunut kahdesta alayksiköstä ja koska mainitut alayksiköt voivat liittyä toisiinsa vapaasti, on kolme entsyymityyppiä mahdollista: lihastyyppi CK-MM, aivotyyppi CK-BB ja hybridityyppi CK-MB, joka pääasiassa esiintyy sydänlihaksessa siirtyen sydäninfarktin yhteydessä veriheraan ja on sen jälkeen siitä todettavissa kohonneena pitoisuutena. Tämän hybridi-isoentsyymin aktiivisuutta veriherassa voidaan entsyymin CK kokonaisaktiivisuuden ohella käyttää sydäninfarktin diagnoosiin.
On tunnettua lisäämällä sopivia entsyymin CK alayksikön M vasta-aineita eristää veriherassa esiintyvä isoentsyymin lihastyyppi CK-MM ja sen jälkeen mitata jollakin tunnetulla CK-määritysmene- o · · - ·' L.
7214 5 telmällä jäljelle jäänyt hybridientsyymi CK-MB. Tällöin käytettiin sekä saostavia että myös ehkäiseviä vasta-aineita. Epäkohtana oli kuitenkin se, että samalla myös hybridientsyymi CK-MB tulee ehkäistyksi 80 %:iin saakka (Clin. Chim. Acta, 58 , 223-232 (1975) ) . Oli jo tosin tunnettua valmistaa vasta-aineita, jotka ehkäisevät lihastyypin CK-MM täysin, mutta eivät lainkaan aivotyyppiä CK-BB (linnuin ochemi s try, Voi. 6, 681-687 (1969)). Vaikka tällaisia vasta-aineita käytettäessä alayksikkö B hybridientsyymissä CK-MB ei tule lainkaan ehkäistyksi, ja siten määritysmenetelmän luotettavuus paranee, esiintyy tässä menetelmässä yhä huomattavia epäkohtia. On nimittäin osoittautunut, että jopa käytettäessä mahdollisimman puhtaita antigeenejä (CK-MM) vasta-aineenmuodostukseen käytetyt eläimet tuottivat yleensä seerumia, joka ehkäisi hybridientsyymiä CK-MB enemmän kuin 55 %:iin saakka, enimmäkseen välille 60...90 %.
Sen vuoksi oli tarpeen tutkia kustakin immunointiin käytetystä eläimestä erikseen, ehkäisivätkö muodostuneet vasta-aineet entsyymiä CK-MB vain 50 %:iin saakka vai enemmän. Tästä johtuvien kustannusten lisäksi on seurauksena, ettei suurinta osaa saaduista seerumeista itse asiassa voida käyttää, koska aina esiintyy erilaisia ehkäisyasteita. Myös poolatut seerumit poistavat tämän vaikeuden vain osittain. Lisäksi on otettava huomioon, että sydäninfarktin yhteydessä veriherassa esiintyvä CK-MB-määrä on erittäin pieni, ja käytettäessä vasta-aineita, jotka puolestaan eristävät tästä määrästä huomattavan osan, menetelmän tulosten luotettavuus vähenee voimakkaasti.
Keksinnön tarkoituksena on poistaa nämä epäkohdat ja aikaansaada mainittua lajia oleva menetelmä, joka erikoisesti tekee mahdolliseksi myös sellaisten vasta-aineiden, jotka ehkäisevät entsyymit CK-MM täydellisesti ja entsyymit CK-MB jopa enemmän kuin 55 %:iin saakka, hyödyksikäytön siten, että hybridientsyy-miin CK-MB sisältyvän alayksikön B kokonaisaktiivisuus voidaan määrittää.
Tämä tavoite saavutetaan keksinnön mukaisesti menetelmällä kreatiinikinaasin MB määrittämiseksi veriherassa eristämällä immunologisesti alayksikkö M ja mittaamalla alayksikkö B tunnettujen kreatiinikinaasinmääritysmenetelmien mukaan, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että alayksikön M eristämiseksi 11 72145 reaktioseoksessa seokseen lisätään alayksikön M vasta-aineista proteolyyttisellä hajotuksella pelkistävissä olosuhteissa valmistettuja yksivalenssisia eli yksiarvoisia fragmentteja.
On tosin tunnettua, että entsyymejä eivät ehkäise vain luontaiset vasta-aineet, jotka kuuluvat IgG-fraktioon tai γ-globulii-neihin ja joiden molekyylipaino on noin 130 000...210 000, vaan myös fragmentit, jotka muodostuvat näiden vasta-aineiden proteo-lyyttisen hajotuksen kautta ja jotka tosin ovat menettäneet saostumiskykynsä, koska ne ovat vain yksiarvoisia päinvastoin kuin kaksiarvoiset vasta-aineet, ja että yksiarvoisten fragmenttien ehkäisyominaisuudet eroavat kuitenkin vain vähän kaksiarvoisten vasta-aineiden ehkäisyominaisuuksista (Kontakte 3/78, 10-17). Näitä fragmentteja nimitetään FAB-fragmenteiksi (Biochem. J. 73, 119-126 (1959); Immunochem. 4, 369 (1967).
Yllättäen nyt todettiin, ettei tämä pidä paikkaansa kyseessä olevassa tapauksessa, vaan vasta-aineista, jotka ehkäisevät entsyymin CK-MM täydellisesti ja entsyymin CK-MB enemmän kuin 55 %, erikoisesti välille 60...90 %, saadaan yksiarvoisia fragmentteja (FAB-fragmentteja) , jotka ehkäisevät entsyymin CK-MM vielä täydellisesti, ts. 99...100 %, mutta entsyymin CK-MB kuitenkin virherajojen puitteissa vain 50 %:iin saakka. Täten tulee mahdolliseksi käyttää sopivista koe-eläimistä, kuten lampaista, kaniineista, kanoista ja sen tapaisista saatuja vastaseerumeja entsyymin CK-MB-määritykseen, ilman että kustannuksia lisäävillä analyyttisillä menetelmillä olisi ennakolta eroteltava sellaiset vastaseerumit, jotka ehkäisevät entsyymiä CK-MB enemmän kuin noin 53 %. Sen sijaan on tästä lähtien mahdollista hajottaa seerumit proteolyyttisesti pelkistävissä olosuhteissa ilman niiden ehkäisyominaisuuksien ennakkomääritystä ja sen jälkeen eristää fragmentteja käyttäen spesifisesti entsyymin CK alayksikkö M riippumatta siitä, esiintyykö se lihasentsyymissä CK-MM tai hybridientsyymissä CK-MB. Keksintöä sovellettaessa käytetään sopivimmin yksi-arvoisia fragmentteja, jotka on saatu sellaisista vasta-aineista, jotka ehkäisevät hybridi-entsyymiä enemmän kuin 55 %, erikoisesti välille 60...90 %, sekä lihastyyppisen isoentsyvmin CK-MM täydellisesti.
** 72145
Keksinnön erään toisen edullisen sovellutusmuodon mukaan käytetään sellaisia yksiarvoisia fragmentteja, joista jäljelle jääneet kokonaiset vasta-aineet ja kiteytyvät fragmentit (F ) on erotettu. Erotus voidaan suorittaa tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi geelikromatografiän avulla tai dialysoimalla suolaliuosta vastaan ja saostamalla sinkkisulfaatilla (Immunochem.
14, 99 (1977)).
Tunnetulla tavalla saatuja yksiarvoisia fragmentteja, jotka, kuten edellä on mainittu, on edullista puhdistaa vasta-aineista ja Fc~fragmenteista, voidaan sellaisenaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä. Sopivimmin käytetään kuitenkin sellaisia yksiarvoisia fragmentteja, joiden SH-ryhmät on ennakolta alkyloitu. Sopivia alkylointiaineita ovat ne, jotka ovat tehokkaita vesiväliaineessa pH-arvoilla, jotka eivät muuta proteiinien tertiäärirakennetta. Esimerkkejä tällaisista ovat jodi-asetaatti ja jodiasetamidi, jälkimmäisen ollessa edullisempi, koska se kykenee saunalla inaktivoimaan fragmenttien valmistukseen käytettävät proteolyyttiset entsyymit.
Keksinnön mukaisesti käytettyjen FAB-fragmenttien tuottamiseen tarvittavien antiseerumien valmistukseen soveltuvat tavanmukaiset immunointimenetelmät, jollaisia on usein selostettu kirjallisuudessa. Viitataan esimerkiksi julkaisuun "Methods of Immunology and Immunochemistry", Band 4, 313 ff (1976), erikoisesti sivuun 336. Immunoinnissa on yleensä käytettävä mahdollisimman puhtaita antigeenejä ja immunoitava riittävän kauan. Yleiset menetelmät on selostettu esimerkiksi julkaisuissa " Immunologiselle Arbetsmethoden", VEB Gustav Fischer Verlag, 1976, 368-370 ja "Microbiology", Harper & Row, New York, 1970, 458/459. Immunointiin soveltuvia puhtaita CK-MM-isoentsyymejä (antigeenejä) voidaan valmistaa artikkelin ABB 150, 648-678 (1972) mukaan, jolloin on tarkoituksenmukaista eristyksen ja puhdistuksen yhteydessä lisätä puskuriin ditiotreitolia stabilointia varten.
Antiseerumeista otetaan tavanmukaisesti talteen IgG-fraktio tai gammaglobuliini, jotka sen jälkeen hajotetaan pelkistävissä olosuhteissa proteolyyttisellä entsyymillä, joka vaikuttaa Hinge-alueella. Esimerkkejä tällaisista ovat papaiini ^a pep-
II
72145 siini. Hajotus on selostettu esirrterkisksi julkaisussa "The Antibody Molecule", Academic Press, New York, 1975, 322-326. Pelkistävien olosuhteiden aikaansaamiseksi lisätään tavallisesti SH-ryhmäpitoisia yhdisteitä, esim. kysteiiniä, merkapto-etanolia ja sen tapaisia. Inkubaatio proteolyyttisellä entsyymillä pysäytetään, kun hajoaminen on täysin tapahtunut, sopivasti lisäämällä jotakin tunnettua inaktivoinuiainetta.
Kuten edellä on mainittu, jodiasetamidia pidetään edullisimpana keksinnössä käytettäväksi. Tämä pysäytysaine alkyloi hajotuksessa syntyneet FAB-fragmenttien vapaat SH-ryhmät.
Tällä tavalla käsitellyt FAB-fragmentit sopivat erittäin hyvin keksinnön puitteisiin, varsinkin jos vielä jäljellä olevat vasta-aineet ja F -fragmentit poistetaan. Entsyymin CK-MB ehkäisy tapahtuu tällöin täysin ilman saostumien esiintymistä ja on itse asiassa tarkkaan 50 %. Keksinnössä voidaan kuitenkin käyttää myös sellaisia FAB-fragmentteja, joita ei ole alky loitu tai puhdistettu sivuaineista, joskin tällöin määrityksessä saadaan jonkin verran suurempi virhe, joka kuitenkin on aina vielä täysin hyväksyttävissä, ts. hybridientsyymi tulee ehkäistyksi määrään 50 + 3 % saakka.
Hybridientsyymissä CK-MB olevan alayksikön B määritys yksiarvoisten vasta-aineiden lisäämisen jälkeen tapahtuu yleisesti tunnetuilla CK-määritysmenetelmillä, joissa lähtösubstraattina käytetään kreatiinia tai kreatiinifosfaattia. Sopivia menetelmiä on selostettu esimerkiksi julkaisun "Methoder. der enzyma-tischen Analyse", H.U. 3ergmeyer, Verlag Chemie, Band 1, 3. Auflage, sivuilla 813-825. Suuren herkkyytensä vuoksi erittäin sopiva menetelmä on selostettu saksalaisessa patenttihakemuksessa (int. Nr. 2292) (vastaa FI-patenttihakemusta 800578), jonka sama hakija on jättänyt 1979-03-02. Tässä menetelmässä käytetään lusiferiini-lusiferaasi-reaktioita ja emittoitu valo-määrä mitataan kineettisesti.
Keksinnön mukainen menetelmä tekee mahdolliseksi entsyymin CK-MM sellaisten antiseerumien käytön entsyymin CK-MB määrittämiseen, jotka on valmistettu jollakin kirjallisuudessa selostetulla immunointimenetelmällä ja joita tähän saakka liian suuren CK-MB-ehkäisyn vuoksi ei ole voitu käyttää diagnostisesti luotettavaan CK-MB-kokeeseen veriherassa. Myös antiseerumeja, jotka ehkäisyn ohessa aiheuttavat saostumisen, voidaan keksinnön 6' 721 45 mukaisesti käyttää hyväksi. Jopa viimeistellyissä immunointi-menetelmissä erittäin huomattavassa määrin esiintyviä antiseerumeja, joilla on liian suuri entsyymin CK-MB ehkäisykyky, ei tarvitse enää erottaa, joten kustannuksia aiheuttava analytiikka antiseerumien jakamiseksi käyttökelpoisiksi ja käyttökelvottomiksi jää pois. Tämä on erikoisen tärkeää, koska anti-seerumin aiheuttaman CK-MB-ehkäisyn koestaminen on mahdollista vain sydäninfarktipotilaan tuoreesta veriherasta saaduilla CK-MB-preparaateilla. Ehkäisykoestusten poisjäänti aikaansaa siten huomattavan yksinkertaistuksen.
Seuraavat esimerkit selittävät keksintöä edelleen.
Esimerkki 1 a) IgG-fraktion valmistus
Lampaista, jotka oli immunoitu ihmisen CK-MM-entsyymillä edellä mainitussa julkaisussa "Immunologiselle Arbetsmethoden" selostetun menettelyn mukaan, saatuun seerumiin lisätään kiteistä am-moniumsulfaattia pitoisuuteen 1,8 M, lämpötilan ollessa välillä 0...4°C ja pH-arvon 7. Linkoamisen jälkeen sakka liuotetaan puskuriseokseen 0,1 M TRIS/0,15 NaCl, jonka pH on 8, ja liuos dialysoidaan perusteellisesti 10 mM fosfaattipuskuria, pH 7,1, vastaan. Uudelleen linkoamalla kirkastettu dialysaatti viedään kolonniin, joka on täytetty DEAE-selluloosalla. Proteiinipitoi-nen läpikulkuvirta sekä eluaatti, jonka muodostaa puskuri 15 mM fosfaatti/10 mM NaCl, pH 7,1, yhdistetään, seoksen sisältäessä enemmän kuin 95 % puhdasta IcG-fraktiota.
b) Papaiinihajotus
IgG-fraktiota, johon on lisätty 1,5 paino-% (IgG-proteiini-määrästä) papaiinia, inkuboidaan artikkelissa"immunochem. A (1967) 369"selostetun menetelmän mukaan pelkistävissä olosuh teissa (10 mM kysteiiniä) ja pH-arvon ollessa 7,5 lämpötilassa 37°C yli 5 tuntia. Inkubaatiovaiheen lopussa entsyymin vaikutus pysäytetään lisäämällä ylimäärä jodiasetamidia, ja seosta inkuboidaan huoneenlämpötilassa 2 tuntia pH-arvon ollessa 7,5 vapaitten SH-ryhmien alkyloimiseksi. Stabiloitu hajonnut seos sisältää FAB-fragmentteja, F -fragmentteja ja vähemmän kuin 10 % hajoamatonta IgG-fraktiota. Immuunireaktilvisuustuotos on enemmän kuin 75 %.
*7 c) FAB-fragmenttien puhdistus 7214 5
Kun seos on väkevöity ultrasuodatuksella pitoisuuteen 30 mg/ml, se erotellaan geelikromatografiän avulla (The LKB Instrument Journal 2_4, (1977) 10) . FAB-f ragmen ti t eluoituvat viimeisenä proteiinihuippuna hyvin erilleen hajoamattomasta IcG-fraktiosta ja Fc~fragmenteista. FAB-fraktiota voidaan ultrasuodatuksella suoritetun väkevöinnin jälkeen käyttää välittömästi entsyymien CK-MM tai CK-MB ehkäisyyn. Entsyymin CK-MB ehkäisy on virhe-rajojen puitteissa 50 %, entsyymin CK-MM ehkäisyn ollessa välillä 99...100 %.
Esimerkki 2 a) γ-globuliinifraktion valmistus lampaanplasmasta Lampaista, joita oli immunoitu 4...6 kuukautta entsyymillä CK-MM, saatuun sitraattiplasmaan lisätään kalsiumkloridia pitoisuuteen 25 mM, ja seos asetetaan noin 2 tunniksi koaguloitumaan huoneenlämpötilassa. Kun koagulaatti on hajotettu mekaanisesti, se ohennetaan 1 tilavuudella fysiologista NaCl-liuosta ja siihen lisätään lipoproteiiniadsorptiota varten 2 % silikaatti-hövtä-löintiainetta (aerosilia).
Linkoamalla saadaan kirkas neste. Nesteestä saostetaan γ-globu-liinifraktio 1,8 M ammoniumsulfaatilla lämpötilan ollessa välillä 0...4°C ja pH-arvon 7, ja sakka kerätään linkoamalla. Dialy-soimalla puskuria 50 mM TRIS/0,1 M NaCl, pH 7,5, vastaan ja vä-kevöimällä uitrasuodatusta käyttäen saadaan entsymaattiseen hajotukseen soveltuva vasta-ainepreparaatti.
b) Papaiinihajotus
Menetellään samoin kuin esimerkissä 1 b), suorittaen kuitenkin pieni muunnos γ-globuliinifraktiota varten. Papaiinilisäys 1,5 paino-% perustuu γ-globuliinifraktion proteiinimäärään ja inkubaatioaika on 20 tuntia lämpötilassa 25°C. Muuten menetellään samoin kuin esimerkissä 1 b).
c) FAB-fraktion puhdistus Älkyloitu hajotettu seos dialysoidaan fysiologista keittosuola-liuosta vastaan, minkä jälkeen seokseen lisätään 25 mM sinkki-sulfaattia (Immunochem. 14_ (1977) 99) . Siten saadaan hajoamattoman IgG:n jäännökset ja Fc~fragmentit saostumaan, ja ne erotetaan linkoamalla. Jäljelle jääneet FAB-fragmentit ovat dialyy- 8 72145 sin ja väkevöinnin jälkeen valmiit käytettäväksi CK-MB-kokeessa. Tuloksena on CK-MM-isoentsyymin ehkäisyaktiivisuus, joka on enemmän kuin 80 % lähtöaineena olleen plasman suhteen. CK-MB tulee ehkäistyksi 50 %:iin saakka riippumatta hajoamattomien vasta-aineiden ehkäisyarvosta. Erilaisilla seerumeilla saadut tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.
Taulukko
Eläimen Entsyymiaktiivisuuden ehkäisy % n:° CK-MM (600...1000 U/l) CK-MB (200...400 U/l) Lähtoseerumi FAB-fragmentit Lähtöseerumi FAB-fragmentit (plasma) 1 99,5 99,5 62 52 2 99,6 99,7 56 53 3 99,3 99,1 64 49 4 98,5 99,3 68 52 it
Claims (8)
1. Menetelmä kreatiinikinaasin MB määrittämiseksi veriherassa eristämällä immunologisesti alayksikkö M ja mittaamalla alayksikkö B tunnettujen kreatiinikinaasinmääritysmenetelmien mukaan, tunnettu siitä, että alayksikön M eristämiseksi reaktioseoksessa seokseen lisätään alayksikön M vasta-aineista, jotka ehkäisevät hybridientsyymin CK-MB enemmän kuin 55 % ja isoentsyymin CK-MM täydellisesti, proteolyyttisellä hajotuksella pelkistävissä olosuhteissa valmistettuja yksivalenssisiä fragmentteja.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään yksiarvoisia fragmentteja, jotka valmistetaan sellaisista vasta-aineista, jotka ehkäisevät hybridi-entsyymin CK-MB enemmän kuin 55 % ja isoentsyymin CK-MM täydellisesti .
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään yksiarvoisia fragmentteja, jotka on saatu sellaisista vasta-aineista, jotka ehkäisevät hybridientsyymin CK-MB 60...90 i:iin saakka.
4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä tunnettu siitä, että käytetään sellaisia yksiarvoisia fragmentteja, joista jäljelle jääneet hajoamattomat vasta-aineet ja kiteytyvät fragmentit (Fc) on erotettu.
5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään sellaisia yksiarvoisia fragmentteja, joiden SH-ryhmät on alkyloitu.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään jodiasetamidilla tai jodiasetaatilla alky-loituja yksiarvoisia fragmentteja.
7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen mentelmä, tunnettu siitä, että alayksikkö B määritetään lusife-riini-lusiferaasi-reaktion avulla ja emittoitu valomäärä mitataan kineettisestä. 1 o 72145
8. Reagenssi kreatiinikinaasin MB määrittämistä varten, rea-genssin sisältäessä systeemin kreatiinikinaasin MB määrittämiseksi sekä aineen kreatiinikinaasin alayksikön M eristämiseksi immunologisesti, tunnettu siitä, että immunologiseen eristämiseen käytettävä aine koostuu alayksikön M vasta-aineiden yksivalenssisista fragmenteista, jotka vasta-aineet ehkäisevät hybridientsyymin CK-MB enemmän kuin 55 % ja isoentsyymin CK-MM täydellisesti.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2908053 | 1979-03-02 | ||
| DE2908053A DE2908053C2 (de) | 1979-03-02 | 1979-03-02 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase MB |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI800577A FI800577A (fi) | 1980-09-03 |
| FI72145B true FI72145B (fi) | 1986-12-31 |
| FI72145C FI72145C (fi) | 1987-04-13 |
Family
ID=6064229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI800577A FI72145C (fi) | 1979-03-02 | 1980-02-27 | Foerfarande och reagens foer bestaemning av kreatinkinas mb. |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4330620A (fi) |
| EP (1) | EP0015508B1 (fi) |
| JP (1) | JPS5820274B2 (fi) |
| AR (1) | AR219440A1 (fi) |
| AT (1) | ATE263T1 (fi) |
| AU (1) | AU515930B2 (fi) |
| CA (1) | CA1160942A (fi) |
| CS (1) | CS226407B2 (fi) |
| DD (1) | DD149421A5 (fi) |
| DE (2) | DE2908053C2 (fi) |
| DK (1) | DK154459C (fi) |
| ES (1) | ES488774A1 (fi) |
| FI (1) | FI72145C (fi) |
| HU (1) | HU181684B (fi) |
| IE (1) | IE49158B1 (fi) |
| SU (1) | SU1336941A3 (fi) |
| YU (1) | YU42965B (fi) |
| ZA (1) | ZA801158B (fi) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4614712A (en) * | 1983-02-25 | 1986-09-30 | The Upjohn Company | Immunoassays with luciferase labeled ligands or receptors |
| CA1260828A (en) * | 1983-07-04 | 1989-09-26 | Masakazu Iwai | Therapeutic and prophylactic agent for gastrointestinal ulcers |
| JPS60125565A (ja) * | 1983-12-12 | 1985-07-04 | Amano Pharmaceut Co Ltd | エノラ−ゼサブユニット量の分別定量法 |
| US4810639A (en) * | 1985-12-20 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassay for CK-MB using bound and soluble antibodies |
| JPS63131065A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-03 | Yatoron:Kk | 抗体の精製法とアイソザイムの測定法及び試薬 |
| CN110133265B (zh) * | 2019-06-10 | 2022-03-15 | 天津市宝坻区人民医院 | 血清中肌酸激酶试剂盒及测定方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2128670B2 (de) * | 1971-06-09 | 1977-06-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode |
| US4001088A (en) * | 1974-08-02 | 1977-01-04 | Antonik Alan S | Method for the determination of creatine phosphokinase enzyme |
| DE2548962C2 (de) * | 1975-11-03 | 1985-11-21 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Antikörper gegen die Untereinheit M von Creatinkinase-Isoenzymen |
| DE2548963C3 (de) * | 1975-11-03 | 1982-03-11 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB |
| JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
| DE2828658C3 (de) * | 1978-06-29 | 1981-10-22 | Lkb-Produkter Ab, Stockholm | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
-
1979
- 1979-03-02 DE DE2908053A patent/DE2908053C2/de not_active Expired
-
1980
- 1980-02-05 IE IE221/80A patent/IE49158B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-02-11 CS CS80907A patent/CS226407B2/cs unknown
- 1980-02-13 AU AU55496/80A patent/AU515930B2/en not_active Expired
- 1980-02-14 DK DK063680A patent/DK154459C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-02-20 ES ES488774A patent/ES488774A1/es not_active Expired
- 1980-02-26 AR AR280091A patent/AR219440A1/es active
- 1980-02-27 CA CA000346572A patent/CA1160942A/en not_active Expired
- 1980-02-27 DD DD80219298A patent/DD149421A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-27 FI FI800577A patent/FI72145C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-02-28 EP EP80100995A patent/EP0015508B1/de not_active Expired
- 1980-02-28 YU YU542/80A patent/YU42965B/xx unknown
- 1980-02-28 DE DE8080100995T patent/DE3060050D1/de not_active Expired
- 1980-02-28 US US06/125,318 patent/US4330620A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-02-28 AT AT80100995T patent/ATE263T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-29 SU SU802891744A patent/SU1336941A3/ru active
- 1980-02-29 ZA ZA00801158A patent/ZA801158B/xx unknown
- 1980-02-29 HU HU80475A patent/HU181684B/hu unknown
- 1980-02-29 JP JP55024219A patent/JPS5820274B2/ja not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES488774A1 (es) | 1980-09-16 |
| DE2908053C2 (de) | 1982-08-19 |
| EP0015508A1 (de) | 1980-09-17 |
| IE49158B1 (en) | 1985-08-07 |
| DD149421A5 (de) | 1981-07-08 |
| JPS55120797A (en) | 1980-09-17 |
| DE3060050D1 (en) | 1981-12-10 |
| SU1336941A3 (ru) | 1987-09-07 |
| US4330620A (en) | 1982-05-18 |
| CS226407B2 (en) | 1984-03-19 |
| CA1160942A (en) | 1984-01-24 |
| AU515930B2 (en) | 1981-05-07 |
| EP0015508B1 (de) | 1981-09-30 |
| YU42965B (en) | 1989-02-28 |
| DK154459C (da) | 1989-05-22 |
| DE2908053A1 (de) | 1980-09-11 |
| IE800221L (en) | 1980-09-02 |
| FI800577A (fi) | 1980-09-03 |
| AU5549680A (en) | 1981-03-12 |
| DK63680A (da) | 1980-09-03 |
| YU54280A (en) | 1984-10-31 |
| HU181684B (en) | 1983-11-28 |
| ZA801158B (en) | 1981-03-25 |
| AR219440A1 (es) | 1980-08-15 |
| ATE263T1 (de) | 1981-10-15 |
| DK154459B (da) | 1988-11-14 |
| JPS5820274B2 (ja) | 1983-04-22 |
| FI72145C (fi) | 1987-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4067775A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-MB | |
| Fechheimer et al. | Phosphorylation of lymphocyte myosin catalyzed in vitro and in intact cells. | |
| Taylor et al. | Identification and quantification of leucine aminopeptidase in aged normal and cataractous human lenses and ability of bovine lens LAP to cleave bovine crystallins | |
| VAN et al. | CaBP2 is a rat homolog of ERp72 with proteindisulfide isomerase activity | |
| Burton et al. | The active centre of triose phosphate isomerase | |
| US4366242A (en) | Method and agent for the immunological determination of enzymes | |
| US4387160A (en) | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme | |
| Väänänen et al. | Purification and localization of human carbonic anhydrase: III. Typing of skeletal muscle fibers in paraffin embedded sections | |
| FI72145B (fi) | Foerfarande och reagens foer bestaemning av kreatinkinas mb | |
| ES2387880T3 (es) | Procedimiento de detección de trombosis mediante la medición de la proteasa de escisión del factor de von Willebrand | |
| US4237044A (en) | Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof | |
| Schachter et al. | A comparative study of the proteins in normal meconium and in meconium from meconium ileus patients | |
| JPS63243098A (ja) | ヒトおよび動物組織からの基底膜タンパクの単離方法 | |
| US20060057134A1 (en) | Antibody against antibacterial peptide and utiliazation thereof | |
| Kanemitsu et al. | Characterization of two types of mitochondrial creatine kinase isolated from normal human cardiac muscle and brain tissue | |
| Calvanico et al. | Fragments of human γG immunoglobulins produced by a porcine pancreatic esterase | |
| US20050032117A1 (en) | Method for assessment of cystic lung fibrosis | |
| Mayron | Isolation of neuraminidase from influenza A virus | |
| WO2000043788A1 (fr) | Procede d'analyse de l'activite de l'isozyme de la creatine kinase et reactif d'analyse | |
| CA1062609A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-mb | |
| US20010006773A1 (en) | Ready-to-use ristocetin cofactor test reagent possessing long-term stability | |
| US5177020A (en) | Method for the immunological determination of heparan sulfate-proteoglycan and process for the preparation and purification of heparan sulfate-proteoglycan suitable for this purpose from tissues containing basal membrane | |
| JPH0682446A (ja) | 腎疾患の診断法 | |
| JP2004208604A (ja) | 新規酵素活性測定方法 | |
| Hosoi et al. | Postnatal Changes in an α Subunit Isoform, α (S), of Na^+, K^+-ATPase in the Submandibular Gland of Rats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |