DK154459B - Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af creatinkinase-mb - Google Patents
Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af creatinkinase-mb Download PDFInfo
- Publication number
- DK154459B DK154459B DK063680AA DK63680A DK154459B DK 154459 B DK154459 B DK 154459B DK 063680A A DK063680A A DK 063680AA DK 63680 A DK63680 A DK 63680A DK 154459 B DK154459 B DK 154459B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- subunit
- antibodies
- monovalent fragments
- fragments
- creatine kinase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 35
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 13
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 claims 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000000396 iron Nutrition 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
DK 154459 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af creatinkinase-MB i serum ved hjælp af immunologisk udkobling af underenheden M og måling af underenheden B ifølge kendte metoder til bestemmelse af creatinkinase. Endvidere 5 angår opfindelsen et reagens til anvendelse ved fremgangsmåden, hvilket reagens indeholder et system til bestemmelse af creatinkinase-MB og et middel til immunologisk udkobling af creatinkinasens underenhed M.
10 I det menneskelige legeme forekommer forskellige arter af underenheder af dette enzym, underenhederne M og B. Da det aktive enzym er sammensat af to underenheder, og da de to underenheder kan kombineres frit med hinanden, er tre enzymtyper mulige: muskeltypen CK-MM, hjernetypen CK-BB og hybridtypen CK-15 MB. Sidstnævnte, som hovedsagelig forekommer i hjertemusklen, forekommer i serummet i tilfælde af hjerteinfarkt og er da at finde deri i forøget koncentration. Aktiviteten af dette hy-brid-isoenzym kan foruden den samlede aktivitet af CK i serummet tages med i betragtning til diagnosen af hjerteinfarkt.
20
Det er kendt ved hjælp af tilsætning af specifikke antistoffer mod CK's underenhed M at udkoble den i serummet forekommende muskeltype af isoenzymet CK-MM og derpå at måle det endnu tilbageblivende hybridenzym CK-MB ifølge en af de kendte metoder 25 til CK-bestemmelse. Dertil blev der benyttet såvel præcipite-rende som hæmmende antistoffer. En ulempe bestod imidlertid i, at også hydribenzymet CK-MB herved hæmmes i et omfang på 80% (Clin. Chim. Acta, 58, 223-232 (1975)). Det var ganske vist allerede kendt at udvinde antistoffer, som fuldstændigt hæmmer 30 muskeltypen CK-MM og overhovedet ikke hæmmer hjernetypen CK-BB (Immunochemistry, bind 6, 681-687 (1969)). Selv om underenheden B i hybridenzymet CK-MB overhovedet ikke hæmmes af sådanne antistoffer, og pålideligheden af bestemmelsesmetoden derfor forøges herved, udviser også denne fremgangsmåde stadig bety-35 delige ulemper. Det har nemlig vist sig, at selv ved anvendelse af de reneste antigener (CK-MM) leverede de til antistofdannelsen benyttede dyr overvejende et serum, som hæmmede hybridenzymet CK-MB mere end 55%, for det meste mellem 60 og 2
DK 154459 B
90%. Det var derfor nødvendigt for hvert enkelt af de til im-munoseringen benyttede dyr at undersøge, om de dannede antistoffer kun hæmmede CK-MB i et omfang på 50% eller kraftigere. Bortset fra den herved forårsagede udgift førte dette til, at 5 størstedelen af de udvundne sera praktisk taget ikke kan anvendes, da der til stadighed optræder forskellige hæmningsgra der. Også forenede sera afhjælper kun delvis disse vanskeligheder. Hertil kommer endvidere, at CK-MB-mængden i serummet i tilfælde af hjerteinfarkt er yderst ringe og ved tilstedevæ-10 relse af antistoffer, som yderligere udkobler en betydelig del deraf, kraftigt formindsker fremgangsmådens pålidelighed.
Opfindelsen tager sigte på at afhjælpe disse ulemper og angive en fremgangsmåde af den angivne art, som især gør det muligt 15 også at kunne benytte antistoffer, som hæmmer CK-MM fuldstændigt, men som hæmmer CK-MB i et omfang på mere end 55%, så at den samlede aktivitet af den i hybridenzymet CK-MB indeholdte underenhed B kan bestemmes.
20 Dette opnås ifølge opfindelsen ved hjælp af en fremgangsmåde til bestemmelse af creatinkinase-MB i serum ved hjælp af immunologisk udkobling af underenheden M og måling af underenheden B ifølge kendte metoder til bestemmelse af kreatinkinase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man til udkob-25 lingen af underenheden M i reaktionsmaterialet tilsætter monovalente fragmenter, der er udvundet af antistoffer mod crea-tinkinase-MM ved hjælp af proteolytisk spaltning under reducerede betingelser.
30 Det er ganske vist kendt, at enzymer ikke blot hæmmes af de naturlige antistoffer, som hører tilhører IgG-frakt ionen eller y-globulinerne, og som har en molekylvægt fra ca. 130.000 til ca. 210.000, men også af fragmenter dannet ved proteolytisk spaltning af disse antistoffer, hvilke fragmenter ganske vist 35 har tabt præcipiteringsevnen, da de kun er monovalente i modsætning til de divalente antistoffer, men monovalente fragmenters hæmningsegenskaber adskiller sig kun i ringe grad fra de divalente antistoffers hæmningsegenskaber (Kontakte 3/78, 3
DK 154459 B
10-17). De betegnes som FAB-fragmenter (Biochem. J. 73, 119-126 (1959); Immunochem. 4, 369 (1967)).
Det har nu overraskende vist sig, at dette ikke gælder i det 5 foreliggende tilfælde, men at der ud fra antistoffer, som hæmmer CK-MM fuldstændigt og hæmmer CK-MB i et omfang på mere end 55%, især fra 60-90%, opnås monovalente fragmenter (FAB-frag-menter), som stadigvæk hæmmer CK-MM fuldstændigt, dvs. i et omfang på 99 til 100%, men som indenfor fejlgrænsens rammer 10 kun hæmmer CK-MB i et omfang på 50%. Herved bliver det muligt at anvende de fra egnede forsøgsdyr, såsorn^ får, kaniner, Irøns og lignende, udvundne antisera til bestemmelsen, af CK-MB, uden at der forinden ved hjælp af bekostelige analytiske metoder behøver at blive frasorteret sådanne antisera, som hæmmer CK-15 MB i et omfang på mere end ca. 53%. Tværtimod er det nu muligt at spalte seraene proteolytisk under reducerende betingelser uden forudgående bestemmelse af deres hæmningsegenskaber og derpå med spaltningsfragmenterne specifikt at udkoble CK's underenhed M, uanset om den er til stede i muskelenzymet CK-MM 20 eller i hybridenzymet CK-MB. Ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis monovalente fragmenter, der udvindes af antistoffer, som hæmmer hybridenzymet CK-MB i et omfang på mere end 55%, særlig foretrukket i et omfang fra 60 til 90%, og som fuldstændig hæmmer muskeltype-isoenzymet CK-MM.
25 ------
Ifølge en yderligere foretruk1<en udførelsesform for opfintte-l— sen anvender man sådanne monovalente fragmenter, fra hvilke resterende fuldstændige antistoffer samt de krystal 1iserbare fragmenter (Fc) er fraskilt. Fraski1 leisen kan ske ifølge 30 kendte metoder, eksempelvis ved hjælp af gelkromatografi eller ved hjælp af dialyse mod saltopløsning og fældning med zinksulfat (Immunochem. 14, 99 (1977)).
De på kendt måde opnåede monovalente fragmenter, der som nævnt 35 fortrinsvis renses for antistoffer og Fc-fragmenter, kan som sådanne anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Fortrinsvis anvendes imidlertid monovalente fragmenter, hvis SH-grupper forinden er blevet alkyleret. Egnede er sådanne alky- 4
DK 154459 B
leringsmidler, som i vandigt medium er virksomme ved pH-værdi-er, der ikke forandrer proteiners tertiærstruktur. Eksempler herpå er jodacetat og jodacetamid, hvoraf sidstnævnte fortrinsvis anvendes, da det samtidigt er i stand til at inak-5 tivere de til fremstilling af fragmenterne benyttede proteoly-tiske enzymer.
Reagenset til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at midlet til immunologisk udkobling belt) står af monovalente fragmenter, som ved hjælp af proteolytisk spaltning under reducerede betingelser er udvundet af antistoffer mod creatinkinase-MM.
Ved fremstillingen af 1e til opnåelse af de ved fremgangsmåden 15 ifølge opfindelsen be: ttede FAB-fragmenter krævede antisera benyttes sædvanlige immuniseringsmetoder, således som de hyppigt er beskrevet i litteraturen. Der henvises eksempelvis til "Methods of Immunology and Immunochemistry", bind 4, 313 ff (1976), især side 336. Generelt gælder det ved immuniseringen 20 om såvidt muligt at benytte rene antigener og at immunisere tilstrækkelig længe. De almindelige metoder beskrives eksempelvis i "Immunologische Arbeitsmethoden", VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, 1976, 368-370, og "Microbiology", forlaget Harper & Row, New York, 1970, 458/459. Til immuniseringen egnede 25 rene CK-MM-isoenzymer (antigener) kan opnås ifølge ABB 150, 648-678 (1972), hvorved pufferen dithiotreitol hensigtsmæssigt tilsættes med henblik på stabilisering ved isoleringen og rensningen.
30 Fra antiseraene udvindes på sædvanlig måde IgG-fraktionen eller gammaglobulinet, og under reducerende betingelser spaltes derpå med et proteolytisk enzym, der angriber ved det som "Hinge-Region" betegnede sted. Eksempler herpå er papain og pepsin. Spaltningen er eksempelvis beskrevet i "The Antibody 35 Molecule", Academic Press New York, 1975, 322-326. Til opnåelse af de reducerende betingelser tilsættes i reglen SH-gruppe-holdige forbindelser, eksempelvis cystein, mercaptoethanol og lignende. Inkubationen med det proteolytiske enzym standses, 5
DK 154459 B
når spaltningen er fuldstændig, hensigtsmæssigt ved tilsætning af et af de kendte inaktiveringsmidler. Som allerede ovenfor nævnt foretrækkes ifølge opfindelsen jodacetamid. De ved spaltningen dannede frie SH-grupper på FAB-fragmenterne alky-5 leres ved hjælp af dette afbrydelsesmiddel. På denne måde behandlede FAB-fragmenter egner sig ifølge opfindelsen særlig godt, især når også endnu tilbageværende antistoffer og Fc_ fragmenter fjernes. Hæmningen af CK-MB sker i så tilfælde helt uden forekomst af præcipitater og andrager praktisk taget nøj-10 agtigt 50%. Imidlertid kan der ifølge opfindelsen også anvendes sådanne FAB-fragmenter, der ikke er alkyleret eller ikke er renset for ledsagestoffer. Ganske vist er bestemmelsen behæftet med større fejl, men resultaterne ligger stadigvæk inden for rammerne af det udmærket brugbare, dvs. hybridenzy-15 met hæmmes i et omfang på 50% ± 3%.
Bestemmelsen af underenheden B i hybridenzymet CK-MB efter tilsætning af de monovalente antistoffer foregår derefter ifølge de til CK-bestemmelsen generelt kendte metoder, som går 20 ud fra creatin eller fra creatinphosphat som substrat. Egnede fremgangsmåder er eksempelvis beskrevet i "Methoden der Enzy-matischen Analyse" af H. U. Bergmeyer, Verlag Chemie, bind 1, 3. oplag, side 813-825. En som følge .af sin høje følsomhed særlig egnet fremgangsmåde er beskrevet i tysk offentiiggørel-25 sesskrift nr. 2.908.054. Denne fremgangsmåde benytter lucife-rin-luciferase-reaktionen og måler den emitterede lysmængde kinetisk.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør anvendelse af anti-30 sera imod CK-MM til kvantitativ bestemmelse af CK-MB, hvilke antisera er blevet opnået ifølge en hvilken som helst af de i litteraturen beskrevne immuniseringsmetoder og hidtil på grund af for høj CK-MB-hæmning ikke var anvendelige til en diagnostisk pålidelig CK-MB-prøve i serum. Også antisera, som foruden 35 hæmningen forårsager præcipitation, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Antisera med for høj CK-MB-hæm-ning behøver ikke længere at blive udeladt, og den bekostelige analyse til differentiering mellem brugbare og ikke brugbare 6
DK 154459 B
antisera bortfalder. Sidstnævnte er af særlig betydning, da afprøvningen af CK-MB-hæmningen af et antiserum kun er mulig på CK-MB-præparater fra frisk serum fra hjerteinfarkt-patien-ter. Bortfaldet af hæmningsprøven fører derfor til en betyde-5 lig forenkling.
De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere.
Eksempel 1 10 a) Fremstilling af IgG-fraktionen.
Serum fra får, som var immuniseret med human CK-MM ifølge det i "Immunologische Art mtsmethoden" Loc. cit. beskrevne skema, 15 tilsættes krystallins ammoniumsulfat indtil 1,8 M vd 0 til 40C og pH 7. Efter centrifugering opløses bundfaldet i 0,1 M TRIS/0,15 M NaCl-puffer, pH 8, og dialyseres grundigt mod 10 mM phosphatpuffer, pH 7,1. Det endnu engang ved hjælp af centrifugering klarede dialysat påføres på en søjle, der er fyldt 20 med DEAE-cellulose (DEAE = diethyl ami noethyl). Det proteinhol-dige gennemløb og eluatet, der opnås med 15 mM phosphat/10 mM NaCl-puffer, pH 7,1, forenes og indeholder mere end 95% ren IgG.
25 b) Papain-spaltning
IgG bliver ved pH 7,5 i løbet af 5 timer ved 37°C inkuberet med 1,5% papain (vægt% regnet i forhold til mængden af IgG-protein) ifølge den i Immunochem. 4 (1967) 369 beskrevne frem-30 gangsmåde under reducerende betingelser (10 μΜ cystein). Ved afslutningen af inkubationsfasen standses enzymindvirkningen ved hjælp af et overskud af jodacetamid, og til alkyleringen af frie SH-grupper inkuberes der ved pH 7,5 i 2 timer ved stuetemperatur. Den stabiliserede spaltningsblanding indehol-35 der FAB-fragmenter, Fc-fragmenter og mindre end 10% uspaltet IgG. Immunreaktivitetsudbyttet andrager mere end 75%.
c) Rensning af FAB-fragmenterne
DK 154459 B
7
Efter koncentrering til 30 mg/ml ved hjælp af ultrafiltrering separeres spaltningsblandingen ved hjælp af gelkromatografi (The LKB Instrument Journal 24, (1977) 10). FAB-fragmenter elueres som sidste proteintop godt adskilt fra IgG og Fc-frag-5 menter. FAB-fraktionen kan efter koncentrering ved hjælp af ultrafiltrering direkte anvendes til hæmning af CK-MM eller CK-MB. Hæmningen af CK-MB andrager inden for fejlgrænsen 50¾. Hæmningen af CK-MM ligger ved 99 til 100¾.
10 Eksempel 2 a) Fremstilling af γ-globulin-fraktionen fra fåreplasma.
Citratplasma fra får, som i 4 til 6 måneder er blevet immuni-15 seret med CK-MM, sættes til 25 mM calciumchlorid og henstilles i ca. 2 timer ved stuetemperatur til koagulation. Efter mekanisk fi deling af koagulatet fortyndes der med 1 volumen fysiologisk NaCl-opløsning, og med henblik på 1ipoproteinadsorp-tion tilsættes 2% si 1ikat-flokkuleringsmiddel (Aerosil®).
20
Ved hjælp af centrifugering udvindes den klare, oven på stående væske.
Fra den ovenstående væske udfældes γ-globuli nfraktionen ved 0 25 til 4°C og pH 7 med 1,8 M ammoniumsulfat, og fraktionen opsamles ved hjælp af centrifugering. Ved hjælp af dialyse mod 50 mM TRIS/0,1 M NaCl-puffer, pH 7,5, og koncentrering ved hjælp af ultrafiltrering opnår man et til den enzymatiske spaltning egnet antistofpræparat.
30 b) Papain-spaltning.
Der gås frem som beskrevet i eksempel 1 b), men en smule modificeret for γ-globuli n-fraktionens vedkommende. 1,5% papain 35 anvendes per g protein i γ-globulin-fraktionen, og inkubationstiden andrager 20 timer ved 25eC. De øvrige betingelser er de samme.
8
DK 154459 B
c) Rensning af FAB-fraktionen.
Den alkylerede spaltningsblanding dialyseres mod fysiologisk kogsaltopløsning og tilsættes derefter 25 mM zinksulfat (Immu-5 nochem. 14 (1977) 99]. Derved bliver resterende uspaltede IgG-09 Fc-fragmenter udfældet og fraskilt ved hjælp af centrifugering. De tilbageblivende FAB-fragmenter er efter dialyse og koncentrering færdige til anvendelse ved CK-MB-prøven. Udbyttet andrager mere end 80% af hæmningsaktiviteten for CK-MM-10 isoenzym, regnet i forhold til udgangsplasmaet. CK-MB bliver uafhængigt af hæmningsværdien for de uspaltede antistoffer hæmmet 50%. De med forskellige sera opnåede resultater fremgår af den efterfølgende tabel.
15 20 25 30 35 9
DK 154459 B
p Q) p
G
<D
i
nj (N f<1 dl N
p in in in
— I
r-i CQ
P h o -:-- o
^ S
12.
O μ O Q) :£ ni til
(D 1 M
+> '' P
O) PQ £ ni ^ co -p g cd vo m vø vo: Ή T tn > ώ ti
' -H U P
-P Λί cd ——---—r--—
N P
β ' <D .
(D -P
a w <d h (ti i .
pq ro in iH m: P P *· * - ** .
fn β m c\ si σι w: •iH * I C\ 0"\ 0\ .
ri h pq ; S s. f< $ P fe P! O ------
ti? O
H S
! 2 ~ op . - irt o 0) φ id ία ί-» in ιο cn in x!· '-cod - - - “ β tjl ^ Ol Cl (Ti 00 Φ g pj ω σι cn cn cn i. P H ro
: w s 3 S
up o
. . * ..... I " * *H
-P
ro c p
(D
,* -P
£ C
S *H
P II
r-i cn cn ^
O D
Claims (8)
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af c.reatinkinase-MB i serum ved hjælp af immunologisk udkobling af underenheden M og måling af underenheden B ifølge kendte metoder til bestemmelse af c:reatinkinase, kendetegnet ved, at man 5 til udkoblingen af underenheden M i reaktionsmaterialet tilsætter monovalente fragmenter, som ved hjælp af proteoly-tisk spaltning under reducerende betingelser er udvundet af antistoffer mod creatinkinase-MM.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at man anvender monovalente fragmenter, der er udvundet af antistoffer, som hæmmer hybridenzymet CK-MB mere end 55% og fuldstændig hæmmer isoenzymet CK-MM.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man anvender monovalente fragmenter, der er udvundet af anti-15 stoffer, som hammer hybridenzymet CK-MB i et emfang på 60 til 90%.
4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man anvender monovalente fragmenter, hvorfra de resterende fuldstændige antistoffer og de krystalliserbare fragmenter (F_J er fraskilt.
5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man tilsætter monovalente fragmenter, hvis SH-grupper er alkyleret.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man tilsætter med jodaeetamid eller jodacetat alkylerede 25 monovalente fragmenter.
7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man bestemmer underenheden B ved hjælp af lueiferin-luceferase-reaktionen og måler den DK 154459 B udsendte lysmængde kinetisk.
8. Reagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, hvilket reagens indeholder et system til bestemmelse af creatinkinase-MB og et middel til immunologisk udkobling af creatinkinasens 5 underenhed M, kendetegnet ved, at midlet til immunologisk udkobling består af monovalente fragmenter, som ved hjælp af proteolytisk spaltning under reducerede betingelser er udvundet af antistoffer mod creatinkinase-MM.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2908053A DE2908053C2 (de) | 1979-03-02 | 1979-03-02 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase MB |
| DE2908053 | 1979-03-02 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK63680A DK63680A (da) | 1980-09-03 |
| DK154459B true DK154459B (da) | 1988-11-14 |
| DK154459C DK154459C (da) | 1989-05-22 |
Family
ID=6064229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK063680A DK154459C (da) | 1979-03-02 | 1980-02-14 | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af creatinkinase-mb |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4330620A (da) |
| EP (1) | EP0015508B1 (da) |
| JP (1) | JPS5820274B2 (da) |
| AR (1) | AR219440A1 (da) |
| AT (1) | ATE263T1 (da) |
| AU (1) | AU515930B2 (da) |
| CA (1) | CA1160942A (da) |
| CS (1) | CS226407B2 (da) |
| DD (1) | DD149421A5 (da) |
| DE (2) | DE2908053C2 (da) |
| DK (1) | DK154459C (da) |
| ES (1) | ES488774A1 (da) |
| FI (1) | FI72145C (da) |
| HU (1) | HU181684B (da) |
| IE (1) | IE49158B1 (da) |
| SU (1) | SU1336941A3 (da) |
| YU (1) | YU42965B (da) |
| ZA (1) | ZA801158B (da) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4614712A (en) * | 1983-02-25 | 1986-09-30 | The Upjohn Company | Immunoassays with luciferase labeled ligands or receptors |
| CA1260828A (en) * | 1983-07-04 | 1989-09-26 | Masakazu Iwai | Therapeutic and prophylactic agent for gastrointestinal ulcers |
| JPS60125565A (ja) * | 1983-12-12 | 1985-07-04 | Amano Pharmaceut Co Ltd | エノラ−ゼサブユニット量の分別定量法 |
| US4810639A (en) * | 1985-12-20 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassay for CK-MB using bound and soluble antibodies |
| JPS63131065A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-03 | Yatoron:Kk | 抗体の精製法とアイソザイムの測定法及び試薬 |
| CN110133265B (zh) * | 2019-06-10 | 2022-03-15 | 天津市宝坻区人民医院 | 血清中肌酸激酶试剂盒及测定方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK496476A (da) * | 1975-11-03 | 1977-05-04 | Merck Patent Gmbh | Fremgangsmade og middel til bestemmelse af creatinkinase-mb |
| DE2548962A1 (de) * | 1975-11-03 | 1977-05-12 | Merck Patent Gmbh | Antikoerper und verfahren zu ihrer herstellung |
| GB1521986A (en) * | 1974-08-02 | 1978-08-23 | Antonik A | Estimation of enzymes |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2128670B2 (de) * | 1971-06-09 | 1977-06-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode |
| JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
| DE2828658C3 (de) * | 1978-06-29 | 1981-10-22 | Lkb-Produkter Ab, Stockholm | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
-
1979
- 1979-03-02 DE DE2908053A patent/DE2908053C2/de not_active Expired
-
1980
- 1980-02-05 IE IE221/80A patent/IE49158B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-02-11 CS CS80907A patent/CS226407B2/cs unknown
- 1980-02-13 AU AU55496/80A patent/AU515930B2/en not_active Expired
- 1980-02-14 DK DK063680A patent/DK154459C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-02-20 ES ES488774A patent/ES488774A1/es not_active Expired
- 1980-02-26 AR AR280091A patent/AR219440A1/es active
- 1980-02-27 FI FI800577A patent/FI72145C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-02-27 DD DD80219298A patent/DD149421A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-27 CA CA000346572A patent/CA1160942A/en not_active Expired
- 1980-02-28 EP EP80100995A patent/EP0015508B1/de not_active Expired
- 1980-02-28 AT AT80100995T patent/ATE263T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-28 US US06/125,318 patent/US4330620A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-02-28 DE DE8080100995T patent/DE3060050D1/de not_active Expired
- 1980-02-28 YU YU542/80A patent/YU42965B/xx unknown
- 1980-02-29 HU HU80475A patent/HU181684B/hu unknown
- 1980-02-29 ZA ZA00801158A patent/ZA801158B/xx unknown
- 1980-02-29 JP JP55024219A patent/JPS5820274B2/ja not_active Expired
- 1980-02-29 SU SU802891744A patent/SU1336941A3/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1521986A (en) * | 1974-08-02 | 1978-08-23 | Antonik A | Estimation of enzymes |
| DK496476A (da) * | 1975-11-03 | 1977-05-04 | Merck Patent Gmbh | Fremgangsmade og middel til bestemmelse af creatinkinase-mb |
| DE2548962A1 (de) * | 1975-11-03 | 1977-05-12 | Merck Patent Gmbh | Antikoerper und verfahren zu ihrer herstellung |
| FR2330010A1 (fr) * | 1975-11-03 | 1977-05-27 | Merck Patent Gmbh | Procede et agent pour la determination de l'activite de creatine-kinase mb |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE263T1 (de) | 1981-10-15 |
| FI72145C (fi) | 1987-04-13 |
| YU54280A (en) | 1984-10-31 |
| CA1160942A (en) | 1984-01-24 |
| JPS5820274B2 (ja) | 1983-04-22 |
| JPS55120797A (en) | 1980-09-17 |
| AU5549680A (en) | 1981-03-12 |
| FI800577A7 (fi) | 1980-09-03 |
| US4330620A (en) | 1982-05-18 |
| DK63680A (da) | 1980-09-03 |
| YU42965B (en) | 1989-02-28 |
| DE3060050D1 (en) | 1981-12-10 |
| ZA801158B (en) | 1981-03-25 |
| ES488774A1 (es) | 1980-09-16 |
| AU515930B2 (en) | 1981-05-07 |
| EP0015508A1 (de) | 1980-09-17 |
| EP0015508B1 (de) | 1981-09-30 |
| DE2908053A1 (de) | 1980-09-11 |
| DE2908053C2 (de) | 1982-08-19 |
| SU1336941A3 (ru) | 1987-09-07 |
| DD149421A5 (de) | 1981-07-08 |
| AR219440A1 (es) | 1980-08-15 |
| CS226407B2 (en) | 1984-03-19 |
| FI72145B (fi) | 1986-12-31 |
| HU181684B (en) | 1983-11-28 |
| IE800221L (en) | 1980-09-02 |
| IE49158B1 (en) | 1985-08-07 |
| DK154459C (da) | 1989-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4067775A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-MB | |
| Jockers-Wretou et al. | Quantitation of creatine kinase isoenzymes in human tissues and sera by an immunological method | |
| Colburn et al. | Anti-clotting activity of endothelial cell cultures and heparan sulfate proteoglycans | |
| Mahan et al. | A radioimmune assay for human prostatic acid phosphatase-levels in prostatic disease | |
| Gray et al. | An Immunological Investigation of the Structure and Function of Ribulose 1, 5‐Bisphosphate Carboxylase | |
| Taylor et al. | Comparison of leucine aminopeptidase from human lens, beef lens and kidney, and hog lens and kidney | |
| Maitre et al. | Comparison of the structural characteristics of the 4-aminobutyrate: 2-oxoglutarate transaminases from rat and human brain, and of their affinities for certain inhibitors | |
| ReJ | An immunochemical procedure for determination of mitochondrial aspartate aminotransferase in human serum. | |
| NO159619B (no) | Immunokjemisk enzymbestemmelse. | |
| Ibsen et al. | Purification and properties of mouse pyruvate kinases K and M and of a modified K subunit | |
| Echetebu et al. | Antibodies to porcine uteroferrin used in measurement of human tartrate-resistant acid phosphatase. | |
| DK154459B (da) | Fremgangsmaade og reagens til bestemmelse af creatinkinase-mb | |
| US4237044A (en) | Antibodies against creatinekinase-M8 and process for the production thereof | |
| Prydz et al. | Factor X | |
| Fahey | Contribution of γ-globulin subunits to electrophoretic heterogeneity: Identification of a distinctive group of 6· 6S γ-myeloma proteins | |
| Koo et al. | α-Ketoglutaric Semialdehyde Dehydrogenase of Pseudomonas: PROPERTIES OF THE SEPARATELY INDUCED ISOENZYMES | |
| Farber et al. | Calmodulin‐Dependent Phosphatases of PC12, GH3, and C6 Cells: Physical, Kinetic, and Immunochemical Properties | |
| Cummings et al. | Atypical γ1A-globulin with the electrophoretic properties of an α2-globulin occurring in multiple myeloma | |
| Romslo et al. | Ectopic alkaline phosphatase production in metastasizing ventricular carcinoma | |
| Wooten et al. | Proportionality between dopamine-β-hydroxylase activity and immunoreactive protein concentration in human serum | |
| Largman et al. | Demonstration of a pancreatic proelastase 2-alpha 1-protease inhibitor complex in normal human plasma | |
| Sidorowicz et al. | Multiple molecular forms of human alanine aminopeptidase: immunochemical properties | |
| Zhao et al. | Protein-induced inactivation and phosphorylation of rabbit muscle phosphofructokinase | |
| Roberts et al. | Antibody to prolyl hydroxylase from rat skin and its cross-reactivity with enzyme from other species | |
| Fujita et al. | Purification and properties of porcine testis acylphosphatase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |