JPS5820274B2 - クレアチンキナ−ゼ−ｍｂを測定する方法および試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細潰中のクレアチンホスホキナーゼＭＢ（以下
ＣＫ−ＭＢと示す）の活性を測定する方法および試薬に
関する。

ヒトの身体には２種の下位単位、すなわちＭおよびＢを
持つ前記の酸素が生じる。

活性酵素はそれぞれ２つの下位単位の組合せからできて
おり、かつ２つの下位単位は任意に相互に組合せること
ができるので、３種の酵素型が可能である二筋肉型（Ｃ
Ｋ−ＭＭ）、脳型（ＣＫ−ＢＢ）およびハイブリッド型
（ＣＫ−ＭＢ）であり、ハイブリッド型は主として心筋
内で生じ、心筋こうそくの場合に細潰中に出るので、心
筋こうそくでは細潰中で高まった濃度で見られる。

このハイブリッド−イソ酵素の活性は細潰中のＣＫの総
活性と並んで心筋こうそくの診断に利用することができ
る。

細潰中で生じる筋肉型イソ酵素ＣＫ−ＭＭをＣＫの下位
単位Ｍに対する特異的抗体の添加により除去し、次いで
ＣＫ−測定の公知方法を用いて依然として存在するハイ
ブリッド型酵素ＣＫ−ＭＢを測定することが公知である
。

その際沈降性抗体並びに阻害性抗体が使用された。

しかしこの場合ハイブリッド型酵素ＣＫ−ＭＢも８０％
阻害されることが欠点である〔″クリニカ・ヒミカ・ア
クタ（Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ） ”、第５８巻
、２２３〜２３２頁（１９７５年）〕。

筋肉型ＣＫ−ＭＭを完全に阻害し、かつ脳型ＣＫ−ＢＢ
を全く阻害しない抗体を取得することも既に公知である
〔゛°イムノケミストリ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）”、第６巻、６８１〜６８７頁（１９６９年）〕
。

かかる抗体ではハイブリッド型酵素ＣＫ−ＭＢ中の下位
単位Ｂは全く阻害されず、そのために該抗体を用いる測
定方法の信頼性が高められるが、該方法も依然として著
しい欠点を有している。

すなわちきわめて純粋な抗原（ＣＫ−ＭＭ）を使用する
場合にも抗体形成に使用される動物が主としてハイブリ
ッド酵素ＣＫ−ＭＢを５５％以上、たいていは６０〜９
０係阻害した血清を産生じたことが示された。

したがって免疫化に使用される各動物で形成された抗体
がＣＫ−ＭＢを５０係阻害したにすぎないか、またはよ
り強く阻害したかを検査することが必要であった。

このことから生じる費用を除いても、取得された血清の
大部分は実際に使用できない、それというのも常に種々
の阻害度が生じるからである。

混注した細潰もこの困難を部分的にしか排除しない。

さらに心筋こうそくの場合に細潰中のＣＫ−ＭＢ量がき
わめて少なく、かつまたこの著しい部分を除去する抗体
では方法の信頼性が著しく減じられる、ということがあ
る。

本発明は前記の欠点を取り除き、かつ特にＣＫ−ＭＭを
完全に阻害し、しかしＣＫ−ＭＢを５５係以上阻害する
抗体をもハイブリッド型酵素ＣＫ−ＭＢ中に含まれる下
位単位Ｂの総活性を測定できるように使用可能にする前
記の種類の方法を見い出す課題を基礎とする。

この課題は本発明により下位単位Ｍを免疫的除去し、か
つクレアチンキナーゼを測定するための公知方法により
下位単位Ｂを測定することにより細潰中のタレアチンキ
ナーゼーＭＢを測定する方法により解決され、該方法は
反応バッチ中で下位単位Ｍを除去するためにハイブリッ
ド酵素ＣＫ−ＭＢを５５係を上回る阻害率で、かつイソ
酵素ＣＫ−ＭＭを完全に阻害する下位単位Ｍに対する抗
体から還元性条件下にたん白質分解による分離により得
られる、ＣＫ−ＭＭを完全に、かつＣＫ−ＭＢを約５０
係阻害する一価のフラグメントを添加することより成る
。

酵素がＩｇＧ−フラクションもしくはγ−グロブリンに
属し、かつ分子量約１３００００〜２１００００を有す
る天然抗体によってのみ阻害されるのではなく、該抗体
をたん白質分解により切断することによって沈降性を失
ったが（二価の抗体とは異なり一価にすぎないので）、
シかしその一価のフラグメントの阻害特性は二価の抗体
の阻害特性とは僅かしか相違しないフラグメントが生成
することは公知である〔゛コンタクチ（Ｋｏｎｔａｋｔ
ｅ ） ”、３／７８．１Ｏ−１７）。

このフラグメントはＦＡＢ−フラグメントと表示される
〔゛°バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｊ、） ”、第７３巻、１１９〜１２６頁（１９５９年
）；゛イムノケミストリ”、第４巻、３６９頁（１９，
６７））。

意外にもこのことは本発明では該当しないことが判明し
た。

すなわちＣＫ−ＭＭを完全に、かつＣＫ−ＭＢを５５係
以上、特に６０〜９０係阻害する抗体からＣＫ−ＭＭは
依然として完全に、すなわち９９〜１００係阻害するが
、ＣＫ−ＭＢは許容誤差の範囲内で５０係阻害するにす
ぎない一価のフラグメント（ＦＡＢ−フラグメント）が
得られることが判明した。

これにより好適な試験動物、例えばヒツジ、ウサギ、ニ
ワトリ等から得られるＣＫ−ＭＢ測測定ための抗細潰を
予め高価な分析方法を用いてＣＫ−ＭＢを約５３％以上
阻害する抗血清を排除することなく使用することが可能
になる。

むしろその阻害特性を予め測定せずに細潰を還元性条件
下にたん白質分解により分離し、かつこの分離フラグメ
ントを用いて次にＣＫの下位単位Ｍを、筋肉型酵素ＣＫ
−ＭＭ中に存在するＭもハイブリッド型酵素ＣＫ−ＭＢ
中に存在するＭも特異的に除去することが可能である。

有利に本発明の範囲内ではハイブリッド型酵素ＣＫ−Ｍ
Ｂを５５係以上、特に有利に６０〜９０％阻害し、かつ
筋肉型イソ酵素ＣＫ−ＭＭを完全に阻害する抗体から得
られる一価のフラグメントを使用する。

本発明のもう１つの有利な実施形によればかかる一価の
フラグメントから残留する完全抗体および結晶性フラグ
メント（Ｆｏ）を分離した一価のフラグメントを使用す
る。

この分離は公知方法、例えはゲルクロマトグラフィー処
理または塩溶液を用いての透析および硫酸亜鉛を用いて
の沈澱により行なうことができる〔、”イムノケミスト
リ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ） ”、第１４巻、９９頁
（１９７７年）〕。

前記のように有利には抗体およびＦ。

−フラグメントを分離した、公知方法で得られた一価の
フラグメントはそれ自体で本発明の方法で使用すること
ができる。

しかし有利にはそのＳＨ−基が予めアルキル化された一
価のフラグメントを使用する。

水性媒体中でたん白質の三次構造が変化しなｌｚ ）ｐ
Ｈ値で有効であるアルキル化剤が好適である。

例えばヨードアセテートおよびヨードアセトアミドであ
り、その際後者が有利に使用される、それというのも該
アルキル化剤はフラグメントの製造に使用されるたん白
質分解酵素を同時に不活性化することができるからであ
る。

本発明により使用されるＦＡＢ−フラグメントの取得に
必要な抗細潰の製造では例えば文献に多種記載されてい
るような常用の免疫化方法を使用する。

例えばメソツズ・オブ・イムノロジー・アンド１イムノ
ケミストリ（Ｍｅｔｈｏｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）″〔第
４巻、第３１３頁以下（１９７６年）、特に第３３６頁
〕が挙げられる。

一般に免疫化ではできる限り純粋な抗原を使用し、かつ
十分に長時間免疫化することが重要である。

一般的な方法は例えば゛イムノロギツシエ・アルバイツ
メ［・−デン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉ ｓｃｈｅＡｒｂ
ｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ ）” （ＶＥＢゲスタフ・
フィッシャー・フエアラーク（Ｇｕｓｔａｖ Ｆ １ｓ
ｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ）社出版、イエナ、１９７６
年３６８〜３７０頁〕および゛マイクロバイオロジー（
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ） ”〔バーパー・アンド
・ロー（Ｈａｒ ｐｅｒ ＆ Ｒａｗ）社出版、ニュー
ヨーク、１９７０年、４５８／４５９頁〕に記載されて
いる。

免疫化に好適な純粋なＣＫ−ＭＭ−イソ酵素（抗原）は
’ Ａ Ｂ Ｂ （Ａｒｃ−ｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ
）”〔第１５０巻、６４８〜６７８頁（１９７２年）〕
により得られ、その際有利に単離及び精製の際に安定化
のために緩衝液にジチオトレイトールを添加する。

抗細潰から常法でＩ、Ｇ−フラクションもしくはγ−グ
ロブリンを得、引続き還元性条件下にたん白質分解酵素
を用いて切断する、該酵素は蝶番部分（Ｈｉｎｇｅ−Ｒ
ｅｇｉｏｎ ）に作用する。

たん白質分解酵素の例はパパインおよびペプシンである
。

この分解は例えばゼ・アンチボディ・モレキュール（Ｔ
ｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ ） ”
（アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ ）社出版、ニューヨーク、３２２〜３２６頁（１９
７５年）〕に記載されている。

還元性条件を作るためには一般にＳＨ−基含有化合物、
例えばシスティン、メルカプトエタノール等が添加され
る。

たん白質分解酵素での恒温保持は切断が完了した時に有
利には公知の不活性化剤を添加することにより中止する
。

既に述べたように本発明の範囲内ではヨードアセトアミ
ドが優れている。

分解の際に生成するＦＡＢ−フラグメントの遊離のＳＨ
−基が該中止剤によりアルキル化される。

このようにして処理されるＦＡＢ−フラグメントは本発
明の範囲内で、特に依然として残留する抗体およびＦ。

−フラグメントを除去する場合に特に好適である。

次いでＣＫ−ＭＢの阻害が完全に沈降物の発生なしに行
なわれ、かつこれは実質的に精確に５０％になる。

しかし本発明の範囲内ではアルキル化されていない、ま
たは随伴物質を分離精製していないＦＡＢ−フラグメン
トも使用でき、これによって若干より大きな誤差が測定
時に生じるが、この誤差は良好に使用可能な範囲内であ
る、すなわちハイブリッド型酵素を５０係±３係阻害す
る。

一価の抗体の添加後のハイブリッド型酵素ＣＫ−ＭＢ中
の下位単位Ｂの測定はＣＫ測測定一般に知られている方
法により行なわれ、該方法は基質としてクレアチンまた
はクレアチンホスフェートから出発する。

好適な方法は例えばベルクマイヤ（Ｈ，Ｕ、Ｂｅｒｇｍ
ｅｙｅｒ ） 著゛メトーデン・デア・エンツイマチツ
シエン・アナリューゼ（Ｍｅｔｈｏｄｅｎｄｅｒ ｅｕ
ｚｙｍａｔｉｓｃｈｅｎ Ａｎａｌｙｓｅ ） ” （
第３版、フエアラーク・ヒエミー（Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈ
ｅｍｉｅ ）社出版、第１巻、８１３〜８２５頁〕に記
載されている。

その高い感度のために特に好適な方法は西ドイツ国特許
出願Ｐ２９０８０５４，５号明細書（１９７９年３月２
日出願）に記載されている。

該方法はルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を使用シ、
カッ発光された光量を動力学的に測定する。

本発明による方法はＣＫ−ＭＢの定量測定に、文献に記
載された免疫化方法のいずれかにより取得され、かつ従
来はその高いＣＫ−ＭＢ阻害のために治療学的に信頼で
きる穐清中のＣＫ−ＭＢ試験に使用できなかったＣＫ−
ＭＭに対する抗細潰を使用することを可能にする。

阻害の他に沈降を惹起する抗細潰も本発明により利用す
ることができる。

研究を重ねられた免疫化方法の際にさえ著量で生じる、
高すぎるＣＫ−ＭＢ阻害を有する抗抽清をもはや排除す
る必要がなく、使用可能な抗血清と使用できない抗細潰
との識別のための高価な分析が省略される。

このことは特に重要である、それというのも抗細潰のＣ
Ｋ−ＭＢ阻害の試験は心筋こうそく患者の新しい細潰か
ら得られたＣＫ−ＭＢ標本でのみ可能であるからである
。

したがって阻害試験の省略は著しい簡略化をもたらす。

次に実施例につき本発明を詳説する。

例１ ａ）ＩｇＧ−フラクションの製造 ゛イムノロギツシエ・アルバイツメトーデン″〔前掲書
、前記の引用の箇所で〕に記載の方法によりヒトのＣＫ
−ＭＭで免疫化されたヒツジの細潰に結晶質硫酸アンモ
ニウムを０〜４℃でｐＨ７で全量１．８モル加える。

遠心分離後沈澱物をトリス０．１モル／ＮａＣ１０，１
５モル−緩衝液（ｐＨ８）に溶かし、かつホスフェート
緩衝液（ｐＨ７，１）を用いて十分に透析する。

更に遠心分離して澄明になった透析物をＤＥＡＥ−セル
ロースで充填したカラムに通す。

たん白質含有流出物およびホスフェート１５ミリモルｌ
Ｎ ａ Ｃ１１０ミリモルー緩衝液（ｐＨ７，１）で得
られる溶離物を合する。

純粋なＩ ｇ Ｇ ９５ ％以上を含有している。

ｂ）パパイン−分解 ＩｇＧを゛イムノケミストリ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、
） ”〔第４巻、３６９頁（１９６７年）〕に記載され
た方法により還元性条件（システィン１０ミリモルを用
いて）下にパパイン１．５％（Ｉ、（３−たん白質量に
対する重量％）でｐＨ７，５，３７℃で５時間にわたっ
て恒温保持する。

恒温保持終了時に酵素の作用を過剰のヨードアセトアミ
ドによって中止し、かつ遊離のＳＨ−基をアルキル化す
るためにｐＨ７，５、室温で２時間恒温保持する。

安定化された分解混合物はＦＡＢ−フラグメント、Ｆｏ
−フラグメントおよび＜ ｉ ｏ ％の未分解のＩｇＧ
を含む。

免疫反応性収率は７５係を上回る。

ｃ）ＦＡＢ−フラグメントの精製 限外濾過により３０Ｔｎ９／ｍｌに濃縮の後分解混合物
をゲルクロマトグラフィー〔ザ・ＬＫＢ・インストルメ
ント・ジャーナル（Ｔｈｅ ＬＫＢＩｎｓｔｎｅ ｍｅ
ｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ）”、第２４巻１０頁（１９
７７年）〕により分離する。

ＦＡＢ−フラグメントは最後のたん白質ピークとして良
好にＩＧおよびＦ。

−フラグメントから分離されて溶離する。

このＦＡＢ−フラクションは限外沖過により濃縮後直接
ＣＫ−ＭＭまたはＣＫ−ＭＢの阻害に使用することがで
きる。

ＣＫ−ＭＢの阻害は許容誤差の範囲内で５０％である。

ＣＫ−ＭＭの阻害は９９〜１００％である。

例２ ａ）ヒツジの細葉からのγ−グロブリンーフラクション
の製造 ＣＫ−ＭＭで４係６ケ月免疫化したヒツジのクエン酸塩
血漿に塩化カルシウム全量２５ミリモルを加え、約２時
間室温で凝固させる。

凝固物を機械的に細砕の後生理的Ｎ ａ Ｃ１３−溶液
１容量で希釈し、かつリポたん白質吸着のために２係−
珪酸塩−凝結剤（アエロジル）を加える。

遠心分離により澄明な上澄みが得られる。

この上澄み液から０〜４℃、ｐＨ７で硫酸アンモニウム
１．８モルを用いてγ−グロブリンーフラクションを沈
澱させ、かつ遠心分離により捕集する。

トリス５０ミリモル１ＮａｃｌｌＯ，１モル−緩衝液（
ｐＨ７，５）を用いて透析し、かつ限外濾過により濃縮
して酵素による分解に好適な抗体−標本が得られる。

ｂ）パパイン−分解 例ｘｂ）に記載された方法と同様にして実施するが、γ
−グロブリンーフラクションについて少し変更される。

パパイン１．５ ％はγ−グロブリンーフラクションの
たん白質１！ｊに対してであり、かつ恒温保持時間は２
５℃で２０時間である。

他の条件は同じである。ｃ）ＦＡＢ−フラクションの精
製 アルキル化された分解混合物を生理的食塩水を用いて透
析し、次いで硫酸亜鉛２５ミリモルを加える〔゛°イム
／ケミストリ（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ） ”、第１４
巻、９９頁（１９７７年）〕。

これにより残りの未分解ＩｇＧおよびＦ。

−フラグメントが沈澱し、これを遠心分離により分離す
る。

残留するＦＡＢ−フラグメントを透析および濃縮によっ
てＣＫ−ＭＢ試験で使用するために仕上げる。

収率は出発細葉に対して、ＣＫ−ＭＭ−イソ酵素の阻害
活性８０係以上である。

ＣＫ−ＭＢは未分解抗体に関する阻害値とは無関係に５
０％阻害される。

種々の血清で得られる結果を次の表に挙げる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下位単位Ｍを免疫的除去し、かつクレアチンキナー
   ゼを測定するための公知方法により下位単位Ｂを測定す
   ることにより細潰中のクレアチンキナーゼ−ＭＢを測定
   するための方法において、反応バッチ中で下位単位Ｍを
   除去するためにハイブリッド酵素ＣＫ−ＭＢを５５係を
   上回る阻害率で、かつイソ酵素ＣＫ−ＭＭを完全に阻害
   する、下位単位Ｍに対する抗体から還元性条件下にたん
   白質分解による分離により得られるＣＫ−ＭＭを完全に
   、かつＣＫ−ＭＢを約５０係阻害する一価のフラグメン
   トを添加することを特徴とする、クレアチンキナーゼ−
   ＭＢを測定する方法。 ２ ハイブリッド酵素ＣＫ−ＭＢを６０〜９０％阻害す
   る抗体の一価のフラグメントを特徴する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３ 残りの完全抗体および結晶性フラグメント（ＦＣ）
   を分離精製した一価のフラグメントを特徴する特許請求
   の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の方法。 ４ そのＳＨ−基がアルキル化されている一価のフラグ
   メントを特徴する特許請求の範囲第１項〜第３項のいず
   れかに記載の方法。 ５ ヨードアセトアミド又はヨードアセテートでアルキ
   ル化された一価のフラグメントを特徴する特許請求の範
   囲第４項記載の方法。 ６ 下位単位Ｂをルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を
   用いて測定し、かつ発光された光量を動力学的に測定す
   る、特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の
   方法。 ７ 下位単位Ｍを免疫的除去し、かつクレアチンキナー
   ゼを測定するための公知方法により下位単位Ｂを測定す
   るためにクレアチンキナーゼ−ＭＢを測定するための系
   およびクレアチンキナーゼＭを免疫的除去するための物
   質を含有する、細潰中のクレアチンキナーゼ−ＭＢを測
   定するための試薬において、免疫的除去のための物質が
   ハイブリッド酵素ＣＫ−ＭＢを５５％を上回る阻害率で
   、かつイソ酵素ＣＫ−ＭＭを完全に阻害する、クレアチ
   ンキナーゼ−ＭＭに対する抗体のＣＫ−ＭＭを完全に、
   かつＣＫ−ＭＢを約５０係阻害する−価のフラグメント
   から成っていることを特徴とする、クレアチンキナーゼ
   −ＭＢを測定するための試薬。