CS226407B2 - Method of determining mb creatinkinase - Google Patents
Method of determining mb creatinkinase Download PDFInfo
- Publication number
- CS226407B2 CS226407B2 CS80907A CS90780A CS226407B2 CS 226407 B2 CS226407 B2 CS 226407B2 CS 80907 A CS80907 A CS 80907A CS 90780 A CS90780 A CS 90780A CS 226407 B2 CS226407 B2 CS 226407B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- fragments
- subunit
- monovalent
- antibodies
- inhibit
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 claims description 5
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 2
- MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methylnaphthalen-1-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound CC1=CC=C2C=CC=CC2=C1N1C(=O)C=CC1=O MEZJQXVOMGUAMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 8
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000018791 negative regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/50—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving creatine phosphokinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu stanovení kreatinkinázy MB, dále nazývané zkratkou KK-MB, v séru.
V lidském těie se vyskytují dvě podjednotky uvedeného enzymu, podjednotky M a B. Protože aktivní enzym je složen vždy ze dvou podjednotek a protože obě podjednotky se mohou spolu volně kombinovat, jsou možné tři typy enzymů: svalový typ KK-MM, mozkový typ KK-BB a hybridní typ KK-MB, který se vyskytuje hlavně v myokardu, při srdečním infarktu se vylučuje do séra a pak jej tam lze zjistit ve vyšší koncentraci. Aktivita tohoto hybridního enzymu se může kromě celkové aktivity KK v séru použít pro diagnózu srdečního infarktu.
Je známé, že přídavkem specifických protilátek proti podjednotce KK-M lze vyřadit svalový typ isoenzymu KK-MM, vyskytující se v séru, a pak změřit podle některé ze známých metod pro stanovení KK ještě zbylý hybridní enzym KK-MB. Přitom bylo použito jak srážecích, tak též inhibujících protilátek. Nedostatek však spočívá v tom, že se přitom též inhiboval z 80 % hybridní enzym KK-MB (Clin. Chim. Acta, 58, 223-232 /1975//). Bylo sice již známé získávat protilátky, které inhibují svalový typ KK-MM úplně a mozkový typ KK-BB neinhibují vůbec (Immunochemistry, Vol. 6, 681-687 /1969/).
......
Ačkoliv u takových protilátek se podjednotka B v hybridním enzymu KK-MB vůbec neinhibuje a tím spolehlivost metody stanovení zvyšuje, má i tento postup ještě značné nedostatky. Ukázalo se totiž, že i při použití nejčistších antigenů (KK-MM) poskytovala zvířata použitá pro vytváření protilátek převážně sérum, které inhibovalo hybridní enzym KK-MB z více než 55 %, většinou mezi 60 a 90 °/o. Bylo proto třeba u každého zvířete použitého pro imunizaci zkoumat, zda vzniklé ' protilátky proti KK-MB inhibují pouze z 50 % nebo silněji. Nepřihlíží-li se k tím vznikajícím nákladům, vede to k tomu, že největší část získaných sér nelze prakticky použít, protože se vyskytují vždy rozdílné stupně inhibice. Rovněž séra vyrobená z loužičky odstraňují tuto obtíž jen částečně. K tomu dále přistupuje, že množství KK-MB v séru je při srdečním . infarktu neobyčejně malé a u protilátek, jež opět jeho značnou část vyřadí, se spolehlivost metody silně zmenší.
Úkolem vynálezu je odstranit uvedené nedostatky a vytvořit způsob uvedeného druhu, jenž zejména umožňuje použít protilátky inhibující KK-MM úplně, avšak KK-MB pouze z více než 55 % takovým způsobem, že lze stanovit celkovou aktivitu podjednotky B v hybridním enzymu KK-MB.
Předmětem' vynálezu je způsob stanovení kreatinkinázy MB v séru imunologickým vyřazením podjednotky M a měřením podjednotky B, vyznačující se tím, že se k reakční násadě sestávající z protilátek proti podjednotce M přidají monovaientní fragmenty, získané proteolytickým štěpením za redukčních podmínek, čímž se vyřadí podjednotka M, načež se stanoví podjednotka B například pomocí luciferln-luciferinázové reakce.
Je sice známé, že enzymy jsou inhibovány nejen přirozenými protilátkami patřícími k isogamaglobulinové frakci popřípadě ke gamaglobulinům a mající molekulovou hmotnost 130 000 až 210 000, nýbrž též vznikají proteolytickým štěpením těchto protilátek fragmenty, jež sice ztrácejí srážecí schopnost, protože jsou oproti divalentním látkám pouze monovalentní, avšak inhibiční vlastnosti monovalentních fragmentů se liší jen nepatrně od inhibičních vlastností divalentních protilátek (Kontakte 3/78, 10—17). Označují se jako FAB-fragmenty (Biochem. J. 73, 119—126 /1959/, Immunochem 4, 369 /1967//).
S překvapením bylo nyní zjištěno, že k tomu tak v daném případě není, nýbrž z protilátek, jež inhibují KK-MM úplně a KK-MB z více než 55 °/o, zejména z 60 až 90 °/o, se získají monovalentní fragmenty (FAB-fragmenty), inhibující KK-MM stále ještě úplně, to je z 99 až 100 °/o, avšak KK-MB inhibují v rozsahu meze chyby ' pouze z 50 %. Tím se umožňuje používat antiséra získaná z vhodných pokusných zvířat jako ovcí, králíků, slepic a podobně, pro stanovení KK-MB, aniž by bylo nutné nákladnými -analytickými metodami vytřiďovat antiséra, jež inhibují KK-MB z více ' než ·asi 53 %. Spíše je nyní možné séra proteolyticky štěpit za redukčních podmínek bez předcházejícího stanovení jejich ' inhibičních vlastností a pomocí fragmentů ze štěpení pak specificky vyřadit podjednotku KK-M bez ohledu na to, zda je obsažena ve svalovém enzymu KK-MM nebo v hybridním enzymu KK-MB. Výhodně se v rámci vynálezu používají monovalentní fragmenty získané z protilátek, jež inhibují hybridní enzym KK-MB · z více než 55 ' °/o, zejména z 60 až 90 · %, a svalový typ isoenzymu KK-MM inhibují úplně.
Podle další výhodné varianty provedení vynálezu se používají monovalentní fragmenty, z nichž jsou odděleny zbytkové totální protilátky a fragmenty schopné krystalizace (Fk). Oddělení lze provádět podle známých metod, například gelovou chromatografií nebo dialýzou proti roztoku soli a srážením síranem zinečnatým (Immunochem. 14, 99 /1977//).
Monovalentní fragmenty získané známým způsobem, · které, jak uvedeno, se vyčistí od protilátek a fragmentů Fk, lze použít jako takové ve způsobu podle vynálezu. Výhodně se však používá monovalentních fragmentů, jejichž SH— skupiny byly předtím alkylovány. Vhodná jsou alkylační činidla účinná ve vodném prostředí při hodnotách pH, jež nemění terciární strukturu proteinů. Příkladem pro to jsou jodacetát a jodacetamid, přičemž posléze uvedený se používá přednostně, protože je současně schopen inalktivovat proteolytické enzymy použité pro výrobu fragmentů.
Při výrobě antisér potřebných k získání FABTragmentů používaných podle vynálezu se uplatňují obvyklé imunizační metody popsané hojně v literatuře. Odkazuje se například na „Methods of Immunology and Immunochemistry“ sv. 4, str. 313 a dále [1976) zejména str. 336. Obecně záleží při imunizaci na použití co nejčistších antlgenů a na dostatečně dlouhé imunizaci. Obecné metody jsou popsány například v „Immunologische Arbeitsmethoden“, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1976, 368—370, a „Microbiology“, nakladatelství Harper & Row, New York, 1970, · 458/459. Čisté KK-MM isoenzymy [antigeny) vhodné pro imunizaci lze získat podle aBb 150, 648—678 (1972), přičemž se při isolování a čištění přidává k pufru dithiotreitol pro stabilizaci.
Z antisér se získá obvyklým způsobem isogamaglobulinová (IgG) frakce popřípadě gamaglobulin a poté za redukčních podmínek se štěpí proteolytickým enzymem, atakujícím Hingeho oblast. Příkladem · pro to jsou papain a pepsin. Štěpení je například popsáno v „The Antibody Molecule“, Academie Press New York, 1975, ·322—326. Pro vytvoření redukčních podmínek se obvykle přidávají sloučeniny obsahující SH— skupiny, například cystein, merkaptoethanol a podobné. Inkubace proteolytickým enzymem se zastaví, jakmile je štěpení úplné, vhodně přídavkem známého inaktivačního činidla. Jak již vpředu uvedeno· dává se přednost jodacetamidu. Volné SH— skupiny FAB-tragmentů vzniklých při štěpení se pomocí těchto inaktivačních činidel alkylují. FAB-fragmenty upravené tímto způsobem se hodí v · rámci vynálezu obzvlášť dobře, zejména odstraní-li se ještě zbytkové protilátky a Fk fragmenty. Dochází pak k úplné inhibici KK-MB bez vzniku sraženin a činí prakticky přesně 50 %. Avšak v rámci vynálezu lze použít též FAB--ragmentů, jež nejsou alkylovány nebo vyčištěny od průvodních látek, i když tím vznikne poněkud větší chyba při stanovení, která však leží vždy ještě v rozsahu použitelnosti, to je inhibuje · hybridní enzymy z 50 % + 3 %.
Stanovení jednotky B v hybridním enzymu KK-MB po přídavku monovalentních protilátek se pak provádí podle všeobecně známých metod stanovení KK, vycházejících z kreatinu nebo kreatinfosfátu jako substrátu. Vhodné způsoby jsou popsány například v „Methoden der enzymatischen Analyse“, H. V. Bergmeyer, Verlag Chemie, sv. 1, 3. vydání str. 813—825. Zvlášť vhodný je způsob, používající velmi citlivou metodu a spočívající na luctferinové-luciferázové reakci a ki226407 netickém měření emitovaného množství světla.
Způsob podle vynálezu umožňuje použití antisér proti KK-Mm pro kvantitativní stanovení KK-MB, které byly získány podle některé z imunizačních metod popsaných v literatuře a které dosud nebyly použitelné pro diagnosticky spolehlivý KK-MB test v séru. Rovněž antisér, způsobujících kromě inhibice srážení, lze podle vynálezu použít. Antiséra s příliš velkou inhibicí KK-MB, odpadající ve velmi značné míře i při vybroušených imunizačních metodách, není již třeba vytřiďovat, odpadá nákladná analytika pro rozlišení neupotřebitelných a upotřebitelných antisér. Posléze uvedená skutečnost je obzvlášť významná, protože vytestování inhibice KK-MB antiséra je možné pouze na preparátech KK-MB z čerstvých sér pacientů se srdečním infarktem. Odpadnutí inhibičního testu vede proto ke značnému zjednodušení.
Následující příklady objasňují vynález blíže.
Příklad 1
a) Příprava IgG-frakce
K sérům z ovcí, imunizovaných podle schéma popsaného dříve citovaných „Immunologische Arbeitsmethoden“ humánním KK-MM, se přidá krystalický síran amonný při 0 až 4 °C a pH 7 do 1,8 M. Po odstředění se sraženina rozpustí v pufru 0,1 M TRIS/0,15 . M NaCl, pH 8, a vydatně dialyzuje proti fosforečnanovému pufru 10 mM, pH 7,1. Dialyzát znovu vyčeřený centrifugováním se nanese na sloupec naplněný diethylaminoethylcelulózou. Proteinový filtrát a eluát získaný 15 mM fosfátovým/10 mM NaCl pufrem, pH 7,1 se spojí a obsahují více než 95 % čistého IgG.
c) Čištění FAB-fragmenlů
Po zahuštění na 30 mg/1 ultrafiltrací se směs po štěpení rozdělí gelovou chromatografií (The LKB Instrument Journal 24, (1977), 10 j. FAB-fragmenty . se eluují jako poslední proteinový pík dobře oddělené od IgG a Fk fragmentů. FAB-dirakce se může po zahuštění ultrafiltrací použít přímo k inhibování KK-MM nebo KK-MB. Inhibice KK-MB činí v rozsahu meze chyb 50 %. Inhibice KK-MM činí 99 až 100 %.
Příklad 2
a) Příprava gamaglobullnové frakce z ovčí plasmy
K citrátové plasmě z ovcí imunizovaných 4 až 6 týdnů KK-MM se přidá 25 mM roztoku chloridu vápenatého a nasadí po dobu asi 2 hodin při teplotě místnosti ke koagulaci. Po mechanickém rozdrobení sraženiny se zředí 1 objemem fyziologického roztoku NaCl a k adsorpci lipoproteinu se přidá 2 % silikátového vločkovadla (Aerosil).
Centrifugováním se získá čirá odsazená kapalina. Z této kapaliny se při 0 až 4 °C a pH 7 vysráží 1,8 M roztokem síranu amonného frakce gamaglobulinu a shromáždí centrifugováním. Dialýzou proti pufru 50 mM TRIS/0,1 M NaCl, pH 7,5 a zahuštěním ultrafiltrací se získá preparát vhodný pro enzymatické štěpení.
b) Papainové štěpení
Postupuje se jak popsáno v příkladu lb], avšak s malou obměnou pro gamaglobulinovou frakci. Použije se 1,5 % papainu na gram proteinu gamaglobulinové frakce a inkubační doba činí 20 hodin při 25 °C. Ostatní podmínky jsou stejné.
b) Papainové štěpení
c) Čištění ΡΑΒ--ΓηΚ<^
IgG se podle způsobu popsaného v Immunochem. 4, 369, (1967) inkubuje za redukččních podmínek (10 mM cystein) 1,5 % papainu (hmotn. vztaženo na množství IgG proteinu ) při pH 7,5 po dobu 5 hodin při 37° Celsia. Na konci inkubační fáze se působení enzymu zastaví přebytkem jodacetamidu a po alkylaci volných SH— skupin se inkubuje při pH 7,5 2 hodiny při teplotě místnosti. Stabilizovaná směs po štěpení obsahuje FAB-fragmenty, Fk fragmenty a 10 °/o nerozštěpeného IgG. Výtěžek imunní reaktivity činí více než 75 %.
Alkylovaná směs po štěpení se dialyzuje proti fyziologickému roztoku chloridu sodného, pak se přidá 25 mM roztok síranu zinečnatého (Immunochem. 14, 99, /1977/). Tím se vysráží zbytky nerozštěpených IgG a Fk fragmentů a oddělí centrifugováním. Zbylé FAB-hragmenty jsou po dialýze a zahuštění hotové pro použití v testu KK-MB. Výtěžek činí více než 80 % inhibiční aktivity pro isoenzym KK-MM, vztaženo na výchozí plasmu. KK-MB se inhibuje z 50 % nezávisle od inhibiční hodnoty pro nerozštěpené protilátky. Výsledky získané s různými séry podává následující tabulka.
Ί
Tabulka
Číslo zvířete °/o inhibice enzymové aktivity
KK-MM (600-1000 j./l) KK-MB (200-400 j./l)
Výchozí sérum FAB-fragmenty Výchozí sérum FAB-fragmenty (plasma)
| 1 | 99,5 | 99,5 | 62 | 52 |
| 2 | 99,6 99,3 | 99,7 | 56 | 53 |
| 3 | 99,1 | 64 | 49 | |
| 4 | 98,5 | 99,3 | 68 | 52 |
pRedmEt
Claims (7)
1. Způsob stanovení kreatinkinázy MB v séru imunologickým vyřazením podjednotky M a měřením podjednotky B, vyznačující se tím, že se к reakční násadě sestávající z protilátek proti podjednotce M přidají monovalentní fragmenty, získané proteolytickým štěpením za redukčních podmínek, čímž se vyřadí podjednotka M, načež se stanoví podjednotka В například pomocí luciferin-luciferinázové reakce.
2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se použijí monovalentní fragmenty získané z protilátek, inhibující hybrydní enzym kreatinkinázy MB alespoň z 55 % a inhibující úplně isoenzym kreatinkinázy MM.
3. Způsob podle bodu 2 vyznačující se tím, že se použijí monovalentní fragmenty protilátek inhibující hybridní enzym kreatinkinázy MB z 60 až 90 %.
VYNALEZU
4. Způsob podle bodů 1 až 3 vyznačující se tím, že se použijí monovalentní fragmenty, z nichž jsou odděleny zbývající totální protilátky s fragmenty schopné krystalizace.
5. Způsob podle bodů 1 až 4 vyznačující se tím, že se přidají monovalentní fragmenty, jejichž SH-skupiny jsou alkylovány jodacetamidem, jodacetátem nebo N-maleinimidem.
6. Způsob podle bodu 5 vyznačující se tím, že se přidají monovalentní fragmenty alkylované jodacetamidem nebo jodacetátem.
7. Způsob podle bodů 1 až 6 vyznačující se tím, že se podjednotka В stanoví pomocí luciferin-luciferinázové reakce a emitované množství světla se měří kineticky.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2908053A DE2908053C2 (de) | 1979-03-02 | 1979-03-02 | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung der Creatinkinase MB |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS226407B2 true CS226407B2 (en) | 1984-03-19 |
Family
ID=6064229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS80907A CS226407B2 (en) | 1979-03-02 | 1980-02-11 | Method of determining mb creatinkinase |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4330620A (cs) |
| EP (1) | EP0015508B1 (cs) |
| JP (1) | JPS5820274B2 (cs) |
| AR (1) | AR219440A1 (cs) |
| AT (1) | ATE263T1 (cs) |
| AU (1) | AU515930B2 (cs) |
| CA (1) | CA1160942A (cs) |
| CS (1) | CS226407B2 (cs) |
| DD (1) | DD149421A5 (cs) |
| DE (2) | DE2908053C2 (cs) |
| DK (1) | DK154459C (cs) |
| ES (1) | ES488774A1 (cs) |
| FI (1) | FI72145C (cs) |
| HU (1) | HU181684B (cs) |
| IE (1) | IE49158B1 (cs) |
| SU (1) | SU1336941A3 (cs) |
| YU (1) | YU42965B (cs) |
| ZA (1) | ZA801158B (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4614712A (en) * | 1983-02-25 | 1986-09-30 | The Upjohn Company | Immunoassays with luciferase labeled ligands or receptors |
| CA1260828A (en) * | 1983-07-04 | 1989-09-26 | Masakazu Iwai | Therapeutic and prophylactic agent for gastrointestinal ulcers |
| JPS60125565A (ja) * | 1983-12-12 | 1985-07-04 | Amano Pharmaceut Co Ltd | エノラ−ゼサブユニット量の分別定量法 |
| US4810639A (en) * | 1985-12-20 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassay for CK-MB using bound and soluble antibodies |
| JPS63131065A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-03 | Yatoron:Kk | 抗体の精製法とアイソザイムの測定法及び試薬 |
| CN110133265B (zh) * | 2019-06-10 | 2022-03-15 | 天津市宝坻区人民医院 | 血清中肌酸激酶试剂盒及测定方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2128670B2 (de) * | 1971-06-09 | 1977-06-30 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Immunologische isoenzym-bestimmungsmethode |
| US4001088A (en) * | 1974-08-02 | 1977-01-04 | Antonik Alan S | Method for the determination of creatine phosphokinase enzyme |
| DE2548962C2 (de) * | 1975-11-03 | 1985-11-21 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Antikörper gegen die Untereinheit M von Creatinkinase-Isoenzymen |
| DE2548963C3 (de) * | 1975-11-03 | 1982-03-11 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB |
| JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
| DE2828658C3 (de) * | 1978-06-29 | 1981-10-22 | Lkb-Produkter Ab, Stockholm | Verfahren zur photometrischen Bestimmung der Untereinheit B der Creatinkinase und Reagens hierfür |
-
1979
- 1979-03-02 DE DE2908053A patent/DE2908053C2/de not_active Expired
-
1980
- 1980-02-05 IE IE221/80A patent/IE49158B1/en not_active IP Right Cessation
- 1980-02-11 CS CS80907A patent/CS226407B2/cs unknown
- 1980-02-13 AU AU55496/80A patent/AU515930B2/en not_active Expired
- 1980-02-14 DK DK063680A patent/DK154459C/da not_active IP Right Cessation
- 1980-02-20 ES ES488774A patent/ES488774A1/es not_active Expired
- 1980-02-26 AR AR280091A patent/AR219440A1/es active
- 1980-02-27 CA CA000346572A patent/CA1160942A/en not_active Expired
- 1980-02-27 FI FI800577A patent/FI72145C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-02-27 DD DD80219298A patent/DD149421A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-28 DE DE8080100995T patent/DE3060050D1/de not_active Expired
- 1980-02-28 EP EP80100995A patent/EP0015508B1/de not_active Expired
- 1980-02-28 AT AT80100995T patent/ATE263T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-28 YU YU542/80A patent/YU42965B/xx unknown
- 1980-02-28 US US06/125,318 patent/US4330620A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-02-29 JP JP55024219A patent/JPS5820274B2/ja not_active Expired
- 1980-02-29 HU HU80475A patent/HU181684B/hu unknown
- 1980-02-29 SU SU802891744A patent/SU1336941A3/ru active
- 1980-02-29 ZA ZA00801158A patent/ZA801158B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD149421A5 (de) | 1981-07-08 |
| YU54280A (en) | 1984-10-31 |
| AU5549680A (en) | 1981-03-12 |
| FI72145C (fi) | 1987-04-13 |
| YU42965B (en) | 1989-02-28 |
| EP0015508A1 (de) | 1980-09-17 |
| SU1336941A3 (ru) | 1987-09-07 |
| IE800221L (en) | 1980-09-02 |
| DK154459C (da) | 1989-05-22 |
| DK63680A (da) | 1980-09-03 |
| EP0015508B1 (de) | 1981-09-30 |
| CA1160942A (en) | 1984-01-24 |
| DE3060050D1 (en) | 1981-12-10 |
| ES488774A1 (es) | 1980-09-16 |
| IE49158B1 (en) | 1985-08-07 |
| HU181684B (en) | 1983-11-28 |
| JPS55120797A (en) | 1980-09-17 |
| AR219440A1 (es) | 1980-08-15 |
| AU515930B2 (en) | 1981-05-07 |
| JPS5820274B2 (ja) | 1983-04-22 |
| US4330620A (en) | 1982-05-18 |
| DE2908053C2 (de) | 1982-08-19 |
| ZA801158B (en) | 1981-03-25 |
| FI800577A7 (fi) | 1980-09-03 |
| DK154459B (da) | 1988-11-14 |
| DE2908053A1 (de) | 1980-09-11 |
| FI72145B (fi) | 1986-12-31 |
| ATE263T1 (de) | 1981-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jockers-Wretou et al. | Quantitation of creatine kinase isoenzymes in human tissues and sera by an immunological method | |
| Cardenas et al. | Bovine Pyruvate Kinases: I. PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF THE SKELETAL MUSCLE ISOZYME | |
| Hougie et al. | Stuart clotting defect. I. Segregation of an hereditary hemorrhagic state from the heterogeneous group heretofore called “stable factor”(SPCA, proconvertin, factor VII) deficiency | |
| US4067775A (en) | Process and composition for determining the activity of creatinekinase-MB | |
| CA2088050A1 (en) | Cell necrosis detection through assays for spectrum and breakdown products thereof | |
| KR100202773B1 (ko) | 프로트롬빈 활성화 펩타이드 및 그것의 분해생성물에 대한 모노클론 항체 및 면역 분석법 | |
| Yamada et al. | Occurrence of immunoreactive 80 kDa and non-immunoreactive diacylglycerol kinases in different pig tissues | |
| Väänänen et al. | Purification and localization of human carbonic anhydrase: III. Typing of skeletal muscle fibers in paraffin embedded sections | |
| Ma et al. | Protein for Lp82 calpain is expressed and enzymatically active in young rat lens | |
| Holmberg et al. | Immunologic studies in haemophilia A | |
| DK163688B (da) | Immunokemisk enzymbestemmelse af creatinkinase mb | |
| JPH08506181A (ja) | 新規抗凝固性補助因子活性 | |
| CS226407B2 (en) | Method of determining mb creatinkinase | |
| DK150719B (da) | Fremgangsmaade og reagens til prothrombinbestemmelse | |
| CN111707837A (zh) | 狼疮抗凝物确认试剂盒（凝固法） | |
| US4139415A (en) | In vitro method of determining the biological activity of factor Xa inhibitor in blood | |
| EP0360871B1 (en) | Method for measuring biological activity of antithrombin iii and reagents for the measurement | |
| Hänsch et al. | Effect of aspirin on the complement system in vitro | |
| EP0877939B1 (en) | Methods for the detection of alzheimer's disease | |
| US5221614A (en) | Method and reagent for determining the biological activity of antithrombin III by measuring coagulation time | |
| Fukiage et al. | Calpain-induced light scattering by crystallins from three rodent species | |
| Arocha-Pinango | A comparison of the TRCII and latex-particle tests for the titration of FR-antigen | |
| Kaiser et al. | Intrathecal synthesis of IgM and IgA in neurological diseases: comparison of two formulae with isoelectric focusing | |
| Lin et al. | An enzyme-linked immunoassay for circulating immune complexes using solid phased goat C1q | |
| JP2508915B2 (ja) | 抗ＳＳＡ／ＲｏおよびＳＳＢ／Ｌａ抗体測定用抗原、その製造法ならびに抗ＳＳＡ／ＲｏおよびＳＳＢ／Ｌａ抗体の測定法 |