SU1698782A1

SU1698782A1 - Способ изготовлени сибире звенного эритроцитарного диагностикума

Info

Publication number: SU1698782A1
Application number: SU894732378A
Authority: SU
Inventors: Игорь Алексеевич Бакулов; Виталий Михайлович Котляров; Людмила Федоровна Николайчук
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии
Priority date: 1989-07-11
Filing date: 1989-07-11
Publication date: 1991-12-15

Abstract

Изобретение относитс к микробиологии , а именно к способу изготовлени сибире звенного эритроцитарного диагности- кума, и может быть использовано дл диагностики сибирской звы и дифференциальной диагностики животных, инфицированных Bacillus anthracis. от инфицированных Изобретение относитс к микробиологии , а именно к способу изготовлени сибире звенного эритроцитарного диагности- кума, и может быть использовано дл диагностики сибирской звы и дифференциальной диагностики животных, инфицированных Bacillus anthracis, от инфицированных микроорганизмами сходной антигенной структуры. Цель изобретени - повышение активности , специфичности, стабильности целемикроорганизмами сходной антигенной структуры. Цель изобретени - повышение активности, специфичности, стабильности целевого продукта и упрощение способа его изготовлени . Дл сенсибилизации эритроцитов используют сибире звенный антиген, выделенный из клеток В.anthracis, в исходной концентрации 100±5 млрд/мл путем дезинтеграции их ультразвуком в течение 15-20 мин при амплитуде ультразвуковых колебаний 16-20 мкм. При этом концентрацию белка в антигене довод т до 1 ±0,05 мг в 1 мл. Стерилизацию антигена осуществл ют путем мембранной фильтрации через фильтры МФА-МА № 4-5 типа Владипор. Лиофилизацию диагностикума осуществл ют с использованием стабилизатора, содержащего 5±0,5% сахарозы, 3±0,2% пептона, 0,5±0,1% бычьего сывороточного альбумина , 0,25±0,05% борной кислоты, кали фосфорнокислого однозамещенного 1,5-4,0 г/л, натри фосфорнокислого двузамещенного 15,5-20 г/л. Способ обеспечивает высокую чувствительность, специфичность диагностикума и стабильность при хранении. 1 табл. вого продукта и упрощение способа его изготовлени , П р и м е р 1. Изготовление сибире звенного диагностикума. Из отмытых эритроцитов барана готов т 12,5%-ную взвесь на физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) и смешивают с равным объемом 5%-ного раствора формалина. Смесь выдерживают 18-20 ч при 37±1&deg;С, затем трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугировани при (Л С Os чэ 00 vj 00 ю

Description

t500 об/мин в течение 10 мин. Из осадка готов т 2,5%-ную взвесь и формалинизиро- ванные эритроциты провер ют на отсутствие спонтанной агглютинации.

Затем к 2,5%-ной суспензии формали- низированных эритроцитов добавл ют равный объем танина в разведени 1:10000, смесь выдерживают в вод ной бане при 37°С 30 мин, Затем трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифуги- ровани при 1 500 об/мин в течение 10 мин. Танизированные эритроциты провер ют на отсутствие самоагглютинации.

Дл приготовлени антигена 16-18-часовую культуру шт. СТИ, выращенную на м сопептонном агаре, трижды отмывают от остатков питательной среды стерильным физиологическим раствором при центрифугировании в течение 20 мин при 5000 об/мин, из отмытой культуры готов т взвесь в концентрации 100 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК.

Суспензию бактерий помещают в стерильный стакан ультразвукового дезинтег- ратора микроорганизмов, подвергают воздействию ультразвука в течение 15-20 мин при амплитуде колебаний 16-20 мкм.

Дезинтеграт микробых клеток, содержащий комплекс термолабильных и термо- стабильных антигенов Вас. anthracfs, сливают в колбу и стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтры Вла- дипор дл освобождени антигена от единичных неразрушенных бактерий.

Дл сенсибилизации эритроцитов амти- ген развод т 0,15 М фосфатным буфером,рН 6,4, до концентрации 1 ±0,05 мг белка в 1 мл.

Дл изготовлени диагностикума два объема разведенного до нужной концентра- ции антигена смешивают с водным объемом 2,5%-ной суспензии танизированных фор- малинизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в вод ной бане при 37±1°С, периодически встр хива . Затем сенсиби- лизированные эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугировани при 1500 об/мин в течение 10 мин. После последнего центрифугировани диагностикум подготавливают дл лиофилизации.

Дл этого из осадка готов т 2,5%-ную суспензию эритроцитов на стабилизаторе.

В качестве стабилизатора используют раствор, содержащий 5±0,5% сахарозы, 3±0,2% пептона, 0,5±0,1 % бычьего сывороточного альбумина, 0,25±0,05% борной кислоты, кали фосфорнокислого однозаме- щенного 1,5±4 г/л, натри фосфорнокислого двузамещенного 15,5-20 г/л (рН стабилизатора 7,2 ±0,2).

Применение в качестве стабилизаторов других веществ (декстрана, галактозы, желатины , сыворотки и т.д.) не обеспечивало стабильности диагностикума.

Перед лиофилизацией диагностикум суспендируют в среде высушивани (стабилизаторе ), разливают в пенициллиновые флаконы или ампулы, замораживают при - (50-60)°С в течение 6-18 ч. После этого материал перенос т в сушильный аппарат. Сушку провод т при остаточном давлении 80-90 мкм. При загрузке температура полок должна быть не выше -20°С, температура конденсатора -40°С и ниже. В течение 14-16 ч температуру постепенно повышают до 20-25°С. Когда температура материала и полок становитс одинаковой, сушку продолжают еще 4-6 ч, после этого ампулы отпаивают , а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Лиофилизаци препарата обеспечивает стабильность его при хранении . Сухой диагностикум сохран ет первоначальную активность в течение 2 лет.

Пример 2. Изготовление сибире звенного диагностикума.

Формалинизированкые танизирован- ные эритроциты барана сенсибилизируют сибире звенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт. СТИ, выращенной на м сопептонном агаре. Из этой культуры готов т взвесь бактерий в концентрации 95 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 15 мин при амплитуде колебаний 16 мкм. Дезинтеграт микробных клеток стерилизуют лу-. тем мембранной фильтрации через фильтр № 4 МФА-МА типа Владипор. Дл сенсибилизации эритроцитов антиген развод т 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 0,95 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5%-ной суспензии формалинизированкых танизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в вод ной бане при 37°С, периодически встр хива . Затем диагностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугировани при 1500 об/мин в течение 10 мин.

Более низкие концентрации культуры (90 млрд/мл и меньше) не обеспечивают получени активного антигена. При снижении амплитуды ультразвуковых колебаний до 15 мкм и менее активность сибире звенного антигена уменьшалась независимо от времени воздействи ультразвука. При

уменьшении времени обработки бактерий ультразвуком до 10 мин отмечали снижение активности антигена. Использование фильтров с меньшим размером пор (№ 2-3) замедл ет процесс фильтрации и приводит к снижению активности антигена, Более низкие концентрации белка не обеспечивают изготовлени активного диагностикума, поэтому при исследовании положительных проб сыворотки возможно получение отрицательных результатов.

Пример 3. Дл изготовлени диэг- ностикума формалинизироеэнные танизи- рованные эритроциты барана сенсибилизируют сибире звенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт. СТИ, выращенной на м сопептонном агаре. Из этой культуры готов т взвесь бактерий в концентрации 1000 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 17 мин при амплитуде колебаний 18 мкм. Дезинтегратор микробных клеток стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтр № 5 МФА-МА типа Влади- . Дл сенсибилизации эритроцитов антиген развод т 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 1 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5%-ной суспензии формалини- зированных танизированных эритроцитов. Смесь выдерживают 2 ч в вод ной бане при 38°С, периоидчески встр хива . Затем ди- агностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугировани при 1500 об/мин в течение 10 мин.

Пример 4. Дл изготовлени диагностикума формалинизированные танизи- рованные эритроциты барана сенсибилизируют сибире звенным антигеном, приготовленным из 16-18-часовой культуры шт. СТИ, выращенной на м сопептонном агаре. Из этой культуры готов т взвесь бактерий в концентрации 105 млрд. микробных клеток в, 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК и дезинтегрируют ультразвуком в течение 20 мин при амплитуде колебаний 20 мкм. Дезинтеграт микробных клеток стерилизуют путем мембранной фильтрации через фильтр № 4 МФА-МА типа Влади- пор. Дл сенсибилизации эритроцитов антиген развод т 0,15 М фосфатным буфером, рН 6,4, до концентрации 1,05 мг белка в 1 мл. Затем два объема разведенного до нужной концентрации антигена смешивают с одним объемом 2,5%-ной суспензии форма- линизированных танизированных эритроцитов . Смесь выдерживают в вод ной бане при 37°С, периодически встр хива . Затем

диагностикум трижды отмывают физиологическим раствором путем центрифугировани при 1500 об/мин в течение 10 мин. При более высоких концентраци х (110

5 млрд/мл и больше) повышение активности сибире звенного антигена не отмечают. Повышение амплитуды колебаний до 22 мкм и более не приводит к увеличению активности антигена. Увеличение времени дезинтегра0 ции клеток до 25 мин и более не приводит к дальнейшему повышению специфической активности.

Использование мембранных фильтров с большим размером пор (Kfe 6-8) не обеспечи5 вает стерилизации материала. Увеличение концентрации антигена нецелесообразно, так как это не приводит к повышению активности диагностикума, но увеличивает расход биологических компонентов. Кроме

0 того, при более высокой концентрации антигена снижаетс специфичность реакции в результате самоагглютинации сенсибилизированных антигеном эритроцитов.

Пример 5. Диагностикум, приготов5 ленный согласно примерам 2, 3 и 4, лиофи- лизируют.

Дл лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивани

-стабилизаторе. В качестве стабилизатора 0 используют раствор, содержащий 4,5% сахарозы , 2,8% пептона, 0,4% бычьего сывороточного альбумина, 0,20% борной кислоты, 1,5 г/л фосфорнокислого одноза- мещенного кали , 15,5 г/л фосфорнокис5 лого двузамещенного натри , рН стабилизатора 7,0. Лиофилизаци диагностикума в данном стабилизаторе обеспечивает стабильность его при хранении.

Примере. Диагностикум, приготов- 0 ленный согласно примерам 2. 3 и 4, лиофи- лизируют.

-стабилизаторе. В качестве стабилизатора 5 используют раствор, содержащий 5% сахарозы . 3% пептона, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,25% борной кислоты, 3 г/л фосфорнокислого од незамещенного кали , 18 г/л фосфорнокислого двузамещен0 ного натри , рН стабилизатора 7,2. Диагностикум, лиофилизированный в указанном стабилизаторе, сохран ет активность и специфичность в течение 2 лет. Пример 7. Диагностикум, приготов5 ленный согласно примерам 2, 3 и 4, лиофи- лизируют.

Дл лиофилизации диагностикум суспендируют в защитной среде высушивают, содержащей 5,5% сахарозы, 3,2% пептона, 0,6% бычьего сывороточного альбумина,

0,30% борной кислоты, 4 г/л фосфорнокислого однозамещенного кали , 20 г/л фосфорнокислого двузамещенного натри , рН стабилизатора 7,4. При использовании данного стабилизатора диагностикам сохран ет активность и специфичность.

Приготовленный согласно примерам 1- 4 и лиофилизированный с предложенным стабилизатором диагностикум вл етс активным специфичным.

Результаты изучени активности и специфичности разработанного сибире звенного диагностикума в сравнении с прототипом представлены в таблице.

Из таблицы видно, что активность предлагаемого диагностикума выше активности известного. Кроме того, предлагаемый диагностикум не взаимодействует с сыворотками здоровых (нормальных) животных и гиперим- мунизированных родственными микроорганизмами B.cereus № 96 и B.anthracoldes № 1312, тогда как известный диагностикум дает положительные реакции как с сыворотками вакцинированных, так и здоровых овец, а так- же с гипериммунными сыворотками к B.cereus № 96 и B.anthracoides № 1312.

Таким образом, предлагаемый диагностикум обладает более высокой активностью и специфичностью по сравнению с прототипом.

0

5

0 5

0

Claims

Формула изобретени Способ изготовлени сибире звенного эритроцитарного диагностикума, включающий получение суспензии микробных клеток , выделение антигена, танизацию и сенсибилизацию антигеном эритроцитов барана, отличающийс тем, что, с целью повышени активности, специфичности и стабильности целевого продукта, суспензию получают с концентрацией 95-105 млрд.микроб.кл в 1 мл, выделение антигена провод т путем обработки ультразвуком в течение 15-20 мин при амплитуде ультразвуковых колебаний 16-20 мкм, перед сенсибилизацией антиген подвергают стерилизующей фильтрации и развод т до концентрации 0.95-1,05 мг/мл, а сенсибилизированные эритроциты смешивают со стабилизатором , содержащим следующие компоненты , об.%:

Сахароза4,5-5,5

Пептон2,8-3,2

Бычий сывороточный альбумин0,4-0,6

Борна кислота0,2-0,3

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Натрий фосфорнокислый двузамещенный РН и лиофилизируют.

0,15-0,40

1,55-2,0 7,0-7,4