JPH03218465A - 梅毒診断試薬の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原抗体反応を利用した梅毒診断試薬の製造方
法に関する。さらに詳しくは、本発明はトレポネーマ・
パリダム（↑ｒｅｐｏｎｅｍａ　Ｐａｌｌｉｄｕｍ　，
以下ＴＰと略す）菌体成分由来の抗原を多量にかつ安定
性よく、担体に固定化し得、感度が高く特異性の良い梅
毒診断試薬の製造方法に関する．〔従来の技術〕 従来、担体を用いた免疫診断試薬においては、該担体に
、例えば抗原性物質や各種抗体を固定化する場合には、
物理吸着による方法が多く用いられてきた。すなわち、
ラテックス、プラスチックプレートなどの疎水性材料、
タンニン酸処理した赤血球などに、緩衝溶液、生理食塩
水または精製水などの水性媒体中で、直接、抗原や抗体
を接触させることにより固定化させていた．または、担
体表面にアミノ基、カルボキシル基などを導入し、抗原
や抗体を共有結合により、表面に固定化させていた。

梅毒診断試薬の場合、担体に固定化しようとするトレポ
ネーマ・パリダム菌体成分由来の抗原（以下、ＴＰ抗原
と略す）を、菌体から抽出するためや安定化させるため
に界面活性剤を用いる場合がある。界面活性剤を含有す
るＴＰ抗原液中のＴＰ抗原を担体に固定化する場合、従
来の物理吸着による固定化方法では、その固定化に疎水
性相互作用を利用しているために、界面活性剤のように
疎水性相互作用を弱める物質が存在すると該抗原を固定
化しにくいという問題点があった。

また、共有結合により固定化する方法も提案されている
が（特開昭５９−１４６５８９、特開昭６１−７４７０
）、反応の制御が難しく、担体の単位面積当りの固定化
量が制御しにくいという問題点があった。また、場合に
よっては、共有結合で固定化した場合、固定化した物質
の活性が著しく失われるなどの問題点があった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、上記従来の問題点を解決するものであり、そ
の目的とするところは、ＴＰ抗原を多量にかつ安定性艮
く担体に固定化し得、感度が高く特異性の良い梅毒診断
試薬の製造方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段および作用〕本発明の梅毒
診断試薬の製造方法は、ＴＰ抗原を担体に担持させたも
のと、抗ＴＰ抗体との抗原抗体反応を測定することによ
り、抗ＴＰ抗体を検出し、梅毒診断を行う診断試薬にお
いて、ＴＰ抗原を担体に担持させるに際し、界面活性剤
を０．０１〜２．５重量％含有し、かつｐｔｉが４．５
〜７．７である水性媒体中で行うことを特徴とするもの
であり、そのことにより上記目的が達成させる．本発明
に使用される界面活性剤としては、ＴＰ菌体の表面抗原
、膜タンパクなどの抽出や安定化のために用いられ、（
１）目的の成分を抽出および可溶化できるもの（２）抽
出能力の特異性が高いもの（３）ｐ　Ｈ　４．　５〜７
．７において析出などせずに安定して存在するものであ
れば、特に制限は受けない。例えば、オクチルグルコビ
ラノシド（１−０−ｎ−オクチルーβ−Ｄ−グルコビラ
ノシド）、トリトンＸ−１００、ツイーン２０，ツイー
ン８０，オクチルチオグルコシドなどの非イオン性界面
活性剤や、ＣＩＡＰＳ　　（３−（　（３−コラミドプ
口ピル）ジメチルアンモニオ〕−１−ブロバンスルホネ
ート：　３　−　（　　（３　−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐ
ｒｏｐｙｌ　）　ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ）
　−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）などの両
面活性剤が好適に用いられるが、ドデシルアミンのよう
な陽イオン性の界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウムの
ような陰イオン性の界面活性剤も用いられる。

ＴＰ抗原を抗体に担持させる際に、水性媒体中の界面活
性剤の有効な濃度は０．０１〜２．５重量％、好ましく
は０．０２〜２．　１　０重量％である。含有される界
面活性剤の濃度が、高すぎるとＴＰ抗原は、担体に担持
されなくなり、また低すぎると、担持されたとしても活
性が失われる可能性がある。

ＴＰ抗原を担体に担持させるに際して使用する水性媒体
としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液など、一般の生
化学実験に用いられるところの緩衝液が好ましい．イオ
ン強度は添加する塩類によって調節する．有効なｐＨは
、４．５〜７．７好ましくは４．９〜７．　ｌ、特に好
ましくは５．４〜６．５である．ｐＨが４．５未満にな
ると抗原性が失なわれ易く、ｐ　Ｈ　７．　７を越える
と固定化量が少なくなる．また、得られた診断試薬の保
存安定性を増すために、必要に応じて防腐剤を添加する
こともできる．本発明に用いられる担体としては、疎水
性の表面を有する、あるいは部分的に疎水性の表面を有
する不活性担体がいずれも利用されうる。例えば、ラテ
ックス、プラスチックビーズ、プラスチックプレートな
どの合成高分子化合物でなる材料；シリ力などの無機材
料；タンニン酸処理した赤血球；およびニトロセルロー
スなどの高分子膜などが挙げられる．特に、工業的に安
定した品質で大量生産しうるラテックス；またはプラス
チックビーズ、プラスチックプレートなどのプラスチッ
ク成形品が好適に使用される。

また、検査の全自動化処理による検査時間の短縮・省力
化が可能なことなどから、特に好適なのがラテックスで
ある。使用しうるラテックスとしては、ボリスチレン系
、合成ゴム系など特に限定されないが、好ましくはボリ
スチレン系のものがよい。平均粒径は０．０５μ一から
１．０μ一のものがよい。特に好ましくは、０．１μ一
から０．５μ翔のものがよい。

本発明の方法は、特に放射免疫測定法（Ｒ　Ｉ　Ａ）、
蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡま
たはＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝集法、ＴＰＨＡ法　（
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　　Ｐａｌｌｉｄｕｓ　　｝ｌｅ＋
ｓｍａｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ）などの
方法の抗ＴＰ抗体検出用診断試薬の製造に好適に利用さ
れる。

本発明によりこのような梅毒診断試薬を製造する場合に
、測定系の特異性を高めたり、測定感度を上げたりする
ために、場合によっては塩化コリン、ＥＤＴＡ，Ｉｉ類
（多ＩＪ！類、デキストランなど）又はポリエチレング
リコールのような親水性合成高分子などを反応系に添加
することもできる。

本発明の梅毒診断試薬の製造方法は、例えば、以下のよ
うに行われる。まず、ＴＰ菌を家兎こう丸などで培養し
たものから、菌体を採取、洗浄後、界面活性剤を添加し
、インキユベートすることにより菌体破壊とＴＰ抗原の
抽出を行なう。このものを遠心分離し上清を採取し、こ
れを界面活性剤含有緩衝液で希釈し梅毒抗原液とする。

この抗原液を所定の界面活性剤濃度およびｐＨに調整し
て抗原感作液とする．この抗原感作液と担体とを、界面
活性剤濃度の０．０１〜２．５重景％かつｐＨが４．５
〜７．７の水性媒体中で接触させ、所定時間イ．ンキュ
ベー卜することにより、ＴＰ抗原を担体に固定する。こ
のようにし′ζＴＰ抗原が固定化された担体を使用し、
常法により、例えば酵素免疫測定法、ラテックス凝集法
、ＴＰＨＡ法などによる梅毒診断試薬を製造する。

また、ＴＰ抗原を担体に固定する方法は、上記の他に、
例えば担体を界面活性剤や緩衝液等で予め希釈した担体
懸濁液を用意し、これに適当な界面活性剤濃度の抗原感
作液を加えて、所定の界面活性剤濃度およびｐＨ下の水
性媒体中で固定化する方法、或いは担体と希釈度の低い
抗原感作液を混合した後、界面活性剤や緩衝液等からな
る希釈液を加えて、所定の界面活性剤濃度およびｐＨ下
の水性媒体中で固定化する方法等、種々の態様をとり得
る。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

夫施■土 （ＥＬＩＳＡによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬）ＥＬＩ
ＳＡによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬の製造に本発明を
適用した．本実施例においては、次に挙げる試薬および
測定用検体を使用した。後述の実施例２〜１３および比
較例１−１３においても、特に指示しない限り、同名の
試薬および検体については、同様のものを使用した。

ＰＢＳ　　（リン酸緩衝液）：リン酸ｌナトリウム（２
水和物）、リン酸２ナトリウム（２水和物）、塩化ナト
リウムおよびアジ化ナトリウム（Ｎ　ａ　Ｎ　３＞を精
製水に溶解し、リン酸、塩化ナトリウムおよびＮａＮ，
の終濃度がそれぞれ０．０２Ｍ，０．１２７Ｍおよび０
．　１％（Ｗ／Ｗ）　、ｐ　Ｈが７．４０となるように
調製した。

ＮａＣＩ−ＰＢＳ：リン酸ｌナトリウム（２水和物）、
リン酸２ナトリウム（２水和物）および塩化ナトリウム
を精製水に溶解し、リン酸および塩化ナトリウムの終濃
度がそれぞれ０．　０　２　Ｍおよび１．００Ｍ％ｐＨ
が６．５０となるように調製した．１％ＢＳＡ−　ＰＢ
Ｓ　：　ＰＢＳに試薬特級ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン
）を１％（Ｗ／Ｗ）　となるように溶解させて調製した
。

１０ｍＭ　　ＫＰＢ：リン酸ｌカリウム（無水）、リン
酸２カリウム（無水）を精製水に溶解し、ｌＯｍＭ　　
ＫＰＢ　　（ｐＨ６．ｏｏ，７．００、７．５０、８．
００の４種類）を調製した。

オクチルグルコピラノシド（１−０−ｎ−オクチルーβ
−Ｄ−グルコピラノシド（以下ＯＧと略す）：難溶性タ
ンパク質研究用〔ナカライテスク■〕を用いた。

１％ＯＧ　：ＯＧを１０ｍＭ　　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０
０）に１％（Ｗ／Ｗ）になるように溶解したもの．クエ
ン酸緩衝液：クエン酸、クエン酸ナトリウム（２水和物
）を精製水に加えて、０．　１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４．ｏＯ、５．００，６．００の３種類）を調製した
。

ＮａＮ，：東京化成■より購入したものを用いた。

梅毒抗原液：家兎こう丸中で１（１１４日間培養したト
レポネーマ・パリダム（　Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　　Ｐａ
１１ｉｄｕｓ　；　Ｃ　Ｄ　Ｃ　（　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆ
ｏｒ旧ｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ．ｐｕｂｌｉｃ　Ｈ
ｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　，　Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒ
ｔａ＋ｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　　＊　　Ｅｄｕｃ
ａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ　　＋　　Ａｔｌ
ａｎｔａ　　．Ｇｅｏｒｇｉａ）より入手されたものを
家兎こう丸に接種し、継代培養したものを用いた］を生
理食塩水中に１０９個菌体／ｄとなるように懸濁した菌
体懸濁液ｌＩｄを採り、リン酸緩衝液中で遠心分ＡＭＣ
６．０００ｒｐｍＸ５分、３回）することにより洗浄し
た．次いで、得られた沈澱にｌ％ＯＧをＩＩｄ添加し、
３７゜Ｃにて３０分間インキユベートした。その後、こ
れを超遠心機にかけて（５０．０００ｒｐｍＸ１時間）
上清を採取したものをｌ％ＯＧでｌＯＯ倍希釈したもの
を梅毒抗原液とした。

梅毒陽性家兎血清：こう丸にトレポネーマ・パリダムを
接種後、４５日間飼育した家兎から血清を採取した．市
販のＴＰＨＡキット〔セロディアＴＰ　　（冨士レビオ
）及びセロクリットＴＰ　　（化血研）〕を用いてタイ
ター（力価）を測定したところ、いずれのキットにおい
ても１０，０００タイターを示した。この血清を１％Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳで１００、２００、４００倍に希釈して使
用した。

正常家兎血清：トレポネーマ・パリダムが接種されてい
ない家兎から採取した血清を用いた。市販ＴＰＨＡキッ
トによりタイターを測定したところ、陰性であった．こ
の血清をｌ％ＢＳＡ−ＰＢＳで１００、２００、４００
倍に希釈して用いた．ベルオキシダーゼ標識抗ウサギＩ
ｇＧ：マイルズ・ラボラトリーズ社のベルオキシダーゼ
標識抗ウサギＩｇＧを１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　（ただし、
ＮａＮ．は含まない）で１，０００倍に希釈して用いた
。

マイクロタイタープレート；ヌンク社の９６穴マイクロ
タイタープレート　（平底）を用いた。

リン酸一クエン酸緩衝液：精製水に熔解させた０．２Ｍ
リン酸２ナトリウムと０．　１　Ｍクエン酸を混合し、
ｐ　Ｈ　５．　５　０±０．０１になるように調製した
。

ベルオキシダーゼ基質：リン酸一クエン酸緩衝液に０−
フエニレンジアミン（２塩酸塩）　ヲ２　ｍｇ／ｄ、そ
して過酸化水素水０．　０　３％（Ｈ．ＯＺ）となるよ
うに加えた。

基質の調製は使用直前に行った。

ＩＮ硫酸：市販されている硫酸のＩＮ規定液をそのまま
用いた。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液を１％ＯＧで５０倍希釈したもの（Ａ液とす
る）、ＮａＣ１−ＰＢＳ　　　１０ｍＭＫＰＢまたはク
エン酸緩衝液およびｌ％ＯＧを各々第１表に示した量で
混合したものを抗原感作液（１）〜０ωとした。

（以下余白） 第１表ｆｌｅｄ市禎 イ》梅毒抗原液を０．１２５％ＯＧで５０倍希釈したも
の（ＡＩｍを用いた．口）梅毒抗原液を５％ＯＧで５０
倍希釈したもの（ＡＪ）を用いた．ハ）梅毒抗顎液を０
．０２５％ＯＧで５０倍希釈したもの（ＡＪ）を用いた
．二）ＯＧを５％含む１０ｍＭＫＰＢを用いた．ホ）Ｏ
Ｇを３％含むｌＯｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ　６．００）を
用いた，（Ｂ）抗原の固定化 （１）〜側の各抗原感作液を、マイクロタイタープレー
トの各ウェルに５０μ２ずつ分注し室温で１時間インキ
ユベートした。１時間後、抗原感作液を吸引除去し、次
いで１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００μｌで１回洗浄した後、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００μ！を加えて室温で１時間イ
ンキユベートし、プロッキングを行った。その後、１％
ＢＳＡ−ＰＢＳを吸引除去し、０．９％ＮａＣｌ水溶液
２００μ℃で３回洗浄を行った。

（Ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 第１抗体として、前述の１００、２００、４００倍に希
釈した梅毒陽性家兎血清を各ウエルに５０μｉずつ分注
し、室温で１時間インキユベートした。対照として、正
常家兎血清を同様に希釈したものを各ウエルに分注・イ
ンキユベートした。

１時間後、反応液を吸引除去し、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ２
００μ２で３回洗浄したのち、第２抗体としてベルオキ
シダーゼ標識抗ウサギＩｇＧを各ウエルに５０μ２ずつ
分注した。室温で１時間イソキュベートしたのち反応液
を吸引除去し１％ＢＳＡ−ＰＢＳ　　（ただし、ＮａＮ
．は含まない）２００μｌで３回洗浄した。洗浄後直ち
に各ウェルに結合した酵素活性を測定した。

各ウェルに１００μ２ずつベルオキシダーゼ基質を分注
し、室温で１５分間インキヱベートした。

基質ブランクとして、第１抗体および第２抗体のいずれ
も添加していないウエルを用意し、同様に基質液を添加
してインキエベートした。インキュベート後、ＩＮ硫酸
を１００μβ分注し、酵素反応を停止させた。各ウェル
の酵素反応時間が一定となるように操作を行った。

反応停止後、マイクロタイタープレートリーダー　（Ｍ
ＴＰ−１　０　０、コロナ社）により、基質ブランクを
対照として４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果を
第２表に示す（ｎ−４の平均値）。

（　以下余白　） また、梅毒陽性家兎血清について、この結果を第１図（
ａ）（ＫＰＢ緩衝液使用，ＯＧ濃度と吸光度）、第１図
（ｂ）（クエン酸緩衝液使用．ＯＧ濃度と吸光度）、第
１図（ｃ）（ｐＨと吸光度）に示す。図において縦軸は
吸光度、横軸は陽性血清の希釈倍率を示す。

ル較貫土 抗原感作液（１）〜０■のかわりに、第１表に示した抗
原感作液０４）〜側を使用したこと以外は、実施例１と
同様の操作を繰り返した。結果を実施例１の結果と共に
第２表に示す． また、梅毒陽性家兎血清についての結果を第１図（ａ）
、第１図（ｂ）、第１図（Ｃ）に示す。

第２表および第１図の結果から明らかなように、ＴＰ抗
原を担体に担持させるに際し、ＯＧ濃度０．０２５、０
．５０、１．００、２．００重量％、かつｐ１１　５．
　０　０、６．００、７．００、７．５０の水性媒体中
で行ったものは、ＴＰ抗原を多量にかつ安定性よく担体
に固定化し得、感度が高く特異性の良い梅毒診断試薬が
得られた。一方、ＯＧ濃度が０．　０　Ｏ　５重量％も
しくは４．００重量％又はｐＨが４．００もしくは８．
００の水性媒体中で行ったものは、ＴＰ抗原を多量にか
つ安定性良く担体に固定化することが出来ず、感度が低
く、また正常家兎血清を検体とした場合にも非特異反応
によりかなりの吸光度が見られ、良好な梅毒診断試薬を
得ることが出来なかった。

夫隻貰Ｉ （ラテックス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用診断試薬一
全自動分析装置を用いた測定−）全自動分析装置を用い
る、ラテックス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用試薬の製
造に本発明を適用した。

ラテックス二粒径０．　４　０　０μｈのポリスチレン
ラテックス〔固型分１０％、積水化学工業■製〕を用い
た。

１００ｍＭ　　ＮａＰＢ：リン酸ｌ水素ナトリウム（無
水）、リン酸２水素ナトリウム（１２水和物）およびＮ
ａＮ．を精製水に加えて、０．１％（Ｗ／Ｗ）ＮａＮ，
を含有する１００ｍＭ　　ＮａＰＢ（ｐＨ７．５０）を
調製した。

ｌ％ＢＳＡ−ＮａＰＢ：１００ｍＭ　　ＮａＰＢにＢＳ
Ａが１％（Ｗ／Ｗ）になるように調製したもの。

５％ＢＳＡ−ＮａＰＢ：１００ｍＭ　　ＮａＰＢにＢＳ
Ａが５％になるように調製したもの。

０．２５％ＰＥＧ５０万；５％ＢＳＡ−ＮａＰＢにポリ
エチレングリコール（平均分子量５００，０００　：和
光純薬社）を０．２５％（重量／重量）となるように溶
解させたもの。

装置：日立７０５０型　全自動分析装置を用いて測定を
行った。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液を１％ＯＧで２５倍希釈したもの（Ｂ液とす
る．）　、Ｎａ　Ｃ　１−ＰＢＳ，１　０ｍＭＫＰＢま
たはクエン酸緩衝液、１％ＯＧを各々第３表に示した量
で混合したものを抗原感作液（１）〜θ■とした。

（　以下余白　） ｍ３表抗原樹擁 イ）梅毒抗原液を０．２５％ＯＧで２５倍希釈したもの
（Ｂ，（支）を用いた．口）梅毒抗原液を５％ＯＧで２
５倍希釈したもの（Ｂ．（転）を用いた．ハ）ＯＧを２
．５％含むｌｏｍＭＫＰＢを用いた．二）ＯＧを８．７
５％含む１０ｍＭ　ＫＰＢを用いた−ホ）ＯＧを３％含
むｌｏｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ　６．００）を用い九勺梅
毒抗原液を０．０５％ＯＧで２５倍希釈したもの（Ｂ．
（転）を用いた．（Ｂ）抗原の固定化 ラテンクスｌ００μｉを４゜Ｃのインキュヘーター中で
マグネチンクスクーラーで撹拌しながら、各抗原惑作液
（１）〜（１３）４００μｌを素早く添加し、４゜Ｃに
て１時間撹拌した。その後、Ｉ％ＢＳＡ・Ｐ　Ｂ　Ｓ　
５　ｎｉｌを添加し、４゜Ｃにて続けて１．５時間撹拌
した。その後、１５，ＯＯＯｒｐｍにて１時間遠心分離
した。得られた沈澱にさらにｌ％ＢＳＡＮａＰＢ５ｒｄ
を添加し、同様に遠心分離することにより沈澱を洗浄し
た。この沈澱にｌ％ＢＳＡＮａＰＢ５ｍＲを添加し、よ
く分散させて固形分０．　２％のラテンクス試薬とした
。このようにして調製したラテックス試薬は４゜Ｃにて
保存した。

（Ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 測定条件は次のとおりである。

検体容量　　　　　　　　　　　　　２０μｌラテック
ス試薬（Ｒ２）　　　　　　　　　５０μｉ希釈液（Ｒ
ｌ　：　０．２５％ＰＥＧ　５０万を使用）３５０μ！
測定波長　　　　　　　　　　　　　　５７０ｎｍ測定
温度　　　　　　　　　　　　　　３７゜Ｃ測定開始後
、８０秒と３２０秒後の吸光度の差（ΔＯ　Ｄ　ｓ　ｔ
。）を測定し、この吸光度の変化量を１０’倍したもの
を第４表に示した（ｎ−４の平均値）。

なお、検体としては、前述の１００倍、２００倍、４０
０倍希釈したーｌｌ陽性家兎血清を用いた．対照として
正常家兎血清を同様に希釈したものを用いた。

（　以下余白　） また梅毒陽性家兎血清についてこの結果をグラフに表し
たのが第２図（ａ）（ＫＰＢ緩衝液使用。ＯＧ濃度と吸
光度）、第２図（ｂ）　（クエン酸緩衝液使用。ＯＧｆ
Ａ度と吸光度）、第２図（ｃ）（ｐＨと吸光度）である
．横軸は陽性血清の希釈倍率を示す。

また縦軸はΔＯＤ，７。を示す。

ル較貫Ｉ 実施例２の抗原感作液（１）〜（１３１の代わりに、第
３表に示した抗原感作液Ｑ４）〜０９）を使用したこと
以外は、実施例２と同様の操作を繰り返した。結果を実
施例２の結果と共に第４表に示す。

また、梅毒陽性家兎血清についての結果を、第２図（ａ
）、第２図（ｂ）、第２図（ｃ）　ニ示ｔ。

第４表および第２図の結果から明らかなように、本発明
によるラテックス試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安定
性良く担体に固定化され、従来の方法では凝集が見られ
なかった高希釈倍率の陽性血清においても、陽性と判定
しうる感度が得られた。

正常血清については、比較例で見られていた非特異反応
による凝集が解消されるなど、本ラテックス試薬は、特
異性が高く、怒度の良いものであるという結果が得られ
た。

夫旌貫ｌ （ラテックス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用診断試薬一
凝集観察板によるマニュアル法を用いた測定−） マニュアル法による、ラテックス凝集法による抗ＴＰ抗
体検出用試薬の製造に本発明を適用した。

０．５０％ＰＥＧ５０万：５％ＢＳＡ−ＮａＰＢにポリ
エチレングリコール（平均分子量５００，０００　：和
光純薬社）を０．５０％（重量／重量）となるように？
容解させたもの。

（Ａ）抗原感作液の調製 実施例２と同様に行った。

（Ｂ）抗原の固定化 感作後のラテックスを５　ｍｌのｌ％ＢＳＡ−ＮａＰＢ
に分散させ固型分濃度を０．　２％とする代わりに、感
作後のラテックスを２．　５　ｍの０．５０％ＰＥＧ５
０万に分散させ固型分濃度を０．４％としたこと以外は
、実施例２と同様にしてラテックス試薬を調製した． （Ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 梅毒陽性家兎血清と各ラテノクス試薬を各々５０μｌず
つ凝集観察板上に採り、混合・撹拌した後、３分間反応
させた。対照として、正常家兎血清についても同様に反
応させた。反応後、ラテックス試薬が凝集したかどうか
を目視で判定した。

この結果を第５表に示した。第５表において、記号は以
下の意味を表わす。

＋＋：陽性（強い凝集） ＋：陽性（ａ集） ＋Ｗ：陽性（弱い凝集） ±：偽陽性 陰性（非凝集） （　以下余白　） ル較％ｌ 実施例３の抗原感作液（１）〜（１３）の代わりに、第
３表に示した抗原感作液圓〜θ９）を使用したこと以外
は、実施例３と同様の操作を繰り返した。結果を実施例
３の結果と共に第５表に示す。

第５表の結果から明らかなように、本発明によるラテッ
クス試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安定性良く担体に
固定化され、従来の方法では凝集が見られなかった高希
釈倍率の陽性血清においても、陽性と判定しうる感度が
得られた。正常血清については、比較例で見られていた
非特異反応による凝集が解消されるなど、本ラテックス
試薬は、特異性が高く、惑度の良いものであるという結
果が得られた。

実１力Ｏ一 （ＥＩＡによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬）ＥＩＡによ
る抗ＴＰ抗体検出用診断試薬の製造に本発明を適用した
。

ポリスチレンビーズ：ボリスチレンを直径６．４關の球
状に成形したもの（４！水化学工業■製）を用いた。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液をｌ％ＯＧで２５倍希釈したもの（Ｃ液とす
る．）、ＮａＣｌ−ＰＢＳ，１０ｍＭ　　ＫＰＢまたは
クエン酸緩衝液およびｌ％ＯＧを各々第６表に示した量
で混合したものを抗原感作液（１１〜０３）とした。

（　以下余白　） 第６表抗涼感作液 ？）梅ｉｆκ駅液を０．２５％ＯＧで２５倍希釈したも
の（Ｃ＋■を用いた．口）梅龜抗原液を５％ＯＧで２５
倍希釈したもの（Ｃ髪υを用いた．ハ）ＯＧを２、５％
４，含むＩＯｍＭＫＰＢを用いた．二）ＯＧを８．７５
％含むＩＯｍＭＫＰＢを用いた．ホ）ＯＧを３％含むｌ
ｏｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ　６．００）を用いた．へ）梅
毒抗原液を０．０５％ＯＧで２５倍希釈したもの（ＣＪ
を用いた．（Ｂ）抗原の固定化 ポリスチレンビーズ１００個を、精製水により充分洗い
風乾した。１０ｍＭ　　ＫＰＢ　（ｐＨ６．００）１０
戚を２　０　０　ｍｌのビーカーに入れ、これにポリス
チレンビーズ１０個を加えた。これに各抗原感作液（１
）〜Ｑ３）　４　０　ｄを加え、室温で１時間撹拌した
。次に感作液を吸引除去し、１００ｍＭＮａＰＢを１０
０ｄ加えた後、吸引除去する操作を３回繰り返して洗浄
した。最終的に１００ｍＭ　　ＮａＰＢを５０ｍｌ加え
、梅毒抗原固定化ポリスチレンビーズとした。この梅毒
抗原固定化ポリスチレンビーズは４゜Ｃで保存した。

（Ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 第１抗体として、前述の１００倍、２００倍および４０
０倍に希釈した梅毒陽性家兎血清５００μｌずつを試験
管に分注した。対照として、前述の１００倍、２００倍
および４００倍に希釈した正常家兎血清を同様に試験管
に分注した。

各試験管に、上述梅毒抗原固定化ポリスチレンビーズを
１個ずつ加えた。各試験管を室温で１時間インキユベー
トした後、反応液を吸引除去し、２ｒＲ１．の０．　９
％ＮａＣ１で３回吸引洗浄した。これにベルオキシダー
ゼ標識抗ウサギＩｇＧを各試験管に５００μｌずつ分注
し、室温で１時間インキユベートした。反応液を吸引除
去し、２戚の０．　９％ＮａＣ１で３回吸引洗浄した。

次に、各試験管に５００μｌずつベルオキシダーゼ基質
を添加し、室温で１５分間インキュベートを行った。基
質ブランクとして、空の試験管にも同様に基質を分注し
、インキユベートした。これにＩＮ　硫酸を２ｄ添加し
、酵素反応を停止させた。各試験管の酵素反応時間は一
定になるように注意して行った。反応停止後、分光光度
計（日立製作所、Ｕν−３２００　）により、基質ブラ
ンクを対照として４９２ｎｍの吸光度を測定した。その
結果を第７表に示す（ｎ＝４の平均｛Ｉ！）。

（　以下余白　） また梅毒陽性家兎血清についてこの結果をグラフに表し
たのが第３図（ａ）（ＫＰＢ緩衝液使用．ＯＧｌ度と吸
光度）、第３図（ｂ）（クエン酸緩衝液使用。ＯＧ濃度
と吸光度）、第３図（ｃ）（ｐＨと吸光度）である。縦
軸は４９２ｎｍでの吸光度、横軸は陽性血清の希釈倍率
を示す。

↓ｌ汗１ 実施例４の抗原惑作液（１）〜（１３１の代わりに、第
６表に示した抗原惑作液０４）〜０９）を使用したこと
以外は、実施例４と同様の操作を繰り返した。結果を実
施例４の結果と共に第７表に示す。

また、梅毒陽性家兎血清についての結果を、第３図（ａ
）、第３図（ト））、第３図（Ｃ）に示す。

第７表および第３図の結果から明らかなように、本発明
によるＥＩＡ試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安定性良
く担体に固定化され、従来の方法では酵素活性の上昇が
見られなかった高希釈倍率の陽性血清においても、陽性
と判定しうる怒度が得られた。正常血清については、比
較例で見られていた非特異反応による酵素活性の上昇が
解消されるなど、本ＥＩＡ試薬は、特異性が高く、感度
の良いものであるという結果が得られた。

夫施貫エ （Ｔ　Ｐ　Ｈ　Ａによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬）Ｔ
ＰＨＡによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬の製造に本発明
を適用した。

タンニン酸：ナカライテスク■より購入したものを用い
た。

市販ＴＰＨＡキット：セロクリット−ＴＰ　（化血研）
、セロディア−ＴＰ　　（冨士レビオ）を用いた。

ヒツジ赤血球：ヒッジ赤血球を常法によりグルタルアル
デヒド処理後、タンニン酸処理したものを用いた。固形
分濃度６％（Ｗ／Ｗ）でＰＢＳ中に懸濁したものを使用
した。

判定プレート：ヌンク社製のＵ字型９６穴マイクロタイ
タープレートを用いた。

ＰＨＡ緩衝液：リン酸１ナトリウム（２水和物）とリン
酸２ナトリウム（２水和物）を精製水に溶解して調製し
た０．　１　５　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４０）を生
理食塩水で１０倍に希釈し、ＮａＮ３を０．　１％、正
常家兎血清を２％、ストローマを１％となるように添加
したもの。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液を１％ＯＧで２５０倍希釈したもの（Ｄ液と
する。）　、ＮａＣ　Ｉ　　ＰＢＳ，１０ｍＭＫＰＢま
たはクエン酸緩衝液および１％ＯＧを各々第８表に示し
た量で混合したものを抗原感作液（１）〜０３）とした
。

（　以下余白　） 第８表　抗原感作液 ハ）ＯＧを２．５％含むｌ　ＯｍＭ　ＫＰＢを用いた．
二）ＯＧを８．７５％含む１０ｍＭＫＰＢを用いた．ホ
）ＯＧを３％含むｌｏｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．００）
を用いた．へ）梅毒抗原液を０．０５％ＯＧで２５０倍
希釈したもの（Ｄｓｓｌ）を用いた．（Ｂ）梅毒抗原の
固定化 前述のタンニン酸処理したヒツジ赤血球６％血球液１−
をスターラー上で撹拌しながら、第８表のように調製し
た抗原感作液（１）〜面各々４ｄを添加し、２５゜Ｃで
１時間撹拌した。この後、十分量の０．　９％ＮａＣＩ
で３回遠心洗浄したのち、ｌ％ＢＳＡ・ＰＢＳで６％血
球液とし、４゜Ｃで保存した。

（Ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 上記（Ｂ）項で製造した血球を用いて、前述の１００、
２００、４００倍に希釈した陽性家兎血清について抗体
価の測定を行った。対照として前述のｉｏｏ、２００、
４００倍希釈した正常家兎血清についても同様の測定を
行った。測定には、市販キット　（セロディアーＴＰ）
を使用し、惑作血球のみ（Ｂ）項で製造した血球を用い
、その他の試薬については同キットの構成品を用い、同
キットの使用説明書に従って定量を行った。なお、判定
プレートは添付のものを使わず、すべてヌンク社製のＵ
字型マイクロタイタープレートを用いた。

なお、（Ｂ）項で作成した血球液はアッセイ時には０．
９％ＮａＣＩで１度洗浄し、ＰＨＡ緩衝液で０．　６％
とし、室温で１時間インキユベートした後で用いた。

反応２時間後、凝集像を目視で観察した。この結果を第
９表に示した。第９表において、記号は以下の意味を表
わす。

＋十：陽性（強い凝集） 十二陽性（凝集） ＋Ｗ：陽性（弱い凝集） ±：偽陽性 陰性（非凝集） （　以下余白　） 土蚊例五 実施例５の抗原惑作液（１）〜０３）の代わりに、第８
表に示した抗原感作液圓〜θ９）を使用したこと以外は
、実施例５と同様の操作を繰り返した。また、市販Ｔ　
Ｐ　Ｈ　Ａキット　（セロクリットーＴＰ，セロディア
ーＴＰ）についても実施例５と同じ検体を用いて測定を
行った。結果を実施例５の結果と共に第９表に示す。

第９表の結果から明らかなように、本発明によるＴＰＨ
Ａ試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安定性良く担体に固
定化され、市販品や従来の方法では凝集が見られなかっ
た高希釈倍率の陽性血清においても、陽性と判定しうる
感度が得られた。正常血清については、比較例で見られ
ていた非特異反応による凝集が解消されるなど、本Ｔ　
Ｐ　Ｈ　Ａ試薬は、特異性が高く、感度の良いものであ
るという結果が得られた。

″！ＪＪＵ殊旦 （梅毒ドット−イムノパインディングアッセイによる抗
ＴＰ抗体検出用診断試薬） 梅毒ドットーイムノハインディングアッセイによる抗Ｔ
Ｐ抗体検出用診断試薬の製造に本発明を適用した。この
アッセイ方法は、（　Ｒ．ｔｌａｗｋｅｓ　ｅｔｃ，Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１
９，１４２−１４７（１９８２）　）に準じて行った。

ニトロセルロースメンブレン（以下ＮＣと略す）：３×
３ＩＩＩ０１方眼のついたニトロセルロースメンブレン
をミリポア■より購入した。

（Ａ）抗原惑作液の調製 梅毒抗原液を１％ＯＧで５０倍希釈したもの（Ｅ液とす
る。）、　ＮａＣｌ−ＰＢＳＳ　１０ｍＭＫＰＢまたは
クエン酸緩衝液、１％ＯＧを各々第１０表に示した量で
混合したものを抗原感作液（１）〜側とした。

（　以下余白　） 第１（１＆　抗涼感作液 （Ｂ）ＮＣシ一トの調製 ＮＣメンブレンを蒸留水中で５分間すすぎ洗いをし、室
温で乾燥させた。１方眼に（Ａ）項で調製した抗原惑作
液（１）〜０クを２０Ｉｌずつ、プロットした。１０分
間４゜Ｃのインキュベーター中で静置した後、ＰＢＳ５
０一中でメンブレンごとすすぎ洗いをした。メンブレン
が濡れているうちに１方眼ずつ切取り、ヌンクの９６穴
プレートに、抗原液をプロットした面を上向きにして１
枚ずつ入れた。

各ウエルに１％ＢＳＡ−　ＰＢＳを１００μｌずつ分注
し、１５分間緩やかに振とうさせ、ブロッキング液を吸
引・除去したのち、ＰＢＳ２００μ２で３回洗浄を行っ
た。

（Ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 第１抗体として、前述の１００、２００、４００倍に希
釈した梅毒陽性血清を各ウェルに５０μｌずつ分注し、
室温で２時間インキユベートした。

対照として、前述の１００倍、２００倍および４００倍
に希釈した正常家兎血清を各ウェルに分注・インキユベ
ートした。

２時間後、反応液を吸引除去し、ｌ％ＢＳＡ・ＰＢＳ２
００μｌで３回洗浄したのち、ベルオキシダーゼ標識抗
ウサギＩｇＧを各ウエルに１００μβずつ分注した。室
温で１時間インキユベートしたのち反応液を吸引除去し
１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ただし、ＮａＮ．は含まない）２
００μｊ！で３回洗浄した。洗浄後ただちに各メンブレ
ンに結合した酵素活性を観察した。

（Ｄ）酵素反応 各ウエルに１００μｌずつベルオキシダーゼ基質を分注
し、室温で１５分間インキユベートした．基質ブランク
として、空の試験管にも同様に基質を分注し、インキユ
ベートした。インキュベート後、ＩＮ硫酸を１００ｔｉ
ｌ分注し、酵素反応を停止させた。各ウエルの酵素反応
時間は一定になるように行った。

反応停止後、基質ブランクを対照として各メンブレンの
発色状態を目視で観察した。この結果を第ｌｌ表に示す
．第１１表において、記号は以下の意味を表わす。

−ト十（陽性）　：非常によく発色した。

＋（陽性）　：発色した。

＋Ｗ（陽性）　：弱い発色。

±（偽陽性）：基質ブランクよりやや発色している。

（陰性）　二発色していない。

（　以下余白　） 几本ム 実施例６の抗原怒作液（１）〜０３）の代わりに、第１
０表に示した抗原惑作液Ｑ４）〜０９）を使用したこと
以外は、実施例６と同様の操作を繰り返した。結果を実
施例６の結果と共に第１１表に示す。

第１１表の結果から明らかなように、本発明によってＴ
Ｐ抗原を固定化させたＮＣメンブレンを用いた場合、惑
度は良くかつ特異性が高く、陽性血清を検出することが
できた。

夫施貝ユ．北較勇ユ （ラテックス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用診断試薬一
全自動分析装置を用いた測定一）界面活性剤としてＯＧ
の代わりにＣＨＡＰＳ〔ナカライテスク＠Ｒｅａｇｅｎ
ｔ　Ｇｒａｄｅ〕を用いる以外は実施例２、比較例２と
全く同様（緩衝液などに溶解する濃度などもＯＧの場合
と全く同様である）にして、測定を行った。

その結果を第１２表および第４図（ａ）（ＫＰＢ緩衝液
使用，ＣＨＡＰＳ濃度と吸光度）、第４図（ｂ）（クエ
ン酸緩衝液使用．ＣＨＡＰＳ濃度と吸光度）、第４図（
ｃ）（ｐＨと吸光度）に示した。

第１２表および第４図より明らかなように、本発明によ
るラテックス試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安定性良
く担体に固定化され、感度、特異性ともに優れた梅毒診
断ラテンクス試薬が得られた。

（　以下余白　） ＩＵ回■旦一、一上し−東とセＬＬ （ラテックス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用診断試薬一
全自動分析装置を用いた測定一）界面活性剤としてＯＧ
の代わりにトリトンＸ　一１００〔ナカライテスク■〕
を用いる以外は実施例２、比較例２と全く同様（緩衝液
などに溶解する濃度などもＯＧの場合と全く同様である
）にして、測定を行った。

その結果を第１３表および第５図（ａ）（ＫＰＢＩ，１
衝液使用。トリトンＸ−１００濃度と吸光度）、第５図
（ｂ）（クエン酸緩衝液使用。トリトンＸ−１０　０　
１度ト吸光度）．第５図（ｃ）　（ｐ　Ｈ　ト吸光度）
　ニ示した。

第１３表および第５図より明らかなように、本発明によ
るラテンクス試薬ではＴＰ抗原が多量にかつ安定性良く
担体に固定化され、感度、特異性ともに優れた梅毒診断
ラテックス試薬が得られた。

（　以下余白　） 実Ｊｉｌレ晩叶ｌ （梅毒ドントーイムノバインディングアッセイによる抗
ＴＰ抗体検出用診断試薬） プロ・７ディング用のメンブレンとしてニトロセルロー
スメンブレンの代わりにナイロンメンブレン（口本ハイ
オ・ラッド　ラボラトリーズ社製）を用いる以外は実施
例６、比較例６と全く同様（大きさなども全く同様であ
る）にして、測定を行った。

その結果を第１４表に示した。第１４表の結果から明ら
かなように、本発明によってＴＰ抗原を固定化さセたナ
イロンメンブレンを用いた場合、感度はよくかつ特異性
が高く、陽性血清を検出することができた。

（　以下余白　） ス」缶例」』− （ラテ，クス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用診断試薬−
全自動分析装置を用いた測定一）全自動分析装置を用い
る、ラテンクス凝集法による抗′『１）抗体検出用試薬
の製造に本発明を適用した。

本実施例では、ラテノクスをＮａＣＩ−ＰＢＳ、１％Ｏ
Ｃ，緩衝液等で予め希釈したラテックス懸濁液を用意し
、これに抗原感作液を加える方法で、を行った。

試薬等、特に断らない限りは実施例２および比較例２に
用いたものと同じものを使用した。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液を１％ＯＧで２５倍希釈したもの（Ｆ液とす
る）を用いた。

（Ｂ）　　ラテンクス懸濁液の調製 ＮａＣｌ−ＰＢＳ、１％ＯＧ，ｌＯｍＭ　　ＫＰＢまた
はクエン酸緩衝液を各々第１５表に示した割合で混合し
たものをラテックスと混合し、ラテックス懸濁液とした
。

（Ｃ）抗原の固定化 ラテックス懸濁液（１）〜θ３）４５０〜４９０μ！（
それぞれの使用量は第１５表に記載）を４゜Ｃのインキ
ュベーター中でマグネチックスクーラーで撹拌しながら
、第１５表に記載した各抗原感作液のｌθ〜５０μ！（
それぞれの使用量は第１５表に記載）を素早く添加し、
４゜Ｃにて１時間撹拌した，その後、ｌ％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓ　　５−を添加し、４゜Ｃにて続けて１．５時間撹拌
した。その後、１５０００ｒｐｍにて１時間遠心分離し
た。得られた沈澱にさらにｌ％ＢＳＡ−ＮａＰＢ　　５
−を添加し、同様に遠心分離することにより沈澱を洗浄
した。この沈澱に１％ＢＳＡ−ＮａＰＢ　　５ＩｒＩＮ
を添加し、よく分散させて固形分０．　２％のラテック
ス試薬とした。このようにして調製したラテックス試薬
は４“Ｃにて保存した。

（以下余白） （Ｄ）抗ＴＰ抗体の測定 上記の方法で調製したラテックス試薬を用いる以外は実
施例２と全く同様にして行った。

この結果を第１６表に示した。

（　以下余白　） また、梅毒陽性家兎血清についてこの結果をグラフに表
したのが第６図（ａ）（ＫＰＢ緩衝液使用。

ＯＧ′ａ度と眼光度）、第６図（ｂ）（クエン酸緩衝液
使用。ｏｃＦａ度と吸光度）、第６図（Ｃ）（ＰＨと吸
光度）である。

几一較−例−１二咀 実施例ｌＯのラテノクス懸濁液（１）〜側および抗原感
作液の代わりに、第１５表に示したラテックス懸濁液０
４）〜０９）および抗原感作液を使用したこと以外は、
実施例１０と同様の操作を繰り返した。

結果を実施例１０の結果と共に第１６表に示す。

また、梅毒陽性家兎血清についての結果を、第６図（ａ
）、第６図（ｂ）、第６図（Ｃ）に示す。

第１６表および第６図の結果から明らかなように、本発
明によるラテックス試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安
定性良く担体に固定化され、従来の方法では凝集が見ら
れなかった高希釈倍率の陽性血清においても、陽性と判
定しうる感度が得られた。

丈施准［Ｌ支 （ラテックス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用診断試薬一
全自動分析装置を用いた測定一）全自動分析装置を用い
る、ラテソクス凝集法による抗ＴＰ抗体検出用試薬の製
造に本発明を適用した。

本実施例では、ラテックスと抗原感作液を予め混合し、
次に、これにＮａＣｌ−ＰＢＳ，１％ＯＧ，緩衝液から
なる希釈液を加えて、水性媒体中の最終のＯＧ濃度およ
びｐＨを所定の濃度範囲に４Ｉ！ 入るようにして、抗原のＢ体への担持を行った。

試薬等、特に断らない限りは実施例２および比較例２に
用いたものと同じものを使用した。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液をｌ％ＯＧで２５倍希釈したもの（Ｆ液とす
る）を用いた。

（Ｂ）希釈液の調製 Ｎａ　Ｃ　１−ＰＢＳ，１％ＯＧ、１０ｍＭ　　ＫＰＢ
またはクエン酸緩衝液を各々第１７表に示した割合で混
合したものを希釈液とした。

（Ｃ）抗原の固定化 ラテンクス１００μｌを４゜Ｃのインキュヘーター中で
マグネチンクスクーラーで撹拌しながら、第１７表に記
載した各抗原惑作液の１０〜５０μ！（それぞれの使用
量は第１７表に記載）を素早く添加し、続けて希釈液（
１）〜０３）を３５０〜３９０μＮ（それぞれの使用量
は第１７表に記載）添加した後４゜Ｃにて１時間撹拌し
た。その後、ｌ％ＢＳＡ−ＰＢＳ　　５ａｙｅを添加し
、４゜Ｃにて続けて１．５時間撹拌した。その後、１５
．００Ｏｒｐｍにて１時間遠心分離した。得られた沈澱
にさらに１％ＢＳＡ−ＮａＰ８　　５ａｌｌを添加し、
同様に遠心分離することにより沈澱を洗浄した。この沈
澱に１％ＢＳＡ−ＮａＰＢ　　５ｍｊ！を添加し、よく
分散させて固形分０．２％のラテックス試薬とした。こ
のようにして調製したラテックス試薬は４゜Ｃにて保存
した。

（以下余白） （Ｄ）抗ＴＰ抗体の測定 上記の方法で調製したラテックス試薬を用いる以外は実
施例２と全く同様にして行った。

この結果を第１８表に示した。

（　以下余白　） また、梅毒陽性家兎血清についてこの結果をグラフに表
したのが第７図（ａ）（ＫＰＢ緩衝液使用。

ＯＧ濃度と吸光度）、第７図（ｂ）（クエン酸緩衝液使
用。ＯＧＩ度と吸光度）、第７図（Ｃ）　（ｐ　Ｈ　ト
吸光度）である。

几較貫」』 寅施例１１の抗原感作液および希釈液（１）〜側の代わ
りに、第１７表に示した抗原感作液および希釈液０ａ〜
θ９》を使用したこと以外は、実施例１ｌと同様の操作
を繰り返した。結果を実施例１１の結果と共に第１８表
に示す。

また、梅毒陽性家兎血清についての結果を、第７図（ａ
）、第７図（ｂ）、第７図（Ｃ）ニ示ス。

第１８表および第７図の結果から明らかなように、本発
明によるラテックス試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安
定性良く担体に固定化され、従来の方法では凝集が見ら
れなかった高希釈倍率の陽性血清においても、陽性と判
定しうる惑度が得られた。

実１１１Ｌ１ （ＴＰＨＡによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬）ＴＰＨＡ
による抗ＴＰ抗体検出用診断試薬の製造に本発明を適用
した。

本実施例では、血球液をＮａＣＩ−ＰＢＳ，１％ＯＧ，
［衝液等で予め希釈した血球浮遊液を用意し、これに抗
原感作液を加える方法で、水性媒た． 試薬等、特に断らない限りは実施例５および比較例５に
用いたものと同じものを使用した。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液をｌ％ＯＧで２５０倍希釈したもの液とする
）を用いた． （Ｂ）血球浮遊液の調製 血球とＮａＣＩ−ＰＢＳ，１％ＱＣ，１０ｍＭＫＰＢま
たはクエン酸緩衝液を各々第１９表に示した割合で混合
したものを血球浮遊液とした。

（Ｃ）抗原の固定化 （Ｇ 上記の血球浮遊液（１）〜（１３１４．５０〜４．９０
ｄをマグネチックスクーラーで撹拌しながら、第１９表
に記載した各抗原感作液の０．１〜０．　５　ｔｎＲ　
（それぞれの使用量は第１９表に記載）を添加し、２５
゜Ｃで１時間撹拌した。この後、十分量の０．９％Ｎａ
ＣＩで３回遠心洗浄したのち、ｌ％ＢＳＡ・ＰＢＳで６
％血球液とし、４゜Ｃにて保存した。

（以下余白） （Ｄ）抗ＴＰ抗体の測定 上記の方法で調製した血球を用いる以外は実施例２と全
く同様にして行った。

反応２時間後、凝集像を目視で観察した。この結果を第
２０表に示した。

（　以下余白　） ル較−叶上ス 実施例１２の血球浮遊液（１）〜θ３）および抗原感作
液の代わりに、第１９表に示した血球浮遊液圓〜０９）
および抗原感作液を使用したこと以外は、実施例１２と
同様の操作を繰り返した。結果を実施例１２の結果と共
に第２０表に示す。

第２０表の結果から明らかなように、本発明によるＴＰ
ＨＡ試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安定性良く担体に
固定化され、市販品や従来の方法では０集が見られなか
った高希釈倍率の陽性血清においても、陽性と判定しう
る惑度が得られた。

正常血清については、比較例で見られていた非特異反応
による凝集が解消されるなど、本Ｔ　Ｐ　Ｈ　Ａ試薬は
、特異性が高く、惑度の良いものであるという結果が得
られた。

月１１Ｌ↓ （Ｔ　Ｐ　Ｈ　Ａによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬）Ｔ
　Ｐ　Ｈ　Ａによる抗ＴＰ抗体検出用診断試薬の製造に
本発明を適用した。

本実施例では、血球と抗原感作液を予め混合し、次に、
これにＮａＣｌ−ＰＢＳ、１％ＯＧ，緩衝液からなる希
釈液を加えて、水性媒体中の最終のＯＧＩ１度およびｐ
Ｈを所定の濃度範囲に入るよう様 にして、抗原の一体への担持を行った。

試薬等、特に断らない限りは実施例５および比較例５に
用いたものと同じものを使用した。

（Ａ）抗原感作液の調製 梅毒抗原液をｌ％ＯＧで２５０倍希釈したもの（Ｇ液と
する）を用いた。

（Ｂ）希釈液の調製 Ｎａ　Ｃ　ｌ−ＰＢＳ，１％ＯＧ，１０ｍＭ　　ＫＰＢ
またはクエン酸緩衝液を各々第２１表に示した割合で混
合したものを希釈液とした。

（Ｃ）抗原の固定化 ヒツジ赤血球液１，　Ｑ　ｍｌをマグネチックスクーラ
ーで撹拌しながら、第２１表に記載した各抗原感作液の
Ｏ．１〜０．５ｄ（それぞれの使用量は第２１表に記載
）を添加し、続けて希釈液（１）〜０■を３．５〜３．
　９　ｄ添加した後、２５゜Ｃで１時間撹拌した。

この後、十分量の０．９％ＮａＣ１で３回遠心洗浄した
のち、 ｌ％ＢＳＡ−ＰＢＳで６％血球液とし、４゜Ｃにて保存
した。

（以下余白） （Ｄ）抗ＴＰ抗体の測定 上記の方法で調製した血球を用いる以外は実施例２と全
く同様にして行った。

反応２時間後、凝集像を目視で観察した。この結果を第
２２表に示した。

（　以下余白　） ，Ｌ較朋且 実施例ｌ３の抗原感作液および希釈液（１）〜０■の代
わりに、第２１表に示した抗原感作液および希釈液ａ／
Ｄ〜０９）を使用したこと以外は、実施例ｌ３と同様の
操作を繰り返した。結果を実施例１３の結果と共に第２
２表に示す。

第２２表の結果から明らかなように、本発明によるＴＰ
ＨＡ試薬では、ＴＰ抗原が多量にかつ安定性良く担体に
固定化され、市販品や従来の方法では凝集が見られなか
った高希釈倍率の陽性血清においても、陽性と判定しう
る感度が得られた。

正常血清については、比較例で見られていた非特異反応
による凝集が解消されるなど、本ＴＰＨＡ試薬は、特異
性が高く、感度の良いものであるという結果が得られた
。

（以下余白） （発明の効果） 本発明によれば、このように、ＴＰ抗原を多量にかつ安
定性良く担体に固定化し得、感度が高く特異性の良い梅
毒診断試薬を製造することが出来る。

本発明は、例えばラテックス、プラスチンクビーズ、プ
ラスチックプレート、赤血球、高分子膜などの担体を使
用し、抗原抗体反応を利用した測定方法、例えば、酵素
免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝
集法、ＴＰＨＡ法、ドントーイムノバインディングアッ
セイ法などの方法による梅毒診断試薬の製造に好適に利
用され得、該試薬は梅毒の診断および治療のための臨床
検査などの分野に広く利用され得る。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、第２図（ａ）、第３図（ａ）、第６図（
ａ）および第７図（ａ）は、ＯＧを含有するＫＰＢ緩衝
液を使用して、第４図（ａ）はＣ　ＨＡＰＳを含有する
ＫＰＢ緩衝液を使用して、そして、第５図（ａ）はトリ
トンＸ−ｌＯＯを含有するＫ　Ｐ　Ｂ　３１街液を使用
して、それぞれ得られた試薬により梅毒陽性家兎血清を
測定したときの、それぞれＯＧ濃度、ＣＨＡＰＳ濃度、
トリｌ・ンＸ１００ｉ４度と梅毒陽性家兎血清の希釈倍
率と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラフ、
第１図（ｂ）、第２図（ｂ）、第３図（ｂ）、第６図（
ｂ）および第７図（ｂ）は、ＯＧを含有するクエン酸緩
衝液を使用して、第４図（ｂ）はＣＨＡＰＳを含有する
クエン酸緩衝液を使用して、そして、第５図（ｂ）はト
リトンＸ−１００を含有するクエン酸緩衝液を使用して
、それぞれ得られた試薬により梅毒陽性家兎血清を測定
したときの、ソレソれＯＣ濃度、ＣＨＡＰＳＮａ度、｝
’Ｊｌ−７Ｘ１００濃度と梅毒陽性家兎血清の希釈倍率
と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラフ、第
１図（Ｃ）、第２図（Ｃ）、第３図（Ｃ）、第４図（Ｃ
）、第５図（Ｃ）、第６図（ｃ）および第７図（ｃ）は
、所定の界面活性剤を含有し、それぞれｐＨの異なる緩
衝液を使用して得られた試薬により、梅毒陽性家兎血清
を測定したときの、ｐＨと梅毒陽性家兎血清の希釈倍率
と測定の結果得られる吸光度との関係を示すグラフであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）トレポネーマ・パリダム（ＴｒｅｐｏｎｅｍａＰ
   ａｌｌｉｄｕｍ）菌体成分由来の抗原を担体に担持させ
   たものと、抗トレポネーマ・パリダム抗体との抗原抗体
   反応を測定することにより、抗トレポネーマ・パリダム
   抗体を検出し、梅毒診断を行う診断試薬において、トレ
   ポネーマ・パリダム菌体成分由来の抗原を担体に担持さ
   せるに際し、界面活性剤を０．０１〜２．５重量％含有
   し、かつｐＨが４．５〜７．７である水性媒体中で行う
   ことを特徴とする梅毒診断試薬の製造方法。