CN109596835A - 一种检测试剂盒及其制备方法和肌钙蛋白t的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外检测技术领域,具体涉及一种检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明的检测试剂盒包括:磁分离试剂和酶标试剂;磁分离试剂,包括:肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;或,包括:链霉亲和素包被的金磁微粒以及生物素标记的肌钙蛋白T抗体;酶标试剂,包括:酶标抗体聚合物;酶标抗体聚合物包括:酶标抗体至少两个,以及碳桥;碳桥联接任意两个或以上、相邻或不相邻的酶标抗体,且碳桥上具有用于联接酶标抗体的联接位点,联接位点至少两个;酶标抗体包括检测抗体和偶联于检测抗体的标记酶,联接位点联接检测抗体和/或标记酶。进行化学发光检测时,进而放大化学发光法的反应信号值,且可增强本发明检测试剂捕获抗原的敏感度,提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于体外检测技术领域,具体涉及一种检测试剂盒及其制备方法和肌钙蛋白T的检测方法。
背景技术
肌钙蛋白(Tn)是肌肉组织收缩的调节蛋白,位于收缩蛋白的细肌丝上,在肌肉收缩和舒张过程中起到非常重要的调节作用。心肌肌钙蛋白(cTn)则仅存在于心肌细胞中,是由肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)和肌钙蛋白C(cTnC)等3个亚单位组成的球形络合物分子。cTnT和cTnI是心肌细胞特有的抗原,在心肌细胞损伤时从心肌纤维上降解下来。在心肌细胞内,绝大部分cTn以复合体的形式结合在细肌丝上,少量的cTn以游离形式存在于细胞质中。健康个体正常情况下外周血中检测不到cTn,但是,当心肌细胞受到缺血、缺氧等损害时,细胞膜通透性增高,游离状态的cTn首先释放到附近的心肌间质、淋巴管和微血管中,随血液循环逐渐进入外周血中。进一步的,随着缺血时间的持续,肌丝陆续崩解,导致大量的cTn持续释放至血液中,高浓度的cTn会持续7d以上,峰值多出现在严重缺血后1~2d,其浓度可达到正常上限的20~50倍。血清中cTn升高反映了心肌细胞受损,其特异性与敏感性均高于以往常用的心肌酶谱。
根据心肌梗死的新定义,当cTn浓度高于健康人群参考范围上限的第99百分位值,且临床上具有心肌缺血表现,或者有ECG的特征性改变时,即可诊断为心肌梗死。血液中肌钙蛋白增加的早期可检测性依赖于所使用的特定肌钙蛋白检测的分析灵敏度。对临床表现出急性胸痛的患者,医生需立即使用hs cTn(高灵敏度心肌肌钙蛋白)进行检测。患者就诊时首次hs cTn检测值低于或等于参考范围上限,3h后的hs cTn检测值高于参考范围上限,且升高的幅度大于参考范围上限的50%,可考虑为心肌坏死;若患者的初始hs cTn检测值高于参考范围上限,也需在3h后重复检测hs cTn。如果第二次检测值高于参考范围上限,且升高的幅度大于初始值的20%,也可考虑为心肌坏死。在此基础上,还可以选择性的在6h后进行第三次hs cTn检测。同样,当6h后的hs cTn检测值高于参考范围上限,且升高的幅度大于参考范围上限的50%或大于初始值的20%,可确诊为心肌坏死。几项研究表明,并由相关机构推荐,高灵敏度-心肌肌肌钙蛋白T(hs cTnT)检测有助于将观察时间从6h缩减到3h,甚至是0或1h。hs cTnT检测不仅实现了对AMI的早期诊断和鉴别诊断,而且作为导致心血管损伤事件的多种危险因子中的“终点”标志物,对于急性冠脉综合征、心力衰竭及稳定型冠心病患者的心血管事件具有预测价值。对于这部分患者而言,通过及早诊断并实施治疗和干预,能大大降低再次发生心血管疾病的风险,节省总体医疗花费,有效提高生存率。而且hscTnT检测对一般人群的心血管事件风险也具有重要的预测价值。
发光免疫分析法是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段,具有灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害等优点,目前主要以化学发光法和电化学发光法为主。电化学发光免疫测定法(Elecsys)发展于1996年,是继放射免疫、酶免疫、化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术,在发光反应中加入了电化学反应,是电化学和免疫测定相结合的产物。但是,电化学发光成本较为昂贵,其产品走高端线路,高昂的价格对使用的医疗机构和患者带来了明显的经济压力。
相对于电化学发光法,化学发光法具有明显的价格优势,且其具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便,自动化程度高等优势,被广泛应用于维生素、免疫球蛋白及酶类等微量生物分子的体外检测。化学发光法(CLIA)是在酶联免疫分析法基础上发展起来的一种免疫检测技术,化学发光法的测定原理与酶联免疫中的双抗体夹心法和竞争法相似,当样本中的待测生物磁微粒试剂和酶标抗体结合形成夹心复合物后,其在磁场作用下通过利用磁微粒的磁性吸附到反应管壁,通过洗涤去除未结合物,然后加入化学发光底物,检测相对发光强度(RLU),样本中的待测生物分子和检测到的RLU成正比。然而,相对电化学发光来说,化学发光法的检测灵敏度较差。因而,如何提高化学发光法的灵敏度,是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种检测试剂盒,旨在解决现有化学发光法存在的检测灵敏度较差等技术问题。
本发明的另一目的在于提供本发明检测试剂盒的制备方法,以方便高效地制备本发明检测试剂盒。
本发明的又一目的在于提供一种肌钙蛋白T的检测方法,旨在提供一种通过采用本发明检测试剂盒来检测待测样品中的肌钙蛋白T的化学发光法。
为了实现上述发明目的,本发明的一方面,提供了一种检测试剂盒,包括:磁分离试剂和酶标试剂;
磁分离试剂,包括:肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;或,包括:链霉亲和素包被的金磁微粒,以及生物素标记的肌钙蛋白T抗体;
酶标试剂,包括:酶标抗体聚合物;所述酶标抗体聚合物包括:酶标抗体至少两个,以及碳桥;所述碳桥联接任意两个或以上、相邻或不相邻的所述酶标抗体,且所述碳桥上具有用于联接所述酶标抗体的联接位点,所述联接位点至少两个;
所述酶标抗体包括检测抗体和偶联于所述检测抗体的标记酶,所述联接位点联接检测抗体和/或所述标记酶。
与现有技术相比,本发明的检测试剂盒,一方面,采用酶标抗体聚合物作为酶标试剂,酶标抗体聚合物为由多个酶标抗体通过碳桥联接形成酶标抗体聚合物,当采用本发明的检测试剂进行化学发光法检测时,酶标抗体聚合物具有多个检测抗体,可增强本发明检测试剂捕获抗原的敏感度,增强灵敏度;而且,在复合物中,与抗原间接连接的标记酶数量增多,酶催化化学发光底物的作用增大,使得化学发光法的反应信号值得到放大,进一步地增强了检测灵敏度。另一方面,采用金磁微粒偶联物作为磁性固相载体,金磁微粒为以氧化铁为核表面包覆修饰有纳米金颗粒的磁性复合微粒,通过与金磁微粒表面的静电作用、疏水相互作用以及氨基酸残基侧链巯基与金相互作用,实现肌钙蛋白T抗体或链霉亲和素一步偶联在磁微粒表面,提高了检测抗体的包被效率,进一步提高了检测灵敏度,且不影响检测抗体的活性。
本发明的另一方面,提供了一种上述检测试剂盒的制备方法,包括:
S011、提供金磁微粒和肌钙蛋白T抗体,将金磁微粒与肌钙蛋白T抗体反应,制备肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;
或,提供金磁微粒、链霉亲和素、生物素和肌钙蛋白T抗体,将金磁微粒与链霉亲和素反应,制备链霉亲和素包被的金磁微粒;将生物素与肌钙蛋白T抗体反应,制备生物素标记的肌钙蛋白T抗体;
S012、提供肌钙蛋白T抗体和标记酶,将所述肌钙蛋白T抗体和所述标记酶进行反应,得到酶标抗体;提供交联试剂,将所述交联试剂与所述酶标抗体在溶液中进行反应,制备酶标抗体聚合物。
在本发明所提供的制备方法中,一方面,将肌钙蛋白T抗体直接偶联金磁微粒,制备肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;或,将链霉亲和素偶联金磁微粒制备链霉亲和素包被的金磁微粒,通过链霉亲和素与生物素之间较强的亲和力,实现金磁微粒与肌钙蛋白T抗体之间的连接。另一方面,将交联试剂与多个酶标抗体反应,交联试剂用于提供碳桥,通过碳桥将反应体系中的任意两个或以上酶标抗体联接起来,进而合成酶标抗体聚合物,方法简便快速,可操作性强。
本发明的又一方面,提供了一种肌钙蛋白T的检测方法,包括:
S021、提供待测样品和上述检测试剂盒,将待测样品、磁分离试剂和酶标试剂混合,进行反应,得到复合物;
S022、提供化学发光底物,将所述化学发光底物与复合物混匀,进行化学发光反应,并采用发光检测仪检测发光强度,计算待测样本中微量生物小分子的含量。
在本发明检测方法中,酶标试剂的酶标抗体聚合物可有效放大化学发光检测的反应信号值,磁分离试剂的金磁微粒上的检测抗体包被效率高,检测抗体活性稳定,具有较高的灵敏度,可有效提高检测的反应信号值和灵敏度,并广泛应用于肌钙蛋白T抗体的检测方法中。
附图说明
图1为本发明实施例的酶标记抗体聚合物与常规的酶标记抗体在进行化学发光检测的反应过程示意图;
图2为本发明实施例中的交联试剂二(磺基琥珀)辛二酸的化学结构图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例说明书中所提到的各组分的质量不仅仅可以指代各组分的具体含量,也可以表示各组分间质量的比例关系,因此,只要是按照本发明实施例说明书组合物各组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地,本发明实施例说明书中所述的质量可以是pg、μg、mg、g、kg等医药领域公知的重量单位。
本发明实施例说明书中所提到的“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。
一方面,本发明实施例提供一种检测试剂盒,包括:磁分离试剂和酶标试剂;
磁分离试剂,包括:肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;或,包括:链霉亲和素包被的金磁微粒,以及生物素标记的肌钙蛋白T抗体;
酶标试剂,包括:酶标抗体聚合物;酶标抗体聚合物包括:酶标抗体至少两个,以及碳桥;碳桥联接任意两个或以上、相邻或不相邻的酶标抗体,且碳桥上具有用于联接酶标抗体的联接位点,联接位点至少两个;
酶标抗体包括检测抗体和偶联于检测抗体的标记酶,联接位点联接检测抗体和/或标记酶。
具体的,本发明实施例中的肌钙蛋白T抗体指的是肌钙蛋白T单克隆抗体或肌钙蛋白T多克隆抗体。常规的,肌钙蛋白T抗体为肌钙蛋白T单克隆抗体。
金磁微粒为以氧化铁为核表面包覆修饰有纳米金颗粒的磁性复合微粒。在本发明实施例中,作为本发明检测试剂盒中的磁性固相载体颗粒。肌钙蛋白T抗体通过与金磁微粒表面的静电作用、疏水相互作用以及氨基酸残基侧链巯基与金相互作用,实现肌钙蛋白T抗体或链霉亲和素一步偶联在磁微粒表面,提高了检测抗体的包被效率,且不影响检测抗体的活性,进一步提高了检测灵敏度。
作为优选,金磁微粒的粒径优选为0.1~2μm,具体的,金磁微粒的粒径为0.1μm、0.3μm、0.5μm、0.7μm、0.9μm、1.1μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm和2μm。当磁珠的粒径大于2μm时,磁珠比表面积减少,检测灵敏度低;当磁珠的粒径小于0.1μm时,影响磁分离效果。
作为优选,在肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒中,金磁微粒与肌钙蛋白T抗体的重量比为(10~1000):1。
链霉亲和素可高度特异性地与生物素结合,偶联金磁微粒的链霉亲和素和生物素之间的亲和力依然较为强烈,检测时,偶联金磁微粒的链霉亲和素与生物素标记的肌钙蛋白T抗体混合,链霉亲和素可作为偶联分子将金磁微粒与生物素标记的肌钙蛋白T抗体连接,并进一步与生化物质结合形成结合物,结合物在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
作为优选,金磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:(10~1000);生物素与肌钙蛋白T抗体的质量比为10:(1~100)。
酶标抗体包括检测抗体和偶联于检测抗体的标记酶,其可采用本领域常规使用的酶标抗体,也可采用本领域常规技术手段制备获得的酶标抗体,还可以为市售商品。在本发明实施例中,采用肌钙蛋白T抗体作为检测抗体,采用碱性磷酸酶或辣根碱过氧化物酶作为标记酶。
碳桥指的是联接任意两个或以上酶标抗体的一段碳链,任意两个或以上、相邻或不相邻的所述酶标抗体,且其上具有用于联接酶标抗体的联接位点,联接位点至少两个。在本发明实施例中,通过碳桥上的联接位点,实现多个酶标抗体的联接聚合。其中,通过碳桥联接的各个酶标抗体之间互不影响。
在本发明实施例中,检测抗体指的是肌钙蛋白T抗体,其通过与标记酶偶联形成酶标记抗体。
如图1所示,通常的,一个酶标抗体上仅含一个检测抗体和一个标记酶分子,在酶标抗体与抗原和/或磁珠抗体结合形成复合物后,加入化学发光底物,化学发光底物被复合物中的标记酶催化,持续稳定地发射出光子,发射出的光子被系统记录进而转化为反应信号值。反应信号值的大小与发射光子的数量呈正比,而发射光子的数量与反应体系中参与反应的酶分子数量直接相关。本发明实施例所提供的检测试剂包括酶标抗体聚合物,一分子酶标抗体聚合物包括多个检测抗体和多个标记酶。当待测样本中存在一个抗原时,其与一分子酶标抗体聚合物结合,此时便有多个标记酶可用于催化作用化学发光底物,从而提高发射光子的数量,进而放大化学发光法的反应信号值。进一步的,本发明实施例中,酶标抗体聚合物中具有多个检测抗体,增强了本发明检测试剂捕获抗原的敏感度,从而提高检测灵敏度。
作为优选,碳桥为直链的碳链结构或支链的碳链结构,且联接位点位于碳桥的端部。联接位点位于碳桥的端部,可减少空间位阻,减少反应基团的遮蔽,可更好的将酶标抗体暴露出来参与免疫反应。
当碳桥为直链的碳链结构时,其具有两个端部,分别表示为第一端部和第二端部。第一端部和第二端部常规带有活性基团作为碳桥的联接位点,且通过该联接位点,碳桥与检测抗体和/或标记酶键合。具体的,第一端部可以与检测抗体键合连接,也可以与标记酶键合连接,第二端部同理。进一步的,将通过碳桥联接的一组酶标抗体分别表示为第一酶标抗体和第二酶标抗体。在其中一个实施例中,第一端部联接第一酶标抗体上的检测抗体,第二端部联接第二酶标抗体上的检测抗体;在另一实施例中,第一端部联接第一酶标抗体上的检测抗体,第二端部联接第二酶标抗体上的标记酶;在又一实施例中,第一端部联接第一酶标抗体上的标记酶,第二端部联接第二酶标抗体上的检测抗体。值得注意的是,少部分碳桥还可能联接在同一酶标抗体上。
当碳桥为支链的碳链结构时,其具有至少三个端部,可将三个相邻或不相邻的酶标抗体联接形成三分子聚合体。呈支链的碳桥与酶标抗体的联接方式,与呈直链的碳桥与酶标抗体之间的联接方式相同,此处不再一一赘述。
作为优选,碳桥的碳个数为5~15个。当碳桥中的碳个数过少,交联剂体积过小,形成聚合物的空间位阻大,影响反应效率。然而碳桥中碳数量增加,交联剂的生产成本也会增加。
值得注意的是,本发明实施例对碳桥的不饱和度不作具体限定,但凡不影响酶标抗体聚合物的活性的均可。
在本发明实施例中,一分子酶标抗体聚合物中的碳桥数量至少为一个,本发明实施例对一分子酶标抗体聚合物中碳桥的个数不作具体限定,能使得多个酶标抗体有效联接聚合形成多分子聚合体即可。
在本发明实施例中,碳桥通过联接位点以酰胺键与检测抗体和/或标记酶联接,具体的,碳桥上的联接位点为羰基(-CO-)或氨基(-NH),其与酶标抗体的检测抗体或标记酶中的伯胺或羧酸反应可形成稳定的化学键。
作为优选,碳桥通过联接位点以酰胺键与检测抗体和/或标记酶联接。具体的,在该酰胺键中,碳桥碳桥提供羰基(C=O),酶标抗体提供仲胺(-NH)。检测抗体和标记酶均为蛋白质,通常的,在其赖氨酸(K)残基侧链及每条多肽的N端都具有多个伯胺,以伯胺作为与碳桥端部结合的位点,可以提到各酶标抗体之间的聚合活性。
在本发明实施例中,通过碳桥联接的两个或以上酶标抗体相邻或不相邻。在一实施例中,碳桥呈直连的碳链结构,且通过碳桥两端联接聚合的两个酶标抗体相互靠近;在另一实施例中,碳桥呈直连,且通过碳桥两端联接聚合的两个酶标抗体之间的空间内还分布有多个酶标抗体。
作为优选,一分子酶标抗体聚合物中的酶标抗体的个数为2~10个。当聚合物中酶标抗体的个数增加,其生产成本会增加,相应的,其灵敏度的改善程度也会增加。但是,当酶标抗体的个数超过一定程度后,不仅其成本增加,而且其灵敏度的改善程度达到上限,甚至会因为分子量过大而发生聚集沉淀。
作为一个优选的实施方式,本发明实施例的检测试剂还包括第一试剂,作为上述酶标抗体聚合物的稀释缓冲液。其中,该第一试剂中含有丝胶蛋白,且丝胶蛋白在该第一试剂中的重量百分比含量为0.05%-5%。
丝胶蛋白提取于天然蚕丝,其链上有许多侧链较长的氨基酸,如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸等,以及含有许多极性亲水基团(如—OH、—COOH、—NH2、—NH等)位于多肽链表面。丝胶蛋白有较强的抗外力破坏和抗温度破坏的能力,其可明显提高酶标抗体聚合物的稳定性。
作为优选,本发明实施例的丝胶蛋白的分子量为10000-50000Da,其基本区重复2-8次,其氨基酸序列共38个碱基,具体为:gsrksggsss hedssksrde nvsttgsssn tdsnsssv。在第一试剂中加入具有该重复序列的多肽,可以增加稳定生物分子的能力。
作为优选,酶标抗体聚合物与第一试剂混合,且酶标抗体聚合物的浓度0.1~3μg/mL。当酶标抗体聚合物的浓度过低时,能够影响试剂的反应性;当酶标抗体聚合物的浓度过高时,则会造成浪费,而且可能阻碍抗原抗体之间的特异结合。
作为优选,第一试剂包括:丝胶蛋白、氯化镁、氯化锌、防腐剂和缓冲液;或,丝胶蛋白、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液。其中,丝胶蛋白可提高第一试剂的稳定性,金属离子可提高如碱性磷酸酶的活性,防腐剂防止溶液长菌,缓冲液提供缓冲环境。
进一步的,在该第一试剂中,丝胶蛋白的质量百分比含量为0.05%~5%,氯化镁的工作浓度为4~6mM,氯化锌的工作浓度为0.5~1.5mM,防腐剂的质量百分比含量为0.05%~1%。
在一实施例中,该第一试剂中,丝胶蛋白的质量百分比含量为0.05%~5%,氯化镁的工作浓度为5mM,氯化锌的工作浓度为1mM,防腐剂的质量百分比含量为0.5%。在使用过程中,将其作为选择碱性磷酸酶作为标记酶的酶标抗体聚合物的稀释液。
作为优选,第一试剂包括:丝胶蛋白、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液。其中,丝胶蛋白和牛血清白蛋白可提高第一试剂的稳定性,防腐剂防止溶液长菌,缓冲液提供缓冲环境。
进一步的,在该第一试剂中,丝胶蛋白的质量百分比含量为0.05%~5%,牛血清白蛋白的质量百分比含量为0.05%~5%,防腐剂的质量百分比含量为0.05%~1%。
在一实施例中,该第一试剂中,丝胶蛋白的质量百分比含量为0.05%~5%,牛血清白蛋白的质量百分比含量为0.5%,防腐剂的质量百分比含量为0.5%。在使用过程中,将其作为选择辣根碱过氧化物酶作为标记酶的酶标抗体聚合物的稀释液。
在本发明实施例中,缓冲液优选为Tris-HCl缓冲液、PBST缓冲液和MES缓冲液中的至少一种,且其活性成分的工作浓度优选为20mM。
在本发明实施例中,上述检测试剂盒还包括:化学发光底物。酶标抗体聚合物中的标记酶与化学发光底物相互作用时,标记酶可直接或间接催化化学底物发生反应,进而发射光子。
当酶标抗体聚合物中的标记酶为碱性磷酸酶时,化学发光底物选为APS-5((4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐)及其衍生物,或者为AMPPD(二氧杂环乙烷)及其衍生物。
APS-5和AMPPD均属于酶促化学发光底物,其可被碱性磷酸酶直接催化发光,具有较高的灵敏度。尤其是APS-5的发光时间短,可在极短时间内(10s)发光强度即达到峰值并在一段时间内保持稳定,因而能得到反应性高重复性好的测定结果。
作为优选,化学发光底物APS-5或AMPPD的工作浓度选为1~300ug/mL。化学发光底物的工作浓度过低时,底物反应性不达标,性能不好;化学发光底物的工作浓度过高时,底物用量较高,浪费资源,且噪底增加。
在本发明实施例中,当酶标抗体聚合物中的标记酶为辣根碱过氧化物酶时,化学发光底物为鲁米诺。
建议简述该化学发光底物的优点,及其与辣根碱过氧化物酶的作用特点。
作为优选,化学发光底物鲁米诺的工作浓度为1~300ug/mL。
建议简述这一特定浓度对化学发光反应的影响。
在本发明实施例中,上述检测试剂盒中还包括:肌钙蛋白T校准品;其中,肌钙蛋白T校准品的浓度分别为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL。
另一方面,本发明实施例还提供了上文所述检测试剂的制备方法,包括:
S011、提供金磁微粒和肌钙蛋白T抗体,将肌钙蛋白T抗体与金磁微粒反应,制备肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;
或,提供金磁微粒、链霉亲和素、生物素和肌钙蛋白T抗体,将链霉亲和素与金磁微粒反应,制备链霉亲和素包被的金磁微粒;将生物素与肌钙蛋白T抗体反应,制备生物素标记的肌钙蛋白T抗体;
S012、提供肌钙蛋白T抗体和标记酶,将肌钙蛋白T抗体和标记酶进行反应,得到酶标抗体;提供交联试剂,将交联试剂与酶标抗体在溶液中进行反应,制备酶标抗体聚合物。
具体的,在步骤S011中,当磁分离试剂包括肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒时,其制备为:将肌钙蛋白T抗体与金磁微粒反应,用于将肌钙蛋白T抗体直接与金磁微粒偶联。将肌钙蛋白T抗体与金磁微粒反应,这一步骤的实现可参考本领域技术人员的常规操作。
作为优选,金磁微粒和肌钙蛋白T抗体的质量比为10:(1~100)。
当肌钙蛋白T抗体与金磁微粒的重量比过低时,金磁微粒上包被的抗体量过少,导致金磁微粒上较多的结合位点浪费,降低包被效率;当肌钙蛋白T抗体与金磁微粒的重量比过高时,过量的抗体竞争结合位点,反而降低抗体与金磁微粒的包被效率,提高本底值,降低信噪比,受到背景光的干扰较大。
本发明实施例中,对肌钙蛋白T抗体与金磁微粒的反应温度不作具体限定,使得肌钙蛋白T抗体能够偶联金磁微粒即可,例如4~42℃;同样的,本发明实施例对其反应时间也不作具体限定,可为0.5~12h。
或者,当磁分离试剂包括:链霉亲和素包被的金磁微粒,以及生物素标记的肌钙蛋白T抗体时,其制备为:将链霉亲和素与金磁微粒反应,使得链霉亲和素偶联金磁微粒,用于制备链霉亲和素包被的金磁微粒;将生物素与肌钙蛋白T抗体反应,使得生物素偶联肌钙蛋白T抗体,用于制备生物素标记的肌钙蛋白T抗体。其具体实施步骤,可参考本领域技术人员的常规操作。检测时,通过链霉亲和素与生物素之间较强的亲和力和放大作用,以链霉亲和素和生物素作为偶联分子,实现金磁微粒与肌钙蛋白T抗体之间的连接。
作为优选,金磁微粒与链霉亲和素的质量比为1:(10~1000);生物素与肌钙蛋白T抗体的质量比为10:(1~100)。
本发明实施例中,对链霉亲和素与金磁微粒反应以及生物素与肌钙蛋白T抗体反应的温度不作具体限定,分别使得链霉亲和素能够偶联金磁微粒,生物素能够偶联肌钙蛋白T抗体即可;同样的,本发明实施例对其反应时间也不作具体限定。
在步骤S012中,将肌钙蛋白T抗体和标记酶进行反应,使得标记酶偶联肌钙蛋白T抗体,用于制备酶标抗体。其具体实施过程,可参考本领域技术人员的常规操作。在本发明实施例中,酶标抗体可直接采用市售商品,例如,碱性磷酸酶或辣根碱过氧化物酶标记的肌钙蛋白T抗体。
将交联试剂与酶标抗体在溶液中进行反应,使得多个酶标抗体聚合形成多分子聚合体,从而获得酶标抗体聚合物。其具体实施过程,可参考本领域技术人员的常规操作。
交联试剂是指将2个或更多个分子相互键合交联成较稳定的多分子聚合体的一类试剂。但凡能将多个酶标抗体相互联接形成多分子聚合体,且为酶标抗体间的联接提供碳桥的交联试剂,均能应用于本发明实施例中。
作为优选,交联试剂为同型双功能交联剂。同型双功能交联剂为一类分子两端各有一个相同的活性基团,可与其他分子上的氨基、羧基、巯基、羟基等发生共价结合而产生交联作用的试剂。相对于异型双功能交联剂来说,同型双功能交联剂在使用时,进行一种条件的活化过程和连接过程的操作更为简便。
检测抗体为一种蛋白质,通常的,在其赖氨酸(K)残基侧链及每条多肽的N端都具有多个伯胺。进一步的,本发明实施例所采用的同型双功能交联剂为氨基间交联剂。
作为优选,同型双功能交联剂选自二(磺基琥珀)辛二酸(简称:BS3)或其衍生物。
BS3为一种氨基间交联剂,其结构如图2所示,在每个8碳的间隔臂末端均含有一种具有氨基反应活性的N-羟基磺基琥珀(NHS)酯,蛋白质在其赖氨酸(K)残基侧链及每条多肽的N端都具有多个伯胺,容易通过BS3将多个酶标抗体聚合形成多分子聚合体。BS3含有亲水磺酰基团,可在多种常用缓冲液中溶解,溶解浓度最高达100mM,避免使用有机溶剂干扰蛋白结构。同时,BS3可与伯胺在pH7-9条件(温和条件)下反应生成稳定的酰胺键,反应条件温和,不会对反应物的活性造成影响。
在本发明实施例中,将交联试剂与酶标抗体在溶液中进行反应,具体为:将酶标抗体与缓冲液中溶解,配置酶标抗体溶液;然后,加入交联试剂与酶标抗体溶液混合,并在搅拌的状态下进行反应。
作为优选,BS3与酶标抗体的质量比为(0.1-10):1。BS3与酶标抗体在反应时处于合适的比例,能够得到合格的酶标抗体聚合物,当比例过高或过低都会降低桥连效率和造成原料的浪费。
作为优选,反应的温度为室温,反应的pH为6~9。反应条件温和,操作简便。当反应的温度和pH值过高或过低时,酶标抗体容易被极端条件破坏,导致解离和失活。
当交联试剂选为BS3时,BS3与伯胺在pH7-9条件下反应生成稳定的酰胺键,同时释放N-羟基磺基琥珀脱离基团。
作为优选,在反应结束之后,还包括对反应产物进行纯化。进一步的,所述纯化采用超滤的手段,且超滤的条件为:2~8℃,9000rmp,2~30min。
本发明实施例对交联试剂和酶标抗体的来源不作具体限定,其可采用市售产品,也可采用本领域常规技术手段制备获得的产物。
又一方面,基于上述检测试剂盒的技术方案,本发明实施例还提供了一种肌钙蛋白T的检测方法,包括:
S021、提供待测样品和上述检测试剂盒,将待测样品与前述检测试剂盒中的磁分离试剂及其酶标试剂混合,进行反应,得到复合物;
S022、提供化学发光底物,将所述化学发光底物与复合物混匀,进行化学发光反应,并采用发光检测仪检测发光强度,计算待测样本中肌钙蛋白T的含量。
本发明实施例所提供的检测方法中,酶标试剂中的酶标抗体聚合物含多个检测抗体,可增强捕获抗原的敏感性,且与抗原间接连接的标记酶数量增多,能够有效放大化学发光检测的反应信号值,增强检测灵敏度;而且,磁分离试剂中的金磁微粒,其检测抗体包被效率高,检测抗体活性稳定,进一步增强了检测的灵敏度。
在本发明实施例中,当酶标抗体聚合物中的标记酶为碱性磷酸酶时,化学发光底物选为APS-5((4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐)及其衍生物,或者为AMPPD(二氧杂环乙烷)及其衍生物;当酶标抗体聚合物中的标记酶为辣根碱过氧化物酶时,化学发光底物为鲁米诺。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解,以及本发明实施例检测试剂及其制备方法和应用的进步性能显著地体现,以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。
实施例1
本实施例提供了一种化学发光检测试剂盒,包括:磁分离试剂、酶标试剂、化学发光底物液和校准品,其制备包括:
1、酶标试剂的制备
(1)选择肌钙蛋白T单克隆抗体作为检测抗体,按抗体体积的1/100加入12mg/mL的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液,混匀,在室温下放置30min,进行活化处理,得到活化后的抗体;
选择碱性磷酸酶作为标记酶,按碱性磷酸酶体积的1/10加入7mg/mL的Sulfo-SMCC溶液,混匀,在室温下放置25min,进行活化处理,得到活化后的碱性磷酸酶溶液;
将活化后的碱性磷酸酶和活化后的肌钙蛋白T单克隆抗体混合,在4℃下反应15h,制备碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体。
(2)将碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体采用PBS缓冲液溶解,选择BS3作为交联试剂并加入BS3,于室温轻搅反应70min,得反应产物;将反应产物置于超滤管中重复超滤3次,超滤条件设置为4℃、9000rmp和30min,收集超滤管内液体,得到纯化后的酶标抗体聚合物。
(3)将纯化后的酶标抗体聚合物加入第一试剂,混合,得到酶标试剂,并于4℃以下保存待用。
其中,第一试剂的配方为:丝胶蛋白5g,氯化镁5mM,氯化锌1mM,防腐剂Proclin3000.5g,PBST缓冲液(20mM)1000mL。
2、磁分离试剂选为肌钙蛋白T单克隆抗体包被的金磁微粒,其制备包括:
取1mg金磁微粒和0.1mg肌钙蛋白T抗体,于PBS缓冲液中混合,常温下反应12h,获得肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒。
3、化学发光底物液选为APS-5溶液。
4、校准品选为肌钙蛋白T溶液。
实施例2
本实施例提供了一种化学发光检测试剂盒,包括:磁分离试剂、酶标试剂、化学发光底物液和校准品,其制备包括:
1、酶标试剂的制备
(1)选择肌钙蛋白T单克隆抗体作为检测抗体,选择辣根碱过氧化物酶(HRP)作为标记酶;
将HRP进行离心,加入新配的0.3M NaIO4溶液,室温下避光搅拌50min,得到醛化HRP;采用0.05M、pH4.4的醋酸钠缓冲液进行超滤,超滤条件设为4℃、9000rmp、20min,超滤3次,收集纯化后的醛化HRP,加入1M、pH9.5的碳酸盐缓冲液,并调节pH至9.0~9.5,再加入肌钙蛋白T单克隆抗体,室温避光震荡7h;加0.1ml新配的9mg/mL的NaBH4溶液,震荡2h(27℃,1500rmp);用0.5M PH7.4PBS超滤3次(4℃,9000rmp,30min),收集超滤管内液体;在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,震荡20-60min(2-37℃,1000rmp);3000rpm离心半小时,弃上清,沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次,最后沉淀物溶于少量0.05-0.15M PH7.4的PBS中;用0.15M PH7.4的PBS缓冲盐超滤3次(2-8℃,9000rmp,2-30min),收集超滤管内液体。
(2)选择BS3作为交联试剂,将HRP标记的肌钙蛋白T单克隆抗体采用PBS缓冲液溶解,加入BS3,于室温轻搅反应70min,得反应产物;将反应产物置于超滤管中重复超滤3次,超滤条件设置为4℃、9000rmp和30min,收集超滤管内液体,得到纯化后的酶标抗体聚合物。
(3)将纯化后的酶标抗体聚合物加入第一试剂,混合,得到酶标试剂,并于4℃以下保存。
其中,第一试剂的配方为:丝胶蛋白2.5g,牛血清白蛋白5g,防腐剂Proclin3000.5g,Tris缓冲液(20mM)1000mL。
2、磁分离试剂包括:链霉亲和素包被的金磁微粒,以及生物素标记的肌钙蛋白T单克隆抗体,其制备包括:
(1)取1mg金磁微粒和0.2mg链霉亲和素,于PBS缓冲液中混合,常温下反应12h,获得链霉亲和素包被的金磁微粒;
(2)取1mg生物素和0.1mg肌钙蛋白T抗体,于PBS缓冲液中混合,常温下反应12h,获得生物素标记的金磁微粒。
3、化学发光底物液选为鲁米诺溶液。
4、校准品选为肌钙蛋白T溶液。
对比例1
本对比例与实施例1相比,其区别在于:本对比例的酶标试剂包括:碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体和第一试剂。
其余地方与实施例1基本相同,此处不再一一赘述。
对比例2
本对比例与实施例1相比,其区别在于:本对比例的酶标试剂包括:碱性磷酸酶标记的肌钙蛋白T单克隆抗体和Tris缓冲液。
其余地方与实施例1基本相同,此处不再一一赘述。
测试例
1、稳定性测试
分别取实施例1~2和对比例1~2的酶标试剂,置于37℃环境下静置8天,然后检测其酶活,表1为检测结果。
表1
2、取实施例1~2和对比例1的化学发光检测试剂盒,采用化学发光法进行检测血液样品中的肌钙蛋白T,考察并记录这几个试剂盒的检测限、重复性和检测范围,表2为检测结果。
表2
实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | |
成本 | 最低 | 低 | 高 |
检测限(pg/mL) | 1.2 | 1.8 | 3 |
重复性(cv%) | 3.2 | 2.7 | 5 |
检测范围(pg/mL) | 1.2~15000 | 1.8~15000 | 3~15000 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测试剂盒,其特征在于,包括:磁分离试剂和酶标试剂;
磁分离试剂,包括:肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;或,包括:链霉亲和素包被的金磁微粒以及生物素标记的肌钙蛋白T抗体;
酶标试剂,包括:酶标抗体聚合物;所述酶标抗体聚合物包括:酶标抗体至少两个,以及碳桥;所述碳桥联接任意两个或以上、相邻或不相邻的所述酶标抗体,且所述碳桥上具有用于联接所述酶标抗体的联接位点,所述联接位点至少两个;所述酶标抗体包括检测抗体和偶联于所述检测抗体的标记酶,所述联接位点联接所述检测抗体和/或所述标记酶。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根碱过氧化物酶;和/或
所述碳桥为直链的碳链结构或支链的碳链结构,且所述联接位点位于所述碳桥的端部;和/或
所述碳桥通过所述联接位点以酰胺键与所述肌钙蛋白T抗体和/或所述标记酶联接。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述酶标试剂中还包括:第一试剂,所述第一试剂含有丝胶蛋白;
在所述第一试剂中,所述丝胶蛋白的重量百分比含量为0.05%~5%。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述酶标抗体聚合物与所述第一试剂混合,且所述酶标抗体聚合物的浓度为0.01~5ug/mL。
5.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述第一试剂包括:丝胶蛋白、氯化镁、氯化锌、防腐剂和缓冲液;或,丝胶蛋白、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液;
所述第一试剂中,所述丝胶蛋白的质量百分比含量为0.05%~5%;所述氯化镁的工作浓度为4~6mM;所述氯化锌的工作浓度为0.5~1.5mM;所述防腐剂的质量百分比含量为0.05%~1%;所述牛血清白蛋白百分比含量为0.05%~5%。
6.权利要求1至5任一项所述的检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括:
S011、提供金磁微粒和肌钙蛋白T抗体,将所述肌钙蛋白T抗体与所述金磁微粒反应,制备肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒;
或,提供金磁微粒、链霉亲和素、生物素和肌钙蛋白T抗体,将所述链霉亲和素与所述金磁微粒反应,制备链霉亲和素包被的金磁微粒;将所述生物素与所述肌钙蛋白T抗体反应,制备生物素标记的肌钙蛋白T抗体;
S012、提供肌钙蛋白T抗体和标记酶,将所述肌钙蛋白T抗体和所述标记酶进行反应,得到酶标抗体;提供交联试剂,将所述交联试剂与所述酶标抗体在溶液中进行反应,制备酶标抗体聚合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根碱过氧化物酶;和/或
所述交联试剂为同型双功能交联剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述同型双功能交联剂选自二(磺基琥珀)辛二酸或其衍生物。
9.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,在制备肌钙蛋白T抗体包被的金磁微粒中,所述金磁微粒和肌钙蛋白T抗体的质量比为(10~1000):1;或,
在制备链霉亲和素包被的金磁微粒中,所述金磁微粒与所述链霉亲和素的质量比为1:(10~1000);在制备生物素标记的肌钙蛋白T抗体中,所述生物素与所述肌钙蛋白T抗体的质量比为10:(1~100)。
10.一种肌钙蛋白T的检测方法,其特征在于,包括:
S021、提供待测样品和权利要求1至5任一项所述的检测试剂盒,将待测样品、磁分离试剂和酶标试剂混合,进行反应,得到复合物;
S022、提供化学发光底物,将所述化学发光底物与所述复合物混匀,进行化学发光反应,并采用发光检测仪检测发光强度,计算待测样本中肌钙蛋白T的含量。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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