CN113777324A - 生长刺激表达因子2即时检测试剂盒、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒、其制备方法及应用，其中，即时检测试剂盒包括碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液、羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液、发光底物工作液和工作清洗液；发光底物工作液包括底物溶剂和0.5％牛血清白蛋白；底物溶剂包括以下组分：二乙醇胺40％、1M氢氧化钠溶液30％、0.1M氯化镁溶液10％、0.25％Proclin300溶液10％、0.5％gemini表面活性剂溶液5％和AMPPD5％。gemini表面活性剂溶液的表面排列的更紧密，表面能更低，具有较高的表面活性，能够提高AMPPD在蒸馏水中的溶解度，促进了化学发光反应效率，并且具有更低的临界胶束浓度。牛血清白蛋白和gemini表面活性剂配合使用，能够显著的增强发光度，进而显著的增强了检测灵敏度。

Description

生长刺激表达因子2即时检测试剂盒、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒、其制备方法及应用。

背景技术

心力衰竭简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和/或舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群.此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心衰的诊断主要依据临床表现。然而，临床上的心衰可能会由于症状轻、肥胖导致的体征不明显以及合并肺部疾病等原因难以诊断，加之缺乏灵敏性和特异性都高的实验室参考指标，极为不利于心衰诊断及病情程度的判断。

生长刺激表达因子2(growth stimulating express gene 2,ST2)是近年来发现的一种新型心血管病生物标志物，生长刺激表达因子2的基因位于染色体2q12，由328个氨基酸组成，包括由9个氨基酸组成的独特C段序列，分子量约为40KD，主要在心肌细胞、心脏成纤维细胞以及辅助T细胞类淋巴细胞的表面表达，表达后可以分泌到细胞外。生长刺激表达因子2是白细胞介素1(IL-1)受体家族成员，主要为可溶性生长刺激表达因子2(sST2)和跨膜型生长刺激表达因子2(ST2L)两种。sST2是通过机械应力的诱导产生释放的一种蛋白质，在成纤维细胞及心肌细胞受到机械性拉伸的情况下，可引起白细胞介素3和生长刺激表达因子2的生成释放，导致血清中生长刺激表达因子2水平升高。心衰的程度越重，心室受到的机械张力越大，生长刺激表达因子2生成释放越多，血清中的生长刺激表达因子2浓度越高。生长刺激表达因子2作为IL-33的受体，与IL-33结合后阻断IL-33与ST2L的结合，减弱其下游通路激活所引起的心脏保护作用，进而加重心机重塑和心功能障碍，并增加心脏发生病变的机率。因此，血清中ST2的含量可能成为心力衰竭的新诊断指标，提高心功能状态诊断的全面性和准确性，为心力衰竭的分级、分层和预后估计提供更客观的依据。

目前，传统的生长刺激表达因子2检测试剂盒用于检测血清中的生长刺激表达因子2的含量时，灵敏度较低。

发明内容

为解决传统的生长刺激表达因子2检测试剂盒用于检测血清中的生长刺激表达因子2的含量时，灵敏度较低的问题，本发明提供一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒、其制备方法及应用。

为实现本发明目的提供的一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，包括碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液、羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液、发光底物工作液和工作清洗液；

发光底物工作液包括底物溶剂和0.5％牛血清白蛋白；

底物溶剂包括以下组分：

在其中一个具体实施例中，碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液包括碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液、0.001％碱性磷酸酶和0.0003％抗生长刺激表达因子2抗体。

在其中一个具体实施例中，碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液包括0.05M磷酸缓冲盐溶液、3.5-8.0％牛血清白蛋白和0.1％Proclin300。

在其中一个具体实施例中，羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液包括羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液、0.1％羟基磁珠和0.0001％抗生长刺激表达因子2抗体。

在其中一个具体实施例中，羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液包括0.05M磷酸缓冲盐溶液、0.05％牛血清白蛋白、5％蔗糖和0.1％Proclin300。

在其中一个具体实施例中，工作清洗液包括50-200mM Tris-HCl溶液、0.05-0.2％吐温-20、0.1％Proclin300和0.05％曲拉通-100。

在其中一个具体实施例中，还包括校准品和质控品；

校准品包括浓度分别为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL和300ng/mL的生长刺激表达因子2抗原溶液；

质控品包括浓度分别为5ng/mL、35ng/mL的生长刺激表达因子2抗原溶液。

在其中一个具体实施例中，校准品所用溶剂为校准品稀释液；

校准品稀释液包括0.05M磷酸缓冲盐溶液、1.0-5.0％牛血清白蛋白、5％蔗糖和0.2％Proclin300。

基于同一构思的一种上述任一具体实施例提供的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

制备检测试剂盒的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液：

配制碱性磷酸酶溶液，并将碱性磷酸酶溶液进行氧化；向氧化后的碱性磷酸酶溶液中加入抗生长刺激表达因子2抗体，使氧化后的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体；将标记有碱性磷酸酶的抗生长刺激表达因子2抗体加入碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液中以形成碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液；

制备检测试剂盒的羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液：

从羟基磁珠溶液中提取羟基磁珠，并对羟基磁珠进行清洗；将清洗完的羟基磁珠进行活化；向活化后的羟基磁珠中加入抗生长刺激表达因子2抗体，使羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体；对包被抗生长刺激表达因子2抗体的羟基磁珠进行清洗；向清洗完的包被抗生长刺激表达因子2抗体的羟基磁珠内加入羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液以形成羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液。

基于同一构思的一种上述任一具体实施例提供的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒的应用，将待检测样品和检测试剂盒的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液混匀，室温下反应10min，以形成第一免疫复合物；向检测试剂盒的羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液中加入第一免疫复合物，室温下反应10min，以形成第二免疫复合物；使用工作清洗液对第二免疫复合物清洗数次；向清洗后的第二免疫复合物中滴入检测试剂盒的发光底物工作液。

本发明的有益效果：本发明的即时检测试剂盒采用采用酶促化学发光-双抗体夹心法，分别使用碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液和羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液，加入样品后，通过抗原抗体的反应，形成免疫复合物，经过温育，洗涤去除未结合的物质后，加入发光底物工作液，免疫复合物上的碱性磷酸酶会催化发光底物反应产生光信号，发光值与样本中生长刺激表达因子2的浓度成正比。发光底物工作液包括底物溶剂和0.5％牛血清白蛋白，底物溶剂包括二乙醇胺40％、1M氢氧化钠溶液30％、0.1M氯化镁溶液10％、0.25％Proclin300溶液10％、0.5％gemini表面活性剂溶液5％和AMPPD5％。gemini表面活性剂溶液的表面排列的更紧密，表面能更低，具有较高的表面活性，能够提高AMPPD在蒸馏水中的溶解度，促进了化学发光反应效率，并且具有更低的临界胶束浓度，低使用量能够避免产生泡沫。牛血清白蛋白和gemini表面活性剂配合使用，能够显著的增强发光度，进而显著的增强了检测的灵敏度。相较于胶体金、免疫层析和免疫荧光法，检测的灵敏度更高，重复性也更好。相较于操作复杂，且体积较大的自动化学发光仪器，即时检测试剂盒受检测场地影响较小，经济效益高，满足了医疗设备较为匮乏的基层医疗机构的需求，提升了基层医疗机构的诊断水平，促进了分级诊疗。

附图说明

图1是本发明一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒的校准曲线图；

图2是本发明一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒中试剂条一具体实施例的结构示意图。

具体实施方式

为了进一步地理解本发明，下面对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明的一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒包括碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液、羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液、发光底物工作液和工作清洗液。其中，发光底物工作液包括底物溶剂和0.5％牛血清白蛋白。底物溶剂包括以下组分：

在此实施例中，采用酶促化学发光-双抗体夹心法，分别使用碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液和羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液，加入样品后，通过抗原抗体的反应，形成免疫复合物，经过温育，洗涤去除未结合的物质后，加入发光底物工作液，免疫复合物上的碱性磷酸酶会催化发光底物反应产生光信号，发光值与样本中生长刺激表达因子2的浓度成正比，样本内生长刺激表达因子2的含量由仪器内所储存的校准曲线转换生长刺激表达因子2的浓度。其中，发光底物工作液包括底物溶剂和0.5％牛血清白蛋白，此处，需要说明的是，0.5％牛血清白蛋白是指每100ml的底物溶剂中加入0.5g牛血清白蛋白。底物溶剂包括二乙醇胺40％、1M氢氧化钠溶液30％、0.1M氯化镁溶液10％、0.25％Proclin300溶液10％、0.5％gemini表面活性剂溶液5％和AMPPD5％，即，每100mL底物溶剂中含有40mL二乙醇胺、30mL物质的量浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液、10mL物质的量浓度为0.1mol/L的氯化镁溶液、10mL0.25％Proclin300溶液、5mL0.5％gemini表面活性剂溶液和5mLAMPPD。此处，需要说明的是，氢氧化钠溶液、氯化镁溶液、Proclin300溶液和gemini表面活性剂溶液所用溶剂均为蒸馏水，0.25％Proclin300溶液是指每100ml蒸馏水加入0.25mLProclin300，0.5％gemini表面活性剂溶液是指每100mL蒸馏水加入0.5g的gemini表面活性剂。AMPPD为3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷，是一种超敏碱性磷酸酶底物。gemini表面活性剂溶液的表面排列的更紧密，表面能更低，具有较高的表面活性，能够提高AMPPD在蒸馏水中的溶解度，促进了化学发光反应效率，并且具有更低的临界胶束浓度，低使用量能够避免产生泡沫。牛血清白蛋白和gemini表面活性剂配合使用，能够显著的增强发光度，进而显著的增强了检测的灵敏度。相较于胶体金、免疫层析和免疫荧光法，检测的灵敏度更高，重复性也更好。相较于操作复杂，且体积较大的自动化学发光仪器，即时检测试剂盒受检测场地影响较小，经济效益高，满足了医疗设备较为匮乏的基层医疗机构的需求，提升了基层医疗机构的诊断水平，促进了分级诊疗。

需要指出的是，抗生长刺激表达因子2抗体购于重庆探生，浓度为4mg/mL。生长刺激表达因子2抗原购于重庆探生，浓度为3mg/mL。碱性磷酸酶购于武汉全臻生物科技有限公司，浓度为18.45mg/mL。羧基磁珠购于英潍捷基(上海)贸易有限公司，浓度为10mg/mL。蔗糖、吐温-20、曲拉通-100、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、2-(N-吗啉)乙磺酸、乙二醇、过碘酸钠和硼氢化钠等常规化学试剂购于国药集团化学试剂有限公司。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、牛血清白蛋白和Proclin-300等购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。所用检测仪器为北京普朗新技术有限公司生产的普朗PHX-60化学发光免疫分析仪(京械注准20172400562)。

在本发明一具体实施例中，碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液包括碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液、0.001％碱性磷酸酶和0.0003％抗生长刺激表达因子2抗体。其中，碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液包括pH为7.4的0.05M磷酸缓冲盐溶液、3.5-8.0％牛血清白蛋白和0.1％Proclin300。此处，需要说明的是，0.001％碱性磷酸酶是指每100mL碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液中加入0.001g碱性磷酸酶，0.0003％抗生长刺激表达因子2抗体是指每100mL碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液中加入0.0003g抗生长刺激表达因子2抗体。3.5-8.0％牛血清白蛋白是指每100mL物质的量浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液中加入3.5-8.0g牛血清白蛋白，0.1％Proclin300指每100mL物质的量浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液中加入0.1mLProclin300。

在本发明一具体实施例中，羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液包括包括羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液、0.1％羟基磁珠和0.0001％抗生长刺激表达因子2抗体。其中，羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液包括pH为7.4的0.05M磷酸缓冲盐溶液、0.05％牛血清白蛋白、5％蔗糖和0.1％Proclin300。此处，需要说明的是，0.1％羟基磁珠是指每100mL羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液中加入0.1g羟基磁珠，羟基磁珠的直径为1.0μm-5.0μm，内核为四氧化三铁或三氧化二铁，表面修饰基团为羟基。0.0001％抗生长刺激表达因子2抗体是指每100mL羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液中加入0.0001抗生长刺激表达因子2抗体。0.05％牛血清白蛋白是指每100mL物质的量浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液中加入0.05g牛血清白蛋白，5％蔗糖是指每100mL物质的量浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液中加入5g蔗糖，0.1％Proclin300是指每100mL物质的量浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液中加入0.1mL的Proclin300。

在本发明一具体实施例中，工作清洗液包括pH为7.0-9.0的50mM-200mM Tris-HCl溶液、0.05-0.2％吐温-20、0.1％Proclin300和0.05％曲拉通-100。此处，需要说明的是，Tris为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。0.05-0.2％吐温-20是指每100mL物质的量浓度为100mmol/L的Tris-HCl溶液中加入0.05-0.2mL吐温-20，0.1％Proclin300是指每100mL物质的量浓度为100mmol/L的Tris-HCl溶液中加入0.1mL的Proclin300，0.05％曲拉通-100是指每100mL物质的量浓度为100mmol/L的Tris-HCl溶液中加入0.05mL曲拉通-100。

在本发明一具体实施例中，还包括校准品。校准品包括浓度分别为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL和300ng/mL的生长刺激表达因子2抗原溶液。质控品包括浓度为5ng/mL、35ng/mL的生长刺激表达因子2抗原溶液。校准品及质控品所用生长刺激表达因子2抗原为天然生长刺激表达因子2抗原。校准品所用稀释液为校准品稀释液，其包括pH为7.4的物质的量浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液、5％蔗糖、1.0-5.0％牛血清白蛋白和0.2％Proclin300。另外，pH为7.4的物质的量浓度为0.05mol/L的磷酸缓冲盐溶液替换为Tris-HCl溶液或者4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。使用校准品稀释液，依次倍比将校准品的母液稀释成0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL和300ng/mL这6个浓度点的生长刺激表达因子2抗原溶液，于2-8℃保存。

本发明还提供一种上述任一具体实施例提供的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

制备检测试剂盒的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液：

配制碱性磷酸酶溶液，并将碱性磷酸酶溶液进行氧化。向氧化后的碱性磷酸酶溶液中加入抗生长刺激表达因子2抗体，使氧化后的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体。将标记有碱性磷酸酶的抗生长刺激表达因子2抗体加入碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液中以形成碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液。

首先，制备pH为9.0的100mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、0.05M过碘酸钠缓冲液、0.06％乙二醇溶液(每100mL蒸馏水中加入0.06mL乙二醇)、3mg/mL的硼氢化钠溶液和碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液。然后，进行碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液的制备。碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液的制备步骤如下：

(1)氧化碱性磷酸酶溶液：向100μL蒸馏水中加入0.1mg碱性磷酸酶，以制得碱性磷酸酶溶液。再向碱性磷酸酶溶液中加入100μL 0.05M过碘酸钠缓冲液，室温下反应30min，之后，再向碱性磷酸酶溶液中加入20μL 0.06％乙二醇溶液，室温下反应10min；

(2)碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体：向氧化后的碱性磷酸酶溶液中加入300μg抗体，并使之混合均匀。然后，再加入200μL100mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，室温下反应30min，之后，再加入100mL3mg/mL的硼氢化钠溶液，在4℃下反应2小时；

(3)制备碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液：将标记有碱性磷酸酶的抗生长刺激表达因子2抗体溶液进行过柱收集，之后，加入10mL碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液，使之混匀。将碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液置于2-8℃下备用。

制备所述检测试剂盒的羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液：

从羟基磁珠溶液中提取羟基磁珠，并对所述羟基磁珠进行清洗。将清洗完的所述羟基磁珠进行活化。向活化后的所述羟基磁珠中加入所述抗生长刺激表达因子2抗体，使所述羟基磁珠包被所述抗生长刺激表达因子2抗体。对包被所述抗生长刺激表达因子2抗体的所述羟基磁珠进行清洗。向清洗完的包被所述抗生长刺激表达因子2抗体的所述羟基磁珠内加入羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液以形成所述羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液。

首先，制备羟基磁珠缓冲液、羟基磁珠活化剂、羟基磁珠清洗液和羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液。然后，进行羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液的制备。其中，羟基磁珠缓冲液包括pH为5.0的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液和0.1％曲拉通-100，即，每100mL2-(N-吗啉)乙磺酸溶液中加入0.1mL曲拉通-100。羟基磁珠活化剂包括蒸馏水、1％1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3％N-羟基硫代琥珀酰亚胺，即，每100mL蒸馏水中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐1g和N-羟基硫代琥珀酰亚胺3g。羟基磁珠清洗液包括pH为6.5-8.8的0.02M-0.07M磷酸缓冲盐溶液和0.5％吐温-20，即，每100mL的物质的量浓度为0.02-0.07mol/L的磷酸缓冲盐溶液加入0.5mL吐温-20。羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液的制备步骤如下：

(1)提取羟基磁珠：量取10mL浓度为10mg/mL的羟基磁珠溶液至磁珠偶联容器中，再将磁珠偶联容器置于磁架上进行磁分离，磁分离时长为2min。然后，弃去上清液；

(2)对磁珠进行清洗：向磁珠偶联容器中加入2mL羟基磁珠缓冲液，并使之混匀，10min后将磁珠偶联容器置于磁架上进行磁分离，磁分离时长为2min。然后，弃去上清液。对磁珠进行清洗的步骤(2)重复两次；

(3)对羟基磁珠进行活化：准确移取200μL羟基磁珠活化剂加入磁珠偶联容器中，再向磁珠偶联容器加入9mL羟基磁珠缓冲液，并使之混匀。然后，将磁珠偶联容器放置于混匀器上，室温下混匀反应30min。之后，将磁珠偶联容器置于磁架上进行磁分离，磁分离时长为2min。然后，弃去上清液。

(4)羟基磁珠和抗生长刺激表达因子2抗体进行偶联：先向磁珠偶联容器中加入100μg抗生长刺激表达因子2抗体，并摇匀。然后，再补入一定体积的羟基磁珠缓冲液，此处，需要说明的是，在步骤(4)中，加入磁珠偶联容器中的抗生长刺激表达因子2抗体体积和羟基磁珠缓冲液体积和值为10mL。使磁珠偶联容器的溶液混匀后，将磁珠偶联容器放置于混匀器上，室温下反应12小时以上。之后，将磁珠偶联容器置于磁架上进行磁分离，磁分离时长为2min。然后，弃去上清液；

(5)对羟基磁珠进行清洗：向磁珠偶联容器加入20mL羟基磁珠清洗液，然后，将磁珠偶联容器放置在混匀器上，清洗10分钟后，将磁珠偶联容器置于磁架上进行磁分离，磁分离时长为2min。然后，弃去上清液。对羟基磁珠进行清洗的步骤(5)重复三次。

(6)制备羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液：向磁珠偶联容器加入10mL羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液，使之混匀。将羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液置于2-8℃下备用

本发明还提供一种上述任一具体实施例提供的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒的应用，将待检测样品和检测试剂盒的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液混匀，室温下反应10min，以形成第一免疫复合物。向检测试剂盒的羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液中加入第一免疫复合物，室温下反应10min，以形成第二免疫复合物。使用工作清洗液对第二免疫复合物清洗3-5次。向清洗后的第二免疫复合物中滴入检测试剂盒的发光底物工作液。采用双抗体夹心法联合磁微粒化学发光技术，将抗原-抗体的高特异性与酶发光的高灵敏度结合在一起，将化学发光技术与即时检测技术结合，能够即时准确地检测出生长刺激表达因子2的指标。整体上，检测灵敏度较高、操作更为便捷、重复性更好、检测结果更为可靠，解决了心肌梗死等时效性强的疾病的诊治以及获得准确结果以指导后期治疗的问题。

在即时检测试剂盒设置有25个试剂条，每个试剂条的构造均如图2所示，在每个试剂条上设置有13个孔，从试剂条的左端至右端依次为第1号孔、第2号孔、第3号孔、第4号孔、第5号孔、第6号孔、第7号孔、第8号孔、第9号孔、第10号孔、第11号孔、第12号孔和第13号孔。

对每个试剂条进行组装：将至少20μL的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液置于试剂条的第8号孔内，将至少20μL羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液置于第9孔内，将100μL发光底物工作液置于第10号孔内，将2000μL的工作清洗液等分成五份，分别置于第2孔内、第3孔内、第4孔内、第5孔内、第6孔内。使用时，第1孔可用于承装50μL的待测样品或50uL校准品。第13孔为反应孔，发光底物工作液与羟基磁珠在第13孔内反应发光。

如图1所示，建立校准曲线：使用北京普朗新技术有限公司生产的普朗PHX-60化学发光免疫分析仪(京械注准20172400562)，进入校准程序，设置测试参数：在室温下，同时从第1孔内吸取50uL校准品和第8孔内吸取20uL碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液，室温下混匀反应10min。然后，将碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液和校准品的反应物加入第9孔内，室温下混匀反应10min，之后，再分别使用第2孔内、第3孔内、第4孔内、第5孔内、第6孔内的工作清洗液清洗对第9孔内的羟基磁珠进行五次清洗，然后，对清洗完的羟基磁珠进行收集，并从第10孔内吸取发光底物工作液加入到清洗完的羟基磁珠中，待发光底物工作液与清洗完的羟基磁珠混匀后，将其置于第13孔内，反应1min后，读取发光值。根据发光值和校准品浓度，建立校准曲线。

校准品浓度和发光值的对应关系如表1所示：

表1

样本测试过程如下：使用北京普朗新技术有限公司生产的普朗PHX-60化学发光免疫分析仪(京械注准20172400562)，进入校准程序，设置测试参数：在室温下，同时从第1孔内吸取50uL待测样本和第8孔内吸取20uL碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液，室温下混匀反应10min，以形成第一免疫复合物。然后，将第一免疫复合物加入第9孔内，室温下混匀反应10min，以形成第二免疫复合物。之后，再分别使用第2孔内、第3孔内、第4孔内、第5孔内、第6孔内的工作清洗液清洗对第9孔内的第二免疫复合物进行五次清洗，然后，对清洗完的第二免疫复合物进行收集，并从第10孔内吸取发光底物工作液加入到清洗完的第二免疫复合物中，待发光底物工作液与清洗完的第二免疫复合物混匀后，将其置于第13孔内，反应1min后，读取发光值。通过校准曲线，计算得出样本度值。

产品性能测试：

检出限：检出限浓度不高于0.1ng/mL；

线性测试结果：介于0.1-300ng/mL；

重复性评价：变异系数不大于10.0％；

批间差：变异系数不大于15.0％；

检测结果的准确度评价：回收率介于85％-115％之间。

1.最低检出限

1.1空白限

以校准品稀释液作为空白样本,用本发明制备的检测条测定20次,计算平均值，带入拟合曲线计算空白限，测试结果如表2所示：

表2

得到空白限浓度为0.05ng/mL

1.2检出限建立

对5份浓度近似LOB的低值进行检测，每份检测5次，对检测结果按照大小进行排序，得到中位数，百分5分位，检出限＝中位数-百分5分位+空白限，测试结果如表3所示：

表3

得到检出限为0.1ng/mL。

2.线性建立

用校准品稀释液稀释浓度为300ng/ml的高值样本,混合成稀释比例为1/3000、1/1000、1/500、1/100、1/50、1/20、1/10、1/5、1/2、1共10个不同梯度的样品,每个稀释浓度的样本重复测试3次，分别求出测定结果的均值,计算理论浓度与实际浓度的相对偏差和绝对偏差，结果表明，本发明试剂，在[0.1～300]ng/mL区间内，线性相关系数(r)应不低于0.9990，且线性区间[0.1～15]ng/mL内，绝对偏差在±2.25ng/mL范围内；线性区间[15～300]pg/mL内，相对偏差在±10％范围内。测试结果如表4所示：

表4

3.重复性评价

本发明试剂重复检测两个水平质控20次，计算CV均在10％之内，测试结果如表5所示：

表5

4.准确度评价

纯品配制成浓度约为700ng/mL的ST2样本(A)加入到血清B中，所加入ST2样本与血清B之间的体积比例为1:19，每份样本各测定3次取平均值。根据以下公式计算结果，可见本发明制备的检测条制备方法回收率在101.37％。

式中：R为回收率，V为加入A液的体积，V0为血清样本B的体积，c为血清样本加入A液后的检测浓度，c0为血清样本B的检测浓度，cs为A液的浓度。测试结果如表6所示：

表6

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一个具体实施例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对所述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的范围内，根据本发明的技术方案及其发明的构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，包括：碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液、羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液、发光底物工作液和工作清洗液；

所述发光底物工作液包括底物溶剂和0.5％牛血清白蛋白；

所述底物溶剂包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液包括碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液、0.001％碱性磷酸酶和0.0003％抗生长刺激表达因子2抗体。

3.根据权利要求2所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液包括0.05M磷酸缓冲盐溶液、3.5-8.0％所述牛血清白蛋白和0.1％Proclin300。

4.根据权利要求1所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，所述羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液包括羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液、0.1％羟基磁珠和0.0001％抗生长刺激表达因子2抗体。

5.根据权利要求4所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，所述羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液包括0.05M磷酸缓冲盐溶液、0.05％所述牛血清白蛋白、5％蔗糖和0.1％Proclin300。

6.根据权利要求2至5任一项所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，所述工作清洗液包括50-200mM Tris-HCl溶液、0.05-0.2％吐温-20、0.1％Proclin300和0.05％曲拉通-100。

7.根据权利要求2至5任一项所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，还包括校准品和质控品；

所述校准品包括浓度分别为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、150ng/mL和300ng/mL的生长刺激表达因子2抗原溶液；

所述质控品包括浓度分别为5ng/mL、35ng/mL的生长刺激表达因子2抗原溶液。

8.根据权利要求7所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒，其特征在于，所述校准品所用溶剂为校准品稀释液；

所述校准品稀释液包括0.05M磷酸缓冲盐溶液、1.0-5.0％牛血清白蛋白、5％蔗糖和0.2％Proclin300。

9.一种权利要求1至8任一项所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备所述检测试剂盒的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液：

配制碱性磷酸酶溶液，并将所述碱性磷酸酶溶液进行氧化；向氧化后的所述碱性磷酸酶溶液中加入抗生长刺激表达因子2抗体，使氧化后的所述碱性磷酸酶标记所述抗生长刺激表达因子2抗体；将标记有所述碱性磷酸酶的所述抗生长刺激表达因子2抗体加入碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体稀释液中以形成所述碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液；

制备所述检测试剂盒的羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液：

从羟基磁珠溶液中提取羟基磁珠，并对所述羟基磁珠进行清洗；将清洗完的所述羟基磁珠进行活化；向活化后的所述羟基磁珠中加入所述抗生长刺激表达因子2抗体，使所述羟基磁珠包被所述抗生长刺激表达因子2抗体；对包被所述抗生长刺激表达因子2抗体的所述羟基磁珠进行清洗；向清洗完的包被所述抗生长刺激表达因子2抗体的所述羟基磁珠内加入羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体稀释液以形成所述羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液。

10.一种权利要求1至8任一项所述的生长刺激表达因子2即时检测试剂盒的应用，其特征在于，将待检测样品和所述检测试剂盒的碱性磷酸酶标记抗生长刺激表达因子2抗体工作液混匀，室温下反应10min，以形成第一免疫复合物；向所述检测试剂盒的羟基磁珠包被抗生长刺激表达因子2抗体工作液中加入所述第一免疫复合物，室温下反应10min，以形成第二免疫复合物；使用工作清洗液对所述第二免疫复合物清洗数次；向清洗后的所述第二免疫复合物中滴入所述检测试剂盒的发光底物工作液。

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