DE69328182T2

DE69328182T2 - Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze

Info

Publication number: DE69328182T2
Application number: DE69328182T
Authority: DE
Inventors: E. Freitag; Douglas Wilsey
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1992-07-02
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 2000-09-28
Anticipated expiration: 2013-07-02
Also published as: EP0654079B1; ES2145054T3; WO1994001544A1; EP0654079A1; EP0654079A4; DE69328182D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die chemische Analyse eines Analyten durch Bildung eines farbigen Indikators.

Hintergrund der Erfindung

Eine gebräuchliche Möglichkeit zur indirekten Messung der Menge eines Analyten in einer Probe besteht darin, den Analyten an einer Reaktionsfolge zu beteiligen, die zur Bildung einer Färbung führt, wobei die Intensität der erzeugten Färbung proportional zur Analytmenge in der Probe ist. Bei einem bekannten Verfahren zur Durchführung dieser Art eines chemischen Tests werden Reagenzien verwendet, die ein Phenazin- Derivat und ein Tetrazolium-Salz enthalten (das System : Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz). Das System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz läßt sich für die Glucose-Analyse anhand des folgenden Schemas schematisch darstellen:
Weitere Erläuterungen zum System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz in der chemischen Analyse finden sich in den folgenden Zitaten: Findlay et al., US-Patent 4 713 327, ausgestellt am 15. Dezember 1987; Josef et al., US-Patent 3 791 988, ausgestellt am 12. Februar 1974; Forgione et al., US-Patent 3 929 580, ausgestellt am 30. Dezember 1975; Shigeta et al., US-Patent 4 803 158, ausgestellt am 7. Februar 1989; Self, US-Patent 4 446 231, ausgestellt am 1. Mai 1984; und Self, US-Patent 4 598 042, ausgestellt am 1. Juli 1986.
JP-A 51 063 688 und US-A 4 427 771 offenbaren Reagenzien, umfassend ein Enzym, eine Tetrazolium-Verbindung oder ein solches Salz, Phenazinmethosulfat und ein Salz eines zweiwertigen Metalls, bei dem es sich um ein Magnesiumsalz handelt. Dieses Magnesiumsalz fungiert lediglich als Enzymcofaktor.
US-A 4 748 115 und US-A 4 946 776 beschreiben Zusammensetzungen, umfassend ein Tetrazolium-Salz und Magnesiumchlorid. In diesen Zitaten findet sich jedoch nichts über die Gegenwart eines Phenazin-Derivats.
US-A 4 892 817 lehrt eine Zusammensetzung, umfassend ein Tetrazolium-Salz und ein wasserlösliches Cyanoferrat(III)/Cyanoferrat(II)-Salz oder eine solche Manganat(VII)/Manganat(IV)-Kombination. Auch in diesem Zitat ist die Gegenwart eines Phenazin-Derivats nicht beschrieben. Bevorzugte Zusammensetzungen enthalten keine Metall-Ionen außer Kalium oder Natrium.
Ein Problem beim System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz besteht in der Stabilität des Phenazin-Derivats und des Tetrazolium-Salzes, besonders dann, wenn das Phenazin-Derivat und das Tetrazolium-Salz in einem einzigen Reagens oder in einem Film bei pHs oberhalb etwa 5,5 enthalten sind. Bei pHs oberhalb etwa 5,5 gewinnen photochemischer Abbau des Phenazin-Derivats und Autoreduktion des Tetrazolium-Salzes an Bedeutung und stören die genaue und präzise Korrelation des Formazans mit dem zu messenden Analyten. Da bei vielen Analysen Enzyme verwendet werden, die am besten bei pHs von etwa 5,5 bis etwa 7,8 arbeiten, ist die Bereitstellung von Mitteln erwünscht, die das System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz in diesem pH-Bereich stabilisieren.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Bei der Erfindung handelt es sich um ein stabiles Reagens für die Analyse eines Analyten. Das Reagens enthält ein Enzym, ein Phenazin-Derivat, ein Tetrazolium-Salz und ein Salz eines zweiwertigen Metalls von hinreichender Art und in ausreichender Menge, um das Reagens zu stabilisieren.
Die Reagenziensysteme Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz werden bei pHs oberhalb etwa 5,5 instabil. Viele Enzyme wie etwa Glucosedehydrogenase, Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase arbeiten jedoch bei pHs über 7 optimal. Wichtig ist, daß durch Beigabe des Salzes eines zweiwertigen Metalls zum Reagens das System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz bei pHs von etwa 5,5 bis etwa 7,8 stabilisiert wird, so daß bestimmte Enzyme (etwa die vorstehend erwähnten Enzyme) bei der Analyse eines Analyten optimal arbeiten können (bei pHs oberhalb etwa 7,8 beginnen die Phenazin-Derivate sich zu zersetzen.)
Das erfinderische Reagens kann in Form einer Lösung bereitgestellt oder in einen Film, ein Gewebenetz, eine Glasfasermatrix oder eine Papiermatrix eingebracht werden. Die Stabilisierung eines Films mit dem erfinderischen Reagens ist besonders wichtig, da normales Trocknen von Filmen, die ein Phenazin-Derivat und ein Tetrazolium-Salz enthalten, zur Zersetzung des Reagens führen kann.
Die Erfindung beschreibt auch Analysenverfahren unter Verwendung des erfinderischen Reagens.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das erfinderische Reagens ist brauchbar für die Analyse eines Analyten (beispielsweise Glucose). Das Reagens enthält mindestens ein Enzym (zum Beispiel Glucoseoxidase), ein Phenazin-Derivat (zum Beispiel Phenazinethosulfat), ein Tetrazolium-Salz (zum Beispiel Iodnitrotetrazoliumchlorid (INT) oder 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazoliumbromid (MTT)) und ein Salz eines zweiwertigen Metalls (wie z. B. Nickelchlorid oder Mangansulfat). Wird das Reagens in Form einer Lösung bereitgestellt, so enthält das Reagens auch Wasser. Wird das Reagens in einem Film bereitgestellt, dann wird ein filmbildendes Mittel (wie etwa Hydroxyethylcellulose und Polyvinylpropionat, zu beziehen durch BASF und vertrieben unter dem Warenzeichen PROPIOFAN 70D) beigegeben (MTT ist sehr empfindlich und wurde in einem Film nicht stabilisiert). Bei einem Film wird das Wasser durch Trocknen des Film im wesentlichen aus dem Reagens entfernt.
Im Reagens muß das Enzym von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um die Reaktion von Analyt und Phenazin-Derivat zu katalysieren. Die Art des Enzyms richtet sich nach dem zu analysierenden Analyten. Ist der Analyt beispielsweise Glucose, so kann das Enzym Glucoseoxidase sein. Weitere beispielhafte Analyt/Enzym-Kombinationen sind nachstehend in Tabelle 1 aufgezählt.

Tabelle 1

Analyt Enzym

Glucose Glucosedehydrogenase und Diaphorase
Cholesterin Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase
HDL-Cholesterin Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase
Triglyceride Lipoproteinlipase, Glycerinkinase, Glycerin-3- phosphatoxidase
Lactat Lactatoxidase
Lactat Lactatdehydrogenase und Diaphorase
Lactatdehydrogenase Diaphorase
Pyruvat Pyruvatoxidase
Alkohol Alkoholoxidase
Bilirubin Bilirubinoxidase
Die Menge an Enzym richtet sich nach der gewünschten Analysengeschwindigkeit (je mehr zugesetztes Enzym, desto schneller der Test).
Das eingesetzte Phenazin-Derivat muß von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um die Reduktion des Tetrazolium-Salzes zu katalysieren. Im Kontext dieser Erfindung werden Phenazin-Derivate als Elektronenträger verwendet, die die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtern. Beispiele für verwendbare Phenazin-Derivate sind nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Phenazin-Derivat:

Phenazinethosulfat
Phenazinmethosulfat
1-Methoxyphenazinmethosulfat
Da das Phenazin-Derivat bei der Analyse ein Katalysator ist, der nicht aufgebraucht wird, ist - bezogen auf den zu messenden Analyten - weniger als ein molares Äquivalent an Phenazin-Derivat im Reagens erforderlich.
Das eingesetzte Tetrazolium-Salz muß von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert wird. Das reduzierte Tetrazolium-Salz ist ein Formazan, bei dem es sich um einen farbigen Indikator handelt. Die Menge dieses bei der Analyse gebildeten farbigen Indikators wird mit der Menge Analyt in der gemessenen Probe korreliert. Beispiele für die im Reagens verwendbaren Tetrazolium-Salze sind nachstehend in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Tetrazolium-Salze:

MTT (falls das Reagens in Form einer Lösung ist; Anmerkung: bekanntermaßen chelatiert Nickelchlorid MTT (MTT-Formazan) und verursacht eine Wellenlängenverschiebung im MTT-Formazan.)
Iodnitrotetrazoliumchlorid (INT)
Tetranitroblautetrazoliumchlorid (TNBT)
Da wenigstens ein molares Äquivalent Tetrazolium-Salz in bezug auf den zu messenden Analyten vorhanden sein muß, sollte eine ausreichende Menge Tetrazolium-Salz im Reagens enthalten sein, um den hohen Bereich der erwarteten Analytkonzentrationen in der zu messenden Probe abzudecken.
Im Mittelpunkt dieser Erfindung steht die Beigabe eines Salzes eines zweiwertigen Metalls zum Reagens. Das Salz des zweiwertigen Metalls muß von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um das Reagens zu stabilisieren. Zu diesen Salzen zweiwertiger Metalle gehören Salze mit einem Kation, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nickel, Mangan und Magnesium, und einem inerten Anion (ein Anion, das bei der Analyse auf den zu messenden Analyten nicht chemisch reagiert). Zu den speziellen Beispielen für derartige Salze eines zweiwertigen Metalls gehören Nickelchlorid, Mangansulfat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid und Nickelsulfat. Zur Stabilisierung des Reagens können die Salze des zweiwertigen Metalls dem Reagens einzeln oder in Kombination zugegeben werden. Zudem kann durch Zugabe einer Kombination dieser Salze zweiwertiger Metalle zum Reagens dieses Reagens bisweilen besser stabilisiert werden als durch Zugabe eines einzigen Salzes eines zweiwertigen Metalls.
Das Metall(II)-Salz Cobaltchlorid, das Lösungen eine rote Farbe verleiht, kann ein flüssiges Reagens stabilisieren, das TRIS-Puffer enthält (siehe Tabelle 4). Cobaltchlorid reagiert jedoch mit HEPES-Puffer (siehe Tabelle 4) bei pH 7,55. Zudem kann Cobaltchlorid in einem Film (oder in einem Gewebenetz, einer Glasfasermatrix oder einer Papiermatrix), der ein Tetrazolium-Salz enthält, nicht verwendet werden, da Cobaltchlorid beim Trocknen einen blau gefärbten Komplex mit Wasser bildet und dadurch die Analyse stört, da Formazane blau gefärbt sind.
Bei der Stabilisierung eines flüssigen Reagens durch Zugabe von Salzen zweiwertiger Metalle sollte das molare Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat wenigstens etwa 30 : 1 betragen. Bei Anwendung dieses Verhältnisses in einem Flüssigreagens, das Magnesiumchlorid und Phenazinethosulfat enthielt, war ein Flüssigreagens, das kein Tetrazolium-Salz enthielt, unter den herrschenden Bedingungen von Laborraumbeleuchtung und -temperatur über wenigstens 2 Stunden stabil (war kein zweiwertiges Kation vorhanden, so war dieses Flüssigreagens für weniger als zwei Stunden stabil). Es wird angenommen, daß die Stabilität eines Flüssigreagens, das auch ein Tetrazolium-Salz enthält, in etwa die gleiche ist, denn es scheint, daß der größte Teil der Instabilität des Reagens auf die Instabilität des Phenazin-Derivats zurückgeht (zum Beispiel war eine wäßrige Lösung, die einen Puffer und MTT enthielt, über wenigstens 3 Stunden stabil).
Mit molaren Verhältnissen von Magnesiumchlorid zu Phenazinethosulfat von 30 : 1, 60 : 1, 120 : 1 und 187 : 1 waren die Reagenzien unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend angegeben über wenigstens 2 Stunden, 3 Stunden, 3 Tage bzw. 3 Tage stabil (wobei wiederum angenommen wird, daß die Stabilität des Reagens bei Beigabe eines Tetrazolium-Salzes in etwa die gleiche wäre).
Es können auch molare Verhältnisse von Salzen zweiwertiger Metalle zu Phenazin-Derivat von mehr als 187 : 1 angewandt werden, solange die Salze der zweiwertigen Metalle im Reagens löslich sind und etwaige erforderliche pH-Einstellungen am Reagens vorgenommen werden (zum Beispiel ist bei molaren Verhältnissen von Nickelchlorid zu Phenazinethosulfat von mehr als 30 : 1 eine Einstellung des pH des Reagens erforderlich, da durch Zugabe von Nickelchlorid der pH des Reagens abgesenkt wird). Je höher der pH des Reagens ist, desto höher muß außerdem das molare Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat sein, damit das Reagens stabilisiert wird. Das höhere molare Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat ist bei höheren pHs erforderlich, weil die Zersetzung von Phenazin-Derivat und Tetrazolium-Salz im Reagens bei höheren pHs mehr ins Gewicht fällt.
Zur Stabilisierung eines Films, eines Gewebenetzes, einer Glasfasermatrix und einer Papiermatrix sollte das Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat wenigstens etwa 15 : 1 betragen, wenn der pH des Reagens etwa 6,8 ist, und wenigstens etwa 25 : 1, wenn der pH des Reagens etwa 7,4 ist. (Wie beim Flüssigreagens ist dass zur Stabilisierung des Films erforderliche Verhältnis von. Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat bei höheren pHs höher, da die Zersetzung von Phenazin-Derivat und Tetrazolium-Salz im Film, im Gewebenetz, in der Glasfasermatrix und in der Papiermatrix bei höheren pHs mehr ins Gewicht fällt. Zur Stabilisierung eines Films, eines Gewebenetzes, einer Glasfasermatrix und einer Papiermatrix, die MTT enthalten, müßten die Verhältnisse ebenfalls höher sein. Die Stabilisierung eines Films, eines Gewebenetzes, einer Glasfasermatrix und einer Papiermatrix, die MTT enthalten, ist bei Luftfeuchtigkeitsbedingungen von unter etwa 15% einfacher.) Es können auch höhere Verhältnisse von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat angewandt werden, doch wird durch diese höheren Verhältnisse keine weitere Stabilisierung erreicht.
Wichtig ist, daß durch Beigabe von Salzen zweiwertiger Metalle das Reagens Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz bei pHs von etwa 5,5 bis etwa 7,8 stabilisiert wird (Filme, die kein Salz eines zweiwertigen Metalls enthalten, zeigen nach 15minütigem Trocknen des nassen Film bei etwa 50ºC eine Formazan-Blindreaktion). Ohne Beigabe eines Salzes eines zweiwertigen Metalls ist das Reagens bei pHs unterhalb etwa 5,5 stabil. Bei pHs oberhalb etwa 5,5 gewinnt jedoch die Zersetzung der Phenazin-Derivate und die Autoreduktion der Tetrazolium-Salze an Bedeutung. Das Problem der Zersetzung der Phenazin-Derivate und Tetrazolium-Salze verschlimmert sich bei steigendem pH. Erwünscht ist die Durchführung der Analysen bei pH-Werten oberhalb etwa 5,5, weil viele Enzyme bei pH-Werten oberhalb etwa 5,5 optimal arbeiten. Zum Beispiel arbeitet Glucosedehydrogenase bei einem pH von etwa 7,9 optimal, und Hexokinase sowie Glucose-6-phosphatdehydrogenase arbeiten bei einem pH von etwa 7,8 optimal. Durch Beigabe der Salze zweiwertiger Metalle der vorliegenden Erfindung wird die Zersetzung von Phenazin-Derivat und Tetrazolium-Salz im pH-Bereich von 5,5 bis etwa 7,8 unmerklich, so daß sich Analysen in diesem pH- Bereich (wo bestimmte Enzyme am besten arbeiten) besser durchführen lassen. Besonders wichtig ist zudem die Stabilisierung von Filmen, die ein Phenazin-Derivat und ein Tetrazolium-Salz enthalten, weil sich die Zersetzung des Phenazin- Derivats und des Tetrazolium-Salzes durch den bei der Bildung des Films angewandten Trocknungsvorgang verschlimmert.
Vorzugsweise ist im Reagens ein Puffer bereitgestellt, um einen pH zu ergeben, der für die Analyse am besten ist. Der Puffer sollte von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um einen pH zu ergeben und aufrechtzuerhalten, bei dem das Enzym als Katalysator arbeitet. Nachstehend sind in Tabelle 4 Puffer beispielhaft dargestellt, die in dem pH-Bereich verwendet werden können, in dem sie eine Lösung wirksam puffern.

Tabelle 4

PUFFER pH-Bereich

MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) 5,5-6,7
BIS-TIS (Bis[2-hydroxyethyl]imino-tris[hydroxymethyl]methan) 5,8-7,2
ADA (N-[2-Acetamido]-2-iminodiessigsäure) 6,0-7,2
PIPES (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure]) 6,1-7,5
ACES (2-[(2-Amino-2-oxoethyl)amino]ethansulfonsäure) 6,1-7,5
BIS-TRIS-PROPAN (1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)-methylamino]propan) 6,3-9,5
MOPSO (3-[N-Morpholino]-2-hydroxypropansulfonsäure) 6,2-7,6
BES (N,N-Bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethansulfonsäure) 6,4-7,8
MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure) 6,5-7,9
TES (N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethansulfonsäure) 6,8-8,2
HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) 6,8-8,2
TAPSO (3-[N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure) 7,0-8,2
POPSO (Piperazin-N,N'-bis[2-hydroxypropansulfonsäure]) 7,2-8,5
EPPS (N[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-3-propansulfonsäure) 7,3-8,7
TRIS (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) 7,0-9,0
RICIN (N-Tris[hydroxymethyl]methylglycin) 7,4-8,8
BICIN (N,N-Bis[2-hydroxyethyl]glycin) 7,6-9,0
TAPS (Tris[hydroxymethyl]methylaminopropansulfonsäure) 7,7-9,1
Beispiele für ein Flüssigreagens und einen Film sind nachstehend gegeben.

Reagensbeispiel 1

Ein Film kann mit den folgenden Bestandteilen in den folgenden Mengen hergestellt werden (Gesamtmasse der Bestandteile = 1 Kilogramm):
Bestandteil Menge in Gramm (sofern nichts anderes angegeben ist)
0,3 molar (M) HEPES-Puffer (pH = 7,5) 253,3
20 Gew.-% einer wäßrigen Zusammensetzung verschiedener Polyoxyethylenether und anderer oberflächenaktiver Verbindungen, vertrieben unter dem Warenzeichen TRITON X-100, zu beziehen durch Sigma Chemical Company 14,5
Mangansulfat 16,7 (99 mmol)
Nickelchlorid 23,6 (99 mmol)
Diatomit, vertrieben unter dem Warenzeichen CELATOM MW25, zu beziehen durch Eagle Picher 157,4
Titandioxid, zu beziehen durch Kronos als TiO&sub2; RN 43 148,3
Phenazinethosulfat, zu beziehen durch Research Organics, Inc. 1,3 (3,9 mmol)
3 : 2 : 1 (Gew./Gew./Gew.) Aceton/Hexanol/Methanol 4,2
50 : 50 (Gew./Gew.) Wasser/Polyvinylpropionat (vertrieben unter dem Warenzeichen PROPIOFAN 70D, zu beziehen durch BASF) 104,5
3% (Gew.) Methylcellulose, vertrieben unter dem Warenzeichen 261,9 TYLOSE MH 2000, zu beziehen durch Hoechst, in 0,3 M HEPES Puffer 261,
Glucoseoxidase (Güteklasse 1, zu beziehen durch Biozyme) 1754,4 Kiloeinheiten
INT 5,689 (11,25 mmol)
Der Film läßt sich wie folgt herstellen:
Schritt 1: 20 Gew.-% wäßriges TRITON X-100-Tensid werden dem 0,3 M HEPES-Puffer (pH = 7,5) zugesetzt;
Schritt 2: als nächstes werden Mangansulfat und Nickelchlorid zugegeben;
Schritt 3: sodann wird das Titandioxid zugesetzt, und es wird gerührt, bis die resultierende Mischung homogen ist;
Schritt 4: als nächstes wird der CELATOM MW25-Diatomit zugegeben;
Schritt 5: dann werden 3 Gew.-% der Methylcellulose TYLOSE MH 2000 in 0,3 M HEPES-Puffer zugesetzt;
Schritt 6: als nächstes wird PROPIOFAN 70D zugesetzt;
Schritt 7: dann wird Glucoseoxidase zugegeben;
Schritt 8: als nächstes wird INT zugesetzt;
Schritt 9: als nächstes wird Aceton/Hexanol/Methanol 3 : 2 : 1 (Gew./Gew./Gew.) zugegeben;
Schritt 10: zur Entfernung von Blasen wird zentrifugiert;
Schritt 11: als nächstes wird gerührt, bis der Inhalt homogen ist;
Schritt 12: dann wird der homogene Inhalt zur Entfernung von Klumpen durch einen Netzbeutel filtriert;
Schritt 13: als nächstes wird das Filtrat gerührt, bis es homogen ist;
Schritt 14: dann wird der Inhalt auf Cronar-Kunststoff aufbeschichtet, so daß sich eine Beschichtungsdicke von 250 Mikrometern (250 um) ergibt;
Schritt 15: die Beschichtung wird 30 Minuten lang bei 45ºC getrocknet.

Reagensbeispiel 2

Ein wäßriges Reagens läßt sich mit den folgenden Bestandteilen in den folgenden Konzentrationen herstellen:
Bestandteil Konzentration (millimolar (mM), sofern nichts anderes angegeben ist)
Wäßriger HEPES-Puffer (pH = 7,3) 100
Magnesiumchlorid 250
Phenazinethosulfat 5
Glucoseoxidase 1 Kiloeinheit/Milliliter (ml) Reagens
INT 12
Bei der Herstellung des oben angegebenen wäßrigen Reagens sollten Phenazinethosulfat und INT dem Reagens zuletzt zugesetzt werden.
Die Analyse eines Analyten läßt sich durch Ausführen der folgenden Schritte durchführen:
a) Bilden einer Testprobe durch Vereinigen einer den Analyten enthaltenden flüssigen Probe mit dem Reagens der vorliegenden Erfindung;
b) Inkubieren der Testprobe;
c) spektrophotometrisches Messen der inkubierten Testprobe; und
d) Korrelieren der spektrophotometrischen Messung mit der Konzentration des Analyten in der flüssigen Probe.
Inkubiertemperatur und Inkubierzeit richten sich nach der durchzuführenden Analyse. Die Wellenlänge der spektrophotometrischen Messung und die Art der spektrophotometrischen Messung (zum Beispiel Extinktion, Durchlässigkeit oder Reflexionsvermögen) richten sich nach dem im Reagens verwendeten Tetrazolium-Salz sowie danach, ob die spektrophotometrischen Messungen an einer Lösung (unter Verwendung eines Flüssigreagens) oder an einem Film durchgeführt werden. Beispiele für spezielle Analysenvorschriften unter Verwendung der oben beispielhaft dargestellten, speziell formulierten Reagenzien sind nachstehend gegeben.

Analysen auf Glucose

Analysenbeispiel 1

In einer Küvette werden 2,9 Milliliter (ml) des oben angegebenen Flüssigreagens (Reagensbeispiel 2) und 0,1 ml einer unbekannten flüssigen Probe, die eine unbekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 Milligramm (mg) Glucose pro Deziliter (dl) Probe enthält, vereinigt, und der resultierende Inhalt wird verwirbelt, um die unbekannte flüssige Probe mit dem Flüssigreagens zu vermischen (Analysenschritt a) oben). Der resultierende Inhalt wird bei Raumtemperatur 15 Sekunden lang inkubiert (Analysenschritt b) oben); dann wird die spektrophotometrische Extinktion des inkubierten resultierenden Inhalts bei 580 Nanometer (nm) abgelesen (Analysenschritt c) oben). Die spektrophotometrische Extinktion des inkubierten resultierenden Inhalts wird mit der spektrophotometrischen Extinktion eines Standards verglichen (d. h., das vorstehend erwähnte Flüssigreagens, das wie oben angegeben mit einer bekannten flüssigen Probe vereinigt und inkubiert wird, die eine bekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 mg Glucose pro dl Probe enthält), und die spektrophotometrische Extinktion des inkubierten resultierenden Inhalts wird mit der Glucose-Konzentration in der unbekannten flüssigen Probe korreliert (Analysenschritt d) oben).

Analysenbeispiel 2

Zur Durchführung einer Glucose-Analyse mit dem vorstehend beschriebenen Film (Reagensbeispiel 1) wird zur Benetzung des Films ausreichend unbekannte flüssige Probe zugesetzt, die eine unbekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 mg Glucose pro dl Probe enthält (Analysenschritt a) oben). Der benetzte Film wird etwa 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert (Analysenschritt b) oben). Das spektrophotometrische Reflexionsvermögen des inkubierten Films wird bei 580 nm gemessen (Analysenschritt c) oben). Das gemessene spektrophotometrische Reflexionsvermögen des Films bei 580 nm wird mit dem spektrophotometrischen Reflexionsvermögen eines Films verglichen, der wie vorstehend behandelt wurde, mit der Ausnahme, daß eine bekannte flüssige Probe (die eine bekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 mg Glucose pro dl Probe enthält) anstelle einer unbekannten flüssigen Probe zur Benetzung des Films verwendet wird, und das spektrophotometrische Reflexionsvermögen des inkubierten Films wird mit der Glucose-Konzentration in der unbekannten flüssigen Probe korreliert.
Die vorliegende Erfindung wurde anhand der obigen Lehren und Abbildungen mit hinreichender Klarheit und Knappheit offenbart, um dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung durchzuführen und anzuwenden, um die beste Art der Durchführung dieser Erfindung zu wissen und sie von anderen Erfindungen und von Altem zu unterscheiden. Zahlreiche Varianten und offensichtliche Anpassungen der Erfindung werden ohne weiteres ersichtlich sein, und diese sollen im Umfang der Erfindung wie nachstehend beansprucht enthalten sein.

Claims

1. Reagens, das zur Analyse eines Analyten brauchbar ist, umfassend:

ein Enzym, ein Tetrazolium-Salz, ein Phenazin-Derivat, das als Elektronenträger fungiert und die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtert, wenigstens ein Salz eines zweiwertigen Metalls, das nicht als Enzymcofaktor fungiert, wenn das Reagens zur Analyse des Analyten eingesetzt wird, und Wasser;

wobei das Enzym in ausreichender Menge vorliegt, um die Reaktion von Analyt und Phenazin-Derivat zu katalysieren;

wobei das Phenazin-Derivat in ausreichender Menge vorliegt, um die Reduktion des Tetrazolium-Salzes zu katalysieren;

wobei das Tetrazolium-Salz in ausreichender Menge vorliegt, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert wird; und

wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ein Nickel-, Mangan-, oder Magnesiumkation und ein inertes Anion aufweist und in ausreichender Menge vorliegt, um das Phenazin-Derivat und das Tetrazolium-Salz zu stabilisieren.

2. Reagens nach Anspruch 1, des weiteren umfassend: einen Puffer in ausreichender Menge, um einen pH für das Enzym bereitzustellen und aufrechtzuerhalten, so daß es als Katalysator wirkt.

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nikelchlorid, Mangansulfat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid und Nickelsulfat.

4. Reagens, das zur Analyse eines Analyten brauchbar ist, umfassend:

ein Enzym, ein Tetrazolium-Salz, ein Phenazin-Derivat, das als Elektronenträger fungiert und die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtert, ein Salz eines zweiwerti gen Metalls, das nicht als Enzymcofaktor fungiert, wenn das Reagens zur Analyse des Analyten eingesetzt wird, einen Puffer und Wasser;

wobei das Tetrazolium-Salz in ausreichender Menge vorliegt, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert wird, das Salz des zweiwertigen Metalls Cobaltchlorid in ausreichender Menge ist, um das Phenazin-Derivat und das Tetrazolium-Salz zu stabilisieren; und

der Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan in ausreichender Menge ist, um einen pH für das Enzym bereitzustellen und aufrechtzuerhalten, so daß es als Katalysator wirkt.

5. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nickelchlorid, Mangansulfat und Nickelsulfat.

6. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Molverhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin- Derivat wenigstens etwa 30 : 1 beträgt.

7. Reagens nach Anspruch 6, wobei der pH des Reagens etwa 5,5 bis etwa 7,8 beträgt.

8. Reagens, das in einen Film, ein Gewebenetz, eine Glasfasermatrix oder in eine Papiermatrix eingebracht und für die Analyse eines Analyten aus einer flüssigen Probe brauchbar ist, umfassend:

ein Enzym, ein Tetrazolium-Salz, ein Phenazin-Derivat, das als Elektronenträger fungiert und die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtert, sowie wenigstens ein Salz eines zweiwertigen Metalls, das nicht als Enzymcofaktor fungiert, wenn das Reagens zur Analyse des Analyten ein gesetzt wird;

wobei das Tetrazolium-Salz in ausreichender Menge vorliegt, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert ist; und

9. Reagens nach Anspruch 8, des weiteren umfassend: einen Puffer in ausreichender Menge, um einen pH für das Enzym bereitzustellen und aufrechtzuerhalten, so daß es als Katalysator wirkt.

10. Reagens nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Molverhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat wenigstens etwa 15 : 1 beträgt.

11. Reagens nach den Ansprüchen 8 bis 10, wobei das Molverhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin- Derivat wenigstens etwa 25 : 1 beträgt.

12. Reagens nach Anspruch 11, wobei der Puffer in ausreichender Menge vorliegt, um einen pH von etwa 5,5 bis etwa 7,8 zu ergeben, wenn die den Analyten enthaltende flüssige Probe dem Reagens zugesetzt wird.

13. Reagens nach den Ansprüchen 8 bis 12, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nickelchlorid, Mangansulfat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid und Nickelsulfat.

14. Reagens nach Anspruch 13, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nikelchlorid, Mangansulfat und Nickelsulfat.

15. Verfahren zum Testen auf einen Analyten, umfassend die Schritte:

a) Bilden einer Testprobe durch Vereinigen einer den Analyten enthaltenden flüssigen Probe mit dem Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 14;

b) Inkubieren der Testprobe;

c) spektrophotometrische Messung der inkubierten Testprobe; und

d) Korrelieren der spektrophotometrischen Messung mit der Konzentration des Analyten in der flüssigen Probe.