DE69328182T2 - Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze - Google Patents

Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze

Info

Publication number
DE69328182T2
DE69328182T2 DE69328182T DE69328182T DE69328182T2 DE 69328182 T2 DE69328182 T2 DE 69328182T2 DE 69328182 T DE69328182 T DE 69328182T DE 69328182 T DE69328182 T DE 69328182T DE 69328182 T2 DE69328182 T2 DE 69328182T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
reagent
salt
analyte
divalent metal
phenazine derivative
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69328182T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69328182D1 (de
Inventor
E. Freitag
Douglas Wilsey
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics Operations Inc
Original Assignee
Roche Diagnostics Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics Corp filed Critical Roche Diagnostics Corp
Application granted granted Critical
Publication of DE69328182D1 publication Critical patent/DE69328182D1/de
Publication of DE69328182T2 publication Critical patent/DE69328182T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die chemische Analyse eines Analyten durch Bildung eines farbigen Indikators.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine gebräuchliche Möglichkeit zur indirekten Messung der Menge eines Analyten in einer Probe besteht darin, den Analyten an einer Reaktionsfolge zu beteiligen, die zur Bildung einer Färbung führt, wobei die Intensität der erzeugten Färbung proportional zur Analytmenge in der Probe ist. Bei einem bekannten Verfahren zur Durchführung dieser Art eines chemischen Tests werden Reagenzien verwendet, die ein Phenazin- Derivat und ein Tetrazolium-Salz enthalten (das System : Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz). Das System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz läßt sich für die Glucose-Analyse anhand des folgenden Schemas schematisch darstellen:
  • Weitere Erläuterungen zum System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz in der chemischen Analyse finden sich in den folgenden Zitaten: Findlay et al., US-Patent 4 713 327, ausgestellt am 15. Dezember 1987; Josef et al., US-Patent 3 791 988, ausgestellt am 12. Februar 1974; Forgione et al., US-Patent 3 929 580, ausgestellt am 30. Dezember 1975; Shigeta et al., US-Patent 4 803 158, ausgestellt am 7. Februar 1989; Self, US-Patent 4 446 231, ausgestellt am 1. Mai 1984; und Self, US-Patent 4 598 042, ausgestellt am 1. Juli 1986.
  • JP-A 51 063 688 und US-A 4 427 771 offenbaren Reagenzien, umfassend ein Enzym, eine Tetrazolium-Verbindung oder ein solches Salz, Phenazinmethosulfat und ein Salz eines zweiwertigen Metalls, bei dem es sich um ein Magnesiumsalz handelt. Dieses Magnesiumsalz fungiert lediglich als Enzymcofaktor.
  • US-A 4 748 115 und US-A 4 946 776 beschreiben Zusammensetzungen, umfassend ein Tetrazolium-Salz und Magnesiumchlorid. In diesen Zitaten findet sich jedoch nichts über die Gegenwart eines Phenazin-Derivats.
  • US-A 4 892 817 lehrt eine Zusammensetzung, umfassend ein Tetrazolium-Salz und ein wasserlösliches Cyanoferrat(III)/Cyanoferrat(II)-Salz oder eine solche Manganat(VII)/Manganat(IV)-Kombination. Auch in diesem Zitat ist die Gegenwart eines Phenazin-Derivats nicht beschrieben. Bevorzugte Zusammensetzungen enthalten keine Metall-Ionen außer Kalium oder Natrium.
  • Ein Problem beim System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz besteht in der Stabilität des Phenazin-Derivats und des Tetrazolium-Salzes, besonders dann, wenn das Phenazin-Derivat und das Tetrazolium-Salz in einem einzigen Reagens oder in einem Film bei pHs oberhalb etwa 5,5 enthalten sind. Bei pHs oberhalb etwa 5,5 gewinnen photochemischer Abbau des Phenazin-Derivats und Autoreduktion des Tetrazolium-Salzes an Bedeutung und stören die genaue und präzise Korrelation des Formazans mit dem zu messenden Analyten. Da bei vielen Analysen Enzyme verwendet werden, die am besten bei pHs von etwa 5,5 bis etwa 7,8 arbeiten, ist die Bereitstellung von Mitteln erwünscht, die das System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz in diesem pH-Bereich stabilisieren.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Bei der Erfindung handelt es sich um ein stabiles Reagens für die Analyse eines Analyten. Das Reagens enthält ein Enzym, ein Phenazin-Derivat, ein Tetrazolium-Salz und ein Salz eines zweiwertigen Metalls von hinreichender Art und in ausreichender Menge, um das Reagens zu stabilisieren.
  • Die Reagenziensysteme Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz werden bei pHs oberhalb etwa 5,5 instabil. Viele Enzyme wie etwa Glucosedehydrogenase, Hexokinase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase arbeiten jedoch bei pHs über 7 optimal. Wichtig ist, daß durch Beigabe des Salzes eines zweiwertigen Metalls zum Reagens das System Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz bei pHs von etwa 5,5 bis etwa 7,8 stabilisiert wird, so daß bestimmte Enzyme (etwa die vorstehend erwähnten Enzyme) bei der Analyse eines Analyten optimal arbeiten können (bei pHs oberhalb etwa 7,8 beginnen die Phenazin-Derivate sich zu zersetzen.)
  • Das erfinderische Reagens kann in Form einer Lösung bereitgestellt oder in einen Film, ein Gewebenetz, eine Glasfasermatrix oder eine Papiermatrix eingebracht werden. Die Stabilisierung eines Films mit dem erfinderischen Reagens ist besonders wichtig, da normales Trocknen von Filmen, die ein Phenazin-Derivat und ein Tetrazolium-Salz enthalten, zur Zersetzung des Reagens führen kann.
  • Die Erfindung beschreibt auch Analysenverfahren unter Verwendung des erfinderischen Reagens.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Das erfinderische Reagens ist brauchbar für die Analyse eines Analyten (beispielsweise Glucose). Das Reagens enthält mindestens ein Enzym (zum Beispiel Glucoseoxidase), ein Phenazin-Derivat (zum Beispiel Phenazinethosulfat), ein Tetrazolium-Salz (zum Beispiel Iodnitrotetrazoliumchlorid (INT) oder 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H- tetrazoliumbromid (MTT)) und ein Salz eines zweiwertigen Metalls (wie z. B. Nickelchlorid oder Mangansulfat). Wird das Reagens in Form einer Lösung bereitgestellt, so enthält das Reagens auch Wasser. Wird das Reagens in einem Film bereitgestellt, dann wird ein filmbildendes Mittel (wie etwa Hydroxyethylcellulose und Polyvinylpropionat, zu beziehen durch BASF und vertrieben unter dem Warenzeichen PROPIOFAN 70D) beigegeben (MTT ist sehr empfindlich und wurde in einem Film nicht stabilisiert). Bei einem Film wird das Wasser durch Trocknen des Film im wesentlichen aus dem Reagens entfernt.
  • Im Reagens muß das Enzym von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um die Reaktion von Analyt und Phenazin-Derivat zu katalysieren. Die Art des Enzyms richtet sich nach dem zu analysierenden Analyten. Ist der Analyt beispielsweise Glucose, so kann das Enzym Glucoseoxidase sein. Weitere beispielhafte Analyt/Enzym-Kombinationen sind nachstehend in Tabelle 1 aufgezählt.
  • Tabelle 1 Analyt Enzym
  • Glucose Glucosedehydrogenase und Diaphorase
  • Cholesterin Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase
  • HDL-Cholesterin Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase
  • Triglyceride Lipoproteinlipase, Glycerinkinase, Glycerin-3- phosphatoxidase
  • Lactat Lactatoxidase
  • Lactat Lactatdehydrogenase und Diaphorase
  • Lactatdehydrogenase Diaphorase
  • Pyruvat Pyruvatoxidase
  • Alkohol Alkoholoxidase
  • Bilirubin Bilirubinoxidase
  • Die Menge an Enzym richtet sich nach der gewünschten Analysengeschwindigkeit (je mehr zugesetztes Enzym, desto schneller der Test).
  • Das eingesetzte Phenazin-Derivat muß von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um die Reduktion des Tetrazolium-Salzes zu katalysieren. Im Kontext dieser Erfindung werden Phenazin-Derivate als Elektronenträger verwendet, die die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtern. Beispiele für verwendbare Phenazin-Derivate sind nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt.
  • Tabelle 2 Phenazin-Derivat:
  • Phenazinethosulfat
  • Phenazinmethosulfat
  • 1-Methoxyphenazinmethosulfat
  • Da das Phenazin-Derivat bei der Analyse ein Katalysator ist, der nicht aufgebraucht wird, ist - bezogen auf den zu messenden Analyten - weniger als ein molares Äquivalent an Phenazin-Derivat im Reagens erforderlich.
  • Das eingesetzte Tetrazolium-Salz muß von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert wird. Das reduzierte Tetrazolium-Salz ist ein Formazan, bei dem es sich um einen farbigen Indikator handelt. Die Menge dieses bei der Analyse gebildeten farbigen Indikators wird mit der Menge Analyt in der gemessenen Probe korreliert. Beispiele für die im Reagens verwendbaren Tetrazolium-Salze sind nachstehend in Tabelle 3 aufgeführt.
  • Tabelle 3 Tetrazolium-Salze:
  • MTT (falls das Reagens in Form einer Lösung ist; Anmerkung: bekanntermaßen chelatiert Nickelchlorid MTT (MTT-Formazan) und verursacht eine Wellenlängenverschiebung im MTT-Formazan.)
  • Iodnitrotetrazoliumchlorid (INT)
  • Tetranitroblautetrazoliumchlorid (TNBT)
  • Da wenigstens ein molares Äquivalent Tetrazolium-Salz in bezug auf den zu messenden Analyten vorhanden sein muß, sollte eine ausreichende Menge Tetrazolium-Salz im Reagens enthalten sein, um den hohen Bereich der erwarteten Analytkonzentrationen in der zu messenden Probe abzudecken.
  • Im Mittelpunkt dieser Erfindung steht die Beigabe eines Salzes eines zweiwertigen Metalls zum Reagens. Das Salz des zweiwertigen Metalls muß von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um das Reagens zu stabilisieren. Zu diesen Salzen zweiwertiger Metalle gehören Salze mit einem Kation, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nickel, Mangan und Magnesium, und einem inerten Anion (ein Anion, das bei der Analyse auf den zu messenden Analyten nicht chemisch reagiert). Zu den speziellen Beispielen für derartige Salze eines zweiwertigen Metalls gehören Nickelchlorid, Mangansulfat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid und Nickelsulfat. Zur Stabilisierung des Reagens können die Salze des zweiwertigen Metalls dem Reagens einzeln oder in Kombination zugegeben werden. Zudem kann durch Zugabe einer Kombination dieser Salze zweiwertiger Metalle zum Reagens dieses Reagens bisweilen besser stabilisiert werden als durch Zugabe eines einzigen Salzes eines zweiwertigen Metalls.
  • Das Metall(II)-Salz Cobaltchlorid, das Lösungen eine rote Farbe verleiht, kann ein flüssiges Reagens stabilisieren, das TRIS-Puffer enthält (siehe Tabelle 4). Cobaltchlorid reagiert jedoch mit HEPES-Puffer (siehe Tabelle 4) bei pH 7,55. Zudem kann Cobaltchlorid in einem Film (oder in einem Gewebenetz, einer Glasfasermatrix oder einer Papiermatrix), der ein Tetrazolium-Salz enthält, nicht verwendet werden, da Cobaltchlorid beim Trocknen einen blau gefärbten Komplex mit Wasser bildet und dadurch die Analyse stört, da Formazane blau gefärbt sind.
  • Bei der Stabilisierung eines flüssigen Reagens durch Zugabe von Salzen zweiwertiger Metalle sollte das molare Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat wenigstens etwa 30 : 1 betragen. Bei Anwendung dieses Verhältnisses in einem Flüssigreagens, das Magnesiumchlorid und Phenazinethosulfat enthielt, war ein Flüssigreagens, das kein Tetrazolium-Salz enthielt, unter den herrschenden Bedingungen von Laborraumbeleuchtung und -temperatur über wenigstens 2 Stunden stabil (war kein zweiwertiges Kation vorhanden, so war dieses Flüssigreagens für weniger als zwei Stunden stabil). Es wird angenommen, daß die Stabilität eines Flüssigreagens, das auch ein Tetrazolium-Salz enthält, in etwa die gleiche ist, denn es scheint, daß der größte Teil der Instabilität des Reagens auf die Instabilität des Phenazin-Derivats zurückgeht (zum Beispiel war eine wäßrige Lösung, die einen Puffer und MTT enthielt, über wenigstens 3 Stunden stabil).
  • Mit molaren Verhältnissen von Magnesiumchlorid zu Phenazinethosulfat von 30 : 1, 60 : 1, 120 : 1 und 187 : 1 waren die Reagenzien unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend angegeben über wenigstens 2 Stunden, 3 Stunden, 3 Tage bzw. 3 Tage stabil (wobei wiederum angenommen wird, daß die Stabilität des Reagens bei Beigabe eines Tetrazolium-Salzes in etwa die gleiche wäre).
  • Es können auch molare Verhältnisse von Salzen zweiwertiger Metalle zu Phenazin-Derivat von mehr als 187 : 1 angewandt werden, solange die Salze der zweiwertigen Metalle im Reagens löslich sind und etwaige erforderliche pH-Einstellungen am Reagens vorgenommen werden (zum Beispiel ist bei molaren Verhältnissen von Nickelchlorid zu Phenazinethosulfat von mehr als 30 : 1 eine Einstellung des pH des Reagens erforderlich, da durch Zugabe von Nickelchlorid der pH des Reagens abgesenkt wird). Je höher der pH des Reagens ist, desto höher muß außerdem das molare Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat sein, damit das Reagens stabilisiert wird. Das höhere molare Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat ist bei höheren pHs erforderlich, weil die Zersetzung von Phenazin-Derivat und Tetrazolium-Salz im Reagens bei höheren pHs mehr ins Gewicht fällt.
  • Zur Stabilisierung eines Films, eines Gewebenetzes, einer Glasfasermatrix und einer Papiermatrix sollte das Verhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat wenigstens etwa 15 : 1 betragen, wenn der pH des Reagens etwa 6,8 ist, und wenigstens etwa 25 : 1, wenn der pH des Reagens etwa 7,4 ist. (Wie beim Flüssigreagens ist dass zur Stabilisierung des Films erforderliche Verhältnis von. Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat bei höheren pHs höher, da die Zersetzung von Phenazin-Derivat und Tetrazolium-Salz im Film, im Gewebenetz, in der Glasfasermatrix und in der Papiermatrix bei höheren pHs mehr ins Gewicht fällt. Zur Stabilisierung eines Films, eines Gewebenetzes, einer Glasfasermatrix und einer Papiermatrix, die MTT enthalten, müßten die Verhältnisse ebenfalls höher sein. Die Stabilisierung eines Films, eines Gewebenetzes, einer Glasfasermatrix und einer Papiermatrix, die MTT enthalten, ist bei Luftfeuchtigkeitsbedingungen von unter etwa 15% einfacher.) Es können auch höhere Verhältnisse von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat angewandt werden, doch wird durch diese höheren Verhältnisse keine weitere Stabilisierung erreicht.
  • Wichtig ist, daß durch Beigabe von Salzen zweiwertiger Metalle das Reagens Phenazin-Derivat/Tetrazolium-Salz bei pHs von etwa 5,5 bis etwa 7,8 stabilisiert wird (Filme, die kein Salz eines zweiwertigen Metalls enthalten, zeigen nach 15minütigem Trocknen des nassen Film bei etwa 50ºC eine Formazan-Blindreaktion). Ohne Beigabe eines Salzes eines zweiwertigen Metalls ist das Reagens bei pHs unterhalb etwa 5,5 stabil. Bei pHs oberhalb etwa 5,5 gewinnt jedoch die Zersetzung der Phenazin-Derivate und die Autoreduktion der Tetrazolium-Salze an Bedeutung. Das Problem der Zersetzung der Phenazin-Derivate und Tetrazolium-Salze verschlimmert sich bei steigendem pH. Erwünscht ist die Durchführung der Analysen bei pH-Werten oberhalb etwa 5,5, weil viele Enzyme bei pH-Werten oberhalb etwa 5,5 optimal arbeiten. Zum Beispiel arbeitet Glucosedehydrogenase bei einem pH von etwa 7,9 optimal, und Hexokinase sowie Glucose-6-phosphatdehydrogenase arbeiten bei einem pH von etwa 7,8 optimal. Durch Beigabe der Salze zweiwertiger Metalle der vorliegenden Erfindung wird die Zersetzung von Phenazin-Derivat und Tetrazolium-Salz im pH-Bereich von 5,5 bis etwa 7,8 unmerklich, so daß sich Analysen in diesem pH- Bereich (wo bestimmte Enzyme am besten arbeiten) besser durchführen lassen. Besonders wichtig ist zudem die Stabilisierung von Filmen, die ein Phenazin-Derivat und ein Tetrazolium-Salz enthalten, weil sich die Zersetzung des Phenazin- Derivats und des Tetrazolium-Salzes durch den bei der Bildung des Films angewandten Trocknungsvorgang verschlimmert.
  • Vorzugsweise ist im Reagens ein Puffer bereitgestellt, um einen pH zu ergeben, der für die Analyse am besten ist. Der Puffer sollte von hinreichender Art sein und in ausreichender Menge vorliegen, um einen pH zu ergeben und aufrechtzuerhalten, bei dem das Enzym als Katalysator arbeitet. Nachstehend sind in Tabelle 4 Puffer beispielhaft dargestellt, die in dem pH-Bereich verwendet werden können, in dem sie eine Lösung wirksam puffern.
  • Tabelle 4 PUFFER pH-Bereich
  • MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) 5,5-6,7
  • BIS-TIS (Bis[2-hydroxyethyl]imino-tris[hydroxymethyl]methan) 5,8-7,2
  • ADA (N-[2-Acetamido]-2-iminodiessigsäure) 6,0-7,2
  • PIPES (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure]) 6,1-7,5
  • ACES (2-[(2-Amino-2-oxoethyl)amino]ethansulfonsäure) 6,1-7,5
  • BIS-TRIS-PROPAN (1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)-methylamino]propan) 6,3-9,5
  • MOPSO (3-[N-Morpholino]-2-hydroxypropansulfonsäure) 6,2-7,6
  • BES (N,N-Bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethansulfonsäure) 6,4-7,8
  • MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure) 6,5-7,9
  • TES (N-Tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethansulfonsäure) 6,8-8,2
  • HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) 6,8-8,2
  • TAPSO (3-[N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure) 7,0-8,2
  • POPSO (Piperazin-N,N'-bis[2-hydroxypropansulfonsäure]) 7,2-8,5
  • EPPS (N[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-3-propansulfonsäure) 7,3-8,7
  • TRIS (Tris[hydroxymethyl]aminomethan) 7,0-9,0
  • RICIN (N-Tris[hydroxymethyl]methylglycin) 7,4-8,8
  • BICIN (N,N-Bis[2-hydroxyethyl]glycin) 7,6-9,0
  • TAPS (Tris[hydroxymethyl]methylaminopropansulfonsäure) 7,7-9,1
  • Beispiele für ein Flüssigreagens und einen Film sind nachstehend gegeben.
  • Reagensbeispiel 1
  • Ein Film kann mit den folgenden Bestandteilen in den folgenden Mengen hergestellt werden (Gesamtmasse der Bestandteile = 1 Kilogramm):
  • Bestandteil Menge in Gramm (sofern nichts anderes angegeben ist)
  • 0,3 molar (M) HEPES-Puffer (pH = 7,5) 253,3
  • 20 Gew.-% einer wäßrigen Zusammensetzung verschiedener Polyoxyethylenether und anderer oberflächenaktiver Verbindungen, vertrieben unter dem Warenzeichen TRITON X-100, zu beziehen durch Sigma Chemical Company 14,5
  • Mangansulfat 16,7 (99 mmol)
  • Nickelchlorid 23,6 (99 mmol)
  • Diatomit, vertrieben unter dem Warenzeichen CELATOM MW25, zu beziehen durch Eagle Picher 157,4
  • Titandioxid, zu beziehen durch Kronos als TiO&sub2; RN 43 148,3
  • Phenazinethosulfat, zu beziehen durch Research Organics, Inc. 1,3 (3,9 mmol)
  • 3 : 2 : 1 (Gew./Gew./Gew.) Aceton/Hexanol/Methanol 4,2
  • 50 : 50 (Gew./Gew.) Wasser/Polyvinylpropionat (vertrieben unter dem Warenzeichen PROPIOFAN 70D, zu beziehen durch BASF) 104,5
  • 3% (Gew.) Methylcellulose, vertrieben unter dem Warenzeichen 261,9 TYLOSE MH 2000, zu beziehen durch Hoechst, in 0,3 M HEPES Puffer 261,
  • Glucoseoxidase (Güteklasse 1, zu beziehen durch Biozyme) 1754,4 Kiloeinheiten
  • INT 5,689 (11,25 mmol)
  • Der Film läßt sich wie folgt herstellen:
  • Schritt 1: 20 Gew.-% wäßriges TRITON X-100-Tensid werden dem 0,3 M HEPES-Puffer (pH = 7,5) zugesetzt;
  • Schritt 2: als nächstes werden Mangansulfat und Nickelchlorid zugegeben;
  • Schritt 3: sodann wird das Titandioxid zugesetzt, und es wird gerührt, bis die resultierende Mischung homogen ist;
  • Schritt 4: als nächstes wird der CELATOM MW25-Diatomit zugegeben;
  • Schritt 5: dann werden 3 Gew.-% der Methylcellulose TYLOSE MH 2000 in 0,3 M HEPES-Puffer zugesetzt;
  • Schritt 6: als nächstes wird PROPIOFAN 70D zugesetzt;
  • Schritt 7: dann wird Glucoseoxidase zugegeben;
  • Schritt 8: als nächstes wird INT zugesetzt;
  • Schritt 9: als nächstes wird Aceton/Hexanol/Methanol 3 : 2 : 1 (Gew./Gew./Gew.) zugegeben;
  • Schritt 10: zur Entfernung von Blasen wird zentrifugiert;
  • Schritt 11: als nächstes wird gerührt, bis der Inhalt homogen ist;
  • Schritt 12: dann wird der homogene Inhalt zur Entfernung von Klumpen durch einen Netzbeutel filtriert;
  • Schritt 13: als nächstes wird das Filtrat gerührt, bis es homogen ist;
  • Schritt 14: dann wird der Inhalt auf Cronar-Kunststoff aufbeschichtet, so daß sich eine Beschichtungsdicke von 250 Mikrometern (250 um) ergibt;
  • Schritt 15: die Beschichtung wird 30 Minuten lang bei 45ºC getrocknet.
  • Reagensbeispiel 2
  • Ein wäßriges Reagens läßt sich mit den folgenden Bestandteilen in den folgenden Konzentrationen herstellen:
  • Bestandteil Konzentration (millimolar (mM), sofern nichts anderes angegeben ist)
  • Wäßriger HEPES-Puffer (pH = 7,3) 100
  • Magnesiumchlorid 250
  • Phenazinethosulfat 5
  • Glucoseoxidase 1 Kiloeinheit/Milliliter (ml) Reagens
  • INT 12
  • Bei der Herstellung des oben angegebenen wäßrigen Reagens sollten Phenazinethosulfat und INT dem Reagens zuletzt zugesetzt werden.
  • Die Analyse eines Analyten läßt sich durch Ausführen der folgenden Schritte durchführen:
  • a) Bilden einer Testprobe durch Vereinigen einer den Analyten enthaltenden flüssigen Probe mit dem Reagens der vorliegenden Erfindung;
  • b) Inkubieren der Testprobe;
  • c) spektrophotometrisches Messen der inkubierten Testprobe; und
  • d) Korrelieren der spektrophotometrischen Messung mit der Konzentration des Analyten in der flüssigen Probe.
  • Inkubiertemperatur und Inkubierzeit richten sich nach der durchzuführenden Analyse. Die Wellenlänge der spektrophotometrischen Messung und die Art der spektrophotometrischen Messung (zum Beispiel Extinktion, Durchlässigkeit oder Reflexionsvermögen) richten sich nach dem im Reagens verwendeten Tetrazolium-Salz sowie danach, ob die spektrophotometrischen Messungen an einer Lösung (unter Verwendung eines Flüssigreagens) oder an einem Film durchgeführt werden. Beispiele für spezielle Analysenvorschriften unter Verwendung der oben beispielhaft dargestellten, speziell formulierten Reagenzien sind nachstehend gegeben.
  • Analysen auf Glucose Analysenbeispiel 1
  • In einer Küvette werden 2,9 Milliliter (ml) des oben angegebenen Flüssigreagens (Reagensbeispiel 2) und 0,1 ml einer unbekannten flüssigen Probe, die eine unbekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 Milligramm (mg) Glucose pro Deziliter (dl) Probe enthält, vereinigt, und der resultierende Inhalt wird verwirbelt, um die unbekannte flüssige Probe mit dem Flüssigreagens zu vermischen (Analysenschritt a) oben). Der resultierende Inhalt wird bei Raumtemperatur 15 Sekunden lang inkubiert (Analysenschritt b) oben); dann wird die spektrophotometrische Extinktion des inkubierten resultierenden Inhalts bei 580 Nanometer (nm) abgelesen (Analysenschritt c) oben). Die spektrophotometrische Extinktion des inkubierten resultierenden Inhalts wird mit der spektrophotometrischen Extinktion eines Standards verglichen (d. h., das vorstehend erwähnte Flüssigreagens, das wie oben angegeben mit einer bekannten flüssigen Probe vereinigt und inkubiert wird, die eine bekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 mg Glucose pro dl Probe enthält), und die spektrophotometrische Extinktion des inkubierten resultierenden Inhalts wird mit der Glucose-Konzentration in der unbekannten flüssigen Probe korreliert (Analysenschritt d) oben).
  • Analysenbeispiel 2
  • Zur Durchführung einer Glucose-Analyse mit dem vorstehend beschriebenen Film (Reagensbeispiel 1) wird zur Benetzung des Films ausreichend unbekannte flüssige Probe zugesetzt, die eine unbekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 mg Glucose pro dl Probe enthält (Analysenschritt a) oben). Der benetzte Film wird etwa 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert (Analysenschritt b) oben). Das spektrophotometrische Reflexionsvermögen des inkubierten Films wird bei 580 nm gemessen (Analysenschritt c) oben). Das gemessene spektrophotometrische Reflexionsvermögen des Films bei 580 nm wird mit dem spektrophotometrischen Reflexionsvermögen eines Films verglichen, der wie vorstehend behandelt wurde, mit der Ausnahme, daß eine bekannte flüssige Probe (die eine bekannte Menge von etwa 0 bis etwa 600 mg Glucose pro dl Probe enthält) anstelle einer unbekannten flüssigen Probe zur Benetzung des Films verwendet wird, und das spektrophotometrische Reflexionsvermögen des inkubierten Films wird mit der Glucose-Konzentration in der unbekannten flüssigen Probe korreliert.
  • Die vorliegende Erfindung wurde anhand der obigen Lehren und Abbildungen mit hinreichender Klarheit und Knappheit offenbart, um dem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung durchzuführen und anzuwenden, um die beste Art der Durchführung dieser Erfindung zu wissen und sie von anderen Erfindungen und von Altem zu unterscheiden. Zahlreiche Varianten und offensichtliche Anpassungen der Erfindung werden ohne weiteres ersichtlich sein, und diese sollen im Umfang der Erfindung wie nachstehend beansprucht enthalten sein.

Claims (15)

1. Reagens, das zur Analyse eines Analyten brauchbar ist, umfassend:
ein Enzym, ein Tetrazolium-Salz, ein Phenazin-Derivat, das als Elektronenträger fungiert und die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtert, wenigstens ein Salz eines zweiwertigen Metalls, das nicht als Enzymcofaktor fungiert, wenn das Reagens zur Analyse des Analyten eingesetzt wird, und Wasser;
wobei das Enzym in ausreichender Menge vorliegt, um die Reaktion von Analyt und Phenazin-Derivat zu katalysieren;
wobei das Phenazin-Derivat in ausreichender Menge vorliegt, um die Reduktion des Tetrazolium-Salzes zu katalysieren;
wobei das Tetrazolium-Salz in ausreichender Menge vorliegt, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert wird; und
wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ein Nickel-, Mangan-, oder Magnesiumkation und ein inertes Anion aufweist und in ausreichender Menge vorliegt, um das Phenazin-Derivat und das Tetrazolium-Salz zu stabilisieren.
2. Reagens nach Anspruch 1, des weiteren umfassend: einen Puffer in ausreichender Menge, um einen pH für das Enzym bereitzustellen und aufrechtzuerhalten, so daß es als Katalysator wirkt.
3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nikelchlorid, Mangansulfat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid und Nickelsulfat.
4. Reagens, das zur Analyse eines Analyten brauchbar ist, umfassend:
ein Enzym, ein Tetrazolium-Salz, ein Phenazin-Derivat, das als Elektronenträger fungiert und die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtert, ein Salz eines zweiwerti gen Metalls, das nicht als Enzymcofaktor fungiert, wenn das Reagens zur Analyse des Analyten eingesetzt wird, einen Puffer und Wasser;
wobei das Enzym in ausreichender Menge vorliegt, um die Reaktion von Analyt und Phenazin-Derivat zu katalysieren;
wobei das Phenazin-Derivat in ausreichender Menge vorliegt, um die Reduktion des Tetrazolium-Salzes zu katalysieren;
wobei das Tetrazolium-Salz in ausreichender Menge vorliegt, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert wird, das Salz des zweiwertigen Metalls Cobaltchlorid in ausreichender Menge ist, um das Phenazin-Derivat und das Tetrazolium-Salz zu stabilisieren; und
der Puffer Tris(hydroxymethyl)aminomethan in ausreichender Menge ist, um einen pH für das Enzym bereitzustellen und aufrechtzuerhalten, so daß es als Katalysator wirkt.
5. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nickelchlorid, Mangansulfat und Nickelsulfat.
6. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Molverhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin- Derivat wenigstens etwa 30 : 1 beträgt.
7. Reagens nach Anspruch 6, wobei der pH des Reagens etwa 5,5 bis etwa 7,8 beträgt.
8. Reagens, das in einen Film, ein Gewebenetz, eine Glasfasermatrix oder in eine Papiermatrix eingebracht und für die Analyse eines Analyten aus einer flüssigen Probe brauchbar ist, umfassend:
ein Enzym, ein Tetrazolium-Salz, ein Phenazin-Derivat, das als Elektronenträger fungiert und die Reduktion des Tetrazolium-Salzes erleichtert, sowie wenigstens ein Salz eines zweiwertigen Metalls, das nicht als Enzymcofaktor fungiert, wenn das Reagens zur Analyse des Analyten ein gesetzt wird;
wobei das Enzym in ausreichender Menge vorliegt, um die Reaktion von Analyt und Phenazin-Derivat zu katalysieren;
wobei das Phenazin-Derivat in ausreichender Menge vorliegt, um die Reduktion des Tetrazolium-Salzes zu katalysieren;
wobei das Tetrazolium-Salz in ausreichender Menge vorliegt, um einen farbigen Indikator zu bilden, wenn es reduziert ist; und
wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ein Nickel-, Mangan-, oder Magnesiumkation und ein inertes Anion aufweist und in ausreichender Menge vorliegt, um das Phenazin-Derivat und das Tetrazolium-Salz zu stabilisieren.
9. Reagens nach Anspruch 8, des weiteren umfassend: einen Puffer in ausreichender Menge, um einen pH für das Enzym bereitzustellen und aufrechtzuerhalten, so daß es als Katalysator wirkt.
10. Reagens nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Molverhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin-Derivat wenigstens etwa 15 : 1 beträgt.
11. Reagens nach den Ansprüchen 8 bis 10, wobei das Molverhältnis von Salz des zweiwertigen Metalls zu Phenazin- Derivat wenigstens etwa 25 : 1 beträgt.
12. Reagens nach Anspruch 11, wobei der Puffer in ausreichender Menge vorliegt, um einen pH von etwa 5,5 bis etwa 7,8 zu ergeben, wenn die den Analyten enthaltende flüssige Probe dem Reagens zugesetzt wird.
13. Reagens nach den Ansprüchen 8 bis 12, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nickelchlorid, Mangansulfat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid und Nickelsulfat.
14. Reagens nach Anspruch 13, wobei das Salz des zweiwertigen Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nikelchlorid, Mangansulfat und Nickelsulfat.
15. Verfahren zum Testen auf einen Analyten, umfassend die Schritte:
a) Bilden einer Testprobe durch Vereinigen einer den Analyten enthaltenden flüssigen Probe mit dem Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 14;
b) Inkubieren der Testprobe;
c) spektrophotometrische Messung der inkubierten Testprobe; und
d) Korrelieren der spektrophotometrischen Messung mit der Konzentration des Analyten in der flüssigen Probe.
DE69328182T 1992-07-02 1993-07-01 Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze Expired - Fee Related DE69328182T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90788692A 1992-07-02 1992-07-02
PCT/US1993/006282 WO1994001544A1 (en) 1992-07-02 1993-07-01 A reagent stabilized by bivalent metal salts

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69328182D1 DE69328182D1 (de) 2000-04-27
DE69328182T2 true DE69328182T2 (de) 2000-09-28

Family

ID=25424809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69328182T Expired - Fee Related DE69328182T2 (de) 1992-07-02 1993-07-01 Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0654079B1 (de)
DE (1) DE69328182T2 (de)
ES (1) ES2145054T3 (de)
WO (1) WO1994001544A1 (de)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6656697B1 (en) 1998-09-28 2003-12-02 Lifescan, Inc. Diagnostics based on tetrazolium compounds
US6635434B1 (en) 1999-09-17 2003-10-21 Exiqon A/S Immunoassay for pesticides and their degradation products
US6420128B1 (en) 2000-09-12 2002-07-16 Lifescan, Inc. Test strips for detecting the presence of a reduced cofactor in a sample and method for using the same
US6586199B2 (en) 2001-11-20 2003-07-01 Lifescan, Inc. Stabilized tetrazolium reagent compositions and methods for using the same
US6939685B2 (en) 2001-11-20 2005-09-06 Lifescan, Inc. Stabilized tetrazolium phenazine reagent compositions and methods for using the same
CA2512854C (en) 2002-06-28 2010-02-09 Alza Corporation A reservoir for use in electrotransport drug delivery
US8008037B2 (en) 2008-03-27 2011-08-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Matrix composition with alkylphenazine quaternary salt and a nitrosoaniline
EP2636750A1 (de) 2012-03-06 2013-09-11 Roche Diagniostics GmbH Kompatibles gelöstes Ectoin sowie Derivate davon zur Enzymstabilisierung
WO2014180939A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Roche Diagnostics Gmbh Stabilization of enzymes by nicotinic acid
EP2927319A1 (de) 2014-03-31 2015-10-07 Roche Diagnostics GmbH Hochlastenzymimmobilisierung mittels Quervernetzung
WO2018067235A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Roche Diabetes Care, Inc. Detection reagents and electrode arrangements for multi-analyte diagnostic test elements, as well as methods of using the same

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5163688A (en) * 1974-05-21 1976-06-02 Iatron Lab Ketsuseichuno chuseishibosokuteiyoshaku
US3929580A (en) * 1974-08-29 1975-12-30 American Cyanamid Co Creatine phosphokinase test indicator
JPS5768798A (en) * 1980-10-14 1982-04-27 Toyo Jozo Co Ltd Novel measurement of amylase activity
US4457461A (en) * 1981-09-24 1984-07-03 Pilkington P.E. Limited Head mounting apparatus
JPS6066993A (ja) * 1983-09-22 1985-04-17 Yatoron:Kk 生体液成分の測定方法
US4748115A (en) * 1986-01-08 1988-05-31 Abbott Laboratories Substrate formulation in 2-amino-2-methyl-1-propanol buffer for alkaline phosphatase assays
US4892817A (en) * 1987-09-21 1990-01-09 Biogenex Laboratories Stable phosphatase substrate composition
IL85018A0 (en) * 1988-01-03 1988-06-30 Orgenics Ltd Stable chromogenic substrate mixture of indoxyl phosphate and tetrazolium salt,method of making and using same in biological and diagnostic assays

Also Published As

Publication number Publication date
EP0654079B1 (de) 2000-03-22
ES2145054T3 (es) 2000-07-01
WO1994001544A1 (en) 1994-01-20
EP0654079A1 (de) 1995-05-24
EP0654079A4 (de) 1996-10-02
DE69328182D1 (de) 2000-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0354441B1 (de) Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels enzymatischer Oxidation
EP0186134B1 (de) Mittel zur Verbesserung des Nachweises Wasserstoffperoxid liefernder Oxidase-Reaktionen und seine Verwendung
EP0054689B1 (de) Stabilisierte Zubereitung von Tetrazoliumsalzen
EP0037056B1 (de) Verfahren und diagnostische Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen
EP0431456A1 (de) Verwendung eines schwer löslichen Salzes einer Heteropolysäure zur Bestimmung eines Analyts, entsprechendes Bestimmungsverfahren sowie hierfür geeignetes Mittel
DE3788239T2 (de) Kontrollierte Farbton-Vorrichtung.
DE2833612B2 (de) Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd
DE2913553C2 (de) Verfahren und Reagenz zur enzymatischen Bestimmung von Enzymsubstraten
DE69328182T2 (de) Reagenz stabilisiert durch zweiwertige metallsalze
EP0355864A2 (de) Verfahren zur quantativen Bemessung von oxydativen Agenzien durch Verwendung von Triphenylmethanleucoverbindungen als Farbstoffe
EP0068356B1 (de) Mittel und Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxid oder Peroxidasen
DE3003490A1 (de) Reagenz zur analytischen bestimmung von wasserstoffperoxid
DE69713601T2 (de) Wasserlösliche tetrazoliumsalz-verbindungen
EP0071730A1 (de) Stabilisiertes Reagenz zum Nachweis von Wasserstoffperoxid
DE69228554T2 (de) Reagenzien und untersuchungsverfahren einschliesslich eines phenazin enthaltenden indikators
DE69129308T2 (de) Hochempfindliche bestimmung von d-3-hydroxybutiersäure oder acetessigsäure und zusammensetzung dafür
DE69124780T2 (de) Oxidierbares, farbproduzierendes Reagenz
EP0309882A2 (de) Verfahren zur spezifischen Bestimmung des Serumfructosamingehalts sowie hierfür geeignetes Reagenzgemisch
DE3781008T2 (de) Verfahren zur messung von wasserstoffperoxid oder zur messung eines peroxidfreimachenden enzyms oder biochemischen substrats.
DE69426354T2 (de) Reagenz zur bestimmung von glucose
DE69430410T2 (de) Methode zum Nachweis von Fructosamin
DE3889845T2 (de) Verfahren zur Massanalyse von Wasserstoff-Peroxyd und Reagens dafür.
DE69709485T2 (de) Reagenszusammensetzung, Teststück und Testkit
DE3851316T2 (de) Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine in einer biologischen Probe.
DE3852498T2 (de) Enzymtest für biologische substanzen.

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: ROCHE DIAGNOSTICS OPERATIONS, INC., INDIANAPOLIS,

8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: DURM & PARTNER, 76137 KARLSRUHE

8339 Ceased/non-payment of the annual fee