KR102646392B1 - 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 헴 단백질의 변성 혹은 분해에 대해 유효한 새로운 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고, 구체적으로는 디술폰산 또는 그 염을 포함한 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질을 포함한 시료 중에 디술폰산 또는 그 염을 공존시키는 헴 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다. 특히, 면역학적 측정법에서 유용한 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다.
최근에 암의 이환율(罹患率)이 증가함에 따라 대장암 검진의 1차 검사나 하부 소화관 질환의 스크리닝법으로서 분변 중의 혈액을 검출하는 변잠혈 검사가 널리 이루어지고 있다. 변잠혈 검사는 헴 단백질인 헤모글로빈이 갖는 퍼옥시다아제 양활성(樣活性)을 이용한 화학적인 발색 반응에 기초한 화학적 측정법이나 인간 헤모글로빈에 특이적인 항체를 이용한 면역학적 측정법에 따라 이루어지고, 특히 면역학적 측정법은 화학적 측정법과 비교하여 검사 전의 식사 제한이나 복약 제한을 필요로 하지 않고 간편하고 신속한 측정이 가능하기 때문에 변잠혈 검사의 주요 검사 방법으로서 정착되어 있다.
그러나, 헤모글로빈은 용액 중에서 매우 불안정하여 변성 혹은 분해되기 쉬운 것이 알려져 있다. 이 변성 혹은 분해에 의해 헤모글로빈의 입체 구조가 파괴되고 그 항원성이 저하되기 때문에 헤모글로빈의 면역학적 측정법에서 잘못된 측정 결과가 도출된다. 헤모글로빈의 변성 혹은 분해 원인으로서는 보존 온도의 상승, 시간 경과, 세균이나 효소 등 다양한 것을 들 수 있는데, 예를 들어 보존 온도에 대해서는 용액 중의 헤모글로빈은 동결 또는 냉장 상태에서는 비교적 안정되지만, 실온 또는 그 이상의 온도에서는 변성 혹은 분해가 진행되는 것이 알려져 있다.
특히, 변잠혈 검사에서는 피험자 자신이 자택 등에서 분변을 채취하고 변검체용 희석액을 포함한 밀폐 용기에 분변을 현탁하여 검사에 제공하는 경우가 많고, 이 경우 분변 중의 인간 헤모글로빈은 용액 중에서 수일간 방치되고 우편 등의 수송 수단을 이용함으로써 고온 하에 놓이는 경우도 있다. 나아가 병원이나 검사 기관에서는 다수의 검체 및 타항목 검사를 실시하기 때문에 측정 결과를 얻기까지 많은 시간을 필요로 하는 경우도 있다. 그 때문에 변잠혈 검사에서는 온도 상승이나 시간 경과 등의 원인이 서로 겹쳐 헤모글로빈의 변성 혹은 분해가 발생하기 쉽다.
나아가 변잠혈 검사에서는 많은 검체를 정확하고 신속하게 측정할 수 있는 자동 분석 장치를 이용하여 측정이 이루어지는 경우가 많다. 자동 분석 장치를 이용한 측정에서는 시약이나 장치의 변화가 검사 결과의 정밀도에 영향을 주기 때문에 이미 알고 있는 농도의 헤모글로빈을 포함한 표준 시료 및 이미 알고 있는 농도의 헤모글로빈을 포함한 대조군(컨트롤) 시료를 이용하여 정기적으로 자동 분석 장치의 캘리브레이션이나 정밀도 관리가 이루어지고 있다. 캘리브레이션에서는 복수의 이미 알고 있는 농도의 측정 대상 물질을 포함한 표준 시료를 자동 분석 장치로 측정하여 검량선을 작성하고 자동 분석 장치의 교정을 하며, 정밀도 관리에서는 이미 알고 있는 농도의 측정 대상 물질을 포함한 대조군 시료를 자동 분석 장치로 측정하여 측정값이 소정 범위 내에 들어가는지 아닌지에 따라 분석 정밀도를 판정한다. 그러나, 표준 시료 및 대조군 시료 중에 포함되는 헤모글로빈이 변성 혹은 분해되어 있으면 캘리브레이션이나 정밀도 관리를 정확하게 행할 수 없고 측정 오류를 초래하게 된다.
따라서, 헤모글로빈의 변성 혹은 분해를 억제하여 정확한 측정 결과를 얻기 위해 지금까지 헤모글로빈을 안정화하기 위한 다양한 방법이 제안되어 왔다. 예를 들어, 티메로살이나 클로르헥시딘 등 항균제를 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 1 참조), 인간 이외의 동물 헤모글로빈을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 2 참조), 인간 이외의 동물 혈청을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 3 참조), 글리코시다아제형 용균 효소를 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 4 참조), 아황산이나 이아황산 등을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 5 참조), 아실아르기닌에스테르 및 양이온성 계면활성제를 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 6 참조), 글리옥실산을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 7 참조) 등이 제안되어 있다.
나아가 본 출원인은 페로시안 화합물 등의 수용성 천이 금속 착체를 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 8, 특허문헌 9 참조), 헤모글로빈의 효소 분해 산물을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 10 참조), 천이 금속류를 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 11 참조), 사과산 등의 유기산을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 12 참조), 탈지 알부민을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 13 참조), 이미노카르본산을 첨가하는 방법(예를 들어 특허문헌 14 참조) 등을 이미 제안하였다.
그러나, 헤모글로빈은 매우 불안정하기 때문에 이들 헤모글로빈의 안정화 방법이어도 그 변성 혹은 분해를 충분히 막는 데에는 이르지 못하였다는 문제가 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 본 발명은 헤모글로빈으로 대표되는 헴 단백질의 변성 혹은 분해에 대해 유효한 새로운 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 헴 단백질의 보존액은 디술폰산 또는 그 염을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 헴 단백질의 안정화 방법은 헴 단백질을 포함한 시료 중에 디술폰산 또는 그 염을 공존시키는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
(1) 디술폰산 또는 그 염을 포함한 헴 단백질의 보존액.
(2) 디술폰산 또는 그 염이 쇄식 탄화수소기 또는 환식 탄화수소기 중 적어도 하나를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로,
상기 쇄식 탄화수소기가 분지상 혹은 직쇄상의 탄화수소기이고, 분지상의 상기 쇄식 탄화수소기의 주쇄 혹은 직쇄상의 상기 쇄식 탄화수소기의 탄소수가 1 내지 10 중 어느 하나인 디술폰산 또는 그 염,
상기 환식 탄화수소기가 시클로알킬렌기 혹은 아릴기이고, 상기 환식 탄화수소기의 탄소수가 3 내지 10 중 어느 하나인 디술폰산 또는 그 염 및
상기 시클로알킬렌기 혹은 상기 아릴기가 1개 이상의 치환된 질소 원자를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, (1)에 기재된 헴 단백질의 보존액.
(3) 디술폰산 또는 그 염이 메탄 디술폰산, 에탄 디술폰산, 프로판 디술폰산, 부탄 디술폰산, 나프탈렌 디술폰산, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, (1) 또는 (2)에 기재된 헴 단백질의 보존액.
(4) 디술폰산 또는 그 염의 농도가 0.001mol/L 이상 0.3mol/L 이하인, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 헴 단백질의 보존액.
(5) N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-에탄술폰산을 더 포함하는, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 헴 단백질의 보존액.
(6) 표준 시료 또는 대조군 시료로서 이용되는 헴 단백질을 더 포함하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 헴 단백질의 보존액.
(7) 면역학적 측정에 이용되는, (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 헴 단백질의 보존액.
(8) 헴 단백질을 포함한 시료 중에 디술폰산 또는 그 염을 공존시키는 헴 단백질의 안정화 방법.
(9) 디술폰산 또는 그 염의 농도가 0.001mol/L 이상 0.3mol/L 이하인, (8)에 기재된 헴 단백질의 안정화 방법.
(10) 헴 단백질과 항헴단백질 항체를 디술폰산 또는 그 염의 존재 하에서 접촉시키는 공정을 포함하는 헴 단백질의 면역학적 측정 방법.
본 명세서는 본원의 우선권 기초가 되는 일본특허출원번호 2015-070667호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명의 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법에 의하면, 헴 단백질의 변성 혹은 분해를 억제하고 헴 단백질을 안정적으로 보존할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명의 헴 단백질의 보존액은 디술폰산 또는 그 염을 포함한다. 또한, 본 발명의 헴 단백질의 안정화 방법은 헴 단백질을 포함한 시료 중에 디술폰산 또는 그 염을 공존시킨다.
본 발명에 이용되는 디술폰산 또는 그 염은 특별히 한정되는 것은 아니고 공지의 것에서 선택할 수 있다. 본 발명에 이용되는 디술폰산은 포화 또는 불포화 결합을 가져도 되는 쇄식 또는 환식 탄화수소기를 적어도 하나 갖는 디술폰산이고, 특히 쇄식 또는 환식 탄화수소기와 2개의 술폰기로 이루어지는 디술폰산인 것이 바람직하다. 본 발명에 이용되는 디술폰산은 쇄식 탄화수소기 또는 환식 탄화수소기 중 어느 하나를 가져도 되고 둘 다 가져도 된다.
특히, 본 발명에 이용되는 디술폰산이 갖는 쇄식 탄화수소기는 분지상 또는 직쇄상의 탄화수소기이다. 분지상의 탄화수소기의 주쇄 또는 직쇄상의 탄화수소기의 탄소수는 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 1 내지 4, 더욱 바람직하게는 1 또는 2 중 어느 하나이다. 분지상의 탄화수소기의 주쇄 또는 직쇄상의 탄화수소기는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 알킬렌기, 알케닐렌기 혹은 알키닐렌기인 것이 바람직하다. 알킬렌기를 갖는 디술폰산으로서는 예를 들어 메탄 디술폰산, 1,2-에탄 디술폰산(이하, 1,2-EDS라고 함), 1,3-프로판 디술폰산, 1,4-부탄 디술폰산, 1,5-펜탄 디술폰산, 1,6-헥산 디술폰산 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 이용되는 디술폰산이 갖는 환식 탄화수소기의 탄소수는 3 내지 10 중 어느 하나인 것이 바람직하다. 환식 탄화수소기는 시클로알킬기, 시클로알케닐기, 시클로알키닐기 또는 아릴기인 것이 바람직하다. 특히, 아릴기는 바람직하게는 페닐렌기 또는 나프틸렌기이다. 페닐렌기 혹은 나프틸렌기를 갖는 디술폰산으로서는 예를 들어 1,2-벤젠 디술폰산, 1,3-벤젠 디술폰산, 1,4-벤젠 디술폰산, 1,6-나프탈렌 디술폰산, 2,6-나프탈렌 디술폰산, 2,7-나프탈렌 디술폰산 등을 들 수 있다.
또한, 환식 탄화수소기는 분지상의 탄화수소기이어도 된다. 또한, 환식 탄화수소기는 1개 이상, 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 바람직하게는 1 내지 2개 중 어느 하나의 질소 원자로 치환되어 있어도 된다. 질소 원자로 치환되어 있는 탄화수소기를 갖는 디술폰산으로서는 예를 들어 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)를 들 수 있다.
또한, 보다 바람직하게는 본 발명에 이용되는 디술폰산은 쇄식 또는 환식 탄화수소기에 2개의 술폰기가 결합된 디술폰산이다. 나아가 쇄식 탄화수소기를 갖는 디술폰산은 2개의 술폰기를 분지상의 탄화수소기의 주쇄 혹은 직쇄상의 탄화수소기의 상이한 탄소 원자에 갖는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 이들의 각 말단에 갖는다. 본 발명에 이용되는 디술폰산은 1,2-에탄디술폰산(1,2-EDS)인 것이 바람직하다.
본 발명에 이용되는 디술폰산의 탄화수소기는 할로겐기 및/또는 히드록시기 등의 치환기를 가져도 된다. 또한, 분지상의 탄화수소기를 갖는 디술폰산에서는 분지쇄가 탄화수소로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 이용되는 디술폰산 또는 그 염은 적어도 1종이며, 2종 이상을 혼합한 혼합물이어도 된다.
본 발명에 의하면 보존액 또는 시료 중에 헴 단백질과 디술폰산 또는 그 염을 포함함으로써 헴 단백질의 변성 혹은 분해를 억제할 수 있다. 특히, 본 발명에 의하면 디술폰산이 에탄디술폰산을 포함함으로써 헴 단백질의 안정성을 보다 높일 수 있다. 본 발명에 이용되는 디술폰산은 측정에 악영향을 미치지 않고, 특히 라텍스 면역 응집법을 이용하는 면역 측정 방법에 적합하다.
본 발명에 이용되는 디술폰산의 염은 특별히 한정되지 않지만, 디술폰산의 1가, 2가 또는 3가의 금속염이다. 디술폰산의 염으로서는 예를 들어 알칼리 금속염, 암모늄염, 알칼리토류 금속염, 철염 또는 알루미늄염 등을 들 수 있다. 알칼리 금속으로서는 예를 들어 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘을 들 수 있다. 알칼리토류 금속으로서는 예를 들어 칼슘, 스트론튬, 바륨, 라듐을 들 수 있다.
본 발명의 헴 단백질의 보존액 또는 헴 단백질을 포함한 시료에 포함되는 디술폰산 또는 그 염의 농도의 상한은 0.3mol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.2mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 0.15mol/L 이하이고, 하한은 0.001mol/L 이상, 보다 바람직하게는 0.005mol/L 이상, 더욱 바람직하게는 0.01mol/L 이상, 가장 바람직하게는 0.02mol/L 이상이다. 디술폰산 또는 그 염의 농도가 0.001mol/L 미만이면 헴 단백질의 안정화 효과가 불충분해진다. 한편, 디술폰산 또는 그 염의 농도가 0.3mol/L을 초과하면 면역 반응이 저해되어 측정에 영향을 미치기 쉬워지는 것 외에 충분한 헴 단백질의 안정화 효과를 얻을 수 없게 된다.
본 발명이 대상으로 하는 헴 단백질 및 본 발명의 시료에 포함되는 헴 단백질은 헴을 구성 성분으로 하는 단백질 중에서 적절히 선택할 수 있다. 헴 단백질로서는 예를 들어 헤모글로빈, 미오글로빈, 퍼옥시다아제 또는 카탈라아제 등을 들 수 있다. 특히, 본 발명이 대상으로 하는 헴 단백질 및 본 발명의 시료에 포함되는 헴 단백질은 바람직하게는 면역학적인 분석 대상이 되는 헴 단백질이고, 보다 바람직하게는 인간 헤모글로빈이다. 면역학적 측정법에서는 검출 대상의 항원성을 유지하는 것이 중요한데, 본 발명에 의하면 헴 단백질의 항원성을 유지할 수 있기 때문에 보다 정확한 헴 단백질의 측정이 가능해진다. 특히, 본 발명이 대상으로 하는 헴 단백질 및 본 발명의 시료에 포함되는 헴 단백질을 생체 시료 중의 헤모글로빈으로 함으로써 대장암 등의 질병 진단에서의 측정 결과 오류를 막는 것을 기대할 수 있다. 헤모글로빈은 변 중에 포함되는 헤모글로빈, 적혈구로 조제한 헤모글로빈을 포함한 표준 시료 또는 대조군으로서 시판되고 있는 헤모글로빈 및 동결 건조 헤모글로빈 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 헴 단백질의 보존액 또는 헴 단백질을 포함한 시료는 헴 단백질을 용해할 수 있는 용액을 포함할 수 있다. 용액으로서는 헴 단백질을 용해할 수 있는 용액이면 되고, 예를 들어 완충액을 들 수 있고, 완충액의 조제에 사용되는 완충제로서는 완충능을 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 굳 완충제나 인산 완충제, 트리스 완충제, 글리신 완충제, 붕산 완충제 등을 들 수 있다.
나아가 굳 완충제로서는 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산(MES) 완충제, 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄(Bis-Tris) 완충제, N-(2-아세트아미드)이미노이아세트산(ADA) 완충제, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 완충제, N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산(ACES) 완충제, 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산(MOPSO) 완충제, N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES) 완충제, 3-모르폴리노프로판술폰산(MOPS) 완충제, N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산(TES) 완충제, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-에탄술폰산(HEPES) 완충제, 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산(DIPSO) 완충제, 2-히드록시-3-{[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산(TAPSO) 완충제, 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-3-술폰산)(POPSO) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-히드록시-3-술포프로필)피페라진(HEPPSO) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(3-술포프로필)피페라진(EPPS) 완충제, 트리신[N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신] 완충제, 비신[N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신] 완충제, 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노프로판술폰산(TAPS) 완충제, 2-(N-시클로헥실아미노)에탄술폰산(CHES) 완충제, 3-(N-시클로헥실아미노)-2-히드록시프로판술폰산(CAPSO) 완충제, 3-(N-시클로헥실아미노)프로판술폰산(CAPS) 완충제 등을 들 수 있다. 특히, 본 발명에서는 굳 완충제 중에서도 HEPES를 이용하는 것이 바람직하고, 디술폰산 또는 그 염을 공존시킴으로써 헴 단백질의 안정성을 현저하게 높일 수 있다.
완충제의 농도는 측정에 적합한 농도이면 특별히 한정되지 않지만, 0.001 내지 2.0mol/L, 바람직하게는 0.005 내지 1.5mol/L, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1.0mol/L이다.
또한, 본 발명의 헴 단백질의 보존액 또는 헴 단백질을 포함한 시료의 pH는 중성 영역이 바람직하고, 5 내지 10이 바람직하며, 보다 바람직하게는 6 내지 8의 범위이다. pH가 5보다 낮거나 10보다 높은 경우는 헴 단백질의 안정성이 손상되어 헴 단백질이 변성 혹은 분해되기 쉬워진다. pH는 공지의 방법으로 조정할 수 있고, NaOH나 적당한 완충제를 이용하여 조정해도 된다.
나아가 본 발명의 헴 단백질의 보존액 또는 헴 단백질을 포함한 시료는 수용성 천이 금속 착체, 페로시안 화합물, 헤모글로빈의 효소 분해 산물, 천이 금속류, 유기산, 이미노카르본산, 알부민이나 젤라틴으로 대표되는 비활성 단백질 및 아지화 나트륨 등 공지의 단백질 보호제를 포함할 수 있다. 또한, 미생물의 불필요한 번식을 막기 위한 항균제 등을 포함해도 된다. 나아가 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서 필요에 따라 염, 응집 촉진제, 그 밖의 성분을 포함해도 된다. 본 발명에 의하면 종래의 단백질 보호제나 항균제 등의 작용을 저해하지 않고 종래의 단백질 보호제나 항균제 등과 함께 헴 단백질의 안정성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 헴 단백질의 보존액 또는 헴 단백질을 포함한 시료가 알부민을 포함하는 경우에는 알부민으로서 소, 말, 돼지, 양, 토끼, 인간, 래트 등의 알부민을 이용할 수 있고, 알부민을 함유하는 혈청을 이용하도록 해도 된다. 본 발명의 헴 단백질의 보존액 또는 헴 단백질을 포함한 시료 중의 알부민 농도는 0.0005 내지 2.0w/v%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.5w/v%이다.
헴 단백질의 측정 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 항헴단백질 항체(헴 단백질에 특이적으로 결합하는 항체)를 이용한 면역학적 측정법, 바람직하게는 항인간 헤모글로빈 항체를 이용한 면역학적 측정법이다. 구체적으로는 시료에 있어서 헴 단백질(예를 들어 인간 헤모글로빈)과 항헴단백질 항체(예를 들어 항인간 헤모글로빈 항체)를 디술폰산 또는 그 염의 존재 하에서 접촉시켜 항원 항체 반응을 일으켜 형성한 면역 복합체에 기초하여 이러한 시료 중의 헴 단백질을 검출 또는 측정한다. 헴 단백질이 인간 헤모글로빈인 경우에는 인간 헤모글로빈의 면역학적 측정법으로서는 예를 들어 한천 평판 내에서 항인간 헤모글로빈 항체와 피검 시료 중의 인간 헤모글로빈의 결합에 따른 면역 복합체에 의한 침강선의 발현을 확인하는 일원 방사상 면역 확산법, 항인간 헤모글로빈 항체를 감작한 라텍스 입자를 이용하는 라텍스 면역 응집법, 효소나 방사성 원소로 표지한 항인간 헤모글로빈 항체를 이용하는 효소 면역 측정법이나 방사 면역 측정법, 항인간 헤모글로빈 항체를 감작한 금 콜로이드 입자를 이용하는 금 콜로이드 응집 비색법, 니트로셀룰로오스막 등의 멤브레인에 있어서 금속 콜로이드 등으로 표지한 항인간 헤모글로빈 항체 및 이 항인간 헤모글로빈 항체와 인간 헤모글로빈의 면역 복합체를 포착하는 포착 항체를 이용하는 면역크로마토법 등을 들 수 있다. 구체적으로 라텍스 면역 응집법에서는 항인간 헤모글로빈 항체를 감작한 라텍스 입자와 시료 중의 인간 헤모글로빈을 반응시켜 면역 복합체의 형성에 의해 라텍스 입자가 응집되고, 이러한 라텍스의 응집에 의한 탁도의 변화에 기초하여 인간 헤모글로빈을 측정한다. 또한, 면역크로마토법에서는 니트로셀룰로오스막 등의 멤브레인에 있어서 시료를 공급하고, 시료 중의 인간 헤모글로빈은 금속 콜로이드 등으로 표지한 항인간 헤모글로빈 항체를 보유하는 표지 시약 보유부에서 항인간 헤모글로빈 항체와 반응하여 면역 복합체를 형성하고, 나아가 면역 복합체가 모세관 현상에 의해 멤브레인 중을 이동하여 멤브레인의 소정 위치에 고정된 포착 항체에 의해 상기 면역 복합체가 포착되고, 이러한 포착에 의한 정색(呈色)에 기초하여 인간 헤모글로빈을 검출한다. 모든 측정 방법에서 디술폰산 또는 그 염을 포함한 본 발명의 헴 단백질의 보존액 또는 헴 단백질을 포함한 시료에 의하면 헴 단백질의 항원 활성을 보호하고 측정값 오류를 억제할 수 있다.
본 발명의 헴 단백질의 보존액은 헴 단백질을 보존하기 위한 용액으로서 다양한 용도로 이용할 수 있고, 예를 들어 분변, 소변 및 혈액 등 생체 시료 유래의 헴 단백질의 용해용 용액이나 희석액 및 추출액 등의 용액으로서 이용할 수 있다. 특히, 헴 단백질의 검출을 행하기 위한 검사, 예를 들어 변잠혈 검사의 변검체용 희석액으로서 유용하다.
또한, 본 발명의 헴 단백질의 보존액은 상술한 본 발명이 대상으로 하는 헴 단백질을 포함하고 있어도 되고, 헴 단백질을 포함한 다양한 용액으로서 사용할 수 있다. 마찬가지로 본 발명의 헴 단백질의 안정화 방법은 헴 단백질을 포함한 다양한 시료에 적용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질을 포함한 시료는 헴 단백질을 포함한 표준 시료 또는 헴 단백질을 포함한 대조군 시료 등, 특히 자동 분석 장치의 캘리브레이션 또는 정밀도 관리용 헴 단백질을 포함한 표준 시료 또는 헴 단백질을 포함한 대조군 시료로서 사용할 수 있다. 헴 단백질을 포함한 표준 시료 및 대조군 시료는 장기적으로 보존된 경우에도 헴 단백질의 측정값이 변동하지 않는 것이 필요한데, 본 발명에 의하면 비교적 고온에서 보존된 경우에도 표준 시료 및 대조군 시료 중의 헴 단백질의 변성 혹은 분해를 억제할 수 있기 때문에 헴 단백질의 측정값의 안정화에 공헌할 수 있다. 따라서, 본 발명의 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질을 포함한 시료는 헴 단백질을 포함한 표준 시료 및 대조군 시료로서 적합하다.
나아가 본 발명의 헴 단백질의 보존액은 예를 들어 변잠혈 검사 등에 사용되는, 헴 단백질(예를 들어 인간 헤모글로빈)의 면역학적 측정용 키트로서 제공할 수도 있다. 이러한 키트는 본 발명의 헴 단백질의 보존액 외에 채변 용기 등의 시료 보존 용기, 키트의 취급 설명서나, 예를 들어 면역학적 측정법이 라텍스 면역 응집법인 경우에는 항헴단백질 항체를 감작한 라텍스액, 희석액 등, 혹은 면역학적 측정법이 면역크로마토법인 경우에는 면역크로마토그래프 디바이스(예를 들어 시료 공급부와, 금속 콜로이드 등으로 표지한 항헴단백질 항체를 보유하는 표지 시약 보유부와, 소정의 위치에 고정된 포착 항체를 포함한 검출부를 갖는, 지지체에 담지된 니트로셀룰로오스막 등의 멤브레인) 등을 포함할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
0.3w/v%의 소혈청 알부민, NaOH 및 완충액으로서 0.05mol/L의 인산 완충액을 포함하고, 잔부를 순수(純水)로 하는 pH 7.0의 용액을 조제하였다. 이 용액에 첨가물로서 1,2-EDS를 표 1에 나타내는 각 농도(0.01 내지 0.2mol/L)가 되도록 첨가하여 각 농도의 용액을 조제하였다. 이 조제한 각 용액 10mL에 용혈 헤모글로빈을 600ng/mL가 되도록 첨가하여 시료로 하였다.
헤모글로빈의 첨가 직후에 각 시료의 헤모글로빈 농도를 측정하였다(첨가 직후 농도). 다음으로 각 시료를 37℃로 보존하였다. 헤모글로빈의 첨가 시점을 보존 0시간으로 하여 6시간 보존 후 및 24시간 보존 후에 각 시료의 헤모글로빈 농도를 측정하였다(6시간 보존(저장) 후 농도 및 24시간 보존(저장) 후 농도).
헤모글로빈의 농도 측정은 OC센서 DIANA 분석기(에이켄 화학(주) 제품)를 이용하여 면역학적 측정법의 일종인 라텍스 응집 반응을 측정 원리로 하는 전용 시약(OC 헤모디아오트 III: 에이켄 화학(주) 제품)을 이용하여 행하였다. 상세하게는 시료로부터 35μL을 채취하여 시험액으로 하고, 이 시험액에 라텍스 유액(20vol%의 항인간 헤모글로빈 토끼 폴리클로날 항체 감작 라텍스액) 60μL 및 희석액(11.92mg/mL의 HEPES) 300μL을 더하고 파장 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 미리 작성한 검량선에 기초하여, 얻어진 측정값으로부터 시험액 중의 헤모글로빈 농도를 결정하였다. 각 시료에 대해 3중 측정을 하고 측정 결과의 평균값을 각 시료의 헤모글로빈 농도로 하였다.
측정한 헤모글로빈 농도로부터 이하의 식에 기초하여 헤모글로빈의 잔존율을 구하였다.
6시간 보존 후 또는 24시간 보존 후의 헤모글로빈의 잔존율[%]=100×헤모글로빈의 6시간 보존 후 농도 또는 24시간 보존 후 농도[ng/mL]/대조 시료의 첨가 직후 농도[ng/mL]
즉, 각 시료의 헤모글로빈의 잔존율은 대조 시료에서의 헤모글로빈의 첨가 직후 농도를 100%로 하는 상대값이다. 본 실시예에서의 대조 시료는 소혈청 알부민 및 NaOH를 포함한 인산 완충액(1,2-EDS를 포함하지 않음)이며, 대조 시료의 첨가 직후 농도는 583ng/mL이었다. 결과를 표 1에 나타낸다.
표 1에 나타내는 바와 같이 디술폰산인 1,2-EDS를 포함한 시료는 대조 시료와 비교하여 6시간 보존 후 및 24시간 보존 후의 잔존율이 높고 1,2-EDS가 헤모글로빈의 안정화 효과를 갖는 것을 알 수 있다. 나아가 1,2-EDS의 농도 증가에 동반하여 잔존율이 높아지고 헤모글로빈의 안정화 효과를 높이는 것을 알 수 있다.
실시예 2
인산 완충액 대신에 0.05mol/L의 N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-에탄술폰산(이하, HEPES라고 함)을 이용한 점, 표 2에 나타내는 각 농도(0.005 내지 0.2mol/L)가 되도록 1,2-EDS를 첨가한 점 이외에는 실시예 1과 같이 하여 시료를 조제하고 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 각 시료의 잔존율은 대조 시료(소혈청 알부민 및 NaOH를 포함한 HEPES 완충액(1,2-EDS를 포함하지 않음))에서의 첨가 직후 농도(576ng/mL)를 100%로 하는 상대값으로 나타내었다.
표 2에 나타내는 바와 같이 디술폰산인 1,2-EDS를 포함한 시료는 대조 시료와 비교하여 6시간 보존 후 및 24시간 보존 후의 잔존율이 높고 1,2-EDS가 헤모글로빈의 안정화 효과를 갖는 것을 알 수 있다. 특히, HEPES와 1,2-EDS를 포함함으로써 1,2-EDS의 첨가 농도가 5mM이라는 저농도인 시료에서도 6시간 보존 후 및 24시간 보존 후의 잔존율이 높은 것을 알 수 있다. 나아가 1,2-EDS의 첨가 농도 증가에 따라 잔존율이 높아지고 헤모글로빈의 안정화 효과를 높이는 것을 알 수 있다.
실시예 3
인산 완충액 대신에 0.05mol/L의 HEPES, 0.05mol/L의 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(이하, PIPES라고 함) 또는 0.05mol/L의 2-모르폴리노에탄술폰산(이하, MES라고 함)을 이용한 점, 1,2-EDS를 표 3에 나타내는 농도가 되도록 첨가한 점 이외에는 실시예 1과 같이 하여 시료를 조제하고 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또, 각 시료의 잔존율은 대조 시료(소혈청 알부민 및 NaOH를 포함한 인산 완충액(1,2-EDS를 포함하지 않음))에서의 첨가 직후 농도(583ng/mL)를 100%로 하는 상대값으로 나타내었다.
표 3에 나타내는 바와 같이 완충액이 상이한 시료에서도 1,2-EDS에 의한 헤모글로빈의 안정화 효과를 볼 수 있었다. 특히, HEPES와 1,2-EDS를 포함한 시료는 HEPES를 완충액으로 하고 1,2-EDS를 포함하지 않는 시료와 비교하여 6시간 보존 후 및 24시간 보존 후의 잔존율이 현저하게 높고, 헤모글로빈의 변성 혹은 분해 억제 효과가 극히 높은 것을 알 수 있음과 아울러 장기적으로 헤모글로빈을 안정화할 수 있는 것이 시사되었다. 또한, HEPES와 1,2-EDS를 포함한 시료는 굳 완충제인 PIPES나 MES와 1,2-EDS를 포함한 시료와 비교해도 6시간 보존 후 및 24시간 보존 후의 잔존율이 높고, 헤모글로빈의 변성 혹은 분해 억제 효과를 보다 높이고 있기 때문에 상승적인 헤모글로빈 안정화 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
실시예 4
1,2-EDS 대신에 1,4-부탄 디술폰산(이하, 1,4-BDS라고 함) 또는 2,6-나프탈렌 디술폰산(이하, 2,6-NDS라고 함), PIPES를 표 4에 나타내는 농도가 되도록 첨가한 점 및 인산 완충액 대신에 0.05mol/L의 HEPES를 이용한 점 이외에는 실시예 1과 같이 하여 시료를 조제하고 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. 또, 각 시료의 잔존율은 대조 시료(소혈청 알부민 및 NaOH를 포함한 인산 완충액(디술폰산을 포함하지 않음))에서의 첨가 직후 농도(548ng/mL)를 100%로 하는 상대값으로 나타내었다.
표 4에 나타내는 바와 같이 디술폰산인 1,4-BDS, 2,6-NDS 및 PIPES가 헤모글로빈의 안정화 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
비교예 1
1,2-EDS 대신에 8-아닐리노-1-나프탈렌술폰산(이하, ANS라고 함) 혹은 2-메르캅토에탄술폰산 나트륨(이하, MESS라고 함)을 0.01mol/L가 되도록 첨가한 점 이외에는 실시예 1과 같이 하여 시료를 조제하고 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 결과를 표 5에 나타낸다. 또, 각 시료의 잔존율은 대조 시료(소혈청 알부민 및 NaOH를 포함한 인산 완충액(첨가물을 포함하지 않음))에서의 첨가 직후 농도(583ng/mL)를 100%로 하는 상대값으로 나타내었다.
표 5에 나타내는 바와 같이 디술폰산이 아닌 술폰산을 포함한 시료에서는 헤모글로빈의 변성 혹은 분해가 진행되어 있을 가능성이 있는 것을 알 수 있다.
따라서, 1,4-BDS, 2,6-NDS 및 1,2-EDS 등의 디술폰산을 포함한 보존액 및 시료는 37℃라는 고온 하에서 보존된 경우에도 6시간 보존 후 및 24시간 보존 후의 헤모글로빈의 잔존율을 높게 유지할 수 있는 것이 나타났다. 이 결과로부터 본 발명의 디술폰산을 포함한 보존액 및 시료는 온도 상승 및 시간 경과를 수반하는 경우에도 헤모글로빈의 변성 혹은 분해를 억제하고 헤모글로빈의 안정화 효과를 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1의 각 시료에 변검체를 첨가하고 동일한 측정을 행한 바, 실시예 1 내지 실시예 4 및 비교예 1의 측정 결과와 동일한 경향을 볼 수 있었다.
이상으로부터 디술폰산 또는 그 염을 포함한 본 발명의 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법에 의하면 헴 단백질의 변성 혹은 분해를 억제하고 헴 단백질을 안정화할 수 있는 것이 명백해졌다.
본 발명의 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법에 의하면, 헴 단백질의 변성 혹은 분해를 억제하고 헴 단백질을 안정적으로 보존할 수 있으며, 변잠혈 검사의 변검체용 희석액, 헴 단백질을 포함한 표준 시료 및 헴 단백질을 포함한 대조군 시료 등의 헴 단백질을 안정적으로 보존할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 한다.
Claims (20)
- 디술폰산 또는 그 염을 포함한 헴 단백질의 보존액으로서,
상기 디술폰산 또는 그 염이 쇄식 탄화수소기를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로,
상기 쇄식 탄화수소기가 분지상 혹은 직쇄상의 탄화수소기이고, 또한 분지상의 상기 쇄식 탄화수소기의 주쇄 혹은 직쇄상의 상기 쇄식 탄화수소기의 탄소수가 1 내지 10 중 어느 하나인 디술폰산 또는 그 염, 및,
나프틸렌기를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 상기 헴 단백질의 보존액. - 청구항 1에 있어서, 상기 디술폰산이 쇄식 탄화수소기 또는 나프탈렌기와 2개의 술폰기로 이루어진 헴 단백질의 보존액.
- 청구항 1에 있어서, 상기 디술폰산이 치환기를 가지고 또한 그 치환기가 할로겐기 및/또는 히드록시기인 헴 단백질의 보존액.
- 청구항 1에 있어서, 상기 디술폰산 또는 그 염이 메탄 디술폰산, 에탄 디술폰산, 프로판 디술폰산, 부탄 디술폰산 및 나프탈렌 디술폰산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 헴 단백질의 보존액.
- 청구항 1에 있어서, 상기 디술폰산 또는 그 염의 농도가 0.001mol/L 이상 0.3mol/L 이하인 헴 단백질의 보존액.
- 청구항 1에 있어서, N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-에탄술폰산을 더 포함하는 헴 단백질의 보존액.
- 청구항 1에 있어서, 표준 시료 또는 대조군 시료로서 이용되는 헴 단백질을 더 포함하는 헴 단백질의 보존액.
- 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
면역학적 측정에 이용되는 헴 단백질의 보존액. - 헴 단백질을 포함한 시료 중에 디술폰산 또는 그 염을 공존시키는 헴 단백질의 안정화 방법으로서,
상기 디술폰산 또는 그 염이 쇄식 탄화수소기를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로, 상기 쇄식 탄화수소기가 분지상 혹은 직쇄상의 탄화수소기이고, 또한 분지상의 상기 쇄식 탄화수소기의 주쇄 혹은 직쇄상의 상기 쇄식 탄화수소기의 탄소수가 1 내지 10 중 어느 하나인 디술폰산 또는 그 염, 및,
나프틸렌기를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 상기 헴 단백질의 안정화 방법. - 청구항 9에 있어서, 상기 디술폰산이 쇄식 탄화수소기 또는 나프탈렌기와 2개의 술폰기로 이루어진 헴 단백질의 안정화 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 디술폰산이 치환기를 가지고 또한 그 치환기가 할로겐기 및/또는 히드록시기인 헴 단백질의 안정화 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 디술폰산 또는 그 염이 메탄 디술폰산, 에탄 디술폰산, 프로판 디술폰산, 부탄 디술폰산 및 나프탈렌 디술폰산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 헴 단백질의 안정화 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 디술폰산 또는 그 염의 농도가 0.001mol/L 이상 0.3mol/L 이하인 헴 단백질의 안정화 방법.
- 청구항 9에 있어서, 헴 단백질을 포함하는 시료 중에 N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-에탄술폰산을 더 공존시키는 헴 단백질의 안정화 방법.
- 헴 단백질과 항헴단백질 항체를 디술폰산 또는 그 염의 존재 하에서 접촉시키는 공정을 포함하는 헴 단백질의 면역학적 측정 방법으로서,
상기 디술폰산 또는 그 염이 쇄식 탄화수소기를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로,
상기 쇄식 탄화수소기가 분지상 혹은 직쇄상의 탄화수소기이고, 또한 분지상의 상기 쇄식 탄화수소기의 주쇄 혹은 직쇄상의 상기 쇄식 탄화수소기의 탄소수가 1 내지 10 중 어느 하나인 디술폰산 또는 그 염, 및,
나프틸렌기를 갖는 디술폰산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 상기 헴 단백질의 면역학적 측정 방법. - 청구항 15에 있어서, 상기 디술폰산이 쇄식 탄화수소기 또는 나프탈렌기와 2개의 술폰기로 이루어진 헴 단백질의 면역학적 측정 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 디술폰산이 치환기를 가지고 또한 그 치환기가 할로겐기 및/또는 히드록시기인 헴 단백질의 면역학적 측정 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 디술폰산 또는 그 염이 메탄 디술폰산, 에탄 디술폰산, 프로판 디술폰산, 부탄 디술폰산 및 나프탈렌 디술폰산 또는 그 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 헴 단백질의 면역학적 측정 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 디술폰산 또는 그 염의 농도가 0.001mol/L 이상 0.3mol/L 이하인 헴 단백질의 면역학적 측정 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 접촉에 있어서 N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-에탄술폰산을 더 존재시키는 헴 단백질의 면역학적 측정 방법.
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