WO2016159203A1 - ヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法 - Google Patents

ヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法 Download PDF

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acid
salt
disulfonic acid
hemoglobin
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梢 坂田
伸 諏合
良太 安居
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栄研化学株式会社
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    • G01N2021/825—Agglutination

Definitions

  • the present invention relates to a hemoprotein storage solution and a hemoprotein stabilization method.
  • the present invention relates to a hemoprotein storage solution and a hemoprotein stabilization method useful in immunoassays.
  • fecal occult blood tests for detecting blood in feces are widely performed as a primary test for colorectal cancer screening and a screening method for lower gastrointestinal diseases.
  • the fecal occult blood test is performed by a chemical measurement method based on a chemical color reaction using the peroxidase-like activity of hemoglobin, a hemoprotein, or by an immunological measurement method using an antibody specific for human hemoglobin,
  • immunological measurement methods do not require pre-test dietary restrictions or medication restrictions compared to chemical measurement methods, and can be measured easily and quickly. It has become established.
  • hemoglobin is very unstable in solution and easily denatured or decomposed. This denaturation or degradation destroys the three-dimensional structure of hemoglobin and reduces its antigenicity, leading to erroneous measurement results in the immunoassay for hemoglobin.
  • the causes of degeneration or degradation of hemoglobin include various things such as increased storage temperature, time, bacteria and enzymes. For example, hemoglobin in solution is relatively stable when frozen or refrigerated. However, it is known that denaturation or decomposition proceeds at room temperature or higher.
  • fecal occult blood tests the subject himself collects feces at home, etc., often suspends feces in a sealed container containing a diluent for fecal samples, and in this case, human hemoglobin in the feces is In some cases, the solution is left in a solution for several days and placed under a high temperature by using a transportation means such as a mail. Furthermore, since many specimens and other items are inspected at hospitals and laboratories, it may take a long time to obtain measurement results. Therefore, in the fecal occult blood test, causes such as temperature rise and time lapse overlap, and hemoglobin is likely to be denatured or decomposed.
  • a standard sample containing a known concentration of hemoglobin and a control sample containing a known concentration of hemoglobin are used regularly. Calibration and quality control are performed. In calibration, a standard sample containing a plurality of substances to be measured with known concentrations is measured with an automatic analyzer, a calibration curve is created, and the automatic analyzer is calibrated. The control sample is measured with an automatic analyzer, and the analysis accuracy is determined based on whether or not the measured value is within a predetermined range. However, if the hemoglobin contained in the standard sample and the control sample is denatured or decomposed, calibration and accuracy management cannot be performed accurately, resulting in measurement errors.
  • a method of adding an antibacterial agent such as thimerosal or chlorhexidine for example, see Patent Document 1
  • a method of adding non-human animal hemoglobin for example, see Patent Document 2
  • a method of adding non-human animal serum for example, Patent Document 3
  • a method of adding a glycosidase-type lytic enzyme see, for example, Patent Document 4
  • a method of adding sulfite, disulfite, or the like see, for example, Patent Document 5
  • an acylarginine ester an cationic surfactant.
  • a method of adding an agent for example, see Patent Document 6
  • a method of adding glyoxylic acid for example, see Patent Document 7
  • the like have been proposed.
  • the present applicant has added a method of adding a water-soluble transition metal complex such as a ferrocyan compound (see, for example, Patent Document 8 and Patent Document 9), and a method of adding an enzymatic degradation product of hemoglobin (see, for example, Patent Document 10).
  • a method of adding transition metals for example, see Patent Document 11
  • a method of adding an organic acid such as malic acid
  • a method of adding defatted albumin for example, see Patent Document 13
  • a method of adding iminocarboxylic acid for example, see Patent Document 14
  • hemoglobin is very unstable, there is a problem that even these methods for stabilizing hemoglobin have not sufficiently prevented its denaturation or decomposition.
  • an object of the present invention is to provide a new hemoprotein preservation solution and a method for stabilizing a hemoprotein, which are effective for denaturation or degradation of hemoprotein represented by hemoglobin.
  • the heme protein preservation solution of the present invention contains disulfonic acid or a salt thereof.
  • the method for stabilizing a hemoprotein of the present invention is characterized in that disulfonic acid or a salt thereof is allowed to coexist in a sample containing the hemoprotein.
  • the present invention includes the following.
  • Heme protein preservation solution containing disulfonic acid or a salt thereof.
  • the disulfonic acid or a salt thereof is a disulfonic acid or a salt thereof having at least one of a chain hydrocarbon group or a cyclic hydrocarbon group
  • the chain hydrocarbon group is a branched or straight chain hydrocarbon group, and the main chain of the branched chain hydrocarbon group or the carbon number of the straight chain hydrocarbon group Disulfonic acid or a salt thereof, wherein A disulfonic acid or a salt thereof, wherein the cyclic hydrocarbon group is a cycloalkylene group or an aryl group, and the cyclic hydrocarbon group has any of 3 to 10 carbon atoms, and
  • Disulfonic acid or a salt thereof is composed of methanedisulfonic acid, ethanedisulfonic acid, propanedisulfonic acid, butanedisulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) or a salt thereof.
  • hemoprotein preservation solution according to any one of (1) to (4), further comprising N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N′-ethanesulfonic acid.
  • a method for immunoassay of heme protein comprising a step of contacting a heme protein and an anti-heme protein antibody in the presence of disulfonic acid or a salt thereof.
  • the hemoprotein can be stably stored while denaturation or degradation of the hemoprotein is suppressed.
  • the heme protein preservation solution of the present invention contains disulfonic acid or a salt thereof.
  • disulfonic acid or a salt thereof is allowed to coexist in a sample containing the hemoprotein.
  • the disulfonic acid or a salt thereof used in the present invention is not particularly limited and can be selected from known ones.
  • the disulfonic acid used in the present invention is a disulfonic acid having at least one chain or cyclic hydrocarbon group which may have a saturated or unsaturated bond, and in particular, a chain or cyclic hydrocarbon.
  • a disulfonic acid composed of a group and two sulfonic groups is preferred.
  • the disulfonic acid used in the present invention may have either a chain hydrocarbon group or a cyclic hydrocarbon group, or may have both.
  • the chain hydrocarbon group of the disulfonic acid used in the present invention is a branched or straight chain hydrocarbon group.
  • the main chain of the branched hydrocarbon group or the straight chain hydrocarbon group preferably has 1 to 10 carbon atoms, more preferably 1 to 4 carbon atoms, and even more preferably 1 or 2.
  • the main chain or straight chain hydrocarbon group of the branched hydrocarbon group is preferably an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkylene group, an alkenylene group, or an alkynylene group.
  • disulfonic acid having an alkylene group examples include methane disulfonic acid, 1,2-ethanedisulfonic acid (hereinafter referred to as 1,2-EDS), 1,3-propanedisulfonic acid, 1,4-butanedisulfonic acid, 1 , 5-pentanedisulfonic acid, 1,6-hexanedisulfonic acid and the like.
  • the cyclic hydrocarbon group of the disulfonic acid used in the present invention preferably has any one of 3 to 10 carbon atoms.
  • the cyclic hydrocarbon group is preferably a cycloalkyl group, a cycloalkenyl group, a cycloalkynyl group, or an aryl group.
  • the aryl group is preferably a phenylene group or a naphthylene group.
  • Examples of the disulfonic acid having a phenylene group or a naphthylene group include 1,2-benzenedisulfonic acid, 1,3-benzenedisulfonic acid, 1,4-benzenedisulfonic acid, 1,6-naphthalenedisulfonic acid, 2,6- And naphthalenedisulfonic acid, 2,7-naphthalenedisulfonic acid, and the like.
  • the cyclic hydrocarbon group may be a branched hydrocarbon group.
  • the cyclic hydrocarbon group may be substituted with one or more, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 nitrogen atoms.
  • Examples of the disulfonic acid having a hydrocarbon group substituted with a nitrogen atom include piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid).
  • the disulfonic acid used in the present invention is a disulfonic acid in which two sulfone groups are bonded to a chain or cyclic hydrocarbon group.
  • the disulfonic acid having a chain hydrocarbon group preferably has two sulfone groups on the main chain of a branched hydrocarbon group or different carbon atoms of a linear hydrocarbon group, more preferably At each of these ends.
  • the disulfonic acid used in the present invention is preferably 1,2-ethanedisulfonic acid (1,2-EDS).
  • the hydrocarbon group of disulfonic acid used in the present invention may have a substituent such as a halogen group and / or a hydroxy group.
  • the branched chain is preferably made of a hydrocarbon.
  • the disulfonic acid or its salt used for this invention is at least 1 type, and the mixture which mixed 2 or more types may be sufficient as it.
  • the denaturation or degradation of heme protein can be suppressed by including heme protein and disulfonic acid or a salt thereof in the preservation solution or sample.
  • the stability of the heme protein can be further enhanced by the fact that the disulfonic acid contains ethanedisulfonic acid.
  • the disulfonic acid used in the present invention does not adversely affect the measurement, and is particularly suitable for an immunoassay method using a latex immunoaggregation method.
  • the salt of disulfonic acid used in the present invention is not particularly limited, but is a monovalent, divalent, or trivalent metal salt of disulfonic acid.
  • the disulfonic acid salt include alkali metal salts, ammonium salts, alkaline earth metal salts, iron salts, and aluminum salts.
  • the alkali metal include lithium, sodium, potassium, rubidium, and cesium.
  • the alkaline earth metal include calcium, strontium, barium, and radium.
  • the upper limit of the concentration of disulfonic acid or a salt thereof contained in the heme protein preservation solution or the sample containing heme protein of the present invention is 0.3 mol / L or less, more preferably 0.2 mol / L or less, and still more preferably 0.8.
  • the lower limit is 0.001 mol / L or more, more preferably 0.005 mol / L or more, still more preferably 0.01 mol / L or more, and most preferably 0.02 mol / L or more. If the concentration of disulfonic acid or a salt thereof is less than 0.001 mol / L, the effect of stabilizing the heme protein becomes insufficient. On the other hand, when the concentration of disulfonic acid or a salt thereof exceeds 0.3 mol / L, the immune reaction is inhibited and the measurement tends to be affected, and a sufficient effect of stabilizing the heme protein cannot be obtained.
  • the heme protein targeted by the present invention and the heme protein contained in the sample of the present invention can be appropriately selected from proteins containing heme as a constituent component.
  • hemoproteins include hemoglobin, myoglobin, peroxidase, or catalase.
  • the hemoprotein targeted by the present invention and the hemoprotein contained in the sample of the present invention are preferably hemoproteins to be analyzed immunologically, more preferably human hemoglobin.
  • the antigenicity of the hemoprotein can be maintained, so that more accurate measurement of the hemoprotein can be achieved. Become.
  • the hemoglobin can include hemoglobin contained in feces, standard samples containing hemoglobin prepared from erythrocytes or hemoglobin marketed as a control, lyophilized hemoglobin, and the like.
  • the preservation solution of heme protein or the sample containing heme protein of the present invention may contain a solution capable of dissolving heme protein.
  • the solution may be any solution that can dissolve heme protein, and examples thereof include a buffer solution.
  • the buffer used for preparing the buffer solution is particularly limited as long as it has a buffer capacity. For example, Good buffer, phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, borate buffer and the like can be mentioned.
  • examples of the good buffer include 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer, bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris) buffer, N- (2-acetamide) Iminodiacetic acid (ADA) buffer, piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) buffer, N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES) buffer, 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) buffer, N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES) buffer, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) buffer Agent, N- [Tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfonic acid (TES) buffer N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N′-ethanes
  • the concentration of the buffer is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is 0.001 to 2.0 mol / L, preferably 0.005 to 1.5 mol / L, more preferably 0.01 to 1. 0 mol / L.
  • the pH of the haem protein preservation solution or the sample containing heme protein of the present invention is preferably in the neutral range, more preferably 5 to 10, and more preferably 6 to 8.
  • the pH can be adjusted by a known method, and may be adjusted using NaOH or an appropriate buffer.
  • the preservation solution of the hemoprotein or the sample containing the hemoprotein of the present invention is represented by a water-soluble transition metal complex, a ferrocyan compound, an enzymatic degradation product of hemoglobin, a transition metal, an organic acid, an iminocarboxylic acid, albumin or gelatin.
  • Known protein protective agents such as inactive proteins and sodium azide.
  • an antibacterial agent or the like for preventing unnecessary propagation of microorganisms may be included.
  • the stability of heme protein can be enhanced together with the conventional protein protective agent, antibacterial agent and the like without inhibiting the action of the conventional protein protective agent, antibacterial agent and the like.
  • albumin from cattle, horses, pigs, sheep, rabbits, humans, rats, etc.
  • albumin from cattle, horses, pigs, sheep, rabbits, humans, rats, etc.
  • Serum containing may be used.
  • concentration of albumin in the stock solution of heme protein of the present invention or the sample containing heme protein is 0.0005 to 2.0 w / v%, more preferably 0.01 to 0.5 w / v%.
  • the method for measuring heme protein is not particularly limited, but an immunoassay method using an anti-heme protein antibody (an antibody that specifically binds to heme protein), preferably an anti-human hemoglobin antibody is used. It is an immunological assay. Specifically, in a sample, a hemoprotein (e.g., human hemoglobin) and an anti-hemoprotein antibody (e.g., anti-human hemoglobin antibody) are contacted in the presence of disulfonic acid or a salt thereof to cause an antigen-antibody reaction, Heme protein in the sample is detected or measured based on the formed immune complex.
  • an anti-heme protein antibody an antibody that specifically binds to heme protein
  • an anti-human hemoglobin antibody preferably an anti-human hemoglobin antibody
  • an immunoassay for human hemoglobin is, for example, a method of immunoprecipitation of a sedimentation line by an immunocomplex due to binding of an anti-human hemoglobin antibody and human hemoglobin in a test sample in an agar plate.
  • Uniform radial immunodiffusion method to confirm expression latex immunoagglutination method using latex particles sensitized with anti-human hemoglobin antibody, enzyme immunoassay method or radioimmunoassay method using anti-human hemoglobin antibody labeled with enzyme or radioactive element, Gold colloid aggregation colorimetric method using gold colloid particles sensitized with anti-human hemoglobin antibody, immunity between anti-human hemoglobin antibody labeled with metal colloid, etc., and anti-human hemoglobin antibody and human hemoglobin on membrane such as nitrocellulose membrane Immunochromatography using capture antibodies to capture complexes And the like.
  • latex immunoaggregation latex particles sensitized with anti-human hemoglobin antibody react with human hemoglobin in a sample, latex particles aggregate due to the formation of immune complexes, and turbidity due to aggregation of the latex Human hemoglobin is measured based on the change in.
  • immunochromatography a sample is supplied on a membrane such as a nitrocellulose membrane, and the human hemoglobin in the sample reacts with the anti-human hemoglobin antibody in a labeling reagent holder that holds the anti-human hemoglobin antibody labeled with a metal colloid or the like.
  • the immune complex is then moved through the membrane by capillary action, and the immune complex is captured by the capture antibody fixed at a predetermined position on the membrane.
  • Human hemoglobin is detected.
  • the hemoprotein storage solution of the present invention containing disulfonic acid or a salt thereof or a sample containing heme protein, the antigenic activity of heme protein can be protected and measurement errors can be suppressed. it can.
  • the hemoprotein preservation solution of the present invention can be used in various applications as a solution for preserving heme protein, such as a solution for dissolving hemoprotein derived from biological samples such as feces, urine, and blood, It can be used as a solution such as a diluted solution and an extract. In particular, it is useful as a diluent for a stool specimen in a test for detecting heme protein, for example, a fecal occult blood test.
  • the heme protein preservation solution of the present invention may contain the above-described heme protein of the present invention, and can be used as various solutions containing the heme protein.
  • the method for stabilizing hemoprotein of the present invention can be applied to various samples containing hemoprotein.
  • the stock solution of the heme protein of the present invention and the sample containing the heme protein may be a standard sample containing a heme protein or a control sample containing a heme protein, such as a standard containing a heme protein for calibration or quality control of an automatic analyzer. It can be used as a sample or a control sample containing heme protein.
  • the standard sample and the control sample containing heme protein are required to have the same measured value of heme protein even when stored for a long period of time.
  • the standard sample and the control sample were stored at a relatively high temperature. Even in this case, denaturation or degradation of heme protein in the standard sample and the control sample can be suppressed, which can contribute to stabilization of the measured value of heme protein. Therefore, the stock solution of heme protein of the present invention and the sample containing heme protein are suitable as a standard sample and a control sample containing heme protein.
  • the heme protein preservation solution of the present invention can also be provided as a kit for immunological measurement of heme protein (eg, human hemoglobin) used for, for example, fecal occult blood test.
  • the kit includes a sample storage container such as a stool collection container, an instruction manual for the kit, and anti-heme when the immunological measurement method is a latex immunoagglutination method, for example. Latex liquid, dilution liquid, etc.
  • a detection part including a capture antibody fixed at a predetermined position, and a membrane such as a nitrocellulose film supported on a support.
  • Example 1 A pH 7.0 solution containing 0.3 w / v% bovine serum albumin, NaOH, and 0.05 mol / L phosphate buffer as a buffer, with the balance being pure water was prepared. To this solution, 1,2-EDS was added as an additive so as to have each concentration (0.01 to 0.2 mol / L) shown in Table 1 to prepare a solution having each concentration. The hemolyzed hemoglobin was added to 10 mL of each prepared solution so that it might become 600 ng / mL, and it was set as the sample.
  • the hemoglobin concentration of each sample was measured (concentration immediately after addition). Each sample was then stored at 37 ° C. The hemoglobin concentration was determined for each sample after storage for 6 hours and after storage for 24 hours (the concentration after storage for 6 hours and the concentration after storage for 24 hours).
  • the hemoglobin concentration is measured using an OC sensor DIANA analyzer (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) and a dedicated reagent (OC hemodia auto III: Eiken Chemical Co., Ltd.). Specifically, 35 ⁇ L is taken from the sample as a test solution, and in this test solution, latex emulsion (20 vol% anti-human hemoglobin rabbit polyclonal antibody-sensitized latex solution) 60 ⁇ L and diluent (11.92 mg / mL HEPES) 300 ⁇ L And the absorbance was measured at a wavelength of 660 nm. Based on the calibration curve prepared in advance, the hemoglobin concentration in the test solution was determined from the obtained measured value. Each sample was subjected to triple measurement, and the average value of the measurement results was used as the hemoglobin concentration of each sample.
  • OC sensor DIANA analyzer manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.
  • a dedicated reagent OC hemodia auto III: Eiken Chemical Co., Ltd.
  • the residual rate of hemoglobin was determined based on the following formula.
  • Residual rate of hemoglobin after storage for 6 hours or 24 hours [%] 100 ⁇ concentration of hemoglobin after storage for 6 hours or concentration after storage for 24 hours [ng / mL] / concentration immediately after addition of control sample [ng / mL] That is, the residual ratio of hemoglobin in each sample is a relative value with the concentration immediately after addition of hemoglobin in the control sample as 100%.
  • the control sample in this example was a phosphate buffer (not containing 1,2-EDS) containing bovine serum albumin and NaOH, and the concentration immediately after addition of the control sample was 583 ng / mL. The results are shown in Table 1.
  • the sample containing 1,2-EDS which is a disulfonic acid, has a higher residual rate after storage for 6 hours and after storage for 24 hours compared to the control sample, and 1,2-EDS is less than that of hemoglobin. It can be seen that it has a stabilizing effect. Furthermore, it can be seen that with the increase in the concentration of 1,2-EDS, the residual ratio increases, and the effect of stabilizing hemoglobin is enhanced.
  • Example 2 0.05 mol / L N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N′-ethanesulfonic acid (hereinafter referred to as HEPES) was used in place of the phosphate buffer, and the concentrations shown in Table 2 (0.
  • a sample was prepared in the same manner as in Example 1 except that 1,2-EDS was added so that the concentration was 005 to 0.2 mol / L), and the hemoglobin concentration was measured. The results are shown in Table 2.
  • the residual ratio of each sample is a relative value in which the concentration immediately after addition (576 ng / mL) in the control sample (HEPES buffer containing bovine serum albumin and NaOH (not including 1,2-EDS) (576 ng / mL) is 100%. Indicated.
  • the sample containing 1,2-EDS which is a disulfonic acid, has a higher residual rate after storage for 6 hours and 24 hours than the control sample, and 1,2-EDS is stable for hemoglobin. It can be seen that it has an effect.
  • HEPES and 1,2-EDS it can be seen that even in samples having a low concentration of 1,2-EDS of 5 mM, the residual ratio after storage for 6 hours and after storage for 24 hours is high. .
  • the residual rate increases with increasing concentration of 1,2-EDS and the effect of stabilizing hemoglobin is enhanced.
  • Example 3 instead of phosphate buffer, 0.05 mol / L HEPES, 0.05 mol / L piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (hereinafter referred to as PIPES), or 0.05 mol / L
  • PIPES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • 1,2-EDS was added to the concentration shown in Table 3.
  • the hemoglobin concentration was measured. The results are shown in Table 3.
  • the residual rate of each sample is a relative value with the concentration immediately after addition (583 ng / mL) as 100% in the control sample (phosphate buffer containing bovine serum albumin and NaOH (not including 1,2-EDS)). It showed in.
  • the sample containing HEPES and 1,2-EDS has a significantly higher residual rate after storage for 6 hours and after storage for 24 hours compared to a sample containing HEPES as a buffer and not containing 1,2-EDS. It was found that the inhibitory effect on hemoglobin denaturation or degradation was extremely high, and that hemoglobin could be stabilized in the long term.
  • the sample containing HEPES and 1,2-EDS is stored after 6 hours and after storage for 24 hours, compared with the samples containing PIPES and MES, which are good buffer agents, and 1,2-EDS. From the fact that the residual ratio is high and the effect of suppressing the denaturation or degradation of hemoglobin is further enhanced, it can be seen that it has a synergistic hemoglobin stabilization effect.
  • Example 4 In place of 1,2-EDS, 1,4-butanedisulfonic acid (hereinafter referred to as 1,4-BDS) or 2,6-naphthalenedisulfonic acid (hereinafter referred to as 2,6-NDS), PIPES is shown in Table 4.
  • the sample was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.05 mol / L HEPES was used instead of the phosphate buffer, and the hemoglobin concentration was measured. did. The results are shown in Table 4.
  • the residual rate of each sample was shown by the relative value which makes the concentration (548 ng / mL) immediately after the addition in a control sample (phosphate buffer solution (it does not contain disulfonic acid) containing bovine serum albumin and NaOH) 100%. .
  • Comparative Example 1 A point in which 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (hereinafter referred to as ANS) or sodium 2-mercaptoethanesulfonate (hereinafter referred to as MESS) was added to 0.01 mol / L instead of 1,2-EDS. Except for the above, a sample was prepared in the same manner as in Example 1, and the hemoglobin concentration was measured. The results are shown in Table 5. In addition, the residual rate of each sample was shown by the relative value which makes the concentration (583ng / mL) immediately after the addition in a control sample (the phosphate buffer solution containing bovine serum albumin and NaOH (without additives)) 100% .
  • ANS 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid
  • MESS sodium 2-mercaptoethanesulfonate
  • hemoglobin may be denatured or decomposed.
  • the storage solutions and samples containing disulfonic acid such as 1,4-BDS, 2,6-NDS, and 1,2-EDS are stored after 6 hours and stored even at a high temperature of 37 ° C. It was shown that the residual ratio of hemoglobin after storage for 24 hours can be kept high. From this result, it can be seen that the preservation solution and the sample containing the disulfonic acid of the present invention have the effect of stabilizing hemoglobin by suppressing the denaturation or decomposition of hemoglobin even when the temperature rises and time elapses.
  • the hemoprotein preservation solution and the hemoprotein stabilization method of the present invention containing disulfonic acid or a salt thereof can stabilize the hemoprotein by suppressing the denaturation or degradation of the hemoprotein.
  • the hemoprotein can be stably stored by suppressing the denaturation or degradation of the hemoprotein, and the diluted solution for fecal occult blood test Heme proteins such as standard samples containing heme proteins and control samples containing heme proteins can be stably stored.

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Abstract

本発明は、ヘムタンパク質の変性あるいは分解に対して有効な、新たなヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法を提供することを目的とし、具体的には、ジスルホン酸又はその塩を含むヘムタンパク質の保存液、及びヘムタンパク質を含む試料中にジスルホン酸又はその塩を共存させるヘムタンパク質の安定化方法に関する。

Description

ヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法
　本発明は、ヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法に関する。特に、免疫学的測定法において有用なヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法に関する。
　近年、がんの罹患率が増加していることに伴い、大腸がん検診の一次検査や下部消化管疾患のスクリーニング法として、糞便中の血液を検出する便潜血検査が広く行われている。便潜血検査は、ヘムタンパク質であるヘモグロビンの持つペルオキシダーゼ様活性を利用した化学的な発色反応に基づく化学的測定法や、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を利用した免疫学的測定法によって行われ、特に、免疫学的測定法は、化学的測定法と比較して検査前の食事制限や服薬制限を必要とせず、簡便で迅速な測定が可能であるため、便潜血検査の主な検査方法として定着している。
　しかしながら、ヘモグロビンは溶液中で非常に不安定であり、変性あるいは分解しやすいことが知られている。この変性あるいは分解によって、ヘモグロビンの立体構造が破壊され、その抗原性が低下するため、ヘモグロビンの免疫学的測定法において誤った測定結果が導かれてしまう。ヘモグロビンの変性あるいは分解の原因としては、保存温度の上昇、時間経過、細菌や酵素等様々なものが挙げられるが、例えば、保存温度については、溶液中のヘモグロビンは凍結又は冷蔵状態では比較的安定であるが、室温又はそれ以上の温度では変性あるいは分解が進むことが知られている。
　特に、便潜血検査においては、被験者自身が自宅等で糞便を採取し、便検体用希釈液を含む密閉容器に糞便を懸濁して検査に供する場合が多く、この場合、糞便中のヒトヘモグロビンは、溶液中で数日間放置され、郵便等の輸送手段を利用することによって高温下に置かれることもある。さらに、病院や検査機関では、多数の検体及び他項目の検査を実施しているため、測定結果を得るまでに多くの時間を要することもある。それゆえ、便潜血検査では、温度上昇や時間経過等の原因が重なり合い、ヘモグロビンの変性あるいは分解が生じやすい。
　さらに、便潜血検査では、多くの検体を正確かつ迅速に測定できる自動分析装置を用いて測定が行われることが多い。自動分析装置を用いた測定では、試薬や装置の変化が検査結果の精度に影響するため、既知濃度のヘモグロビンを含む標準試料及び既知濃度のヘモグロビンを含むコントロール試料を用いて定期的に自動分析装置のキャリブレーションや精度管理が行われている。キャリブレーションでは、複数の既知濃度の測定対象物質を含む標準試料を自動分析装置で測定して、検量線を作成し、自動分析装置の校正を行い、精度管理では、既知濃度の測定対象物質を含むコントロール試料を自動分析装置で測定し、測定値が所定範囲内に収まっているか否かにより、分析精度を判定する。しかしながら、標準試料及びコントロール試料中に含まれるヘモグロビンが変性あるいは分解していると、キャリブレーションや精度管理を正確に行うことができず、測定の誤りを招くこととなる。
　従って、ヘモグロビンの変性あるいは分解を抑制し、正確な測定結果を得るために、これまで、ヘモグロビンを安定化するための様々な方法が提案されてきた。例えば、チメロサールやクロルヘキシジン等抗菌剤を添加する方法（例えば、特許文献１参照）、ヒト以外の動物ヘモグロビンを添加する方法（例えば、特許文献２参照）、ヒト以外の動物血清を添加する方法（例えば、特許文献３参照）、グリコシダーゼ型溶菌酵素を添加する方法（例えば、特許文献４参照）、亜硫酸や二亜硫酸等を添加する方法（例えば、特許文献５参照）、アシルアルギニンエステル及びカチオン性界面活性剤を添加する方法（例えば、特許文献６参照）、グリオキシル酸を添加する方法（例えば、特許文献７参照）等が提案されている。
　さらに、本出願人は、フェロシアン化合物等の水溶性遷移金属錯体を添加する方法（例えば、特許文献８、特許文献９参照）、ヘモグロビンの酵素分解産物を添加する方法（例えば、特許文献１０参照）、遷移金属類を添加する方法（例えば、特許文献１１参照）、リンゴ酸等の有機酸を添加する方法（例えば、特許文献１２参照）、脱脂アルブミンを添加する方法（例えば、特許文献１３参照）、イミノカルボン酸を添加する方法（例えば、特許文献１４参照）等を既に提案している。
　しかしながら、ヘモグロビンは非常に不安定であることから、これらのヘモグロビンの安定化方法であっても、その変性あるいは分解を十分に防ぐには至っていないという問題がある。
特開昭６３－２７１１６０号公報 特開平２－２９６１４９号公報 特開平４－１４５３６６号公報 特公平５－６９４６６号公報 特開２０００－２５８４２０号公報 特開２００９－２２２７１０号公報 特開２０１３－２５７２１６号公報 特開平７－２２９９０２号公報 特開平１１－１１８８０６号公報 特開平１１－２１８５３３号公報 特開２００１－２４９１３２号公報 特開２００３－１４７６８号公報 特開２００３－１９４８２５号公報 特開２００９－０９７９５６号公報
　このような問題を解決するため、本発明は、ヘモグロビンに代表されるヘムタンパク質の変性あるいは分解に対して有効な、新たなヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法を提供することを目的とする。
　本発明のヘムタンパク質の保存液は、ジスルホン酸又はその塩を含むことを特徴とする。また、本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、ヘムタンパク質を含む試料中にジスルホン酸又はその塩を共存させることを特徴とする。
　すなわち、本発明は、以下を包含する。
　（１）　ジスルホン酸又はその塩を含むヘムタンパク質の保存液。
　（２）　ジスルホン酸又はその塩が、鎖式の炭化水素基又は環式の炭化水素基の少なくとも１つを有するジスルホン酸又はその塩であって、
　前記鎖式の炭化水素基が分岐状もしくは直鎖状の炭化水素基であり、かつ分岐状の前記鎖式の炭化水素基の主鎖もしくは直鎖状の前記鎖式の炭化水素基の炭素数が１乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、
　前記環式の炭化水素基がシクロアルキレン基もしくはアリール基であり、かつ前記環式の炭化水素基の炭素数が３乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、並びに、
　前記シクロアルキレン基もしくは前記アリール基が１個以上の置換された窒素原子を有するジスルホン酸又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である（１）に記載のヘムタンパク質の保存液。
　（３）　ジスルホン酸又はその塩が、メタンジスルホン酸、エタンジスルホン酸、プロパンジスルホン酸、ブタンジスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である（１）又は（２）に記載のヘムタンパク質の保存液。
　（４）　ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である（１）乃至（３）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。
　（５）　Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸をさらに含む（１）乃至（４）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。
　（６）　標準試料又はコントロール試料として用いられる、ヘムタンパク質をさらに含む（１）乃至（５）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。
　（７）　免疫学的測定に用いられる（１）乃至（６）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。
　（８）　ヘムタンパク質を含む試料中に、ジスルホン酸又はその塩を共存させるヘムタンパク質の安定化方法。
　（９）　ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である（８）記載のヘムタンパク質の安定化方法。
　（１０）　ヘムタンパク質と抗ヘムタンパク質抗体とをジスルホン酸又はその塩の存在下で接触させる工程を含む、ヘムタンパク質の免疫学的測定方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-070667号の開示内容を包含する。
　本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法によれば、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制し、ヘムタンパク質を安定的に保存することができる。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明のヘムタンパク質の保存液は、ジスルホン酸又はその塩を含む。また、本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、ヘムタンパク質を含む試料中にジスルホン酸又はその塩を共存させる。
　本発明に用いられるジスルホン酸又はその塩は、特に限定されるものではなく、公知のものから選択することができる。本発明に用いられるジスルホン酸は、飽和又は不飽和結合を有していてもよい鎖式又は環式の炭化水素基を少なくとも１つ有するジスルホン酸であり、特に、鎖式又は環式の炭化水素基と、２つのスルホン基とからなるジスルホン酸であることが好ましい。本発明に用いられるジスルホン酸は、鎖式の炭化水素基又は環式の炭化水素基のいずれかを有してもよく、両方を有していてもよい。
　特に、本発明に用いられるジスルホン酸が有する鎖式炭化水素基は、分岐状又は直鎖状の炭化水素基である。分岐状の炭化水素基の主鎖又は直鎖状の炭化水素基の炭素数は、好ましくは１乃至１０、より好ましくは１乃至４、さらに好ましくは１又は２のいずれかである。分岐状の炭化水素基の主鎖又は直鎖状の炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキレン基、アルケニレン基、もしくはアルキニレン基であることが好ましい。アルキレン基を有するジスルホン酸としては、例えば、メタンジスルホン酸、１，２－エタンジスルホン酸（以下、１，２－ＥＤＳという）、１，３－プロパンジスルホン酸、１，４－ブタンジスルホン酸、１，５－ペンタンジスルホン酸、１，６－ヘキサンジスルホン酸等が挙げられる。
　また、本発明に用いられるジスルホン酸が有する環式の炭化水素基の炭素数は、３乃至１０のいずれかであることが好ましい。環式の炭化水素基は、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、又はアリール基であることが好ましい。特に、アリール基は、好ましくはフェニレン基又はナフチレン基である。フェニレン基もしくはナフチレン基を有するジスルホン酸としては、例えば、１，２－ベンゼンジスルホン酸、１，３－ベンゼンジスルホン酸、１，４－ベンゼンジスルホン酸、１，６－ナフタレンジスルホン酸、２，６－ナフタレンジスルホン酸、２，７－ナフタレンジスルホン酸等が挙げられる。
　また、環式の炭化水素基は、分岐状の炭化水素基であってもよい。また、環式の炭化水素基は、１個以上、好ましくは１乃至３個、より好ましくは１乃至２個のいずれかの窒素原子で置換されていてもよい。窒素原子で置換されている炭化水素基を有するジスルホン酸としては、例えば、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）を挙げることができる。
　また、より好ましくは、本発明に用いられるジスルホン酸は、鎖式又は環式の炭化水素基に２つのスルホン基が結合したジスルホン酸である。さらに、鎖式の炭化水素基を有するジスルホン酸は、２つのスルホン基を、分岐状の炭化水素基の主鎖もしくは直鎖状の炭化水素基の異なる炭素原子に有することが好ましく、より好ましくはこれらの各末端に有する。本発明に用いられるジスルホン酸は、１，２－エタンジスルホン酸（１，２－ＥＤＳ）であることが好ましい。
　本発明に用いられるジスルホン酸の炭化水素基は、ハロゲン基及び／又はヒドロキシ基等の置換基を有してもよい。また、分岐状の炭化水素基を有するジスルホン酸では、分岐鎖が炭化水素からなることが好ましい。また、本発明に用いられるジスルホン酸又はその塩は、少なくとも１種であり、２種以上を混合した混合物であってもよい。
　本発明によれば、保存液又は試料中にヘムタンパク質とジスルホン酸又はその塩とを含むことによって、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制することができる。特に、本発明によれば、ジスルホン酸がエタンジスルホン酸を含むことによって、ヘムタンパク質の安定性をより高めることができる。本発明に用いられるジスルホン酸は、測定に悪影響を及ぼさず、特にラテックス免疫凝集法を用いる免疫測定方法に好適である。
　本発明に用いられるジスルホン酸の塩は、特に限定されないが、ジスルホン酸の１価、２価、又は３価の金属塩である。ジスルホン酸の塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アンモニウム塩、アルカリ土類金属塩、鉄塩、又はアルミニウム塩等が挙げられる。アルカリ金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムが挙げられる。アルカリ土類金属としては、例えばカルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウムが挙げられる。
　本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料に含まれるジスルホン酸又はその塩の濃度の上限は、０．３ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．２ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．１５ｍｏｌ／Ｌ以下であり、下限は０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．００５ｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、最も好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌ以上である。ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘムタンパク質の安定化効果が不十分になる。一方、ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌを超えると、免疫反応が阻害され、測定に影響を及ぼしやすくなる他、十分なヘムタンパク質の安定化効果が得られなくなる。
　本発明が対象とするヘムタンパク質及び本発明の試料に含まれるヘムタンパク質は、ヘムを構成成分とするタンパク質の中から適宜選択することができる。ヘムタンパク質としては、例えば、ヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシターゼ又はカタラーゼ等が挙げられる。特に、本発明が対象とするヘムタンパク質及び本発明の試料に含まれるヘムタンパク質は、好ましくは免疫学的な分析対象となるヘムタンパク質であり、より好ましくはヒトヘモグロビンである。免疫学的測定法では、検出対象の抗原性を維持することが重要であるが、本発明によればヘムタンパク質の抗原性を維持することができるため、より精確なヘムタンパク質の測定が可能となる。特に、本発明が対象とするヘムタンパク質及び本発明の試料に含まれるヘムタンパク質を生体試料中のヘモグロビンとすることで、大腸がん等の疾病の診断における測定結果の誤りを防ぐことが期待できる。ヘモグロビンは、便中に含まれるヘモグロビン、赤血球より調製したヘモグロビンを含む標準試料又はコントロ－ルとして市販されているヘモグロビン、及び凍結乾燥ヘモグロビン等を含むことができる。
　また、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料は、ヘムタンパク質を溶解できる溶液を含むことができる。溶液としては、ヘムタンパク質を溶解できる溶液であればよく、例えば、緩衝液を挙げることができ、緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、グッド緩衝剤やリン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤等が挙げられる。
　さらに、グッド緩衝剤としては、例えば、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２－ヒドロキシ－３－｛［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパン－３－スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（３－スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。特に、本発明では、グッド緩衝剤の中でもＨＥＰＥＳを用いることが好ましく、ジスルホン酸又はその塩を共存させることで、ヘムタンパク質の安定性を著しく高めることができる。
　緩衝剤の濃度は、測定に適した濃度であれば特に限定されないが、０．００１乃至２．０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５乃至１．５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０１乃至１．０ｍｏｌ／Ｌである。
　また、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料のｐＨは、中性域が好ましく、５乃至１０が好ましく、より好ましくは６乃至８の範囲である。ｐＨが５より低い、あるいは１０より高い場合は、ヘムタンパク質の安定性が損なわれ、ヘムタンパク質が変性あるいは分解しやすくなる。ｐＨは、公知の方法で調整でき、ＮａＯＨや適当な緩衝剤を用いて調整してもよい。
　さらに、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料は、水溶性遷移金属錯体、フェロシアン化合物、ヘモグロビンの酵素分解産物、遷移金属類、有機酸、イミノカルボン酸、アルブミンやゼラチンに代表される不活性タンパク質、及びアジ化ナトリウム等、公知のタンパク質保護剤を含むことができる。また、微生物の不必要な繁殖を防ぐための抗菌剤等を含んでもよい。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分を含んでもよい。本発明によれば、従来のタンパク質保護剤や抗菌剤等の作用を阻害することなく、従来のタンパク質保護剤や抗菌剤等と共にヘムタンパク質の安定性を高めることができる。
　また、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料がアルブミンを含む場合には、アルブミンとして、牛、馬、豚、羊、兎、ヒト、ラット等のアルブミンを用いることができ、アルブミンを含有する血清を用いるようにしてもよい。本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料中のアルブミンの濃度は、０．０００５乃至２．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０１乃至０．５ｗ／ｖ％である。
　ヘムタンパク質の測定方法は、特に限定されるものではないが、抗ヘムタンパク質抗体(ヘムタンパク質に特異的に結合する抗体)を用いた免疫学的測定法、好ましくは、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的測定法である。具体的には、試料において、ヘムタンパク質(例えば、ヒトヘモグロビン)と抗ヘムタンパク質抗体(例えば、抗ヒトヘモグロビン抗体)とをジスルホン酸又はその塩の存在下で接触させ、抗原抗体反応を生じさせ、形成した免疫複合体に基づいて当該試料中のヘムタンパク質を検出又は測定する。ヘムタンパク質がヒトヘモグロビンである場合には、ヒトヘモグロビンの免疫学的測定法としては、例えば、寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検試料中のヒトヘモグロビンの結合による免疫複合体による沈降線の発現を確認する一元放射状免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子を用いるラテックス免疫凝集法、酵素や放射性元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫測定法や放射免疫測定法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用いる金コロイド凝集比色法、ニトロセルロース膜等のメンブレンにおいて、金属コロイド等で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体及び当該抗ヒトヘモグロビン抗体とヒトヘモグロビンとの免疫複合体を捕捉する捕捉抗体を用いるイムノクロマト法等が挙げられる。具体的に、ラテックス免疫凝集法では、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子と試料中のヒトヘモグロビンとを反応させ、免疫複合体の形成によりラテックス粒子が凝集し、当該ラテックスの凝集による濁度の変化に基づいて、ヒトヘモグロビンを測定する。また、イムノクロマト法では、ニトロセルロース膜等のメンブレンにおいて、試料を供給し、試料中のヒトヘモグロビンは金属コロイド等で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を保持する標識試薬保持部で抗ヒトヘモグロビン抗体と反応して免疫複合体を形成し、さらに免疫複合体が毛細管現象によってメンブレン中を移動し、メンブレンの所定の位置に固定された捕捉抗体により当該免疫複合体が捕捉され、当該捕捉による呈色に基づいてヒトヘモグロビンを検出する。いずれの測定方法においても、ジスルホン酸又はその塩を含む本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料によれば、ヘムタンパク質の抗原活性を保護し、測定値の誤りを抑制することができる。
　本発明のヘムタンパク質の保存液は、ヘムタンパク質を保存するための溶液として様々な用途に用いることができ、例えば、糞便、尿、及び血液等、生体試料由来のヘムタンパク質の溶解用溶液や、希釈液及び抽出液等の溶液として用いることができる。特に、ヘムタンパク質の検出を行うための検査、例えば便潜血検査の便検体用希釈液として有用である。
　また、本発明のヘムタンパク質の保存液は、上述の本発明が対象とするヘムタンパク質を含んでいてもよく、ヘムタンパク質を含む様々な溶液として使用できる。同様に、本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、ヘムタンパク質を含む様々な試料に適用できる。例えば、本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質を含む試料は、ヘムタンパク質を含む標準試料又はヘムタンパク質を含むコントロール試料等、特に自動分析装置のキャリブレーション又は精度管理用のヘムタンパク質を含む標準試料又はヘムタンパク質を含むコントロール試料として使用できる。ヘムタンパク質を含む標準試料及びコントロール試料は、長期的に保存された場合においても、ヘムタンパク質の測定値が変動しないことが必要とされるが、本発明によれば、比較的高温で保存された場合においても標準試料及びコントロール試料中のヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制できるため、ヘムタンパク質の測定値の安定化に貢献することができる。従って、本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質を含む試料は、ヘムタンパク質を含む標準試料及びコントロール試料として好適である。
　さらに、本発明のヘムタンパク質の保存液は、例えば便潜血検査等に使用される、ヘムタンパク質(例えば、ヒトヘモグロビン)の免疫学的測定用キットとして提供することもできる。当該キットは、本発明のヘムタンパク質の保存液の他に、採便容器等の試料保存容器、キットの取扱説明書や、例えば免疫学的測定法がラテックス免疫凝集法である場合には抗ヘムタンパク質抗体を感作したラテックス液、希釈液等、あるいは免疫学的測定法がイムノクロマト法である場合にはイムノクロマトグラフデバイス(例えば、試料供給部と、金属コロイド等で標識した抗ヘムタンパク質抗体を保持する標識試薬保持部と、所定の位置に固定された捕捉抗体を含む検出部とを有する、支持体に担持されたニトロセルロース膜等のメンブレン)等を含むことができる。
　以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１
　０．３ｗ／ｖ％の牛血清アルブミン、ＮａＯＨ、及び緩衝液として０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液を含み、残部を純水とするｐＨ７．０の溶液を調製した。この溶液に、添加物として１，２－ＥＤＳを表１に示す各濃度（０．０１乃至０．２ｍｏｌ／Ｌ）となるように添加し、各濃度の溶液を調製した。この調製した各溶液１０ｍＬに溶血ヘモグロビンを６００ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、試料とした。
　ヘモグロビンの添加直後に、各試料のヘモグロビン濃度を測定した（添加直後濃度）。次いで、各試料を３７℃で保存した。ヘモグロビンの添加時点を保存０時間として、６時間保存後及び２４時間保存後に各試料のヘモグロビン濃度を測定した（６時間保存後濃度及び２４時間保存後濃度）。
　ヘモグロビンの濃度測定は、ＯＣセンサーＤＩＡＮＡ分析機（栄研化学（株）製）を用いて、免疫学的測定法の一種であるラテックス凝集反応を測定原理とする専用試薬（ＯＣヘモディアオートＩＩＩ:栄研化学（株）製）を用いて行った。詳細には、試料から３５μＬを採取して試験液とし、この試験液にラテックス乳液（２０ｖｏｌ％の抗ヒトヘモグロビンウサギポリクローナル抗体感作ラテックス液）６０μＬ及び希釈液（１１．９２ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ）３００μＬを加え、波長６６０ｎｍで吸光度を測定した。予め作成した検量線に基づき、得られた測定値から試験液中のヘモグロビン濃度を決定した。各試料について、３重測定を行い、測定結果の平均値を各試料のヘモグロビン濃度とした。
　測定したヘモグロビン濃度から、以下の式に基づいてヘモグロビンの残存率を求めた。
　６時間保存後又は２４時間保存後のヘモグロビンの残存率［％］　＝　１００　×　ヘモグロビンの６時間保存後濃度又は２４時間保存後濃度［ｎｇ／ｍＬ］　／　対照試料の添加直後濃度［ｎｇ／ｍＬ］
　すなわち、各試料のヘモグロビンの残存率は、対照試料におけるヘモグロビンの添加直後濃度を１００％とする相対値である。本実施例における対照試料は、牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（１，２－ＥＤＳを含まない）であり、対照試料の添加直後濃度は５８３ｎｇ／ｍＬであった。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す通り、ジスルホン酸である１，２－ＥＤＳを含む試料は、対照試料と比較して、６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高く、１，２－ＥＤＳがヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。さらに、１，２－ＥＤＳの濃度の増加に伴い、残存率が高くなり、ヘモグロビンの安定化効果を高めていることが分かる。
実施例２
　リン酸緩衝液の代わりに、０．０５ｍｏｌ／ＬのＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという）を用いた点、表２に示す各濃度（０．００５乃至０．２ｍｏｌ／Ｌ）となるように１，２－ＥＤＳを添加した点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表２に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１，２－ＥＤＳを含まない））における添加直後濃度（５７６ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す通り、ジスルホン酸である１，２－ＥＤＳを含む試料は、対照試料と比較して６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高く、１，２－ＥＤＳがヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。特に、ＨＥＰＥＳと１，２－ＥＤＳとを含むことによって、１，２－ＥＤＳの添加濃度が５ｍＭという低濃度である試料においても６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高いことが分かる。さらに、１，２－ＥＤＳの添加濃度の増加に伴い、残存率が高くなり、ヘモグロビンの安定化効果を高めていることが分かる。
実施例３
　リン酸緩衝液の代わりに、０．０５ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、０．０５ｍｏｌ／Ｌのピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（以下、ＰＩＰＥＳという）、又は０．０５ｍｏｌ／Ｌの２－モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳという）を用いた点、１，２－ＥＤＳを表３に示す濃度となるように添加した点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表３に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（１，２－ＥＤＳを含まない））における添加直後濃度（５８３ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示す通り、緩衝液が異なる試料においても、１，２－ＥＤＳによるヘモグロビンの安定化効果がみられた。特に、ＨＥＰＥＳと、１，２－ＥＤＳとを含む試料は、ＨＥＰＥＳを緩衝液として１，２－ＥＤＳを含まない試料と比較して、６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が著しく高く、ヘモグロビンの変性あるいは分解の抑制効果が極めて高いことが分かると共に、長期的にヘモグロビンを安定化できることが示唆された。また、ＨＥＰＥＳと、１，２－ＥＤＳとを含む試料は、グッド緩衝剤であるＰＩＰＥＳやＭＥＳと、１，２－ＥＤＳとを含む試料と比較しても、６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高く、ヘモグロビンの変性あるいは分解の抑制効果をより高めていることから、相乗的なヘモグロビン安定化効果を有することが分かる。
実施例４
　１，２－ＥＤＳの代わりに、１，４－ブタンジスルホン酸（以下、１，４－ＢＤＳという）、又は２，６－ナフタレンジスルホン酸（以下、２，６－ＮＤＳという）、ＰＩＰＥＳを表４に示す濃度となるように添加した点、及びリン酸緩衝液の代わりに、０．０５ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳを用いた点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表４に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（ジスルホン酸を含まない））における添加直後濃度（５４８ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示す通り、ジスルホン酸である１，４－ＢＤＳ、２，６－ＮＤＳ、及びＰＩＰＥＳがヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。
比較例１
　１，２－ＥＤＳの代わりに８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（以下、ＡＮＳという）もしくは２－メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（以下、ＭＥＳＳという）を０．０１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表５に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（添加物を含まない））における添加直後濃度（５８３ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示す通り、ジスルホン酸ではないスルホン酸を含む試料では、ヘモグロビンの変性あるいは分解が進んでいる可能性があることが分かる。
　従って、１，４－ＢＤＳ、２，６－ＮＤＳ、及び１，２－ＥＤＳ等のジスルホン酸を含む保存液及び試料は、３７℃という高温下で保存された場合においても、６時間保存後及び２４時間保存後のヘモグロビンの残存率を高く保つことが可能であることが示された。この結果から、本発明のジスルホン酸を含む保存液及び試料は、温度上昇及び時間経過を伴う場合においてもヘモグロビンの変性あるいは分解を抑制し、ヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。
　また、実施例１乃至実施例４及び比較例１の各試料に便検体を添加し、同様の測定を行ったところ、実施例１乃至実施例４及び比較例１の測定結果と同様の傾向がみられた。
　以上より、ジスルホン酸又はその塩を含む本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法によれば、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制し、ヘムタンパク質を安定化できることが明らかとなった。
　本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法によれば、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制し、ヘムタンパク質を安定的に保存することができ、便潜血検査の便検体用希釈液、ヘムタンパク質を含む標準試料、及びヘムタンパク質を含むコントロール試料等のヘムタンパク質を安定的に保存することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (10)

  1. 　ジスルホン酸又はその塩を含むヘムタンパク質の保存液。
  2. 　前記ジスルホン酸又はその塩が、鎖式の炭化水素基又は環式の炭化水素基の少なくとも１つを有するジスルホン酸又はその塩であって、
    　前記鎖式の炭化水素基が分岐状もしくは直鎖状の炭化水素基であり、かつ分岐状の前記鎖式の炭化水素基の主鎖もしくは直鎖状の前記鎖式の炭化水素基の炭素数が１乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、
    　前記環式の炭化水素基がシクロアルキレン基もしくはアリール基であり、かつ前記環式の炭化水素基の炭素数が３乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、並びに、
    　前記シクロアルキレン基もしくは前記アリール基が１個以上の置換された窒素原子を有するジスルホン酸又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載のヘムタンパク質の保存液。
  3. 　前記ジスルホン酸又はその塩が、メタンジスルホン酸、エタンジスルホン酸、プロパンジスルホン酸、ブタンジスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載のヘムタンパク質の保存液。
  4. 　前記ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１乃至３のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
  5. 　Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸をさらに含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
  6. 　標準試料又はコントロール試料として用いられる、ヘムタンパク質をさらに含む請求項１乃至５のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
  7. 　免疫学的測定に用いられる請求項１乃至６のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
  8. 　ヘムタンパク質を含む試料中に、ジスルホン酸又はその塩を共存させるヘムタンパク質の安定化方法。
  9. 　前記ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項８記載のヘムタンパク質の安定化方法。
  10. 　ヘムタンパク質と抗ヘムタンパク質抗体とをジスルホン酸又はその塩の存在下で接触させる工程を含む、ヘムタンパク質の免疫学的測定方法。
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