JPH07229902A - ヘモグロビンの安定化方法 - Google Patents
ヘモグロビンの安定化方法Info
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- JPH07229902A JPH07229902A JP4769094A JP4769094A JPH07229902A JP H07229902 A JPH07229902 A JP H07229902A JP 4769094 A JP4769094 A JP 4769094A JP 4769094 A JP4769094 A JP 4769094A JP H07229902 A JPH07229902 A JP H07229902A
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- acid
- stabilizing
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】本発明は公知の安定剤では十分効果が期待でき
ない未知のヘモグロビン変性・分解作用に対して有効
な、新規なヘモグロビン保護物質を提供することを課題
としている。 【構成】本発明は、ＦｅIIIＥＤＴＡのような水溶性遷
移金属錯体を利用した溶液中のヘモグロビンの安定化方
法、ならびにヘモグロビンの保存溶液である。 【効果】本発明によれば、糞便懸濁液中等に存在するヘ
モグロビンを効果的に安定化することができる。本発明
は特にヘモグロビンの抗原性の保護効果に優れ、免疫学
的分析対象としてのヘモグロビンの安定化に有用な技術
である。
ない未知のヘモグロビン変性・分解作用に対して有効
な、新規なヘモグロビン保護物質を提供することを課題
としている。 【構成】本発明は、ＦｅIIIＥＤＴＡのような水溶性遷
移金属錯体を利用した溶液中のヘモグロビンの安定化方
法、ならびにヘモグロビンの保存溶液である。 【効果】本発明によれば、糞便懸濁液中等に存在するヘ
モグロビンを効果的に安定化することができる。本発明
は特にヘモグロビンの抗原性の保護効果に優れ、免疫学
的分析対象としてのヘモグロビンの安定化に有用な技術
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヘモグロビンの安定化
方法に関するものである。具体的には、検出の対象とな
る試料中のヘモグロビンや、陽性対照として用いる標準
物質としてのヘモグロビンの安定化技術に関するもので
ある。尿や糞便などに含まれるヘモグロビンの検出は、
多くの疾患の診断に有用である。特に糞便中のヘモグロ
ビン（便潜血）の検出は、大腸癌をはじめとする消化器
系の疾患の診断における重要な情報である。近年は、古
くから便中のヘモグロビンに利用されていた化学的な発
色反応に基づく試験紙法に代わり、ヘモグロビンに対す
る抗体を利用した免疫学的手法による検出方法が普及
し、手軽な検査方法として定着している。
方法に関するものである。具体的には、検出の対象とな
る試料中のヘモグロビンや、陽性対照として用いる標準
物質としてのヘモグロビンの安定化技術に関するもので
ある。尿や糞便などに含まれるヘモグロビンの検出は、
多くの疾患の診断に有用である。特に糞便中のヘモグロ
ビン（便潜血）の検出は、大腸癌をはじめとする消化器
系の疾患の診断における重要な情報である。近年は、古
くから便中のヘモグロビンに利用されていた化学的な発
色反応に基づく試験紙法に代わり、ヘモグロビンに対す
る抗体を利用した免疫学的手法による検出方法が普及
し、手軽な検査方法として定着している。
【０００２】
【従来技術の問題点】糞便等の試料中に含まれるヘモグ
ロビンを検出するには、検査施設まで試料を輸送する必
要が有る。糞便試料の輸送は、例えば実公平５−１７６
５２号公報等に記載された輸送容器で行う。この種の容
器を利用することにより、糞便の定量的な採取が可能と
なり、また簡単に糞便懸濁液をろ過することができる。
糞便を採取した容器は、郵送等の手段で検査施設に輸送
される。
ロビンを検出するには、検査施設まで試料を輸送する必
要が有る。糞便試料の輸送は、例えば実公平５−１７６
５２号公報等に記載された輸送容器で行う。この種の容
器を利用することにより、糞便の定量的な採取が可能と
なり、また簡単に糞便懸濁液をろ過することができる。
糞便を採取した容器は、郵送等の手段で検査施設に輸送
される。
【０００３】輸送中は糞便に含まれる細菌やその他の多
くの成分とヘモグロビンが共存する状態に有る。また一
般には温度の管理が困難なため、保存上は好ましくない
温度条件にさらされることも避けられない。したがって
輸送中のヘモグロビンは、常に変性・分解の可能性が有
る。輸送中のヘモグロビンの変性・分解は誤った診断結
果につながるので極力小さくすることが望まれる。ヘモ
グロビンに限らず、蛋白物質の安定化には他の蛋白や糖
が用いられる。ヘモグロビンについても、蛋白としてウ
シ血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）、ウサギ血
清アルブミン（以下ＲＳＡと省略する）、あるいは卵白
アルブミン等が、糖としてはショ糖等が安定化効果を示
すことが知られている。しかしこれらの一般的な安定剤
は特に糞便懸濁液中でのヘモグロビン安定化効果が小さ
く、十分な保存性能を期待できない。糞便中には細菌や
蛋白分解酵素のようなヘモグロビンの変性・分解の原因
となる多くの成分が存在し、蛋白や糖のみではヘモグロ
ビンを十分に保護できないのである。また糖や蛋白は微
生物に消費されやすく、安定化効果を長時間維持するこ
とが困難である。
くの成分とヘモグロビンが共存する状態に有る。また一
般には温度の管理が困難なため、保存上は好ましくない
温度条件にさらされることも避けられない。したがって
輸送中のヘモグロビンは、常に変性・分解の可能性が有
る。輸送中のヘモグロビンの変性・分解は誤った診断結
果につながるので極力小さくすることが望まれる。ヘモ
グロビンに限らず、蛋白物質の安定化には他の蛋白や糖
が用いられる。ヘモグロビンについても、蛋白としてウ
シ血清アルブミン（以下ＢＳＡと省略する）、ウサギ血
清アルブミン（以下ＲＳＡと省略する）、あるいは卵白
アルブミン等が、糖としてはショ糖等が安定化効果を示
すことが知られている。しかしこれらの一般的な安定剤
は特に糞便懸濁液中でのヘモグロビン安定化効果が小さ
く、十分な保存性能を期待できない。糞便中には細菌や
蛋白分解酵素のようなヘモグロビンの変性・分解の原因
となる多くの成分が存在し、蛋白や糖のみではヘモグロ
ビンを十分に保護できないのである。また糖や蛋白は微
生物に消費されやすく、安定化効果を長時間維持するこ
とが困難である。
【０００４】糞便懸濁液中のヘモグロビンを安定化する
技術としては、溶菌酵素の添加（特公平５−６９４６
６）、プロテアーゼ阻害物質の添加（特開平３−２７９
８５９）、ｐＨのコントロール（特開平５−２８１２２
６）、鉄プロトポルフィリンの添加（特開平５−２８１
２２７）等が知られている。これらは細菌の影響を抑制
したり、あるいはヘモグロビンと構造的に類似する化合
物によりヘモグロビンに対する影響を分散させることで
ヘモグロビンの保護効果を示すものと考えられる。しか
し糞便中にはこれらの公知のヘモグロビン安定化技術で
はなお影響を抑制することのできないヘモグロビン変性
・分解作用が存在する。したがって現在のヘモグロビン
安定化技術には、未だに改善の余地が有る。
技術としては、溶菌酵素の添加（特公平５−６９４６
６）、プロテアーゼ阻害物質の添加（特開平３−２７９
８５９）、ｐＨのコントロール（特開平５−２８１２２
６）、鉄プロトポルフィリンの添加（特開平５−２８１
２２７）等が知られている。これらは細菌の影響を抑制
したり、あるいはヘモグロビンと構造的に類似する化合
物によりヘモグロビンに対する影響を分散させることで
ヘモグロビンの保護効果を示すものと考えられる。しか
し糞便中にはこれらの公知のヘモグロビン安定化技術で
はなお影響を抑制することのできないヘモグロビン変性
・分解作用が存在する。したがって現在のヘモグロビン
安定化技術には、未だに改善の余地が有る。
【０００５】この他にもエチレンジアミン４酢酸（以下
ＥＤＴＡと省略する）によるヘモグロビン安定化効果が
知られている（特開平２−２２１８５９）。しかし本発
明者による追試の結果、ＥＤＴＡでは糞便中のヘモグロ
ビンに対して十分な安定化作用を期待できないことが確
認された。したがって保存上はきわめて不利な条件であ
る糞便中においては、ＥＤＴＡでヘモグロビンを安定化
することができないといえる。
ＥＤＴＡと省略する）によるヘモグロビン安定化効果が
知られている（特開平２−２２１８５９）。しかし本発
明者による追試の結果、ＥＤＴＡでは糞便中のヘモグロ
ビンに対して十分な安定化作用を期待できないことが確
認された。したがって保存上はきわめて不利な条件であ
る糞便中においては、ＥＤＴＡでヘモグロビンを安定化
することができないといえる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は公知の安定剤
では十分な効果を期待できないヘモグロビン変性・分解
作用に対して有効な、新規なヘモグロビン保護物質の提
供を第一の課題としている。特に変性・分解作用の強い
糞便成分と共存するヘモグロビンを、効果的に安定化す
るための技術の提供が本発明の最も大きな課題である。
また本発明の第二の課題は、分析用試料としてのヘモグ
ロビンを安定化する技術の提供に有る。すなわち、分析
時の反応系に対して影響のないヘモグロビンの安定化技
術を提供するものである。本発明の第三の課題は、新し
いヘモグロビン安定化剤を利用したヘモグロビン保存溶
液を提供することにある。
では十分な効果を期待できないヘモグロビン変性・分解
作用に対して有効な、新規なヘモグロビン保護物質の提
供を第一の課題としている。特に変性・分解作用の強い
糞便成分と共存するヘモグロビンを、効果的に安定化す
るための技術の提供が本発明の最も大きな課題である。
また本発明の第二の課題は、分析用試料としてのヘモグ
ロビンを安定化する技術の提供に有る。すなわち、分析
時の反応系に対して影響のないヘモグロビンの安定化技
術を提供するものである。本発明の第三の課題は、新し
いヘモグロビン安定化剤を利用したヘモグロビン保存溶
液を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、遷移金属イオ
ンの水溶性金属錯体によるヘモグロビンの安定化方法、
ならびにこの安定化方法を適用したヘモグロビン保存溶
液である。また本発明の別の態様によれば、遷移金属イ
オンの水溶性金属錯体による糞便成分と共存するヘモグ
ロビンを耐熱性の変性因子から保護する方法が提供され
る。更に具体的には、ヘモグロビンの抗原構造の保護が
可能な技術が提供される。
ンの水溶性金属錯体によるヘモグロビンの安定化方法、
ならびにこの安定化方法を適用したヘモグロビン保存溶
液である。また本発明の別の態様によれば、遷移金属イ
オンの水溶性金属錯体による糞便成分と共存するヘモグ
ロビンを耐熱性の変性因子から保護する方法が提供され
る。更に具体的には、ヘモグロビンの抗原構造の保護が
可能な技術が提供される。
【０００８】本発明における遷移金属イオンは、水溶性
の錯体を形成するものであれば特に限定されるものでは
ない。具体的には、マンガン、鉄、コバルト、ニッケ
ル、銅、亜鉛、モリブデン、カドミウム、バナジウム、
および水銀等から選択される金属を利用することができ
る。更に荷電状態が違うイオンが存在する場合には、３
荷のイオンの方が良い成績を示す傾向が有る。中でも
鉄、特に第二鉄イオンの作用は大きく、最も顕著なヘモ
グロビン安定化作用を示す。
の錯体を形成するものであれば特に限定されるものでは
ない。具体的には、マンガン、鉄、コバルト、ニッケ
ル、銅、亜鉛、モリブデン、カドミウム、バナジウム、
および水銀等から選択される金属を利用することができ
る。更に荷電状態が違うイオンが存在する場合には、３
荷のイオンの方が良い成績を示す傾向が有る。中でも
鉄、特に第二鉄イオンの作用は大きく、最も顕著なヘモ
グロビン安定化作用を示す。
【０００９】また本発明における水溶性の金属錯体形成
剤も、水溶性の錯体を形成するものであれば特に限定さ
れない。一般に錯体形成剤は金属イオンとの配位構造に
基づいて、Ｎ，Ｎ−配位型、Ｎ，Ｏ−配位型、Ｏ，Ｏ−
配位型、Ｎ，Ｓ−配位型、およびＳ，Ｓ−配位型に分類
することができるが、本発明においてはこれらの錯体形
成剤のいずれも利用することができる。中でもＮ，Ｏ−
配位型の錯体形成剤には良好な安定化作用を持つものが
多く、好ましい例として挙げることができる。Ｎ，Ｏ−
配位型の錯体形成剤には、コンプレクサン類、フタレイ
ンコンプレクソン類、オキシン類が知られている。本発
明においてはＮ，Ｏ−配位型の中でもコンプレクサン類
が好ましい錯体形成剤として利用できる。以下にコンプ
レクサン類に該当する錯体形成剤を具体的に示す。なお
錯体形成剤は、適当な塩の形で用いても良い。
剤も、水溶性の錯体を形成するものであれば特に限定さ
れない。一般に錯体形成剤は金属イオンとの配位構造に
基づいて、Ｎ，Ｎ−配位型、Ｎ，Ｏ−配位型、Ｏ，Ｏ−
配位型、Ｎ，Ｓ−配位型、およびＳ，Ｓ−配位型に分類
することができるが、本発明においてはこれらの錯体形
成剤のいずれも利用することができる。中でもＮ，Ｏ−
配位型の錯体形成剤には良好な安定化作用を持つものが
多く、好ましい例として挙げることができる。Ｎ，Ｏ−
配位型の錯体形成剤には、コンプレクサン類、フタレイ
ンコンプレクソン類、オキシン類が知られている。本発
明においてはＮ，Ｏ−配位型の中でもコンプレクサン類
が好ましい錯体形成剤として利用できる。以下にコンプ
レクサン類に該当する錯体形成剤を具体的に示す。なお
錯体形成剤は、適当な塩の形で用いても良い。
【００１０】エチレンジアミン４酢酸（Ethylenediamin
e-N,N,N',N'-tetraacetic acid、ＥＤＴＡと省略する） １，２−シクロヘキサンジアミン４酢酸（1.2-Cyclohex
anediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid、ＣｙＤＴＡ
と省略する） グリコールエーテルジアミン４酢酸（Glycoletherdiami
ne-N,N,N'N'-tetraacetic acid、ＧＥＤＴＡと省略す
る） ヘキサメチレンジアミン４酢酸（Hexamethylenediamine
-N,N,N',N'-tetraaceticacid、ＨＤＴＡと省略する） イミノ２酢酸（Iminodiacetic acid、ＩＤＡと省略す
る） ヒドロキシエチルイミノ２酢酸（Hydroxyethyliminodia
cetic acid、ＨＩＤＡと省略する） １、３−ジアミノプロパン−２−オール４酢酸（1,3-Di
aminopropane-2-ol-N,N,N',N'-tetraacetic acid、ＤＰ
ＴＡ−ＯＨと省略する） ジエチレントリアミン５酢酸（Diethylenetriamine-N,
N,-N',N'',N''-pentaacetic acid、ＤＴＰＡと省略す
る） エチレンジアミン２酢酸（Ethylenediamine-N,N'-diace
tic acid、ＥＤＤＡと省略する） エチレンジアミン２酢酸２プロピオン酸（Ethylenediam
ine-N,N'-dipropionic acid dihydrochloride、ＥＤＤ
Ｐと省略する） エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）４酢酸（O,O'
-bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraac
etic acid、ＥＧＴＡと省略する、グリコールエーテル
ジアミン４酢酸；Glycoletherdiamine-N,N,N'N'-tetraa
cetic acidとも呼ばれる） エチレンジアミン−テトラキス（メチレンホスホン酸）
（Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetrakis(methylenphosp
holic acid)、ＥＤＴＰＯと省略する） エチレンジアミン２プロピオン酸（Ethylenediamine-N,
N'-dipropionic acid、ＥＤＤＰと省略する） ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸（N-Hydroxye
thylethylenediamine-N,N',N'-triacetic acid、ＥＤＴ
Ａ−ＯＨと省略する） Ｎ−（２−ヒドロキシルエチル）エチレンジアミン３酢
酸（N-(2-Hydroxyethyl)ethylenediamine-N,N',N'-tria
cetic acid、ＨＥＥＤＴＡと省略する） ニトリロ３酢酸（Nitrilotriacetic acid、ＮＴＡと省
略する） ニトリロ３プロピオン酸（Nitrilotripropionic acid、
ＮＴＰと省略する） ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（Nitrilotris
(methylenephosphonic acid)） ２（ヒドロキシエチル）グリシン（N,N,-2(hydroxyethy
l)glycine、ＮＴＰＯと省略する） １，２−ジアミノプロパン４酢酸（1,2-Diaminopropane
-N,N,N',N'-tetraaceticacid、Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ
と省略する）
e-N,N,N',N'-tetraacetic acid、ＥＤＴＡと省略する） １，２−シクロヘキサンジアミン４酢酸（1.2-Cyclohex
anediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid、ＣｙＤＴＡ
と省略する） グリコールエーテルジアミン４酢酸（Glycoletherdiami
ne-N,N,N'N'-tetraacetic acid、ＧＥＤＴＡと省略す
る） ヘキサメチレンジアミン４酢酸（Hexamethylenediamine
-N,N,N',N'-tetraaceticacid、ＨＤＴＡと省略する） イミノ２酢酸（Iminodiacetic acid、ＩＤＡと省略す
る） ヒドロキシエチルイミノ２酢酸（Hydroxyethyliminodia
cetic acid、ＨＩＤＡと省略する） １、３−ジアミノプロパン−２−オール４酢酸（1,3-Di
aminopropane-2-ol-N,N,N',N'-tetraacetic acid、ＤＰ
ＴＡ−ＯＨと省略する） ジエチレントリアミン５酢酸（Diethylenetriamine-N,
N,-N',N'',N''-pentaacetic acid、ＤＴＰＡと省略す
る） エチレンジアミン２酢酸（Ethylenediamine-N,N'-diace
tic acid、ＥＤＤＡと省略する） エチレンジアミン２酢酸２プロピオン酸（Ethylenediam
ine-N,N'-dipropionic acid dihydrochloride、ＥＤＤ
Ｐと省略する） エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）４酢酸（O,O'
-bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraac
etic acid、ＥＧＴＡと省略する、グリコールエーテル
ジアミン４酢酸；Glycoletherdiamine-N,N,N'N'-tetraa
cetic acidとも呼ばれる） エチレンジアミン−テトラキス（メチレンホスホン酸）
（Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetrakis(methylenphosp
holic acid)、ＥＤＴＰＯと省略する） エチレンジアミン２プロピオン酸（Ethylenediamine-N,
N'-dipropionic acid、ＥＤＤＰと省略する） ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸（N-Hydroxye
thylethylenediamine-N,N',N'-triacetic acid、ＥＤＴ
Ａ−ＯＨと省略する） Ｎ−（２−ヒドロキシルエチル）エチレンジアミン３酢
酸（N-(2-Hydroxyethyl)ethylenediamine-N,N',N'-tria
cetic acid、ＨＥＥＤＴＡと省略する） ニトリロ３酢酸（Nitrilotriacetic acid、ＮＴＡと省
略する） ニトリロ３プロピオン酸（Nitrilotripropionic acid、
ＮＴＰと省略する） ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（Nitrilotris
(methylenephosphonic acid)） ２（ヒドロキシエチル）グリシン（N,N,-2(hydroxyethy
l)glycine、ＮＴＰＯと省略する） １，２−ジアミノプロパン４酢酸（1,2-Diaminopropane
-N,N,N',N'-tetraaceticacid、Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ
と省略する）
【００１１】これらの錯体形成剤の中でも、ＥＤＴＡ４
Ｎａ、ＥＤＴＡ２Ｎａ等は、強酸性の金属塩溶液と混合
した時にほぼ中性の錯体溶液を与えるので好ましい錯体
形成剤である。
Ｎａ、ＥＤＴＡ２Ｎａ等は、強酸性の金属塩溶液と混合
した時にほぼ中性の錯体溶液を与えるので好ましい錯体
形成剤である。
【００１２】本発明の水溶性の金属錯体は、公知の方法
によって得ることができる。具体的には、遷移金属と錯
体形成剤を溶液中で混合し必要に応じてｐＨを調整した
後に利用する。なお遷移金属や錯体形成剤は、最終的な
ｐＨを考慮して極端な酸やアルカリとならないように選
択すると良い。たとえば遷移金属として鉄を、錯体形成
剤としてＥＤＴＡを利用する場合、鉄塩としては塩化第
二鉄をＥＤＴＡとしては４Ｎａ塩を利用するとほぼ中性
のｐＨを維持することができる。
によって得ることができる。具体的には、遷移金属と錯
体形成剤を溶液中で混合し必要に応じてｐＨを調整した
後に利用する。なお遷移金属や錯体形成剤は、最終的な
ｐＨを考慮して極端な酸やアルカリとならないように選
択すると良い。たとえば遷移金属として鉄を、錯体形成
剤としてＥＤＴＡを利用する場合、鉄塩としては塩化第
二鉄をＥＤＴＡとしては４Ｎａ塩を利用するとほぼ中性
のｐＨを維持することができる。
【００１３】金属錯体の選択にあたっては、錯体溶液の
ｐＨのみならず、最終的な分析の反応の場で阻害作用を
持たない物質を選ぶべきである。またたとえ反応の阻害
作用を持たない物質であっても、たとえば光学的な測定
を妨害する着色物質の使用も避けた方が好ましい。ただ
し光学測定を行わないときは着色の影響は受けないの
で、着色物質であっても支障なく利用することができ
る。具体的には、たとえば抗ヘモグロビン抗体を感作し
たラテックス粒子の凝集を光学的に追跡してヘモグロビ
ンを測定する時には、測定波長に吸収を持つ金属錯体を
避けた方が好ましい。他方、同じラテックス粒子を利用
する時でも単に凝集を肉眼的に追跡する場合や、あるい
は抗ヘモグロビン抗体を固定した吸収性担体によるイム
ノクロマトグラフ法でヘモグロビンを検出する時には、
肉眼判定を妨害しない限り多少の着色は問題とならな
い。またＥＬＩＳＡ法のように、Ｂ／Ｆ分離により分析
試料溶液が反応系から除かれるような場合にも着色や反
応系への影響を考慮する必要が無い。
ｐＨのみならず、最終的な分析の反応の場で阻害作用を
持たない物質を選ぶべきである。またたとえ反応の阻害
作用を持たない物質であっても、たとえば光学的な測定
を妨害する着色物質の使用も避けた方が好ましい。ただ
し光学測定を行わないときは着色の影響は受けないの
で、着色物質であっても支障なく利用することができ
る。具体的には、たとえば抗ヘモグロビン抗体を感作し
たラテックス粒子の凝集を光学的に追跡してヘモグロビ
ンを測定する時には、測定波長に吸収を持つ金属錯体を
避けた方が好ましい。他方、同じラテックス粒子を利用
する時でも単に凝集を肉眼的に追跡する場合や、あるい
は抗ヘモグロビン抗体を固定した吸収性担体によるイム
ノクロマトグラフ法でヘモグロビンを検出する時には、
肉眼判定を妨害しない限り多少の着色は問題とならな
い。またＥＬＩＳＡ法のように、Ｂ／Ｆ分離により分析
試料溶液が反応系から除かれるような場合にも着色や反
応系への影響を考慮する必要が無い。
【００１４】なお金属錯体調製時の錯体形成剤と金属イ
オンとのモル比は、基本的には両者の組み合わせに依存
するが、あるていどの幅が選択できる時には最も安定化
効果の大きい比を選択する。たとえば、Ｆｅ(III)Ｃｌ3
とＥＤＴＡ４Ｎａとの組み合わせでは、１：１、１：
２、１：４、および１：６を選択することができる。こ
れらの中からヘモグロビンの安定化効果が大きい比を選
ぶと良い。
オンとのモル比は、基本的には両者の組み合わせに依存
するが、あるていどの幅が選択できる時には最も安定化
効果の大きい比を選択する。たとえば、Ｆｅ(III)Ｃｌ3
とＥＤＴＡ４Ｎａとの組み合わせでは、１：１、１：
２、１：４、および１：６を選択することができる。こ
れらの中からヘモグロビンの安定化効果が大きい比を選
ぶと良い。
【００１５】本発明における金属錯体は、０．１〜５０
０mM、好ましくは５〜３００mM程度の濃度で利用する。
好ましい利用濃度範囲は個々の錯体に依存する面も有る
が、たとえば第二鉄ＥＤＴＡ錯体（以下ＦｅIIIＥＤＴ
Ａと省略する）を例にとると糞便懸濁液中で５〜２５０
mMの範囲において非常に有効な安定化作用を期待するこ
とができる。本発明によるヘモグロビンの安定化技術に
は、金属錯体の添加以外にもヘモグロビンの安定性に寄
与する条件を組み合せることができる。ヘモグロビンの
安定化をもたらす条件とは、ｐＨの制御、ならびに本発
明による金属錯体以外の安定化成分の利用を指す。
０mM、好ましくは５〜３００mM程度の濃度で利用する。
好ましい利用濃度範囲は個々の錯体に依存する面も有る
が、たとえば第二鉄ＥＤＴＡ錯体（以下ＦｅIIIＥＤＴ
Ａと省略する）を例にとると糞便懸濁液中で５〜２５０
mMの範囲において非常に有効な安定化作用を期待するこ
とができる。本発明によるヘモグロビンの安定化技術に
は、金属錯体の添加以外にもヘモグロビンの安定性に寄
与する条件を組み合せることができる。ヘモグロビンの
安定化をもたらす条件とは、ｐＨの制御、ならびに本発
明による金属錯体以外の安定化成分の利用を指す。
【００１６】ｐＨはヘモグロビンを安定に保持できる範
囲に設定する。極端な酸やアルカリ条件下ではヘモグロ
ビンの安定性を損なう恐れが有るので、できるだけ中性
域のｐＨを採用する。具体的には５〜１０、好ましくは
６〜８程度のｐＨとするとよい。ｐＨの維持のためには
適当な緩衝剤を利用することができる。緩衝剤としては
つぎのようなものが利用できる。なお緩衝剤を利用する
時には、本発明による金属錯体に影響を与えないものを
選ぶようにすると良い。 本発明に利用することができる緩衝剤： ＧＯＯＤ緩衝剤 ２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)et
hanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する） ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する） （２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hyd
roxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する） ３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nic acid、ＥＰＰＳと省略する） ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する） ３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する） ３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する） ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する） その他の緩衝剤 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパン
ジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanedio
l、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Tris(hy
droxymethyl)aminomethaneとも呼ばれる） リン酸緩衝液 アンモニウム緩衝液
囲に設定する。極端な酸やアルカリ条件下ではヘモグロ
ビンの安定性を損なう恐れが有るので、できるだけ中性
域のｐＨを採用する。具体的には５〜１０、好ましくは
６〜８程度のｐＨとするとよい。ｐＨの維持のためには
適当な緩衝剤を利用することができる。緩衝剤としては
つぎのようなものが利用できる。なお緩衝剤を利用する
時には、本発明による金属錯体に影響を与えないものを
選ぶようにすると良い。 本発明に利用することができる緩衝剤： ＧＯＯＤ緩衝剤 ２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)et
hanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する） ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する） （２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hyd
roxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する） ３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nic acid、ＥＰＰＳと省略する） ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する） ３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する） ３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する） ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する） その他の緩衝剤 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパン
ジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanedio
l、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Tris(hy
droxymethyl)aminomethaneとも呼ばれる） リン酸緩衝液 アンモニウム緩衝液
【００１７】これらの緩衝剤の中でも、ＨＥＰＥＳやＰ
ＩＰＥＳ等のＧＯＯＤ緩衝剤は、ヘモグロビンの構造を
最も安定化すると思われるｐＨ（６〜８）を与えると同
時に、免疫反応によってヘモグロビンを検出する時の反
応用緩衝液としても利用されているものであり特に好ま
しい緩衝剤として挙げられる。
ＩＰＥＳ等のＧＯＯＤ緩衝剤は、ヘモグロビンの構造を
最も安定化すると思われるｐＨ（６〜８）を与えると同
時に、免疫反応によってヘモグロビンを検出する時の反
応用緩衝液としても利用されているものであり特に好ま
しい緩衝剤として挙げられる。
【００１８】本発明におけるヘモグロビンの安定化方法
には、公知の安定化技術を組み合せることが可能であ
る。具体的には、ＢＳＡやＲＳＡ等の不活性蛋白、リジ
ンやヒスチジン等のアミノ酸、ＮａＮ3や安息香酸エチ
ル等の抗菌性物質、ショ糖等の糖、プロテアーゼ抑制物
質、およびイオン強度を調節する塩類等を加えることが
できる。また分析やヘモグロビンの安定化を妨害しない
範囲で、消臭剤、香料、あるいは色素等を併用すること
も可能である。本発明に基づくヘモグロビン安定化用の
溶液について、具体的な組成の例を次に示す。 ＦｅIIIＥＤＴＡ：５〜３００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）：１０〜５００mM ＢＳＡ：０．１〜５% ＮａＮ3：０．１〜１%
には、公知の安定化技術を組み合せることが可能であ
る。具体的には、ＢＳＡやＲＳＡ等の不活性蛋白、リジ
ンやヒスチジン等のアミノ酸、ＮａＮ3や安息香酸エチ
ル等の抗菌性物質、ショ糖等の糖、プロテアーゼ抑制物
質、およびイオン強度を調節する塩類等を加えることが
できる。また分析やヘモグロビンの安定化を妨害しない
範囲で、消臭剤、香料、あるいは色素等を併用すること
も可能である。本発明に基づくヘモグロビン安定化用の
溶液について、具体的な組成の例を次に示す。 ＦｅIIIＥＤＴＡ：５〜３００mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）：１０〜５００mM ＢＳＡ：０．１〜５% ＮａＮ3：０．１〜１%
【００１９】本発明のヘモグロビンの安定化方法は、糞
便潜血の検出を目的とする糞便試料中のヘモグロビンの
安定化に利用することができる。特に抗原構造の保護が
要求される免疫学的な分析対象としてのヘモグロビンに
ついて、その抗原性の維持に有用である。また、糞便や
尿中のヘモグロビン検出において必要な標準品としての
ヘモグロビンの安定化にも応用することができる。
便潜血の検出を目的とする糞便試料中のヘモグロビンの
安定化に利用することができる。特に抗原構造の保護が
要求される免疫学的な分析対象としてのヘモグロビンに
ついて、その抗原性の維持に有用である。また、糞便や
尿中のヘモグロビン検出において必要な標準品としての
ヘモグロビンの安定化にも応用することができる。
【００２０】本発明は、前記ヘモグロビンの安定化方法
に加えてこの安定化方法を応用したヘモグロビン保存溶
液をも提供する。本発明によるヘモグロビン保存溶液
は、先に述べたような安定化方法のための条件に基づい
て金属錯体を含むものである。本発明によるヘモグロビ
ン保存溶液は、たとえば公知の糞便採取容器に充填して
利用される。あるいは標準品となるヘモグロビンを適当
な濃度で溶解して利用する。その他、分析試料である糞
便や尿などに直接添加してヘモグロビンを安定化するこ
とも可能である。
に加えてこの安定化方法を応用したヘモグロビン保存溶
液をも提供する。本発明によるヘモグロビン保存溶液
は、先に述べたような安定化方法のための条件に基づい
て金属錯体を含むものである。本発明によるヘモグロビ
ン保存溶液は、たとえば公知の糞便採取容器に充填して
利用される。あるいは標準品となるヘモグロビンを適当
な濃度で溶解して利用する。その他、分析試料である糞
便や尿などに直接添加してヘモグロビンを安定化するこ
とも可能である。
【００２１】
【作用】本発明における遷移金属イオンの水溶性金属錯
体は、従来のヘモグロビン安定剤では必ずしも十分な効
果を期待できなかったヘモグロビンの変性・分解を効果
的に抑制する作用を持つ。特に変性・分解作用成分を多
く含み、また保存条件の管理が困難な糞便懸濁液中のヘ
モグロビンに対しても十分な保護作用を示す。
体は、従来のヘモグロビン安定剤では必ずしも十分な効
果を期待できなかったヘモグロビンの変性・分解を効果
的に抑制する作用を持つ。特に変性・分解作用成分を多
く含み、また保存条件の管理が困難な糞便懸濁液中のヘ
モグロビンに対しても十分な保護作用を示す。
【００２２】遷移金属イオンの水溶性金属錯体がどのよ
うな作用機序によってヘモグロビンを保護するのかは不
明である。本発明者らは、従来の安定剤では十分に対応
できないヘモグロビンの変性・分解作用に対して有効な
保護剤を探索し、幅広い遷移金属イオンの水溶性金属錯
体が有効なことを発見し本発明にいたった。特に糞便成
分と共存するヘモグロビンの変性には、従来は主に細菌
や蛋白分解酵素が関与するものとされていた。本発明者
らは糞便成分の中には、細菌や蛋白分解酵素の作用だけ
では説明が困難な耐熱性の変性因子が存在することを確
認し、更にこの変性因子に対しても有効なヘモグロビン
保護物質を見出したものである。ただし本発明によるヘ
モグロビン保護作用が、耐熱性因子に対してのみ作用す
ると推測すべきではない。またその保護効果がヘモグロ
ビンの抗原性のみに限定されるものでもない。続いて実
施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
うな作用機序によってヘモグロビンを保護するのかは不
明である。本発明者らは、従来の安定剤では十分に対応
できないヘモグロビンの変性・分解作用に対して有効な
保護剤を探索し、幅広い遷移金属イオンの水溶性金属錯
体が有効なことを発見し本発明にいたった。特に糞便成
分と共存するヘモグロビンの変性には、従来は主に細菌
や蛋白分解酵素が関与するものとされていた。本発明者
らは糞便成分の中には、細菌や蛋白分解酵素の作用だけ
では説明が困難な耐熱性の変性因子が存在することを確
認し、更にこの変性因子に対しても有効なヘモグロビン
保護物質を見出したものである。ただし本発明によるヘ
モグロビン保護作用が、耐熱性因子に対してのみ作用す
ると推測すべきではない。またその保護効果がヘモグロ
ビンの抗原性のみに限定されるものでもない。続いて実
施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【００２３】
実施例１．水溶性金属錯体によるヘモグロビンの安定化 水溶性金属錯体としてＦｅIIIＥＤＴＡを用い、本発明
による糞便中におけるヘモグロビンの安定化効果を公知
の安定化剤と比較した。公知の安定化剤としては、表１
に示す化合物を用いた。表中、ＦＯＹＰＡＮ錠（小野薬
品工業製、商品名、メシル酸カモスタット）、ミラクリ
ッド（持田製薬製、商品名、ウリナスタチン）、および
アプロチニンはいずれもプロテアーゼ阻害剤である。 遷移金属錯体の調製：ＦｅIIIＥＤＴＡは次のようにし
て調製した。第二鉄イオンとＥＤＴＡとは１：１で錯体
を形成するので塩化第二鉄とＥＤＴＡ４Ｎａの等モル量
を精製水中で混合し、錯体を形成させた。得られた赤色
溶液のｐＨはほぼ中性であったが、ｐＨを７．４に調整
して実験に用いた。 試料の調製：ヒト血液を精製水と混合して溶血後遠心分
離により固形分を除き、凍結保存したものをヒト・ヘモ
グロビンとして用いた。市販のヘモグロビン測定試薬Ｏ
Ｃ−ヘモディアオート‘栄研’（栄研化学製、登録商
標）で濃度を測定したところ、ヘモグロビンＡ０濃度は
６０mg/mlであった。このヘモグロビンを１０倍に希釈
し、ヒト新鮮便１gに対し３０μlを加えて均一にかくは
ん混合した。このヘモグロビン含有糞便を５０μg採取
し、各安定剤を含む１０mlのＨＥＰＥＳ緩衝液（１００
mM、ｐＨ７．４）に懸濁した。なお糞便はＡ（健常
人）、Ｂ（抗菌剤を服用）の２種類を用いた。 ヘモグロビンの測定：測定前に糞便懸濁液を遠心分離
（３０００rpm、１５分間）し、得られた遠心上清を測
定試料とした。市販のヘモグロビン測定試薬ＯＣ−ヘモ
ディアオート‘栄研’を用い、遠心上清５０μlに試薬
を３００μl加えて３７℃で約３分間反応させた。この
間の免疫学的凝集反応に基づく５８５nmにおける吸光度
変化量よりヘモグロビン濃度を決定した。なお標準とし
ては、試薬に添付のヒト溶血液（２０００ng/mlヒト・
ヘモグロビン含有ＨＥＰＥＳ緩衝液）を用いた。結果は
表１に示すとおりである。表中の数字は実験開始時の測
定値（約３００ng/ml）に対する残存濃度の%である。
による糞便中におけるヘモグロビンの安定化効果を公知
の安定化剤と比較した。公知の安定化剤としては、表１
に示す化合物を用いた。表中、ＦＯＹＰＡＮ錠（小野薬
品工業製、商品名、メシル酸カモスタット）、ミラクリ
ッド（持田製薬製、商品名、ウリナスタチン）、および
アプロチニンはいずれもプロテアーゼ阻害剤である。 遷移金属錯体の調製：ＦｅIIIＥＤＴＡは次のようにし
て調製した。第二鉄イオンとＥＤＴＡとは１：１で錯体
を形成するので塩化第二鉄とＥＤＴＡ４Ｎａの等モル量
を精製水中で混合し、錯体を形成させた。得られた赤色
溶液のｐＨはほぼ中性であったが、ｐＨを７．４に調整
して実験に用いた。 試料の調製：ヒト血液を精製水と混合して溶血後遠心分
離により固形分を除き、凍結保存したものをヒト・ヘモ
グロビンとして用いた。市販のヘモグロビン測定試薬Ｏ
Ｃ−ヘモディアオート‘栄研’（栄研化学製、登録商
標）で濃度を測定したところ、ヘモグロビンＡ０濃度は
６０mg/mlであった。このヘモグロビンを１０倍に希釈
し、ヒト新鮮便１gに対し３０μlを加えて均一にかくは
ん混合した。このヘモグロビン含有糞便を５０μg採取
し、各安定剤を含む１０mlのＨＥＰＥＳ緩衝液（１００
mM、ｐＨ７．４）に懸濁した。なお糞便はＡ（健常
人）、Ｂ（抗菌剤を服用）の２種類を用いた。 ヘモグロビンの測定：測定前に糞便懸濁液を遠心分離
（３０００rpm、１５分間）し、得られた遠心上清を測
定試料とした。市販のヘモグロビン測定試薬ＯＣ−ヘモ
ディアオート‘栄研’を用い、遠心上清５０μlに試薬
を３００μl加えて３７℃で約３分間反応させた。この
間の免疫学的凝集反応に基づく５８５nmにおける吸光度
変化量よりヘモグロビン濃度を決定した。なお標準とし
ては、試薬に添付のヒト溶血液（２０００ng/mlヒト・
ヘモグロビン含有ＨＥＰＥＳ緩衝液）を用いた。結果は
表１に示すとおりである。表中の数字は実験開始時の測
定値（約３００ng/ml）に対する残存濃度の%である。
【００２４】
【表１】
【００２５】検体２例に共通し、ＥＤＴＡ単独並びに４
種の阻害剤はヘモグロビンの安定化に何らの効果も示さ
なかった。またＦＯＹＰＡＮは、安定化よりもむしろヘ
モグロビンに対し変性作用を持つものと推定された。一
方でＢＳＡについては濃度０．１%に比べ５%のものの残
存率が高く、ヘモグロビンの安定化に寄与しているもの
と考えられる。本発明である５mMＦｅIIIＥＤＴＡにつ
いては検体Ａで５%ＢＳＡにほぼ匹敵し、検体Ｂではは
るかに上回る残存率を示し、ヘモグロビンの安定化に極
めて有効であることが実証された。ＦｅIIIＥＤＴＡの
安定化作用に対して、錯体化していないＥＤＴＡ溶液で
は安定化作用が観察されず、ヘモグロビンの安定化作用
は金属錯体に固有の効果であることが確認された。
種の阻害剤はヘモグロビンの安定化に何らの効果も示さ
なかった。またＦＯＹＰＡＮは、安定化よりもむしろヘ
モグロビンに対し変性作用を持つものと推定された。一
方でＢＳＡについては濃度０．１%に比べ５%のものの残
存率が高く、ヘモグロビンの安定化に寄与しているもの
と考えられる。本発明である５mMＦｅIIIＥＤＴＡにつ
いては検体Ａで５%ＢＳＡにほぼ匹敵し、検体Ｂではは
るかに上回る残存率を示し、ヘモグロビンの安定化に極
めて有効であることが実証された。ＦｅIIIＥＤＴＡの
安定化作用に対して、錯体化していないＥＤＴＡ溶液で
は安定化作用が観察されず、ヘモグロビンの安定化作用
は金属錯体に固有の効果であることが確認された。
【００２６】実施例２．また本発明による安定化剤の作
用機序を推定するため、糞便の懸濁液を無菌ろ過（０．
２μm）したもの、およびろ過後更に１５分間沸騰水で
処理したものについてもヘモグロビンの安定化に及ぼす
遷移金属錯体の影響を調査した。 試料の調製：新鮮な糞便１gをＨＥＰＥＳ緩衝液（１０
０mM、ｐＨ７．４）１００mlに懸濁させ、３０００rpm
で１０分間遠心分離して上清を得た。この遠心上清をメ
ンブレンフィルター（０．２μm）でろ過し、無菌ろ過
懸濁液とした。沸騰水処理は、この無菌ろ過懸濁液を１
５分間沸騰水中に水浴することにより行った。無菌ろ過
によって細菌の影響が除かれ、更に煮沸したことで糞便
中に存在が予想される蛋白分解酵素の影響が除かれる。
各懸濁液の１容に対し、ヒト溶血液（０．２%ＢＳＡ含
有ＨＥＰＥＳ）１容を加え、３７℃で保存してヘモグロ
ビンの残存量を追跡した。遷移金属錯体を添加する時に
は、１と同様ＦｅIIIＥＤＴＡ錯体を５mMとなるように
加えた。ヘモグロビンの残存量は、遠心操作を省略する
他は１と同様の操作により測定した。なお表中の未処理
は、無菌ろ過と加熱処理を行わない遠心上清である。
用機序を推定するため、糞便の懸濁液を無菌ろ過（０．
２μm）したもの、およびろ過後更に１５分間沸騰水で
処理したものについてもヘモグロビンの安定化に及ぼす
遷移金属錯体の影響を調査した。 試料の調製：新鮮な糞便１gをＨＥＰＥＳ緩衝液（１０
０mM、ｐＨ７．４）１００mlに懸濁させ、３０００rpm
で１０分間遠心分離して上清を得た。この遠心上清をメ
ンブレンフィルター（０．２μm）でろ過し、無菌ろ過
懸濁液とした。沸騰水処理は、この無菌ろ過懸濁液を１
５分間沸騰水中に水浴することにより行った。無菌ろ過
によって細菌の影響が除かれ、更に煮沸したことで糞便
中に存在が予想される蛋白分解酵素の影響が除かれる。
各懸濁液の１容に対し、ヒト溶血液（０．２%ＢＳＡ含
有ＨＥＰＥＳ）１容を加え、３７℃で保存してヘモグロ
ビンの残存量を追跡した。遷移金属錯体を添加する時に
は、１と同様ＦｅIIIＥＤＴＡ錯体を５mMとなるように
加えた。ヘモグロビンの残存量は、遠心操作を省略する
他は１と同様の操作により測定した。なお表中の未処理
は、無菌ろ過と加熱処理を行わない遠心上清である。
【００２７】
【表２】
【００２８】未処理便の３０時間までの残存率と比較
し、ろ過による除菌、更に煮沸と処理を重ねるに従いヘ
モグロビンの残存率が増加することから、細菌およびプ
ロテアーゼ等の酵素によるヘモグロビンの変性が裏付け
られた。しかしながらこれらの処理と０．２%ＢＳＡの
組合せをもってしても３０時間後の残存率は僅かに１
３．０%であり、便無しの７１．９%を大きく下回るもの
である。ところがこのろ過＋煮沸便に本発明であるＦｅ
IIIＥＤＴＡをＢＳＡとともに添加したところ、便無し
と同率の残存率（７０．０%）を示した。またろ過のみ
でＦｅIIIＥＤＴＡを添加したした場合も、対応する未
添加の場合と比較し有意に残存率が高く有効な保存効果
を示した。以上の結果から便中のヘモグロビンの変性因
子としては、従来から指摘されてきた便中細菌並びにプ
ロテアーゼに加えて耐熱性物質の影響が考えられ、しか
もその影響がきわめて大きいといえる。そして本発明に
おけるＦｅIIIＥＤＴＡ錯体は、耐熱性変性因子のヘモ
グロビンに対する作用を抑制する作用を持つことが明ら
かである。
し、ろ過による除菌、更に煮沸と処理を重ねるに従いヘ
モグロビンの残存率が増加することから、細菌およびプ
ロテアーゼ等の酵素によるヘモグロビンの変性が裏付け
られた。しかしながらこれらの処理と０．２%ＢＳＡの
組合せをもってしても３０時間後の残存率は僅かに１
３．０%であり、便無しの７１．９%を大きく下回るもの
である。ところがこのろ過＋煮沸便に本発明であるＦｅ
IIIＥＤＴＡをＢＳＡとともに添加したところ、便無し
と同率の残存率（７０．０%）を示した。またろ過のみ
でＦｅIIIＥＤＴＡを添加したした場合も、対応する未
添加の場合と比較し有意に残存率が高く有効な保存効果
を示した。以上の結果から便中のヘモグロビンの変性因
子としては、従来から指摘されてきた便中細菌並びにプ
ロテアーゼに加えて耐熱性物質の影響が考えられ、しか
もその影響がきわめて大きいといえる。そして本発明に
おけるＦｅIIIＥＤＴＡ錯体は、耐熱性変性因子のヘモ
グロビンに対する作用を抑制する作用を持つことが明ら
かである。
【００２９】実施例３．遷移金属錯体の種類、あるいは
使用濃度とヘモグロビンの安定化効果の関係を調査し
た。 遷移金属錯体の調製：遷移金属錯体としてはＮｉII、Ｃ
ｏII、ＺｎII、およびＦｅIIIのＥＤＴＡ４Ｎａとの錯
体を用いた。ＮｉはＮｉＣｌ2として、ＣｏはＣｏＣｌ2
として、ＺｎはＺｎＣｌ2として用い、１と同様の操作
によりＥＤＴＡ錯体とした。得られた錯体溶液はいずれ
もほぼ中性のｐＨを示したが、ｐＨを７．４に調整して
実験に用いた。また各錯体は、ＮｉIIＥＤＴＡが緑色、
ＣｏIIＥＤＴＡが赤色、ＺｎIIＥＤＴＡが無色の溶液と
なる。 試料の調製：１と同様にヘモグロビン含有糞便（個体別
７例、Ｃ〜Ｉ）５０μgを０．１%ＢＳＡと各々の金属錯
体を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁させた。３７℃で０〜
２４時間保存し、その間のヘモグロビン残存率を１と同
じ測定方法により追跡した。
使用濃度とヘモグロビンの安定化効果の関係を調査し
た。 遷移金属錯体の調製：遷移金属錯体としてはＮｉII、Ｃ
ｏII、ＺｎII、およびＦｅIIIのＥＤＴＡ４Ｎａとの錯
体を用いた。ＮｉはＮｉＣｌ2として、ＣｏはＣｏＣｌ2
として、ＺｎはＺｎＣｌ2として用い、１と同様の操作
によりＥＤＴＡ錯体とした。得られた錯体溶液はいずれ
もほぼ中性のｐＨを示したが、ｐＨを７．４に調整して
実験に用いた。また各錯体は、ＮｉIIＥＤＴＡが緑色、
ＣｏIIＥＤＴＡが赤色、ＺｎIIＥＤＴＡが無色の溶液と
なる。 試料の調製：１と同様にヘモグロビン含有糞便（個体別
７例、Ｃ〜Ｉ）５０μgを０．１%ＢＳＡと各々の金属錯
体を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁させた。３７℃で０〜
２４時間保存し、その間のヘモグロビン残存率を１と同
じ測定方法により追跡した。
【００３０】
【表３】
【００３１】Ｎｉ、Ｃｏ、およびＺｎ錯体はＢＳＡのみ
を安定化剤とした対照と比較し同等もしくはそれ以上の
残存率を示し、安定化効果が確認された。鉄錯体は他の
金属錯体に比べ残存率が有意に高く、また検体Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｉでは２濃度間で残存率に大きな差はない。一方検
体Ｆ、Ｇ、Ｈに於いて濃度５mMに対し１０mMとすること
で残存率にかなりの増加がみられる。これはヘモグロビ
ン変性因子の便中存在量に個体差があり、ＦｅIIIＥＤ
ＴＡ濃度５mMでは完全にその影響を除くことができない
場合もあるためと推定する。
を安定化剤とした対照と比較し同等もしくはそれ以上の
残存率を示し、安定化効果が確認された。鉄錯体は他の
金属錯体に比べ残存率が有意に高く、また検体Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｉでは２濃度間で残存率に大きな差はない。一方検
体Ｆ、Ｇ、Ｈに於いて濃度５mMに対し１０mMとすること
で残存率にかなりの増加がみられる。これはヘモグロビ
ン変性因子の便中存在量に個体差があり、ＦｅIIIＥＤ
ＴＡ濃度５mMでは完全にその影響を除くことができない
場合もあるためと推定する。
【００３２】
【発明の効果】以上のように、遷移金属イオンの水溶性
金属錯体を共存させることによってヘモグロビンを効果
的に安定化することができる。この安定化効果は公知の
安定剤と組み合せた場合に相加的に作用し、たとえばＢ
ＳＡ等のとの組み合せで更に良好な安定化効果を期待す
ることができる。このことは、本発明による安定化作用
が既に知られている安定剤とは作用機序が異なるか、あ
るいは同じ機序であるとしても更に強力な保護作用を持
っていることを示唆している。
金属錯体を共存させることによってヘモグロビンを効果
的に安定化することができる。この安定化効果は公知の
安定剤と組み合せた場合に相加的に作用し、たとえばＢ
ＳＡ等のとの組み合せで更に良好な安定化効果を期待す
ることができる。このことは、本発明による安定化作用
が既に知られている安定剤とは作用機序が異なるか、あ
るいは同じ機序であるとしても更に強力な保護作用を持
っていることを示唆している。
【００３３】本発明のヘモグロビン安定化技術では、ヘ
モグロビンに対して強い変性・分解作用を持つ糞便成分
との共存下においても保護作用を得ることができる。し
たがって、糞便潜血の分析を目的とする試料に含まれる
ヘモグロビンの安定化に有用である。特に抗原構造の保
護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘモグロビ
ンについて、その抗原性の維持に貢献する。本発明によ
って糞便試料中のヘモグロビンが効果的に安定化され、
ヘモグロビンの変性・分解による偽陰性結果の防止を期
待することができる。
モグロビンに対して強い変性・分解作用を持つ糞便成分
との共存下においても保護作用を得ることができる。し
たがって、糞便潜血の分析を目的とする試料に含まれる
ヘモグロビンの安定化に有用である。特に抗原構造の保
護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘモグロビ
ンについて、その抗原性の維持に貢献する。本発明によ
って糞便試料中のヘモグロビンが効果的に安定化され、
ヘモグロビンの変性・分解による偽陰性結果の防止を期
待することができる。
【００３４】本発明に必要な遷移金属イオンの水溶性金
属錯体は、それ自身が安定な成分であるので長時間にわ
たってヘモグロビンを安定化することができる。たとえ
ばＢＳＡや糖のような安定剤では糞便中の細菌によって
速やかに代謝されるため長時間にわたる安定化効果を期
待しにくいので、この点でも本発明の安定化技術は優れ
ている。また本発明における水溶性金属錯体は安価であ
り、たとえば特殊な酵素のような高価な物質に比べて経
済的に有利である。
属錯体は、それ自身が安定な成分であるので長時間にわ
たってヘモグロビンを安定化することができる。たとえ
ばＢＳＡや糖のような安定剤では糞便中の細菌によって
速やかに代謝されるため長時間にわたる安定化効果を期
待しにくいので、この点でも本発明の安定化技術は優れ
ている。また本発明における水溶性金属錯体は安価であ
り、たとえば特殊な酵素のような高価な物質に比べて経
済的に有利である。
Claims (23)
- 【請求項１】遷移金属イオンの水溶性金属錯体によるヘ
モグロビンの安定化方法 - 【請求項２】遷移金属が、マンガン、鉄、コバルト、ニ
ッケル、銅、亜鉛、モリブデン、カドミウム、バナジウ
ム、および水銀から選択される請求項１のヘモグロビン
の安定化方法 - 【請求項３】遷移金属が鉄である請求項２のヘモグロビ
ンの安定化方法 - 【請求項４】鉄が３価の鉄である請求項３のヘモグロビ
ンの安定化方法 - 【請求項５】水溶性の金属錯体形成剤が、Ｎ，Ｎ−配位
型である請求項１のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項６】水溶性の金属錯体形成剤が、Ｎ，Ｏ−配位
型である請求項１のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項７】水溶性の金属錯体形成剤が、Ｏ，Ｏ−配位
型である請求項１のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項８】水溶性の金属錯体形成剤が、Ｎ，Ｓ−配位
型である請求項１のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項９】水溶性の金属錯体形成剤が、Ｓ，Ｓ−配位
型である請求項１のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項１０】Ｎ，Ｏ−配位型の水溶性の金属錯体形成
剤が、コンプレクサン類、フタレインコンプレクソン
類、およびオキシン類から選択されたものである請求項
６のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項１１】Ｎ，Ｏ−配位型の水溶性の金属錯体形成
剤がコンプレクサン類であり、かつ次の群から選択され
る少なくとも１つの化合物である請求項１０のヘモグロ
ビンの安定化方法 エチレンジアミン４酢酸（Ethylenediamine-N,N,N',N'-
tetraacetic acid） １，２−シクロヘキサンジアミン４酢酸（1.2-Cyclohex
anediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid） ヘキサメチレンジアミン４酢酸（Hexamethylenediamine
-N,N,N',N'-tetraaceticacid） イミノ２酢酸（Iminodiacetic acid） ヒドロキシエチルイミノ２酢酸（Hydroxyethyliminodia
cetic acid） １，３−ジアミノプロパン−２−オール４酢酸（1,3-Di
aminopropane-2-ol-N,N,N',N'-tetraacetic acid） ジエチレントリアミン５酢酸（Diethylenetriamine-N,
N,-N',N'',N''-pentaacetic acid） エチレンジアミン２酢酸（Ethylenediamine-N,N'-diace
tic acid） エチレンジアミン２酢酸２プロピオン酸（Ethylenediam
ine-N,N'-dipropionic acid dihydrochloride） エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）４酢酸（O,O'
-bis(2-aminoethyl)ethyleneglycol-N,N,N',N'-tetraac
etic acid） エチレンジアミン−テトラキス（メチレンホスホン酸）
（Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetrakis(methylenphosp
holic acid)） エチレンジアミン２プロピオン酸（Ethylenediamine-N,
N'-dipropionic acid） ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸（N-Hydroxye
thylethylenediamine-N,N',N'-triacetic acid） Ｎ−（２−ヒドロキシルエチル）エチレンジアミン３酢
酸（N-(2-Hydroxyethyl)ethylenediamine-N,N',N'-tria
cetic acid） ニトリロ３酢酸（Nitrilotriacetic acid） ニトリロ３プロピオン酸（Nitrilotripropionic acid） ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（Nitrilotris
(methylenephosphonic acid)） ２（ヒドロキシエチル）グリシン（N,N,-2(hydroxyethy
l)glycine） および１，２−ジアミノプロパン４酢酸またはこれらの
塩からなる群から選択される請求項１０のヘモグロビン
の安定化方法 - 【請求項１２】錯体形成剤がエチレンジアミン４酢酸ま
たはその塩である請求項１１のヘモグロビンの安定化方
法 - 【請求項１３】錯体形成剤がエチレンジアミン４酢酸４
ナトリウムである請求項１２のヘモグロビンの安定化方
法 - 【請求項１４】ヘモグロビンを含む溶液に金属錯体を
０.１〜５００mM添加する請求項１のヘモグロビンの安
定化方法 - 【請求項１５】ヘモグロビンを含む溶液に金属錯体を１
０〜３００mM添加する請求項１のヘモグロビンの安定化
方法 - 【請求項１６】ヘモグロビンを含む溶液のｐＨが５〜１
０である請求項１のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項１７】ヘモグロビンが糞便懸濁液中に存在する
ものである請求項１のヘモグロビンの安定化方法 - 【請求項１８】ヘモグロビンが免疫学的手法による検出
のためのものである請求項１のヘモグロビンの安定化方
法 - 【請求項１９】遷移金属イオンの水溶性金属錯体と共存
させることによって、糞便成分と共存するヘモグロビン
を耐熱性の変性因子から保護する方法 - 【請求項２０】遷移金属イオンの水溶性金属錯体と共存
させることによって、糞便成分と共存するヘモグロビン
の抗原性を耐熱性の変性因子から保護する方法 - 【請求項２１】遷移金属イオンの水溶性金属錯体を含む
ヘモグロビン保存溶液 - 【請求項２２】ヘモグロビンが免疫学的手法による検出
対象である請求項２１のヘモグロビン保存溶液 - 【請求項２３】糞便を懸濁させるためのものである請求
項２１のヘモグロビン保存溶液
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4769094A JPH07229902A (ja) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | ヘモグロビンの安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4769094A JPH07229902A (ja) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | ヘモグロビンの安定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07229902A true JPH07229902A (ja) | 1995-08-29 |
Family
ID=12782292
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4769094A Pending JPH07229902A (ja) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | ヘモグロビンの安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07229902A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009051032A1 (ja) | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Eiken Chemical Co., Ltd. | ヘムタンパク質の安定化方法及び保存溶液 |
| WO2017038711A1 (ja) * | 2015-08-28 | 2017-03-09 | 栄研化学株式会社 | 免疫学的測定用試薬組成物およびその用途 |
| KR20170132845A (ko) | 2015-03-31 | 2017-12-04 | 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤 | 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법 |
| WO2019107414A1 (ja) | 2017-12-01 | 2019-06-06 | 栄研化学株式会社 | ヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体を安定化する方法、及びヘモグロビンを含む検体を保存するための保存溶液 |
-
1994
- 1994-02-22 JP JP4769094A patent/JPH07229902A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009051032A1 (ja) | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Eiken Chemical Co., Ltd. | ヘムタンパク質の安定化方法及び保存溶液 |
| JP2009097956A (ja) * | 2007-10-16 | 2009-05-07 | Eiken Chem Co Ltd | ヘムタンパク質の安定化方法及び保存溶液 |
| KR20100089845A (ko) | 2007-10-16 | 2010-08-12 | 에이켄 케미컬 컴퍼니 리미티드 | 헴 단백질의 안정화방법 및 보존용액 |
| CN101828112A (zh) * | 2007-10-16 | 2010-09-08 | 荣研化学株式会社 | 血红素蛋白的稳定化方法和保存溶液 |
| US8329943B2 (en) | 2007-10-16 | 2012-12-11 | Eiken Chemical Co., Ltd. | Method of stabilizing heme protein and storage solution therefor |
| US8445719B2 (en) | 2007-10-16 | 2013-05-21 | Eiken Chemical Co., Ltd. | Method of stabilizing heme protein and storage solution therefor |
| EP2944959A1 (en) | 2007-10-16 | 2015-11-18 | Eiken Chemical Co., Ltd. | Hemoglobin stabilizing storage solution |
| KR20170132845A (ko) | 2015-03-31 | 2017-12-04 | 에이껜 가가꾸 가부시끼가이샤 | 헴 단백질의 보존액 및 헴 단백질의 안정화 방법 |
| US11125659B2 (en) | 2015-03-31 | 2021-09-21 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Preservative solution for heme protein, and method for stabilizing heme protein |
| WO2017038711A1 (ja) * | 2015-08-28 | 2017-03-09 | 栄研化学株式会社 | 免疫学的測定用試薬組成物およびその用途 |
| WO2019107414A1 (ja) | 2017-12-01 | 2019-06-06 | 栄研化学株式会社 | ヘモグロビンとハプトグロビンとの複合体を安定化する方法、及びヘモグロビンを含む検体を保存するための保存溶液 |
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