CN110241105A - Stromelysin-1水溶液及免疫检测用标准品、检测试剂盒、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶液,是使所含有的Stromelysin‑1具有良好的反应性及保存稳定性的水溶液;具体是以水为溶媒的缓冲液中添加Stromelysin‑1和2价金属离子。本发明还公开了一种用于Stromelysin‑1免疫检测的标准品,及使用上述标准品的检测试剂盒,及其检测方法。在Stromelysin‑1免疫检测法试剂方面,过去无法提供反应性及保存稳定性良好的标准品。通过本发明,可以提供反应性及稳定性良好的标准品。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域,具体涉及Stromelysin-1水溶液及免疫检测用标准品、检测试剂盒、检测方法。
背景技术
免疫检测法试剂的检测原理在于抗原抗体反应,而作为抗原的蛋白质等生物体物质的立体结构会对反应强度产生显著影响。一般情况下,存在于水溶液中的蛋白质,其结构稳定性很差。特别是经过纯化的蛋白质,当将其溶解在非血清等的非生物体类缓冲液中后,在进行长期保存的过程中,蛋白质的立体结构极易被破坏。如,常会出现抗原抗体反应性降低等现象,这种保存稳定性的下降众所周知。此外,在非生物体类溶剂中溶解保存时,其难以维持本来的结构,常常出现抗原效价(抗原性)发生变化的情况。
免疫检测试剂的标准品中溶解着以非生物体类溶剂为基准的抗原,其标值(期待值)已确定。在对患者抗体进行检测前,会对标准品进行检测(即,校准)。标准品的作用是,吸收因外部条件引起的试剂反应性变化,如因长期保存而引起的反应性降低。为了使其能够发挥此作用,和患者样本所含抗原一样,必须使标准品自身的反应性能够在其保管过程中或经过一段时间后只产生最小的变化。因此,保存稳定性的降低,会对临床检测试剂的有效性保证产生致命影响。
因此,一般会向蛋白质水溶液及标准品中添加牛血清白蛋白(BSA)等载体蛋白质或与其性状相似的化学合成多聚体及糖类、甘油等低分子物质。但是,这些添加成分无法再现生物体溶媒中的抗原蛋白的抗原性,其对保存稳定性的维持作用也十分有限。
Stromelysin-1(基质裂解素1)是一种能够分解细胞外基质的蛋白酶,其是一种在对风湿性关节炎的临床诊断方面、在与其他疾病相鉴别方面及在对病情发展的评估方面都具有重要临床意义的血液标志物。众所周知,与激素等其他生物体成分相比,当Stromelysin-1这种酶类蛋白处于除生物体溶剂以外的水溶液中时,其立体结构难以维持。另外,其保存稳定性也不佳。因此,当将其作为临床检测试剂时,其作为标准液所应具备的良好反应性和保存稳定性难以实现。这一问题使Stromelysin-1检测的临床意义受到极大损害。因此,亟需一种能够解决上述问题的Stromelysin-1水溶液及标准品。
发明内容
本发明为解决上述技术问题,采用如下技术方案:
本发明第一方面提供了一种水溶液,是使所含有的Stromelysin-1具有良好的反应性及保存稳定性的水溶液;具体是以水为溶媒的缓冲液中添加Stromelysin-1和2价金属离子。
进一步地,2价金属离子包括Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cr2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Se2+、Mo2+、Sn2+中的至少一种;优选地,2价金属离子包括Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+中的至少一种。
进一步地,2价金属离子浓度为0.001mM~5000mM,优选地,2价金属离子浓度为0.01mM~4000mM;更优选地,2价金属离子浓度为0.1mM~2500mM。
进一步地,水溶液pH为6.0~9.0。
进一步地,Stromelysin-1为天然或人工合成。
进一步地,Stromelysin-1浓度为3ng/mL~2000ng/mL。
本发明第二方面提供了一种免疫检测用标准品,是用于Stromelysin-1免疫检测的标准品,并具有良好的反应性及保存稳定性;具体为上述水溶液,其Stromelysin-1浓度确定。
进一步地,所述水溶液内还包括添加剂,所述添加剂包括蛋白稳定剂或/和防止蛋白发生凝集的添加剂或/和防腐剂。
本发明第三方面提供了一种检测Stromelysin-1的检测试剂盒,包括上述免疫检测用标准品及含有抗Stromelysin-1抗体的免疫检测试剂;优选地,包括上述免疫检测用标准品及含有包被了抗Stromelysin-1抗体的不溶性载体的免疫检测试剂。
本发明第四方面提供了一种检测Stromelysin-1的检测方法,使用上述检测试剂盒来进行检测,并且其标准曲线是通过上述免疫检测用标准品绘制而成。
本发明的有益效果:
在Stromelysin-1免疫检测法试剂方面,过去无法提供反应性及保存稳定性良好的标准品。通过本发明,可以提供反应性及稳定性良好的标准品。
附图说明
图1为LTIA测定时在Stromelysin-1标准品中添加金属离子对反应性和稳定性的影响。
图2为ELISA测定时在Stromelysin-1标准品中添加金属离子对反应性和稳定性的影响。
图3为标准品中添加不同浓度的CaCl2对反应性的影响。
图4为标准品中添加不同浓度的ZnCl2对反应性的影响。
图5为标准品中添加不同种类的金属盐对反应性的影响。
图6为标准品中Stromelysin-1的来源和添加2价金属离子对反应性的影响。
具体实施方式
本发明提供一种水溶液,是以水为溶媒的缓冲液中添加Stromelysin-1及2价金属离子。
本发明涉及的Stromelysin-1,可以使用Mature-form形式的,也可以使用Pro-form等全长序列形式的。同时,还可以使用氨基酸肽形式的,但其需拥有表位来捕捉与样本Stromelysin-1发生反应的抗Stromelysin-1抗体。同时,也可以使用由上述蛋白质或肽与牛血清蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白构成的结合物(conjugate)。本发明涉及的Stromelysin-1浓度最佳为在水溶液中调制至3ng/mL~2000ng/mL。这一浓度范围涵盖了当将其作为标准品来使用时,从正常人的标准最低参考值17.3ng/mL到临床上的判定高值1800ng/mL这一完整区间。本发明涉及的Stromelysin-1可以通过人、黑猩猩、红猩猩等动物的血清在活体内制得。但是,考虑到生产重复性及成本,通过在试管内进行细胞表达来获得Stromelysin-1更佳。通过此方法,对从人、黑猩猩、红猩猩等动物中分离、细胞株化的细胞进行培养而得的Stromelysin-1也可以使用。并且,通过将上述细胞与骨髓瘤细胞融合而获得的表达细胞置于试管中进行培养,再从培养上清及细胞体中制得的Stromelysin-1也适用于本专利。此外,将Stromelysin-1的表达基因载体化后,将其插入已建立细胞株的小鼠等动物细胞及大肠杆菌等原核细胞中后得到的Stromelysin-1也适用于本专利。在使用此方法进行制取时,也可以在对载体核酸序列编辑后再进行插入及细胞表达。
本发明中涉及的2价金属离子可以使用Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cr2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Se2+、Mo2+、Sn2+等,但是,使用Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+能够获得更好的反应性及保存稳定性。上述2价金属离子可以单独使用,也可以2种及以上混合使用。可以通过溶解如氯化物盐、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐等来获得这些2价金属盐,从而制得含有这些2价金属离子的标准品。从溶解性的角度来说,上述2价金属盐中氯化物盐、硝酸盐更佳;从溶解性及购买渠道的角度来说,氯化物盐最佳,如MgCl2、CaCl2、ZnCl2、MnCl2等。在水溶液中,2价金属离子的浓度可以为0.001mM~5000mM,在0.01mM~4000mM更佳,而在0.1mM~2500mM则最佳。若浓度低于0.001mM,将降低其对反应性及保存稳定性的改善效果。并且,在作为标准品使用时,若Stromelysin-1的浓度较高,2价金属离子不足将会导致从高值至低值的稀释线性不良。然而,当浓度超过5000mM时,不仅会导致发生非特异性反应,还会导致将标准品保存在仅略为干燥、低温的环境下时即发生盐析。
本发明涉及的水溶液是通过向以水为溶媒的缓冲液中添加Stromelysin-1及2价金属盐。此外,还可以按需要添加蛋白稳定剂等其他添加剂。
本发明涉及的水溶液的pH值一般为6.0~9.0。为使pH值维持在此范围内,可使用一些适合的缓冲液,如:磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液、HEPES(N-二羟乙基哌嗪-N'-乙磺酸)缓冲液、TES(N-三羟甲基甲基-2-氨基乙磺酸)缓冲液、MOPS(3-(N-吗啉)丙烷磺酸)缓冲液、Bis-Tris(二(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)缓冲液、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸)缓冲液、ADA(N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸)缓冲液、PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)缓冲液、Tris-硼酸缓冲液、EDTA缓冲液、Tris-EDTA缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲胺]-2-羟基丙磺酸)缓冲液、POPSO(哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸)缓冲液、HEPPSO(3-羟乙基哌嗪-2-羟基丙磺酸)缓冲液、EPPS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(3-丙磺酸))缓冲液、Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)缓冲液、Bicine(N-二(2-羟乙基)甘氨酸)缓冲液、TAPS(三羟甲基甲胺基丙磺酸)缓冲液、CHES(2-(环己基氨基)乙磺酸)缓冲液、CAPS(3-(环己氨基)-1-丙磺酸)缓冲液等。本发明涉及的缓冲液是通过将适用的缓冲剂稀释至适宜浓度调制而成。缓冲剂浓度范围可以为1~500mM,在3~300mM之间更佳。
本发明涉及的标准品是通过确定本发明涉及的水溶液中所含有的Stromelysin-1的期望值(绝对重量)而制得。除了直接测量固体成分重量外,还可以采用质谱法确定Stromelysin-1的期望值。
在本发明涉及的标准品中,可以添加牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白,以及胎牛血清(FBS)等生物高分子来作为蛋白稳定剂。此外,作为蛋白稳定剂,还可以添加如聚乙二醇、葡聚糖、干酪素、纤维素、MPC(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)多聚体等水溶性高分子及如Tween、Triton等的界面活性剂。为防止蛋白发生凝集,还可添加蔗糖、海藻糖等单糖、多糖、低聚糖作为添加剂,也可添加甘油等多元醇类作为添加剂。还有,添加精氨酸、甘氨酸等氨基酸及其氨基酸盐,以及氯化胆碱等季铵盐也可以起到防止蛋白发生凝集的作用。另外,可添加异唑酮类化合物(如品名为Proclin950、Proclin300的化合物等)、叠氮钠等作为防腐剂。
本发明涉及的水溶液是通过使抗Stromelysin-1抗体和样本中的Stromelysin-1发生抗原抗体反应而得的信号检测试剂。即,本发明适用于免疫检测试剂,如,乳胶粒子比浊凝集免疫检测法(LTIA)、酶联免疫检测法(EIA)、荧光酶联免疫检测法(FEIA)、电化学发光免疫检测法(ECLIA)、化学发光酶免检测法(CLEIA)等。使用本发明涉及的水溶液来检测样本中的Stromelysin-1时,需要使用包含免疫检测试剂的检测试剂盒。免疫检测试剂内含有抗Stromelysin-1抗体,特别是含有包被了抗Stromelysin-1抗体的不溶性载体的试剂更为适用。在使用乳胶粒子比浊凝集免疫检测法(LTIA)时,常用聚苯乙烯等乳胶粒子作为不溶性载体;而在酶联免疫检测法(EIA)、荧光酶联免疫检测法(FEIA)、电化学发光免疫检测法(ECLIA)、化学发光酶免检测法(CLEIA)中则常用磁性粒子。在使用免疫检测试剂检测患者血清等实际样本时,通过检测Stromelysin-1的浓度已知的标准品进行定标后,通过Spline、Logit-4等计算方法,使用上述各检测方法而得的信号(如,在LTIA法中即为⊿OD)来绘制标准曲线。此时,标准品的Stromelysin-1浓度不仅可以设定为1点,还可以设定为2~12点等呈阶梯性的多点浓度。此外,可在各浓度点中设定空白定标点,也可以直接使用蒸馏水等合适的材料来设定空白点。
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明,但并不用来限定本发明的实施范围。
生产例1~3、对比生产例1~3
调制标准品
(1)生产例1(用于实施例1、3)
向Protein Accession No.P08254(Tyr18-Cys477)加入His Tag序列后插入pDIA(增强导入基因表达的基因)来作为载体。
将其导入HEK293细胞,使之在试管中进行表达后,再使用Ni柱进行纯化,从而得到8.4mL的Stromelysin-1(A-1a)溶液。将此溶液用胰蛋白酶进行解离后,使用LCMS-8060(由株式会社岛津制作所制作)将同样解离过的BSA(66.5kDa)作为内标进行质谱法分析。将Stromelysin-1的分子量定为54.0kDa,将Stromelysin-1的特异氨基酸序列“PRCGXPD”设定为蛋白的检索结构域。使用Lab Solution(由株式会社岛津制作所制作)来对浓度进行定量,从而确定Stromelysin-1的溶液浓度为5.2μg/mL。
调制标准稀释液:将水作为溶媒,在pH已调至7.2的0.1M的HEPES缓冲液中,以使CaCl2的含量为1mM、使蔗糖为5%(w/w)、使Glycerol(甘油)(w/w)为10%、使BSA为3%(w/w)、使Proclin950为3%(w/w)为目标,溶解上述各成分来调制成标准稀释液。
使用上述标准稀释液来调制各浓度溶液,使Stromelysin-1的理论浓度分别达到0、100、400和1600ng/mL。将其作为本发明涉及的标准品1。
(2)生产例2(用于实施例2、4)
在生产例1中,除了使用ZnCl2来代替CaCl2外,其他均与生产例1相同,均为在本发明涉及的范围内制作标准品2。
(3)对比生产例1(用于对比实施例1、3)
在生产例1中没有使用CaCl2。除此以外,均和生产例1同样来调制对比标准品1。
(4)对比生产例2(用于对比实施例2、4)
在生产例1中使用了100mM的EDTA来代替1mM的CaCl2。除此之外,均和生产例1同样来调制对比标准品2。
(5)生产例3(实施例5~20)、对比生产例3(对比实施例5~15)
在生产例1中,使用了表3、4、5所记载的各类盐(浓度也已标明)来代替1mM CaCl2。除此之外,和生产例1同样来调制标准品及对比标准品。表中的符号“-”表示未使用CaCl2。
(6)生产例4(实施例21)、对比生产例4(对比实施例16~17)
调制Stromelysin-1(A-native):取Stromelysin-1为阳性的人混合血清18mL,置于1000mL的15mM EDTA/PBS磷酸缓冲液(pH7.4)中,在4℃条件下透析(Cat.#131345,SPECTRUM-LABS)18小时,如此重复透析3次。再放入2.5mM EDTA/50mM HEPES缓冲液(pH7.2)中,通过凝胶过滤法进行纯化(SuperDex 75,GE life-science),获得3.2μg/mL的Stromelysin-1共2.7mL。将其再置于1000mL的100mM HEPES缓冲液(pH7.2)中,在4℃条件下透析(Cat.#131345,SPECTRUM-LABS),18小时,如此重复透析3次,获得2.8μg/mL的Stromelysin-1共1.3mL。
在生产例2、对比生产例1、对比生产例2中,使用了上述Stromelysin-1(A-native)来代替Stromelysin-1(A-1a),除此以外均相同。
实施例1~4、对比实施例1~4
对比在添加2价金属离子过程中的Stromelysin-1标准品的反应性及稳定性;LTIA、ELISA
(1)调制试剂-A.LTIA
调制第一试剂;反应缓冲液
调制含有1%(w/w)的牛血清白蛋白、1%(w/w)氯化钠的200mMTris-HCl缓冲液(pH7.2)。
调制第二试剂;胶乳悬浊液
使用其粒子尺寸为300nm的聚苯乙烯胶乳(JSR生命科学株式会社生产)1g,使其吸附来源于小鼠骨髓细胞瘤的抗Stromelysin-1抗体0.03mg。离心除去上清后,在沉淀下来的乳胶微球中,加入含有1%(w/w)牛血清白蛋白的50mM HEPES液(pH7.2),在25℃条件下搅拌1小时后进行封闭处理。再次离心除去上清后,加入与(1)所述的第一试剂相同的缓冲液进行悬浊。调制含有0.1%(w/w)固态的包被了抗Stromelysin-1抗体粒子的悬浊液作为第二试剂。
(1)调制试剂-B.ELISA
调制第一试剂;反应缓冲液
调制含有2.5%(w/w)的牛血清白蛋白、含有1.8%(w/w)的氯化钠的50mM MES缓冲液(pH6.5)。
调制第二试剂;标识抗体溶液
在含有1%(w/w)牛血清白蛋白、1%(w/w)氯化钠的20mM HEPES缓冲液(pH7.2)中稀释HRP标记的抗Stromelysin-1抗体,使其浓度达到12μg/mL。
微板;包被抗Stromelysin-1抗体
向微板上各孔内装入抗Stromelysin-1抗体,使其浓度达到1μg/well,在4℃条件下包被24小时。加入含有1%(w/w)牛血清白蛋白的50mM HEPES液(pH7.2),在25℃条件下封闭2小时。使用50mM HEPES液(pH7.2)清洗4次,将抗Stromelysin-1抗体包被在微板上。
清洗液;微板清洗液
在磷酸缓冲液(pH7.4)中进行稀释,使Tween20为0.02%(w/w)。
显色底物;HRP反应底物
直接使用3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate Systemfor ELISA peroxidase substrate(Sigma)
反应终止液;HRP反应终止液
调制及使用0.5N硫酸。
(2)检测方法-A.LTIA
使用生化分析仪7180型(日立制作所公司生产)进行检测。检测条件如下:
向检测系统内加入第一试剂和样本,37℃加热约300秒后,加入第二试剂,检测约80秒后及约320秒后的吸光度差值(ΔOD),将此差值的10000倍作为吸光度的变化量。
将上述标准品1、标准品2、对比标准品1、对比标准品2作为样本进行检测。通过加速试验来确认标准品的保存稳定性。在Day-0(标准品调制首日)进行检测后,在37℃条件下保存14天。在保存过程中,分别在第7天(Day-7)、第14天(Day-14)进行检测。
(3)检测方法-B.ELISA
使用Sunrise Rainbow Thermo RC-R(TECAN)进行检测。手动进行清洗等操作,实验过程如下:
检测样本、加速实验的操作过程与检测方法-A.LTIA相同。
(4)检测结果-A.LTIA
对比实施例1及2与实施例1及2在Day-0(标准品调制首日)的反应性(ΔOD值)可以得知,
前者的反应性信号为后者的1/4程度。因此可以得出结论,在检测相同含量的Stromelysin-1时,是否含有2价金属对反应性具有显著影响。特别是与对比实施例1相比,从使用了EDTA来去除金属离子的对比实施例2与其具有相同倾向这一点能够得知,2价金属离子是提高Stromelysin-1的抗原性的重要因素。
另外,关于在Day-14/-1的反应性程度,对比实施例1及2与实施例1及2相比,前者的比例(Ratio)衰减至约0.40,而后者基本没有衰减。因此可以得出结论,2价金属对于维持Stromelysin-1的抗原稳定性具有重要作用。
表1在LTIA法检测中,通过向Stromelysin-1标准品中添加金属离子而产生的反应性和稳定性变化的比较
(3)检测结果-B.ELISA
与通过LTIA法检测的结果相同,关于对比实施例3及对比实施例4与实施例3及4的反应性(ΔOD值),后者在加入金属离子后的反应性较高。因此可以得出结论,无论检测平台为何,二价金属离子都是提高Stromelysin-1抗原性的重要因素。另外,在维持抗原稳定性方面,使用ELTIA法时也得到了同样的结果。
表2ELISA测定时在Stromelysin-1标准品中添加金属离子对反应性和稳定性的影响
对比实施例5~8、实施例5~10
标准品中的2价金属离子的浓度对Stromelysin-1标准品的反应性及稳定性的影响;LTIA
(1)试剂制作
实施例1~4、对比实施例1~4均以相同的组成及方法进行试剂的制作。
(2)检测方法
实施例1~4、对比实施例1~4均以相同的组成及方法进行检测。
检测样本:EDTA浓度为100mM的标准品(对比实施例6)、CaCl2浓度为0.01~5000mM的标准品(实施例5、6、7、对比实施例7)、ZnCl2浓度为0.01~4000mM的标准品(实施例8、9、10、对比实施例8)。作为对照,准备了不含添加物的标准品(对比实施例5)。为了确认标准品的保存稳定性,对其进行加速稳定实验。Day-0(标准品配制首日)检测后,37℃下存放14天,对第7天(Day-7)和第14天(Day-14)的标准品分别进行检测。
(3)检测结果
由实施例5~7和8~10可以得出,随着金属盐浓度的增加,反应性随之上升。从对比实施例7和8得出的结论是,空白值(抗原0ng/mL)时也会呈现出反应性,而这种反应性对重复性不利。因此,从重复性的角度来讲,前述的这种空白值时产生反应性的现象是不好的。综上得出,当添加的金属盐约为4M,即约500mg/mL以上时,反应性会变得不稳定。
表3LTIA测定时在Stromelysin-1标准品中添加不同浓度的金属离子对反应性和稳定性的影响
对比实施例9~13、实施例11~19
标准品中的不同2价金属离子对Stromelysin-1标准品的反应性的影响;LTIA
(1)调制试剂
实施例1~4、对比实施例1~4均以相同的组成及方法进行试剂的制作。
(2)检测方法
实施例1~4、对比实施例1~4均以相同的组成及方法进行检测。
检测样本:EDTA浓度为100mM的标准品(对比实施例10)、CaCl2浓度为1mM的标准品(实施例11)、ZnCl2浓度为1mM的标准品(实施例12)、MgCl2浓度为1mM的标准品(实施例13)、MnCl2浓度为1mM的标准品(实施例14)、CuCl2浓度为1mM的标准品(实施例15)、CoCl2浓度为1mM的标准品(实施例16)、CrCl2浓度为1mM的标准品(实施例17)、MgSO4浓度为1mM的标准品(实施例18)、FeSO4浓度为1mM的标准品(实施例19)。同时,准备了1价金属盐NaCl(对比实施例11)、KCl(对比实施例12)及3价金属盐Fe2(SO4)3(对比实施例13)。作为对照,准备了不含添加物的标准品(对比实施例9)。
(3)检测结果
从实施例11~19得知,不同种类的金属盐对标准品的反应性差异极小,结果基本上是一致的。尤其是实施例13和18可以证明这一点。实施例13和18为同种类金属,虽然两者的阴性离子不同,但两者呈现的效果是相同的。因此可以得出,与反应性相关的是金属种类本身。从对比实施例11~13反应性较低可得出,所添加的金属盐必须是2价金属盐。实施例19和对比实施例13也很好地证明了这一论点。实施例19和对比实施例13为同种阴性离子的同种类金属,但两者的化合价不同。结果只有实施例19(2价)呈现出了反应性。因此,这一结论更加证实了添加至标准品中的金属盐必须是2价金属盐。
表4标准品中添加不同种类的金属盐对反应性的影响
对比实施例14~17、实施例20~21
标准品中的Stromelysin-1的来源和添加2价金属离子对标准品的反应性的影响;LTIA
(1)试剂制作
实施例1~4、对比实施例1~4均以相同的组成及方法进行试剂的制作。
(2)检测方法
实施例1~4、对比实施例1~4均以相同的组成及方法进行检测。
检测样本为上述实施例中的HEK293重组表达出来的Recombinant Stromelysin-1和Stromelysin-1阳性人血清纯化出来的Native Stromelysin-1内分别添加100mM EDTA(对比实施例15、对比实施例17)、1mM ZnCl2(实施例20、实施例21)的标准品。作为对照,准备了不含添加物的标准品(对比实施例14、对比实施例16)。
(3)检测结果
从实施例20和实施例21得知,当纯化抗原作为标准品时,反应性与Stromelysin-1的来源无关,而是通过2价金属盐的添加,反应性得到上升。
表5标准品中Stromelysin-1的来源和添加2价金属离子对反应性的影响
通过上述实施例可以得出,在Stromelysin-1免疫检测法试剂标准品中添加2价金属盐可以改善其反应性和保存稳定性。这种效果的发挥跟金属盐种类、阴性离子种类以及Stromelysin-1的来源均无关,只要2价金属离子存在于标准品中,即可发挥该效果。
Claims (10)
1.一种水溶液,其特征在于,是以水为溶媒的缓冲液中添加Stromelysin-1和2价金属离子。
2.根据权利要求1所述的水溶液,其特征在于,2价金属离子包括Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cr2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Se2+、Mo2+、Sn2+中的至少一种;优选地,2价金属离子包括Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的水溶液,其特征在于,2价金属离子浓度为0.001mM~5000mM;优选地,2价金属离子浓度为0.01mM~4000mM;更优选地,2价金属离子浓度为0.1mM~2500mM。
4.根据权利要求1所述的水溶液,其特征在于,水溶液pH为6.0~9.0。
5.根据权利要求1所述的水溶液,其特征在于,Stromelysin-1为天然或人工合成。
6.根据权利要求1所述的水溶液,其特征在于,Stromelysin-1浓度为3ng/mL~2000ng/mL。
7.一种免疫检测用标准品,其特征在于,为权利要求1-6任一权利要求所述的水溶液,其Stromelysin-1浓度确定。
8.根据权利要求7所述的免疫检测用标准品,其特征在于,所述水溶液内还包括添加剂,所述添加剂包括蛋白稳定剂或/和防止蛋白发生凝集的添加剂或/和防腐剂。
9.一种检测Stromelysin-1的检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求7或8所述的免疫检测用标准品及含有抗Stromelysin-1抗体的免疫检测试剂;优选地,包括权利要求7或8所述的免疫检测用标准品及含有包被了抗Stromelysin-1抗体的不溶性载体的免疫检测试剂。
10.一种检测Stromelysin-1的检测方法,其特征在于,使用权利要求9所述的检测试剂盒来进行检测,并且其标准曲线是通过权利要求7或8所述的免疫检测用标准品绘制而成。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111157743A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-05-15 | 河南大学 | 一种金属离子-qlisa免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6242265B1 (en) * | 1989-01-19 | 2001-06-05 | Dade Behring Marburg Gmbh | Use of doubly or triply charged cations in immunochemical assays |
CN109239344A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-01-18 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品 |
-
2019
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6242265B1 (en) * | 1989-01-19 | 2001-06-05 | Dade Behring Marburg Gmbh | Use of doubly or triply charged cations in immunochemical assays |
CN109239344A (zh) * | 2018-09-30 | 2019-01-18 | 郑州安图生物工程股份有限公司 | 一种神经元特异性烯醇化酶含量测定用液态校准品 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
HOUSLEY, TJ等: "RECOMBINANT CHINESE-HAMSTER OVARY CELL MATRIX METALLOPROTEASE-3 (MMP-3, STROMELYSIN-1)", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
KONOPKA, JA等: "The Intracellular Effect of Relaxin on Female Anterior Cruciate Ligament Cells", 《AMERICAN JOURNAL OF SPORTS MEDICINE》 * |
OBATA, K等: "A ONE-STEP SANDWICH ENZYME-IMMUNOASSAY FOR HUMAN MATRIX METALLOPROTEINASE-3 (STROMELYSIN-1) USING MONOCLONAL-ANTIBODIES", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 * |
张开滋等: "《临床心力衰竭学》", 31 October 2014, 湖南科学技术出版社 * |
成军: "《肿瘤相关基因》", 31 December 2000 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111157743A (zh) * | 2020-01-06 | 2020-05-15 | 河南大学 | 一种金属离子-qlisa免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法 |
CN111157743B (zh) * | 2020-01-06 | 2021-01-22 | 河南大学 | 一种金属离子-qlisa免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法 |
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