CN111157743A - 一种金属离子-qlisa免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种金属离子‑QLISA免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法，属于体外诊断检测技术领域，所述试剂盒包括以下组分：包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、偶联抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液；所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中包括二价金属离子和三价金属离子。本发明提供的金属离子QLISA免疫检测信号放大试剂盒检测荧光可增强到2.5～4倍，灵敏度可增强到2～4倍；具有检测范围广且检测结果稳定准确的特点。

Description

一种金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断检测技术领域，尤其涉及一种金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
近些年来，由于量子点材料具有荧光效率高、稳定性高、Stockes位移较大、发射光谱窄而对称、单一波长多色激发等诸多优秀的荧光特性，基于量子点材料的检测技术已经得到了的极大的发展，被广泛的应用于食物中的有毒物质、超标物质、体内炎症因子、癌症因子和药物的定性定量检测。QLI SA方法灵敏度高，可进行定量检测，已被广泛应用于相关标志物的检测，例如，应用QDs作为荧光标记物的QLISA检测MON810玉米中的Cry1Ab蛋白(High Sensitive Detection of Cry1Ab Protein Using a Quantum Dot-Based Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay)、用QDs标记的抗体荧光免疫方法(FLISA)检测吗啡(Development of Quantum Dots-Labeled Antibody Flu orescence Immunoassaysfor the Detection of Morphine)，基于QLISA的免疫化学技术同时筛选谷物中的几种真菌毒素(Novel multiplex fluorescent i mmunoassays based on quantum dotnanolabels for mycotoxins determinati on)。
但量子点的性能仍然是影响检测结果的重要因素，有相关文献报道在一些含有金属离子的溶液中，量子点加入后会发生荧光猝灭，通过不同浓度金属离子使量子点发生荧光猝灭程度的强弱不同，实现对该特定金属离子的定量检测(例如Cd2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Ag+、Fe2+等)(Fluorescence sensor array based on amino acids-modulating quantum dotsfor the discrimination of metal ions)。但目前并未有关于金属离子影响生物检测方面的研究，而在生理环境中，或多或少会存在许多金属离子，它们作为人体的组成元素，在人体的糖、蛋白质、脂肪、生长因子、辅酶、激素等方面发挥着重要作用，例如，人体血浆中Ca2+和Mg2+的特征浓度非常接近，分别为1.16×10-6～1.32×10-6mol/mL和0.5×10-6～0.65×10-6mol/mL。因此，探究金属离子对量子点性质及生物检测结果的影响具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒，包括以下组分：
包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液；
所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中包括二价和三价金属离子。
优选的，所述羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体中的水溶性量子点选自CdSe/ZnS、ZnCdSeS/ZnS、ZnxCd1-xSe、ZnSe、CuInZnS、InP、Cu或Mn掺杂的ZnSe量子点中的一种；所述水溶性量子点的发射波长范围为400～800nm。
优选的，所述羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体中的羧基包覆水溶性量子点包括二氧化硅包覆的量子点QDs@SiO2，两亲性聚合物包覆的量子点QDs@PMAH或3-巯基丙酸修饰的量子点QDs@MPA。
优选的，所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中金属离子包括Ca2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+和Al3+中的一种或几种；金属离子在水溶性量子点标记的第二反应抗体中的浓度为5×10-7～3×10-5mol/mL。
优选的，所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中第二反应抗体的浓度为330～1000μg/mL，所述检测板上第一反应抗体的包被浓度为1～20μg/mL。
优选的，所述稀释液为含25％～35％(体积比)新生牛血清的8×10-6～1.2×10- 5mol/mL的磷酸盐缓冲液，所述稀释液的pH值为7.2～7.5，用于稀释样品、标准品和量子点标记的第二反应抗体；所述洗涤液为含0.04％～0.06％(体积比)吐温20的8×10-6～1.2×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的pH值为7.2～7.5。
本发明提供了所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将第一反应抗体与包被液混合后，包被检测板，弃去液体、洗涤、封闭后获得包被第一反应抗体的检测板；
将表面包覆羧基的水溶性量子点活化、与第二反应抗体偶联后，与金属离子混合获得羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体；
将所述包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液组装获得试剂盒。
优选的，所述表面包覆羧基的水溶性量子点活化为将含表面包覆羧基的水溶性量子点的BS溶液、含S-NHS的BS溶液和含EDC的MES溶液按照体积比(16～18):1:1混合，超声处理、固液分离；收集固相组分为活化后的表面包覆羧基的水溶性量子点；
所述表面包覆羧基的水溶性量子点的BS溶液中表面包覆羧基的水溶性量子点的浓度为0.4～0.45mg/mL；所述S-NHS的BS溶液中S-NHS的浓度为40～60mg/mL；所述EDC的MES溶液中EDC的浓度为15～20mg/mL。
本发明提供了所述试剂盒在检测蛋白质中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的一种金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒，在所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中加入金属离子，利用二价金属离子或三价金属离子可以连接两个或三个表面包覆羧基的量子点的特性，将信号放大；并且含金属离子的无机盐能够增大抗原抗体结合率，相比于不加离子的QLISA方法，本发明提供的金属离子-QLISA检测荧光可增强到2.5～4倍，灵敏度可增强到2～4倍。实施例中通过绘制CRP标准品的标准曲线，表明对于CRP的检测范围是1～1000ng/mL，R2接近于1，由此可见，本发明提供的金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒具有检测范围广且检测结果稳定准确的特点。
附图说明
图1为QD-QLISA与Ca2+-QLISA操作流程图；
图2为QD-QLISA与Ca2+-QLISA在96板孔中抗体-抗原-量子点标记抗体结合示意图；
图3为激发波长为450nm条件下QLISA与Ca2+-QLISA在96板孔中荧光显微镜对比图；
图4为激发波长为450nm条件下QLISA与Ca2+-QLISA在检测范围是1～1000ng/mL检测CRP标准品的荧光发射图谱；
图5为QLISA与Ca2+-QLISA在检测范围是1～1000ng/mL检测CRP标准品的标准曲线；
图6为CRP标准品浓度为500ng/mL时，加入7种金属离子的21种金属离子-QLISA与原QLISA荧光强度对比图以及其他炎症因子(SAA和PCT)标准品浓度为500ng/mL时，加入3种金属离子的9种金属离子-QLISA与原QLISA荧光强度对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒，包括以下组分：包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液；所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中包括金属离子。
在本发明中，所述试剂盒中包括羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体；在本发明中，所述羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体中的水溶性量子点优选的选自CdSe/ZnS、ZnCdSeS/ZnS、ZnxCd1-xSe、ZnSe、CuInZnS、InP、Cu或Mn掺杂的ZnSe量子点中的一种；所述水溶性量子点的发射波长范围优选为400～800nm。
在本发明中，所述羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体中的羧基包覆水溶性量子点包括二氧化硅包覆的量子点QDs@SiO2，两亲性聚合物包覆的量子点QDs@PMAH或3-巯基丙酸修饰的量子点QDs@MPA。本发明对所述二氧化硅包覆的量子点QDs@SiO2，两亲性聚合物包覆的量子点QDs@PMAH或3-巯基丙酸修饰的量子点QDs@MPA的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品或自行制备均可。本发明以二氧化硅的包覆法(硅烷偶联剂)用反相微乳液法制备表面羧基化的CdSe/ZnS量子点为例，加以说明。基于二氧化硅的包覆法(硅烷偶联剂)制备表面羧基化的水相量子点的制备方法优选包括以下步骤：
Ⅰ.向CdSe/ZnS量子点环己烷溶液依次加入正硅酸乙酯(TEOS)、氨水进行反应，搅拌，用乙醇溶液清洗，固液分离，收集沉淀；
Ⅱ.将所述沉淀溶解后，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(ATPES)和氨水溶液，搅拌，加入正己烷，固液分离，得到沉淀；
Ⅲ.将所述沉淀溶解，加入含丁二酸酐的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，搅拌，固液分离，得到沉淀；
Ⅳ.将所述沉淀与氨水溶液混合，超声，固液分离，沉淀为表面羧基化的水相量子点CdSe/ZnS。
在本发明中，所述CdSe/ZnS量子点环己烷溶液的浓度优选为8～12mg/mL，更优选为10mg/mL；所述环己烷溶液为8mL环己烷溶解有1.32g表面活性剂CO-520的环己烷。在本发明中，步骤I中所述搅拌的时间优选为30分钟～24小时。在本发明中，所述TEOS的加入体积优选为0.16mL；所述氨水溶液的加入体积优选为0.45mL，所述氨水溶液中氨水和水的体积比优选为1:1。
在本发明中，步骤II中优选的用4mL乙醇来溶解沉淀；所述ATPES添加体积优选为0.1mL；步骤II中所述氨水的添加体积优选为0.08mL；所述搅拌的时间优选为24小时；所述正己烷的加入量优选为3mL。
在本发明中，步骤III中优选的用乙醇来溶解沉淀；所述含DMF溶液的添加量优选为0.15mL；所述含DMF溶液的配制方法优选为将15mg的丁二酸酐溶解到0.15mL的N，N-二甲基甲酰胺。
在本发明中，所述步骤IV中所述氨水溶液的体积优选为0.04mL；所述超声的功率优选为240w；所述超声的时间优选为30分钟。
在本发明中，上述步骤中所述固液分离方式优选为离心；所述离心的转速优选为1×104～2×104rpm，更优选为1.2×104～1.8×104rpm；所述离心的时间优选为3～15分钟，更优选为5～10分钟。在本发明中，所述清洗用溶液优选为乙醇溶液；所述乙醇溶液为分析纯乙醇(乙醇含量大于99.7％)，所述清洗用溶液的使用体积优选为10～20mL。
在本发明中，所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中第二反应抗体的浓度优选为330～1×103μg/mL，更优选为400～900μg/mL。
在本发明中，所述金属离子优选的包括Ca2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Fe2+二价金属离子和Fe3+、Al3+三价金属离子。在本发明中，所述二价金属离子优选的以无机盐溶液的形式存在；在本发明中，所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中金属离子的浓度优选为5×10-7～3×10-5mol/mL。在本发明中，所述Ca2+优选的以CaCl2的形式存在；所述Mg2+优选的以MgCl2的形式存在；所述Fe2+优选的以FeSO4的形式存在；所述Mn2+优选的以MnCl2的形式存在；所述Fe3+优选的以FeCl3的形式存在；所述Al3+优选的以AlCl3的形式存在。在本发明中，所述羧基包覆的水溶性量子点表面最外层为COO-，带有负电荷；而金属离子带有两个或三个正电荷。将两者混合后，由于正负电荷相互吸引，羧基包覆的水溶性量子点会呈现相互连接状态，从而放大信号；与此同时，无机盐的加入又会很大程度增强抗原抗体结合的疏水作用力，因此，无机盐形式的二价或三价金属离子的加入能够增强了抗原和抗体的结合能力。
在本发明中，所述试剂盒还包括包被第一反应抗体的检测板；所述检测板上第一反应抗体的包被浓度优选为1～20μg/mL，更优选为5～15μg/mL。本发明对所述检测板的来源和规格没有特殊要求，采用本领域常规市售的检测板即可。
在本发明中，所述试剂盒还包括偶联用的第二反应抗体；所述偶联用的第二反应抗体优选为单克隆抗体；本发明对所述偶联用第二反应抗体的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
在本发明中，所述试剂盒还包括稀释液；在本发明中，所述稀释液优选为含25％～35％(体积比)新生牛血清的8×10-6～1.2×10-5mol/L的磷酸盐缓冲液，更优选为含30％(体积比)新生牛血清的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液；所述稀释液的pH值优选为7.2～7.5，更优选为7.4。在本发明中，所述稀释液用于稀释量子点标记的第二反应抗体、样品和标准品。
在本发明中，所述试剂盒还包括标准品溶液，在本发明中；所述标准品溶液为包括待测物质的溶液；本发明对所述标准品溶液的浓度没有特殊限定，在使用时，可以根据需要进行稀释。
在本发明中，所述试剂盒还包括洗涤液；所述洗涤液优选为为含0.04％～0.06％(体积比)吐温20的8×10-6～1.2×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，更优选为含0.05％(体积比)吐温20的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液的pH值优选为7.2～7.5，更优选为7.4。
本发明提供了所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将第一反应抗体与包被液混合后，包被检测板，弃去液体、洗涤、封闭后获得包被第一反应抗体的检测板；
将表面包覆羧基的水溶性量子点活化、与第二反应抗体偶联后，与金属离子混合获得羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体；
将所述包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液组装获得试剂盒。
在本发明中，将第一反应抗体与包被液混合获得包被液体。在本发明中，所述包被液优选为4×10-5～6×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液，更优选为5×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液；所述包被液的pH值优选为9.6。本发明在获得所述包被液体后，将所述包被液体注入检测板的检测孔中进行包被；每孔的包被体积优选为0.1mL；在本发明中，包被的时间优选为10～14小时，更优选为12小时；所述包被的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。本发明在所述包被结束后，弃去液体、洗涤、封闭后获得包被第一反应抗体的检测板。在本发明中，所述封闭液优选为含有0.5％(质量比)牛血清白蛋白、0.5％(质量比)酪蛋白和5％(质量比)蔗糖的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液；所述封闭液的pH值优选为7.4。在本发明中，所述封闭的时间优选为20～28小时，更优选为24小时；所述封闭的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。本发明在所述封闭后，优选的甩去封闭液获得包被第一反应抗体的检测板；所述包被第一反应抗体的检测板优选的恒温恒湿干燥后密封保存；所述保存的温度优先为3～5℃，更优选为4℃。
在本发明中，将表面包覆羧基的水溶性量子点活化、与第二反应抗体偶联后，与金属离子混合获得羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体。
在本发明中，所述表面包覆羧基的水溶性量子点活化为将表面包覆羧基的水溶性量子点的BS溶液、S-NHS的BS溶液和EDC的MES溶液混合、超声处理、固液分离；收集固相组分为活化后的表面包覆羧基的水溶性量子点。在本发明中，所述表面包覆羧基的水溶性量子点的BS溶液、S-NHS的BS溶液和EDC的MES溶液混合的体积比优选为(16～18):1:1；更优选为17:1:1。在本发明中，所述表面包覆羧基的水溶性量子点的BS溶液中表面包覆羧基的水溶性量子点的浓度优选为0.4～0.45mg/mL，更优选为0.42mg/mL；所述S-NHS的BS溶液中S-NHS的浓度为40～60mg/mL，更优选为49mg/mL所述EDC的MES溶液中EDC的浓度优选为15～20mg/mL，更优选为17mg/mL。
在本发明中，将表面包覆羧基的水溶性量子点活化后与第二反应抗体偶联。在本发明中，所述偶联优选为将所述活化后的表面包覆羧基的水溶性量子点与第二反应抗体混合；所述偶联的温度为3～5℃，更优选为4℃；所述偶联的时间优选为10～14小时，更优选为12小时；所述偶联优选的在旋转培养器中进行。本发明在所述偶联结束后，优选的加入终止剂和封闭剂，终止反应。本发明对所述终止剂和封闭剂没有特殊限定，采用本领域常规的终止剂和封闭剂即可。
在本发明中，将所述包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液组装获得试剂盒；本发明优选的对所述组装后的试剂盒进行包装，配置说明书。
本发明提供了所述试剂盒在检测蛋白质中的应用。本发明对所述蛋白质的种类没有特殊限定，能够发生抗原抗体结合反应的蛋白质均可进行检测；包括蛋白类的生物标志物，例如C-反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和降钙素原(PCT)；心肌类标志物，例如心肌肌钙蛋白I(cTnI)、B型尿钠肽(BNP)和心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)等；激素类物质，例如人绒毛膜促性腺激素(HCG)和促黄体生成素(LH)。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
Ca2+-QLISA(QDs@SiO2)的试剂盒制备和检测
(一)试剂盒的组成
包被用第一反应抗体：CRP单克隆抗体1，购自北京百川飞虹生物科技有限公司，产品目录号为7D9，浓度为2.2mg/mL。
偶联用第二反应抗体：CRP单克隆抗体2，购自杭州启泰有限公司，产品目录号为MC02，浓度为5mg/mL。
羧基包覆的水溶性量子点标记的第二反应抗体：CaCl2加入QDs@SiO2结合的CRP单克隆孔抗体2，CaCl2浓度为5×10-6mol/mL。
标准品：CRP标准品购自杭州启泰有限公司，用稀释液稀释至相关浓度。
洗涤液：含有0.05％吐温20(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
稀释液：含有30％新生牛血清(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
量子点标记的第二反应抗体保存液：含有0.5％牛血清白蛋白(体积比)的5×10- 6mol/mL硼砂缓冲液，pH值为8.0。
包被液：5×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。
封闭液：含有0.5％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白和5％蔗糖(质量比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
(二)羧基包覆的水溶性量子点标记的第二反应抗体Ca2+-QD-mAb的制备方法
(1)活化：取0.075mL表面包覆羧基的水溶性量子点(5mg/mL)加入到0.825mLBS(5mMpH7.2)溶液中，加入0.05mL浓度为49mg/mL的S-NHS的5×10-6mol/mLBS(pH7.2)溶液与0.05mL浓度为17mg/mL的EDC的5×10-6mol/mLMES(pH5.5)溶液，涡旋混匀，4℃下超声活化10分钟。将体积增容至1.4mL，4℃下，使用低温超速离心机2×104rpm离心分离30分钟，弃上清液。
(2)偶联：将0.4mL的5×10-6mol/mLBS(pH8.0)加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入9.6×10-3mL(5.2mg/mL)CRP抗体2。涡旋混匀后，置于旋转培养器4℃过夜反应。分别加入终止剂(0.006mL，乙醇胺)和封闭剂(0.025mL，10％B2)混匀，室温下，置于旋转培养器上反应30分钟，扩容至1.4mL，4℃低温2×104rpm离心分离30分钟，弃上清。加入5×10-6mol/mLBS(pH9.0)复溶，离心弃上清。加入量子点标记的第二反应抗体保存液，重悬至0.075mL。待实验进行时以1:50体积比用稀释液稀释，加入CaCl2使得Ca2+浓度为5×10- 6mol/mL，则为Ca2+-QD-mAb。
(三)试剂盒的制备
(1)包被第一反应抗体的检测板的制备方法：用包被液稀释包被抗体，确定第一反应抗体包被浓度为5μg/mL，每孔加入0.1mL，4℃包被过夜。甩去包被液后用洗涤液洗三遍，在吸水纸上拍干。每孔加入1.1mL封闭液后进行封闭，4℃孵育24小时。甩去封闭液，在吸水纸上拍干。放入恒温恒湿干燥箱中干燥24小时。之后置于密封袋中，放入4℃冰箱中保存。
(四)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出酶标板，恢复至室温。用样品稀释液稀释两份CRP标准品至目标浓度，例如浓度的CRP标准品溶液：0、1、5、10、50、100、500、1000ng/mL，混合后，每孔加入0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30分钟；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用稀释液稀释QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL；之后用稀释液稀释Ca2+-QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育80分钟。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用荧光酶标仪检测数据，选择顶读、反射模式，激发光为450nm，测荧光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP标准品的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
结果如图4和图5所示。根据绘制CRP标准曲线可知，用QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝16863+195X，R2＝0.9962，最低检测限(LOD)＝0.96ng/mL。
根据绘制CRP标准曲线可知，用Ca2+-QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝27262+460X，R2＝0.9976，最低检测限(LOD)＝0.23ng/mL。
实施例2
Mg2+-QLISA(QDs@SiO2)的试剂盒制备和检测
包被用第一反应抗体：CRP单克隆抗体1，购自北京百川飞虹生物科技有限公司，产品目录号为7D9，浓度为2.2mg/mL。
偶联用第二反应抗体：CRP单克隆抗体2，购自杭州启泰有限公司，产品目录号为MC02，浓度为5mg/mL。
羧基包覆的水溶性量子点标记的第二反应抗体：MgCl2加入QDs@SiO2结合的CRP单克隆孔抗体2，MgCl2浓度为3×10-5mol/mL。
标准品：CRP标准品购自杭州启泰有限公司，用稀释液稀释至相关浓度。
洗涤液：含有0.05％吐温20(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
稀释液：含有30％新生牛血清(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
量子点标记的第二反应抗体保存液：含有0.5％牛血清白蛋白(体积比)的5×10- 6mol/mL硼砂缓冲液，pH值为8.0。
包被液：5×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。
封闭液：含有0.5％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白和5％蔗糖(质量比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
(二)Mg2+-QD-mAb的制备方法
(1)活化：取0.75mL表面包覆羧基的水溶性量子点(5mg/mL)加入到0.825mL的BS(5mMpH7.2)溶液中，加入0.05mL浓度为49mg/mL的S-NHS的5×10-6mol/mL的BS(pH7.2)溶液与0.05mL浓度为17mg/mL的EDC的5×10-6mol/mL的MES(pH5.5)溶液，涡旋混匀，4℃下超声活化10分钟。将体积增容至1.4mL，4℃下，使用低温超速离心机2×104rpm离心分离30分钟，弃上清液。
(2)偶联：将0.4mL的5×10-6mol/mL的BS(pH8.0)加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入9.6×10-6mL(5.2mg/mL)CRP抗体2。涡旋混匀后，置于旋转培养器4℃过夜反应。分别加入终止剂(0.006mL，乙醇胺)和封闭剂(0.025mL，10％B2)混匀，室温下，置于旋转培养器上反应30分钟，扩容至1.4mL，4℃低温2×104rpm离心分离30分钟，弃上清。加入5×10-6mol/mL BS(pH9.0)复溶，离心弃上清。加入量子点标记的第二反应抗体保存液，重悬至0.075mL。待实验进行时以1:50体积比用稀释液稀释，加入MgCl2使得Mg2+浓度为3×10-5mol/mL，则为Mg2+-QD-mAb。
(三)试剂盒的制备
(1)包被第一反应抗体检测板的制备方法：用包被液稀释包被抗体，确定第一反应抗体的包被浓度为5μg/mL，每孔加入0.1mL，4℃包被过夜。甩去包被液后用洗涤液洗三遍，在吸水纸上拍干。每孔加入0.1mL封闭液后进行封闭，4℃孵育24小时。甩去封闭液，在吸水纸上拍干。放入恒温恒湿干燥箱中干燥24小时。之后置于密封袋中，放入4℃冰箱中保存。
(四)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出酶标板，恢复至室温。用样品稀释液稀释两份CRP标准品至目标浓度，例如浓度的CRP标准品溶液：0、1、5、10、50、100、500、1000ng/mL，混合后，每孔加入0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30分钟；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用稀释液稀释QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL；之后用稀释液稀释Mg2+-QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育80分钟。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用荧光酶标仪检测数据，选择顶读、反射模式，激发光为405nm，测荧光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP标准品的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
绘制CRP标准曲线可知，用QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝16863+195X，R2＝0.9962，LOD＝0.96ng/mL。
绘制CRP标准曲线可知，用Mg2+-QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝20610+545X，R2＝0.9921，LOD＝0.17ng/mL。
实施例3
Fe2+-QLISA(QDs@SiO2)的试剂盒制备和检测
包被用第一反应抗体：CRP单克隆抗体1，购自北京百川飞虹生物科技有限公司，产品目录号为7D9，浓度为2.2mg/mL。
偶联用第二反应抗体：CRP单克隆抗体2，购自杭州启泰有限公司，产品目录号为MC02，浓度为5mg/mL。
羧基包覆的水溶性量子点标记的第二反应抗体：FeSO4加入QDs@SiO2结合的CRP单克隆孔抗体2，FeSO4浓度为1×10-6mol/mL。
标准品：CRP标准品购自杭州启泰有限公司，用稀释液稀释至相关浓度。
洗涤液：含有0.05％吐温20(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
稀释液：含有30％新生牛血清(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
量子点标记的第二反应抗体保存液：含有体积比0.5％牛血清白蛋白的5×10- 6mol/mL硼砂缓冲液，pH值为8.0。
包被液：5×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。
封闭液：含有0.5％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白和5％蔗糖(质量比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
(二)Fe2+-QD-mAb的制备方法
(1)活化：取0.075mL表面包覆羧基的水溶性量子点(5mg/mL)加入到0.825mL的BS(5mMpH7.2)溶液中，加入0.05mL浓度为49mg/mL的S-NHS的5×10-6mol/mL的BS(pH7.2)溶液与0.05mL浓度为17mg/mL的EDC的5×10-6mol/mL的MES(pH5.5)溶液，涡旋混匀，4℃下超声活化10分钟。将体积增容至1.4mL，4℃下，使用低温超速离心机2×104rpm离心分离30分钟，弃上清液。
(2)偶联：将0.4mL的5×10-6mol/mL的BS(pH8.0)加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入9.6×10-3mL(5.2mg/mL)CRP抗体2。涡旋混匀后，置于旋转培养器4℃过夜反应。分别加入终止剂(0.006mL，乙醇胺)和封闭剂(0.025mL，10％B2)混匀，室温下，置于旋转培养器上反应30分钟，扩容至1.4mL，4℃低温2×104rpm离心分离30分钟，弃上清。加入5×10-6mol/mL BS(pH9.0)复溶，离心弃上清。加入量子点标记的第二反应抗体保存液，重悬至0.075mL。待实验进行时以1:50体积比用稀释液稀释，加入FeSO4使得Fe2+浓度为1×10-6mol/mL，则为Fe2+-QD-mAb。
(三)试剂盒的制备
(1)包被第一反应抗体检测板的制备方法：用包被液稀释包被抗体，确定第一反应抗体包被浓度为5μg/mL，每孔加入0.1mL，4℃包被过夜。甩去包被液后用洗涤液洗三遍，在吸水纸上拍干。每孔加入0.11mL封闭液后进行封闭，4℃孵育24小时。甩去封闭液，在吸水纸上拍干。放入恒温恒湿干燥箱中干燥24小时。之后置于密封袋中，放入4℃冰箱中保存。
(四)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出酶标板，恢复至室温。用样品稀释液稀释两份CRP标准品至目标浓度，例如浓度的CRP标准品溶液：0、1、5、10、50、100、500、1000ng/mL，混合后，每孔加入0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30分钟；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用稀释液稀释QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL；之后用稀释液稀释Fe2+-QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育80分钟。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用荧光酶标仪检测数据，选择顶读、反射模式，激发光为405nm，测荧光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP标准品的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
绘制CRP标准曲线可知，用QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝16863+195X，R2＝0.9962，LOD＝0.96ng/mL。
绘制CRP标准曲线可知，用Fe2+-QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝23264+667X，R2＝0.9872，LOD＝0.61ng/mL。
实施例4
Ca2+-QLISA(QDs@PMAH)的试剂盒制备和检测
(一)试剂盒的组成
包被用第一反应抗体：CRP单克隆抗体1，购自北京百川飞虹生物科技有限公司，产品目录号为7D9，浓度为2.2mg/mL。
偶联用第二反应抗体：CRP单克隆抗体2，购自杭州启泰有限公司，产品目录号为MC02，浓度为5mg/mL。
羧基包覆的水溶性量子点标记的第二反应抗体：CaCl2加入QDs@PMAH结合的CRP单克隆孔抗体2，CaCl2浓度为5×10-6mol/mL。
标准品：CRP标准品购自杭州启泰有限公司，用稀释液稀释至相关浓度。
洗涤液：含有0.05％吐温20(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
稀释液：含有30％新生牛血清(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
量子点标记的第二反应抗体保存液：含有0.5％牛血清白蛋白(体积比)的5×10- 6mol/mL硼砂缓冲液，pH值为8.0。
包被液：5×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。
封闭液：含有0.5％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白和5％蔗糖(质量比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
(二)Ca2+-QD-mAb的制备方法
(1)活化：取0.075mL表面包覆羧基的水溶性量子点(5mg/mL)加入到0.825mL的BS(5mMpH7.2)溶液中，加入0.05mL浓度为49mg/mL的S-NHS的5×10-6mol/mL的BS(pH7.2)溶液与0.05mL浓度为17mg/mL的EDC的5×10-6mol/mL MES(pH5.5)溶液，涡旋混匀，4℃下超声活化10分钟。将体积增容至1.4mL，4℃下，使用低温超速离心机2×104rpm离心分离30分钟，弃上清液。
(2)偶联：将0.4mL的5×10-6mol/mL的BS(pH8.0)加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入9.6×10-3mL(5.2mg/mL)CRP抗体2。涡旋混匀后，置于旋转培养器4℃过夜反应。分别加入终止剂(0.006mL，乙醇胺)和封闭剂(0.025mL，10％B2)混匀，室温下，置于旋转培养器上反应30分钟，扩容至1.4mL，4℃低温2×104rpm离心分离30分钟，弃上清。加入5×10-6mol/mL BS(pH9.0)复溶，离心弃上清。加入量子点标记的第二反应抗体保存液，重悬至0.075mL。待实验进行时以1:50体积比用稀释液稀释，加入CaCl2使得Ca2+浓度为5×10-6mol/mL，则为Ca2+-QD-mAb。
(三)试剂盒的制备
(1)包被第一反应抗体检测板的制备方法：用包被液稀释包被抗体，确定第一反应抗体包被浓度为5μg/mL，每孔加入0.1mL，4℃包被过夜。甩去包被液后用洗涤液洗三遍，在吸水纸上拍干。每孔加入0.11mL封闭液后进行封闭，4℃孵育24小时。甩去封闭液，在吸水纸上拍干。放入恒温恒湿干燥箱中干燥24小时。之后置于密封袋中，放入4℃冰箱中保存。
(四)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出酶标板，恢复至室温。用样品稀释液稀释两份CRP标准品至目标浓度，例如浓度的CRP标准品溶液：0、1、5、10、50、100、500、1000ng/mL，混合后，每孔加入0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30分钟；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用稀释液稀释QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL；之后用稀释液稀释Ca2+-QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育80分钟。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用荧光酶标仪检测数据，选择顶读、反射模式，激发光为450nm，测荧光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP标准品的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
结果如图4和图5所示。根据绘制CRP标准曲线可知，用QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝26269.72+735.90X-0.33X2，R2＝0.9995，LOD＝0.94ng/mL。
根据绘制CRP标准曲线可知，用Ca2+-QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝27959.99+916.13X-0.41X2，R2＝0.9786，LOD＝0.52ng/mL。
实施例5
Fe3+-QLISA(QDs@SiO2)的试剂盒制备和检测
(一)试剂盒的组成
包被用第一反应抗体：CRP单克隆抗体1，购自北京百川飞虹生物科技有限公司，产品目录号为7D9，浓度为2.2mg/mL。
偶联用第二反应抗体：CRP单克隆抗体2，购自杭州启泰有限公司，产品目录号为MC02，浓度为5mg/mL。
荧光标记的抗体2：FeCl3加入QDs@SiO2结合的CRP单克隆孔抗体2，FeCl3浓度为5×10-7mol/mL。
标准品：CRP标准品购自杭州启泰有限公司，用稀释液稀释至相关浓度。
洗涤液：含有0.05％吐温20的1×10-5mol/mL(体积比)的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
稀释液：含有30％新生牛血清(体积比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
量子点标记的第二反应抗体保存液：含有0.5％牛血清白蛋白(体积比)的5×10- 6mol/mL硼砂缓冲液，pH值为8.0。
包被液：5×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液，pH值为9.6。
封闭液：含有0.5％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白和5％蔗糖(质量比)的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。
(二)Fe3+-QD-mAb的制备方法
(1)活化：取0.075mL表面包覆羧基的水溶性量子点(5mg/mL)加入到0.825mL的BS(5mMpH7.2)溶液中，加入0.05mL浓度为49mg/mL的S-NHS的5×10-6mol/mL的BS(pH7.2)溶液与0.05mL浓度为17mg/mL的EDC的5×10-6mol/mLMES(pH5.5)溶液，涡旋混匀，4℃下超声活化10分钟。将体积增容至1.4mL，4℃下，使用低温超速离心机2×104rpm离心分离30分钟，弃上清液。
(2)偶联：将0.4mL的5×10-6mol/mL的BS(pH8.0)加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入9.6×10-3mL(5.2mg/mL)CRP抗体2。涡旋混匀后，置于旋转培养器4℃过夜反应。分别加入终止剂(0.006mL，乙醇胺)和封闭剂(0.025mL，10％B2)混匀，室温下，置于旋转培养器上反应30分钟，扩容至1.4mL，4℃低温2×104rpm离心分离30分钟，弃上清。加入5×10-6mol/mL BS(pH9.0)复溶，离心弃上清。加入量子点标记的第二反应抗体保存液，重悬至0.075mL。待实验进行时以1:50体积比用稀释液稀释，加入使得FeCl3浓度为5×10-7mol/mL，则为Fe3+-QD-mAb。
(三)试剂盒的制备
(1)包被第一反应抗体检测板的制备方法：用包被液稀释包被抗体，确定第一反应抗体包被浓度为5μg/mL，每孔加入0.1mL，4℃包被过夜。甩去包被液后用洗涤液洗三遍，在吸水纸上拍干。每孔加入0.11mL封闭液后进行封闭，4℃孵育24小时。甩去封闭液，在吸水纸上拍干。放入恒温恒湿干燥箱中干燥24小时。之后置于密封袋中，放入4℃冰箱中保存。
(四)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出酶标板，恢复至室温。用样品稀释液稀释两份CRP标准品至目标浓度，例如浓度的CRP标准品溶液：0、1、5、10、50、100、500、1000ng/mL，混合后，每孔加入0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30分钟；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用量子点标记的第二反应抗体稀释液稀释QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL；之后用量子点标记的第二反应抗体稀释液稀释Ca2+-QD-mAb，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育80分钟。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用荧光酶标仪检测数据，选择顶读、反射模式，激发光为450nm，测荧光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP标准品的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
结果如图4和图5所示。根据绘制CRP标准曲线可知，用QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝99.9856+17.1375X，R2＝0.9903，LOD＝0.96ng/mL。
根据绘制CRP标准曲线可知，用Fe3+-QD-mAb检测CRP蛋白的检测范围是1～1000ng/mL，标准曲线是Y＝145.4865+20.3987X，R2＝0.9946，LOD＝0.78ng/mL。
实施例6
配置浓度为500ng/mL的CRP标准品，分别加入QDs@SiO2标记的QD-mAb和含金属离子(Mg2+、Ba2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+)的金属离子-QD-mAb，同条件下对比其检测荧光，金属离子-QLISA荧光强度均高于未加入金属离子的QLISA荧光强度。
配置浓度为500ng/mL的CRP标准品，分别加入QDs@PMAH标记的QD-mAb和含金属离子(Mg2+、Ba2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+)的金属离子-QD-mAb，同条件下对比其检测荧光，金属离子-QLISA荧光强度均高于原始QLISA荧光强度。
配置浓度为500ng/mL的CRP标准品，分别加入QDs@MPA标记的QD-mAb和含金属离子(Mg2+、Ba2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+)的金属离子-QD-mAb，同条件下对比其检测荧光，除Fe3 +、Al3+以外的金属离子-QLISA荧光强度均高于原始QLISA荧光强度。
配置浓度为500ng/mL的CRP、SAA、PCT标准品，分别加入QDs@SiO2标记的QD-mAb和含金属离子(Mg2+、Ba2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、Fe3+、Al3+)的金属离子-QD-mAb，同条件下对比其检测荧光，金属离子-QLISA荧光强度均高于原始QLISA荧光强度。
上述结果见图6。
由上述实施例可知，本发明提供的金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒检测荧光可增强到2.5～4倍，灵敏度可增强到2～4倍。本发明提供的金属离子-QLISA免疫检测信号放大，所述试剂盒具有检测范围广且检测结果稳定准确的特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种金属离子-QLISA免疫检测信号放大试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液；
所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中包括二价金属离子或三价金属离子。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体中的水溶性量子点选自CdSe/ZnS、ZnCdSeS/ZnS、ZnxCd1-xSe、ZnSe、CuInZnS、InP、Cu或Mn掺杂的ZnSe量子点中的一种；所述水溶性量子点的发射波长范围为400～800nm。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体中的羧基包覆水溶性量子点包括二氧化硅包覆的量子点QDs@SiO2，两亲性聚合物包覆的量子点QDs@PMAH或3-巯基丙酸修饰的量子点QDs@MPA。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中金属离子包括Ca2+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+和Al3+中的一种或几种；金属离子在水溶性量子点标记的第二反应抗体中的浓度为5×10-7～3×10-5mol/mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述水溶性量子点标记的第二反应抗体中第二反应抗体的浓度为330～1000μg/mL，所述检测板上第一反应抗体的包被浓度为1～20μg/mL。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为含25％～35％(体积比)新生牛血清的8×10-6～1.2×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，所述稀释液的pH值为7.2～7.5，用于稀释样品、标准品和量子点标记的第二反应抗体；所述洗涤液为含(体积比)0.04％～0.06％吐温20的8×10-6～1.2×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的pH值为7.2～7.5。
7.权利要求1～6任意一项所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
将第一反应抗体与包被液混合后，包被检测板，弃去液体、洗涤、封闭后获得包被第一反应抗体的检测板；
将表面包覆羧基的水溶性量子点活化、与第二反应抗体偶联后，与金属离子混合获得羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体；
将所述包被第一反应抗体的检测板、羧基包覆水溶性量子点标记的第二反应抗体、稀释液、标准品溶液和洗涤液组装获得试剂盒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述表面包覆羧基的水溶性量子点活化为将含表面包覆羧基的水溶性量子点的BS溶液、含S-NHS的BS溶液和含EDC的MES溶液按照体积比(16～18):1:1混合，超声处理、固液分离；收集固相组分为活化后的表面包覆羧基的水溶性量子点；
所述表面包覆羧基的水溶性量子点的BS溶液中表面包覆羧基的水溶性量子点的浓度为0.4～0.45mg/mL；所述S-NHS的BS溶液中S-NHS的浓度为40～60mg/mL；所述EDC的MES溶液中EDC的浓度为15～20mg/mL。
9.权利要求1～6任意一项所述试剂盒在检测蛋白质中的应用。
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