CN111208289A - 一种基于荧光量子点的三维生物检测体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于荧光量子点的三维生物检测体系及其制备方法和应用，属于体外诊断检测领域。本发明提供的三维生物检测体系利用水溶性荧光量子点作为荧光探针，结合三维结构作为检测基底，利用“包被抗体‑待测抗原‑荧光量子点标记抗体”的双抗体夹心法，建立了一种简便、灵敏、稳定的新型多种标志物检测的方法，能够放大检测信号，不仅可以提高检测的灵敏度，同时良好的检测特异性、操作的简便性以及稳定的荧光标记物保证了检测的准确性。

Description

一种基于荧光量子点的三维生物检测体系及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及体外诊断检测技术领域，尤其涉及一种基于荧光量子点的三维生物检测体系及其制备方法和应用。
背景技术
检测生物标志物常见的液相检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，具有快速、简便、载体易于标准化等优点，被广泛应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，以及多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。但是酶标板是二维结构为基底，所捕获的抗体有限，同时二维平面捕获的抗体，常常存在后置、正置、侧置和平置等位置的结合，以致抗原结合位点难以暴露，导致抗原抗体的结合效率过低，从而导致灵敏度难以进一步的提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于荧光量子点的三维生物检测体系及其制备方法和应用。本发明提供的三维生物检测体系以树状三维结构为基底，增加了抗体的包被负载量和抗原抗体的结合效率，进而提高了灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于荧光量子点的三维生物检测体系，以树状三维结构为基底，以水溶性荧光量子点结合偶联抗体作为荧光探针，所述基底表面负载包被抗体，所述基底由包括以下步骤制备得到：以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到所述基底。
优选地，所述水溶性荧光量子点的波长为450～700nm。
优选地，所述水溶性荧光量子点由包括以下步骤的方法制备得到：将油溶性量子点经过表面修饰，得到羧基化的水溶性荧光量子点。
优选地，所述油溶性量子点为CdSe/ZnS量子点、ZnCdSeS/ZnS量子点、ZnxCd1-xSe/ZnS量子点、ZnSe/ZnS量子点、Cu掺杂的ZnSe/ZnS量子点、Mn掺杂的ZnSe/ZnS量子点、CuInZnS/ZnS量子点或InP/GaP/ZnS量子点。
优选地，所述荧光探针由包括以下步骤的方法制备得到：
将所述水溶性荧光量子点通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，得到羧基活化的水溶性荧光量子点；
将所述羧基活化的水溶性荧光量子点与偶联抗体进行共价键偶联，得到所述荧光探针。
优选地，所述包被抗体包括C-反应蛋白单克隆抗体、血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、B型尿钠肽单克隆抗体、心脏脂肪酸结合蛋白单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和促黄体生成素单克隆抗体中的一种或多种。
优选地，所述偶联抗体包括C-反应蛋白单克隆抗体、血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、B型尿钠肽单克隆抗体、心脏脂肪酸结合蛋白单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和促黄体生成素单克隆抗体中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述三维生物检测体系的制备方法，包括以下步骤：
以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到树状三维结构，作为基底；
在所述基底表面利用生物芯片点样仪打印抗体，在所述基底表面得到包被抗体；
以水溶性荧光量子点结合偶联抗体进行共价键偶联，作为荧光探针。
优选地，所述生物芯片点样仪的打印浓度为0.05～1.6mg/mL，打印单个点的体积为1×10-7～5×10-7mL，一次打印点数为1～120滴。
本发明还提供了上述技术方案所述三维生物检测体系或上述技术方案所述制备方法制得的三维生物检测体系在制备检测生物标志物体系中的应用。
本发明提供了一种基于荧光量子点的三维生物检测体系，以树状三维结构为基底，以水溶性荧光量子点结合偶联抗体作为荧光探针，所述基底表面负载包被抗体，所述基底由包括以下步骤制备得到：以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到所述基底。本发明以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为基底，经过表面引发聚合反应(SIP)，制备成具有表面功能化聚甲基丙烯酸低聚乙二醇(POEGMA)树状高分子的三维结构基底，三维结构包被的抗体具有更好的选择性(抗原抗体的结合位点更易暴露)，从而提高抗原抗体的结合效率，同时该基底具有“零”非特异性吸附的特征，可以负载各种蛋白质等生物分子，用于高灵敏检测领域；水溶性荧光量子点具有荧光效率高、稳定性好、Stock位移较大、发射光谱窄而对称、单一波长多色激发等诸多优秀的荧光特性，本发明利用水溶性荧光量子点结合偶联抗体建立量子点免疫吸附，具有稳定性好，灵敏度高，特异性好和高通量等优势。本发明提供的三维生物检测体系利用水溶性荧光量子点作为荧光探针，结合三维结构作为检测基底，利用“包被抗体-待测抗原-荧光量子点标记抗体”的双抗体夹心法，建立了一种简便、灵敏、稳定的新型多种标志物检测的方法，能够放大检测信号，不仅可以提高检测的灵敏度，同时良好的检测特异性、操作的简便性以及稳定的荧光标记物保证了检测的准确性。本发明利用量子点标记一种或者多种抗体作为荧光标记物，利用三维结构为基底更高量的捕获包被抗体，提高抗原抗体的结合效率，从而放大检测信号，实现高灵敏度的检测。利用在基底上不同位置的上打印包被抗体，可以实现一种或者多种物质的同时定量准确检测。实施例的数据表明，本发明可以实现感染疾病标志物中CRP和SAA物质的单个和同步检测，大大提高了检测效率。相比于传统的QD-FLISA法，本发明方法在单独检测时将灵敏度提高了6～10倍，同时检测时将灵敏度提高了9倍左右。另外，本发明提供的三维生物检测体系进行监测时，样品前处理过程简单，实现了感染疾病标志物的同步检测，解决了分项检测所带来的操作繁琐、检测成本较高的问题，适用于细菌与病毒感染的快速鉴别诊断。
附图说明
图1为二维结构与三维结构包被抗体的对比图；
图2为48孔样品板结构示意图；
图3为荧光量子点发射图谱；
图4为单独检测C反应蛋白(CRP)的标准曲线；
图5为单独检测血清淀粉样蛋白A(SAA)的标准曲线；
图6为同时检测CRP和SAA时，CRP和SAA的标准曲线；
图7为检测C反应蛋白(CRP)的特异性曲线；
图8为检测淀粉样蛋白A(SAA)的特异性曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种基于荧光量子点的三维生物检测体系，以树状三维结构为基底，以水溶性荧光量子点结合偶联抗体作为荧光探针，所述基底表面负载包被抗体，所述基底由包括以下步骤制备得到：以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到所述基底。
在本发明中，所述包被抗体在基底表面的负载浓度优选为0.05～1.6mg/mL，远远优于二维结构的负载浓度为5×10-4～0.02mg/mL。在本发明中，所述包被抗体优选包括C-反应蛋白单克隆抗体(CRP)、血清淀粉样蛋白A单克隆抗体(SAA)、心肌肌钙蛋白I单克隆抗体(cTnI)、B型尿钠肽单克隆抗体(BNP)、心脏脂肪酸结合蛋白单克隆抗体(H-FABP)、人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体(HCG)和促黄体生成素单克隆抗体(LH)中的一种或多种。
在本发明中，所述水溶性荧光量子点的波长优选为450～700nm。
在本发明中，所述水溶性荧光量子点的水合粒径优选为10～500nm。
在本发明中，所述水溶性荧光量子点优选由包括以下步骤的方法制备得到：将油溶性量子点经过表面修饰，得到羧基化的水溶性荧光量子点。
在本发明中，所述油溶性量子点优选为CdSe/ZnS量子点、ZnCdSeS/ZnS量子点、ZnxCd1-xSe/ZnS量子点、ZnSe/ZnS量子点、Cu掺杂的ZnSe/ZnS量子点、Mn掺杂的ZnSe/ZnS量子点、CuInZnS/ZnS量子点或InP/GaP/ZnS量子点。在本发明中，所述CdSe/ZnS量子点、ZnCdSeS/ZnS量子点、ZnxCd1-xSe/ZnS量子点、ZnSe/ZnS量子点、Cu掺杂的ZnSe/ZnS量子点、Mn掺杂的ZnSe/ZnS量子点、CuInZnS/ZnS量子点和InP/GaP/ZnS量子点为具有核壳结构的量子点，以CdSe/ZnS量子点为例，说明核壳结构的组成，CdSe/ZnS量子点的壳层的材料为ZnS，核的材料为CdSe。
在本发明中，所述表面修饰的方法优选为配体交换法、两亲性聚合物包覆法或基于二氧化硅的包覆法。
在本发明中，所述配体交换法以巯基丙酸修饰CdSe/ZnS量子点为例，具体制备过程优选如下：
将含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液中加入巯基丙酸，超声反应后，固液分离，沉淀经氯仿清洗后，挥发氯仿，再加入氨水溶液，得到表面包覆有羧基的水溶性量子点，在本发明的具体实施例中，所述含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液的浓度为5mg/mL，体积为4mL；所述巯基丙酸的加入量为0.4mL；超声时间为30min；固液分离为离心，所述离心的条件为10000rpm下进行为3min；所述氯仿清洗的体积为3～5mL，清洗次数为2次；所述氨水溶液为含有0.01％氨水的水溶液，体积为4mL。
在本发明中，所述两亲性聚合物包覆法以聚马来酸酐十六醇酯(PMAH)包覆CdSe/ZnS量子点为例，具体制备过程优选如下：
将含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液与含有PMAH的氯仿溶液混合，超声反应后，旋蒸掉溶剂，加入氨水溶液，搅拌后，离心，固液分离，沉淀为表面包覆有羧基的水溶性量子点，在本发明的具体实施例中，所述含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液的浓度为5mg/mL，体积为4mL；含有PMAH的氯仿溶液的浓度为10mg/mL，体积为2mL；超声时间为10min；旋蒸时间为15min；所述离心的条件为20000rpm下进行30min；所述氨水溶液为含有0.01％氨水的水溶液，体积为4mL。
在本发明中，所述二氧化硅包覆法以反相微乳液法包覆CdSe/ZnS量子点为例，具体制备过程优选如下：
Ⅰ、将含有CO-520的环己烷溶液与含有CdSe/ZnS量子点的环己烷溶液混合，依次加入正硅酸乙酯(TEOS)和氨水溶液，搅拌进行反应；
Ⅱ、用乙醇溶液和正己烷溶液清洗反应产物后，固液分离收集沉淀，将所得沉淀用乙醇溶解，分别加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(ATPES)和氨水溶液，搅拌进行反应；
Ⅲ、依次用乙醇溶液、正己烷溶液和氯仿溶液清洗反应产物后，固液分离收集沉淀，将所得沉淀用氯仿溶解，加入含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，搅拌进行反应；
Ⅳ、用乙醇溶液清洗所得反应产物后，固液分离收集沉淀，将所述沉淀与氨水溶液混合，超声，固液分离，沉淀即为表面羧基化的水相量子点CdSe/ZnS。
在本发明的具体实施例中，所述含有CO-520的环己烷溶液的浓度为0.165g/mL，体积为8mL；所述含有CdSe/ZnS量子点的环己烷溶液的浓度为10mg/mL，体积为2mL；所述搅拌的时间为24h；所述TEOS的加入体积为0.16mL；所述氨水溶液浓度为含有50％氨水的水溶液，体积为0.08～0.45mL；所述ATPES的体积为0.1mL；所述含有丁二酸酐的DMF溶液的浓度为0.1mg/mL，体积为0.15mL；所述固液分离为离心；所述离心的转速为10000～20000rpm，时间为3～30min。
在本发明中，所述荧光探针优选由包括以下步骤的方法制备得到：
所述水溶性荧光量子点通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，得到羧基活化的水溶性荧光量子点；
将所述羧基活化的水溶性荧光量子点与偶联抗体进行共价键偶联，得到所述荧光探针。
在本发明中，所述水溶性荧光量子点通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基后，得到羧基活化的水溶性荧光量子点，优选为将含有水溶性荧光量子点的硼砂(BS)溶液，与含有活化剂EDC的2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)溶液和Sulfo-NHS的BS溶液混合后，超声活化，然后依次经过低温离心、固液分离洗去未反应的活化剂，得到所述羧基活化的水溶性荧光量子点，所述含有水溶性量子点的BS溶液更优选为包含0.42mg/mL表面包覆羧基量子点的浓度为5×10-6mol/mL的BS溶液，体积更优选为0.9mL；所述含有EDC的MES溶液更优选为含有4.526×10-3mol/mL EDC的浓度为5×10-6mol/mL MES溶液，体积更优选为0.05mL；所述含Sulfo-NHS的BS溶液更优选为含有1.13×10-2mol/mL Sulfo-NHS的浓度为5×10-6mol/mL BS溶液，体积更优选为0.05mL。
得到羧基活化的水溶性荧光量子点后，本发明将所述羧基活化的水溶性荧光量子点与偶联抗体进行共价键偶联，得到所述荧光探针。
在本发明中，所述偶联抗体优选包括C-反应蛋白单克隆抗体、血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、B型尿钠肽单克隆抗体、心脏脂肪酸结合蛋白单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和促黄体生成素单克隆抗体中的一种或多种。在本发明中，当所述偶联抗体优选为C-反应蛋白单克隆抗体时，所述荧光探针为QD-CRP探针，当所述偶联抗体优选为血清淀粉样蛋白A单克隆抗体是，所述荧光探针为QD-SAA探针。
在本发明中，所述三维生物检测体系优选还包括检测装置，更优选为以激光及LED光源为基础的检测仪，激发波长优选为405nm，检测范围优选为450～1060nm，发光功率和测试积分时间优选均可连续调节。
在本发明的具体实施例中，所述检测装置为激光检测仪，功率为1～500W，优选为20W，积分时间为1～1000ms，优选为200ms。
在本发明中，所述三维生物检测体系优选还包括标准品溶液、样品稀释液、探针稀释液和洗涤液。
在本发明中，所述标准品溶液优选为CRP标准品溶液和SAA标准品溶液，
所述CRP标准品溶液的浓度为：0、0.5、1、5、10、25、50、100、200、400、800、1000ng/mL；
所述SAA标准品溶液的浓度为：0、0.5、1、5、10、25、50、100、200、400、800、1000ng/mL。
在本发明中，所述样品稀释液和探针稀释液均优选为含有体积比为10％小牛血清的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
在本发明中，所述洗涤液优选为含有体积比的0.05％吐温20的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
本发明还提供了上述技术方案所述三维生物检测体系的制备方法，包括以下步骤：
以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到树状三维结构，作为基底；
在所述基底表面利用生物芯片点样仪打印抗体，在所述基底表面得到包被抗体；
以水溶性荧光量子点结合偶联抗体进行共价键偶联，作为荧光探针。
本发明以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到树状三维结构，作为基底。本发明对所述聚合反应的条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。
得到基底后，本发明在所述基底表面利用生物芯片点样仪打印抗体，在所述基底表面得到包被抗体。在本发明中，所述生物芯片点样仪优选为ScienionAG公司的sciFLEXARRAYER S3仪器，所述生物芯片点样仪具有高的精度，可以实现皮升(pL)到纳升(nL)体积的点样，以及微米(μm)到厘米(cm)点样距离的精准控制。
在本发明中，所述生物芯片点样仪的打印浓度优选为0.05～1.6mg/mL，更优选为0.4mg/mL，打印单个点的体积优选为1×10-7～5×10-7mL，更优选为4×10-7mL，一次打印点数优选为1～120滴，更优选为100滴。
本发明以水溶性荧光量子点结合偶联抗体进行共价键偶联，作为荧光探针。本发明对所述共价键偶联的具体方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。
本发明还提供了上述技术方案所述三维生物检测体系或上述技术方案所述制备方法制得的三维生物检测体系在制备检测生物标志物体系中的应用。
在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：
1)制作所述三维生物检测体系中检测一种或者两种抗原对应的标准曲线，所述标准曲线横坐标为标准品溶液的浓度值，所述标准曲线的纵坐标为所述三维生物检测体系的相对荧光强度；
2)向所述所述三维生物检测体系的基底中加入待测样品的溶液，再加入所述三维生物检测体系中的荧光探针，进行孵育，检测体系相对荧光强度；
3)将步骤2)中得到的相对荧光强度与1)中的标准曲线中的相对荧光强度进行计算，得出所测样品的浓度值。
在本发明中，所述步骤1)中的相对荧光强度是指用激光器在特定波长405nm下激发，得到的三明治夹心结构复合物的相对荧光强度，通过标准曲线的对比求出待测样品中物质的浓度，通常待测样品待测物的浓度越大，得到三明治夹心结构复合物越多，所测得的相对荧光强度越高。
相对荧光强度定义：荧光的相对强弱，以不同峰、谷的荧光强度之差来表示，是一个对应的值。
在本发明中，所述待测样品优选进行前处理，所述前处理优选为用样品稀释液对待测样品稀释200倍。本发明对所述样品稀释液的限定与前文一致，在此不再赘述。在本发明中，所述待测样品优选为血清、血浆或全血。
当所述检测优选为同时对SAA和CRP检测时，所述检测方法优选为多组分同步分析，具体是采用双抗体夹心法，SAA和CRP单克隆抗体同时作为包被抗体，加入待测抗原物质，SAA和CRP单克隆抗体同时作为偶联抗体制备荧光探针，采用统一光源激发，测得不同发射波长的荧光强度，从而实现同一样品中不同组分的定量分析。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的基于荧光量子点的三维生物检测体系及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(一)基于荧光量子点的三维生物检测体系的组成
1.包被抗体：CRP单克隆抗体，购自北京百川飞虹生物科技有限公司，产品目录号为7D9，浓度为2.2mg/mL。SAA单克隆孔抗体，购自上海优宁维生物科技股份有限公司，产品目录号为2201，浓度为5.0mg/mL。
2.偶联抗体：CRP单克隆抗体，购自杭州启泰有限公司，产品目录号为MC02，浓度为5mg/mL。SAA单克隆孔抗体，购自上海优宁维生物科技股份有限公司，产品目录号为2203，浓度为5.1mg/mL。
3.荧光探针：量子点结合CRP单克隆孔抗体，制备QD-CRP探针；量子点结合SAA单克隆孔抗体，制备QD-SAA探针。
4.标准品：CRP标准品购自杭州启泰有限公司，SAA标准品购自上海优宁维生物科技股份有限公司，分别用稀释液稀释至相关浓度。
5.洗涤液：含有体积比0.05％吐温20的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
6.稀释液(样品和探针)：含有体积比10％小牛血清的1×10-5mol/mL的磷酸盐缓冲液，pH＝7.4。
7.探针保存液：含有质量比0.5％牛血清白蛋白的5×10-6mol/mL硼砂缓冲液，pH＝8.0。
8.包被液：5×10-5mol/mL碳酸盐缓冲液，pH＝9.6。
(二)基底的制备
三维结构基底为以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为基底主体，经过表面引发聚合反应(SIP)，制备成具有表面功能化聚甲基丙烯酸低聚乙二醇(POEGMA)的树状高分子的三维结构基底，即48孔样品板，图1为二维结构与三维结构包被抗体的对比，可以看出，三维结构可以负载更多的抗体。图2为48孔样品板结构示意图，为三部分组成：上底板，中间表面三维结构的PDMS膜和下底板。
包被抗体(CRP和/或SAA)在基底表面的负载浓度为0.05mg/mL。
(三)荧光探针的制备
将油溶性量子点经过表面修饰，得到羧基化的水溶性荧光量子点，油溶性量子点为CdSe/ZnS量子点，壳层的材料为ZnS，核的材料为CdSe。
表面修饰为配体交换法、两亲性聚合物包覆法或基于二氧化硅的包覆法。
配体交换法，具体制备过程如下：
将含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液中加入巯基丙酸，超声反应后，固液分离，沉淀经氯仿清洗后，挥发氯仿，再加入氨水溶液，得到表面包覆有羧基的水溶性量子点，含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液的浓度为5mg/mL，体积为4mL；巯基丙酸的加入量为0.4mL；超声时间为30min；固液分离为离心，所述离心的条件为10000rpm下进行为3min；所述氯仿清洗的体积为3mL，清洗次数为2次；所述氨水溶液为含有0.01％氨水的水溶液，体积为4mL。
两亲性聚合物包覆法具体制备过程如下：
将含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液与含有PMAH的氯仿溶液混合，超声反应后，旋蒸掉溶剂，加入氨水溶液，搅拌后，离心，固液分离，沉淀为表面包覆有羧基的水溶性量子点，含有CdSe/ZnS量子点的氯仿溶液的浓度为5mg/mL，体积为4mL；含有PMAH的氯仿溶液的浓度为10mg/mL，体积为2mL；超声时间为10min；旋蒸时间为15min；离心的条件为20000rpm下进行30min；氨水溶液为含有0.01％氨水的水溶液，体积为4mL。
二氧化硅包覆法具体制备过程如下：
Ⅰ、将含有CO-520的环己烷溶液与含有CdSe/ZnS量子点的环己烷溶液混合，依次加入正硅酸乙酯(TEOS)和氨水溶液，搅拌进行反应；
Ⅱ、用乙醇溶液和正己烷溶液清洗反应产物后，固液分离收集沉淀，将所得沉淀用乙醇溶解，分别加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(ATPES)和氨水溶液，搅拌进行反应；
Ⅲ、依次用乙醇溶液、正己烷溶液和氯仿溶液清洗反应产物后，固液分离收集沉淀，将所得沉淀用氯仿溶解，加入含丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，搅拌进行反应；
Ⅳ、用乙醇溶液清洗所得反应产物后，固液分离收集沉淀，将所述沉淀与氨水溶液混合，超声，固液分离，沉淀即为表面羧基化的水相量子点CdSe/ZnS；
其中，含有CO-520的环己烷溶液的浓度为0.165g/mL，体积为8mL；含有CdSe/ZnS量子点的环己烷溶液的浓度为10mg/mL，体积为2mL；搅拌的时间为24h；TEOS的加入体积为0.16mL；氨水溶液浓度为含有50％氨水的水溶液，体积为0.08mL；ATPES的体积为0.1mL；含有丁二酸酐的DMF溶液的浓度为0.1mg/mL，体积为0.15mL；固液分离为离心；离心的转速为10000rpm，时间为30min。
将含有水溶性量子点的BS溶液，与含有活化剂EDC的MES溶液和Sulfo-NHS的BS溶液，按体积比18：1：1混合，超声活化。经过低温下离心，固液分离洗去未反应的活化剂，所得到的沉淀物为活化后的表面包覆羧基的量子点，将其与偶联抗体结合得到，量子点-抗体探针发光复合物，即荧光探针，固液分离洗去未反应的抗体，所得到的沉淀物经探针保存液溶解后保存待用，其中含有水溶性量子点的BS溶液为包含0.42mg/mL表面包覆羧基量子点的5×10-6mol/mL BS溶液，体积为0.9mL；含有EDC的MES溶液为含有4.526×10-3mol/mL EDC的5×10-6mol/mL MES溶液，体积为0.05mL；含Sulfo-NHS的BS溶液为含有1.13×10-2mol/mLSulfo-NHS的5×10-6mol/mL BS溶液，体积为0.05mL，偶联抗体为50g的CRP抗体(或SAA抗体)，最终定容的浓度优选为0.075mL，保存条件优选为4℃。
图3为荧光量子点发射图谱，激发波长为365nm。
(四)基于荧光量子点的三维生物检测体系的制备
用包被液稀释包被抗体，确定抗体包被浓度为0.4mg/mL，用生物芯片点样仪打印包被抗体，每个位置100滴，每滴的体积为4×10-7mL。两个位置的距离为4mm。将打印好抗体的下底板，在生物芯片点样仪操作室中，室温下放置过夜。将下底板与上底板组合，制成48孔样品板。之后放入干燥剂抽真空置于密封袋中，放入4℃冰箱中保存。
实施例2
CRP检测方法的建立及效果评价：
(一)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出多孔样品板恢复至室温。每个孔里先用1×10-5mol/mL的PBS溶液润湿10min。用稀释液稀释CRP标准品至目标浓度，每孔加入0.1mL，放入恒温培养摇床中，37℃孵育30min；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用稀释液稀释QD-CRP探针，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温培养摇床中，37℃孵育30min。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用激光仪进行测样，激发光波长为405nm，检测固定位置的荧光光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP标准品的浓度为横坐标，CRP标准品溶液的浓度为：0、0.5、1、5、10、25、50、100、200、400、800、1000ng/mL，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，如图4所示，检测范围是0.5～1000ng/mL，标准曲线是Y＝2294+92.71X-0.03X2，R2＝0.998。
(二)试剂盒的效果评价：
评价双抗体夹心免疫吸附试验反应灵敏度的方法，常用的是最低检测限(LOD)。经过计算，LOD＝0.27ng/mL。对比常见的以二维结构酶标板为基底的量子点免疫吸附法(QD-FLISA)对浓度为0.5～1000ng/mL的CRP检测，LOD＝1.62ng/mL，灵敏度提高了6倍。
实施例3：SAA检测方法的建立及效果评价
(一)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出多孔样品板恢复至室温。每个孔里先用1×10-5mol/mL的PBS溶液润湿10min。用稀释液稀释SAA标准品至目标浓度，每孔加入0.1mL，放入恒温培养摇床中，37℃孵育30min；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用稀释液稀释QD-SAA探针，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温培养摇床中，37℃孵育30min。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用激光仪进行测样，激发光波长为405nm，检测固定位置的荧光光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以SAA标准品的浓度为横坐标，SAA标准品溶液的浓度为：0、0.5、1、5、10、25、50、100、200、400、800、1000ng/mL，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，如图5所示，标准曲线是Y＝1089+14X-0.007X2，R2＝0.991。
(二)试剂盒的效果评价：
经过计算，LOD＝0.17ng/mL。对比常见的以二维结构酶标板为基底量子点免疫吸附法(QD-FLISA)对浓度为0.5～1000ng/mL的SAA检测，LOD＝1.69ng/mL，灵敏度提高了10倍。
实施例4：CRP和SAA同时检测方法的建立及效果评价
(一)标准曲线的制作
(1)标准品的孵育：取出多孔样品板恢复至室温。每个孔里先用1×10-5mol/mL的PBS溶液润湿10min。用稀释液分别稀释CRP和SAA标准品至目标浓度，混合后，每孔加入0.1mL，放入恒温培养摇床中，37℃孵育30min；甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(2)标记抗体的孵育：用稀释液稀释SAA探针，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温培养摇床中，37℃孵育30min。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。之后用稀释液稀释CRP探针，按1:50倍稀释，每孔0.1mL，放入恒温恒湿培养箱中，37℃孵育30min。甩去反应液，洗涤液洗五遍，在吸水纸上拍干。
(3)数据检测：用激光仪进行测样，激发光波长为405nm，检测对应位置的荧光光谱，取荧光峰处的最大值。
(4)绘制标准曲线：以CRP或者SAA标准品的浓度为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，CRP标准品溶液的浓度为：0、0.5、1、5、10、25、50、100、200、400、800、1000ng/mL，SAA标准品溶液的浓度为：0、0.5、1、5、10、25、50、100、200、400、800、1000ng/mL，如图6所示，左图为CRP标准品的标准曲线，检测范围是0.5～1000ng/mL，标准曲线是Y＝1808+38.6X-0.016X2，R2＝0.993。右图为SAA标准品的标准曲线，检测范围是0.5～1000ng/mL，标准曲线是Y＝2273+8.73X-0.0043X2，R2＝0.986。
(二)试剂盒的效果评价：
(1)灵敏度：利用三维结构为基底对浓度为0.5～1000ng/mL的CRP检测，经过计算，LOD＝0.20ng/mL，对比常见的以二维结构酶标板为基底量子点免疫吸附法(QD-FLISA)对浓度为0.5-1000ng/mL的CRP检测，LOD＝1.62ng/mL，灵敏度提高了8倍。
利用三维结构为基底对浓度为0.5-1000ng/mL的SAA检测，经过计算，LOD＝0.19ng/mL，对比常见的以二维结构酶标板为基底量子点免疫吸附法(QD-FLISA)对浓度为0.5～1000ng/mL的SAA检测，LOD＝1.69ng/mL，灵敏度提高了9倍。
(2)添加回收率实验
向同一份不含CRP和SAA的阴性血清样本中添加CRP和SAA两种标准品，使得阴性血清中CRP和SAA的浓度分别为10ng/mL、200ng/mL和800ng/mL；完成免疫吸附反应过程。每个浓度做5个平行，计算每种添加物质的回收率(回收率＝实测值/添加值*100)。
表1C-反应蛋白(CRP)样本回收率测定
Figure BDA0002399474870000151
表2血清淀粉样蛋白A(SAA)样本回收率测定
Figure BDA0002399474870000152
由表1和2可知，以三维结构为基底对阴性血清样本中CRP和SAA两种物质的添加回收率在91.09％～114.66％之间，相对标准偏差小于15％，符合准确度的测定标准。与常见的二维结构为基底的量子点免疫吸附法对比，该方法具有良好的准确度。
(3)特异性实验
配置浓度为100ng/mL的CRP(或SAA)、高于其100倍的SAA(或CRP)、降钙素原、L-半胱酰胺、DL-异性半胱酰胺、谷胱甘肽和碱性磷酸酶(1×105ng/mL)等物质，进行荧光免疫吸附试验，从而对比其特异性。图7为检测C反应蛋白(CRP)的特异性曲线，干扰因子分别为淀粉样蛋白A(SAA)，降钙素原(PCT)，L-半胱酰胺，DL-异性半胱酰胺，谷胱甘肽和碱性磷酸酶，图8为检测淀粉样蛋白A(SAA)的特异性曲线，干扰因子分别为C反应蛋白(CRP)，降钙素原(PCT)，L-半胱酰胺，DL-异性半胱酰胺，谷胱甘肽和碱性磷酸酶。由图7和图8得到，CRP(或SAA)物质特异性好，不受SAA(或CRP)、降钙素原、L-半胱酰胺、DL-异性半胱酰胺、谷胱甘肽和碱性磷酸酶等物质的干扰。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于荧光量子点的三维生物检测体系，其特征在于，以树状三维结构为基底，以水溶性荧光量子点结合偶联抗体作为荧光探针，所述基底表面负载包被抗体，所述基底由包括以下步骤制备得到：以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到所述基底。
2.根据权利要求1所述的三维生物检测体系，其特征在于，所述水溶性荧光量子点的波长为450～700nm。
3.根据权利要求1或2所述的三维生物检测体系，其特征在于，所述水溶性荧光量子点由包括以下步骤的方法制备得到：将油溶性量子点经过表面修饰，得到羧基化的水溶性荧光量子点。
4.根据权利要求3所述的三维生物检测体系，其特征在于，所述油溶性量子点为CdSe/ZnS量子点、ZnCdSeS/ZnS量子点、ZnxCd1-xSe/ZnS量子点、ZnSe/ZnS量子点、Cu掺杂的ZnSe/ZnS量子点、Mn掺杂的ZnSe/ZnS量子点、CuInZnS/ZnS量子点或InP/GaP/ZnS量子点。
5.根据权利要求1或3所述的三维生物检测体系，其特征在于，所述荧光探针由包括以下步骤的方法制备得到：
将所述水溶性荧光量子点通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化羧基后，得到羧基活化的水溶性荧光量子点；
将所述羧基活化的水溶性荧光量子点与偶联抗体进行共价键偶联，得到所述荧光探针。
6.根据权利要求1所述的三维生物检测体系，其特征在于，所述包被抗体包括C-反应蛋白单克隆抗体、血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、B型尿钠肽单克隆抗体、心脏脂肪酸结合蛋白单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和促黄体生成素单克隆抗体中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的三维生物检测体系，其特征在于，所述偶联抗体包括C-反应蛋白单克隆抗体、血清淀粉样蛋白A单克隆抗体、心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、B型尿钠肽单克隆抗体、心脏脂肪酸结合蛋白单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和促黄体生成素单克隆抗体中的一种或多种。
8.权利要求1～7任一项所述三维生物检测体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以聚二甲基硅氧烷为基底主体，表面引发聚合反应，得到树状三维结构，作为基底；
在所述基底表面利用生物芯片点样仪打印抗体，在所述基底表面得到包被抗体；
以水溶性荧光量子点结合偶联抗体进行共价键偶联，作为荧光探针。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述生物芯片点样仪的打印浓度为0.05～1.6mg/mL，打印单个点的体积为1×10-7～5×10-7mL，一次打印点数为1～120滴。
10.权利要求1～7任一项所述三维生物检测体系或权利要求8或9所述制备方法制得的三维生物检测体系在制备检测生物标志物体系中的应用。
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