WO2012020745A1 - 糖化ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

糖化ヘモグロビンの測定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012020745A1
WO2012020745A1 PCT/JP2011/068104 JP2011068104W WO2012020745A1 WO 2012020745 A1 WO2012020745 A1 WO 2012020745A1 JP 2011068104 W JP2011068104 W JP 2011068104W WO 2012020745 A1 WO2012020745 A1 WO 2012020745A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substituted
reagent
unsubstituted alkyl
hemoglobin
general formula
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/068104
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
陽代 征矢
智美 村上
春樹 角田
友 大杉
彩子 依田
政嗣 松下
Original Assignee
協和メデックス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 協和メデックス株式会社 filed Critical 協和メデックス株式会社
Priority to CA 2807133 priority Critical patent/CA2807133A1/en
Priority to US13/811,914 priority patent/US9090931B2/en
Priority to CN201180038604.XA priority patent/CN103069003B/zh
Priority to JP2012528678A priority patent/JP5955220B2/ja
Priority to BR112013001393A priority patent/BR112013001393A2/pt
Priority to EP11816409.4A priority patent/EP2604699B1/en
Priority to KR1020137002627A priority patent/KR20130100972A/ko
Publication of WO2012020745A1 publication Critical patent/WO2012020745A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin

Definitions

  • the present invention relates to a measurement method, a measurement reagent, and a measurement kit for glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample. Furthermore, the present invention relates to a method for storing a leuco chromogen-containing aqueous solution and a method for stabilizing a leuco chromogen.
  • Glycated hemoglobin is a saccharified product in which glucose is bound to hemoglobin.
  • Hemoglobin has a tetramer structure consisting of ⁇ and ⁇ chains, but the glycated N-terminus of ⁇ chain is called hemoglobin A1c, and increases as the blood glucose level increases. It is routinely measured in clinical tests as an indicator of glycemic control.
  • an immunoassay method using an antibody such as a chromatography method such as HPLC, electrophoresis, latex immunoagglutination, an enzyme that acts on glycated protein, and a glycated peptide and / or glycated amino acid.
  • An enzyme measurement method using an enzyme is known.
  • glycated hemoglobin As an enzyme measurement method for glycated hemoglobin, first, glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample is denatured with a denaturing agent, a proteolytic enzyme is allowed to act on the denatured glycated hemoglobin, and then a glycated peptide oxidase is allowed to act on the produced glycated peptide.
  • a method is known in which the produced hydrogen peroxide is reacted with an oxidative coloring type chromogen in the presence of a peroxidase or other peroxidase, leading to a dye, and glycated hemoglobin is measured from the absorbance of the produced dye. .
  • the denaturing agent is used to enable the action of a proteolytic enzyme on glycated hemoglobin, and so far, a compound containing an acetate group or a salt thereof, N-acyl taurine or a salt thereof, polyoxyethylene alkyl Ether sulfuric acid or a salt thereof (Patent Document 1), anionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether sulfates, polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfates (Patent Document 2), sodium lauryl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate And the like (Patent Document 3), sulfonic acid compounds and nitro compounds (Patent Document 4), quaternary ammonium salts, alkylbenzyldimethylammonium chloride, lauryldimethylamine oxide and the like (Patent Document 5) are known. It has been.
  • the glycated hemoglobin is converted to hydrogen peroxide, and the generated hydrogen peroxide is reacted with an oxidative coloring type chromogen in the presence of a peroxidase or other peroxidative substance. Therefore, a method of measuring glycated hemoglobin from the absorbance of the produced dye is often used.
  • a leuco chromogen is often used as the oxidative coloring chromogen.
  • a leuco-type chromogen is a kind of chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase to produce a pigment.
  • the leuco chromogen is suitably used as a high-sensitivity chromogen for quantification of components to be quantified, such as glycated hemoglobin, which are present in a trace amount (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • components to be quantified such as glycated hemoglobin, which are present in a trace amount
  • Non-Patent Document 1 glycated hemoglobin
  • its storage stability is poor, and in particular, it has the disadvantage of spontaneous color development over time in solution. Due to the poor stability of this leuco chromogen, it should be quantified in the sample. There is a problem that the components cannot be measured accurately.
  • the glycated hemoglobin denaturing agent known so far does not sufficiently denature the glycated hemoglobin, so that the proteolytic enzyme reaction does not proceed satisfactorily and accurate measurement of glycated hemoglobin is not possible. There was a problem that it could not be done.
  • the leuco chromogen used in the method for measuring glycated hemoglobin is not always a satisfactory method because a conventionally known storage method requires storage under severe conditions.
  • An object of the present invention is to provide a method, a reagent and a kit for accurately measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample, and a leuco chromogen-containing aqueous solution that enables accurate measurement of glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample.
  • the object is to provide a storage method and a method for stabilizing a leuco chromogen.
  • the present inventors diligently studied this problem, and by reacting glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme in the presence of a pyridinium salt, a phosphonium salt, an imidazolium salt, or an isoquinolinium salt, The present inventors have found that hemoglobin and glycated hemoglobin can be sufficiently denatured and glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample can be accurately measured. Furthermore, the inventors have found that a pyridinium salt, a phosphonium salt, an imidazolium salt, or an isoquinolinium salt stabilizes a leuco chromogen, and completed the present invention. That is, the present invention relates to the following [1] to [18].
  • a glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme are converted into a pyridinium salt represented by the following general formula (I), a phosphonium salt represented by the following general formula (II), and the following general formula (III ) And an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV) in the presence of at least one selected from the group consisting of a fructosyl peptide oxidase and a fructosyl peptide oxidase.
  • a method for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample which comprises measuring hydrogen peroxide produced by the action.
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • R a represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • X ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 2 to R 5 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, and Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 6 and R 8 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, a substituted or unsubstituted alkenyl, and R 7 , R 9 and R 10 are a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, (Represents a substituted or unsubstituted alkenyl, and Z ⁇ represents a monovalent anion.)
  • a reagent for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample comprising a proteolytic enzyme, fructosyl peptide oxidase, a pyridinium salt represented by the following general formula (I), and the following general formula ( And at least one selected from the group consisting of phosphonium salts represented by II), imidazolium salts represented by the following general formula (III), and isoquinolinium salts represented by the following general formula (IV): A reagent for measuring glycated hemoglobin.
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • R a represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • X ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 2 to R 5 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, and Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 6 and R 8 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, a substituted or unsubstituted alkenyl, and R 7 , R 9 and R 10 are a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, (Represents a substituted or unsubstituted alkenyl, and Z ⁇ represents a monovalent anion.)
  • R 11 represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, and W ⁇ represents a monovalent anion.
  • the measuring reagent according to [9] wherein the phenothiazine chromogen is 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine.
  • a kit for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample comprising a proteolytic enzyme, a pyridinium salt represented by the following general formula (I), and a phosphonium represented by the following general formula (II)
  • a first reagent comprising at least one selected from the group consisting of a salt, an imidazolium salt represented by the following general formula (III), and an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV); and fructosyl peptide oxidation
  • a glycated hemoglobin measurement kit comprising a second reagent containing an enzyme.
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • R a represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • X ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 2 to R 5 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, and Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 6 and R 8 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, a substituted or unsubstituted alkenyl, and R 7 , R 9 and R 10 are a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, (Represents a substituted or unsubstituted alkenyl, and Z ⁇ represents a monovalent anion.)
  • R 11 represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, and W ⁇ represents a monovalent anion.
  • the leuco chromogen is a phenothiazine chromogen.
  • the phenothiazine chromogen is 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine.
  • a pyridinium salt represented by the following general formula (I), a phosphonium salt represented by the following general formula (II), and an imidazolium represented by the following general formula (III) A method for preserving a leuco chromogen-containing aqueous solution, comprising adding at least one selected from the group consisting of a salt and an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV):
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • R a represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • X ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 2 to R 5 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, and Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 6 and R 8 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, a substituted or unsubstituted alkenyl, and R 7 , R 9 and R 10 are a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, (Represents a substituted or unsubstituted alkenyl, and Z ⁇ represents a monovalent anion.)
  • R 11 represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, and W ⁇ represents a monovalent anion.
  • a leuco-type chromogen is converted into a pyridinium salt represented by the following general formula (I), a phosphonium salt represented by the following general formula (II), an imidazolium salt represented by the following general formula (III), And the stabilization method of the leuco chromogen characterized by making it coexist in the aqueous solution containing at least 1 sort (s) chosen from the group which consists of the isoquinolinium salt represented with the following general formula (IV).
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • R a represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl.
  • N represents an integer of 1 to 5
  • X ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 2 to R 5 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, and Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • R 6 and R 8 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, a substituted or unsubstituted alkenyl, and R 7 , R 9 and R 10 are a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl, (Represents a substituted or unsubstituted alkenyl, and Z ⁇ represents a monovalent anion.)
  • R 11 represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, and W ⁇ represents a monovalent anion.
  • a method, a reagent and a kit for accurately measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and a method for preserving a leuco chromogen-containing aqueous solution that enables accurate measurement of glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample And a method for stabilizing a leuco chromogen.
  • ⁇ represents measurement using the kit of Example 2
  • ⁇ represents measurement using the kit of Comparative Example 1
  • the vertical axis represents the reaction absorbance ( ⁇ 10 ⁇ 4 Abs)
  • the horizontal axis represents the theoretical concentration of HbA1c ( ⁇ mol / L).
  • ⁇ represents measurement using the kit of Example 3
  • ⁇ represents measurement using the kit of Comparative Example 1
  • the vertical axis represents the reaction absorbance ( ⁇ 10 ⁇ 4 Abs)
  • the horizontal axis represents the theoretical concentration of HbA1c ( ⁇ mol / L).
  • ⁇ represents measurement using the kit of Example 5
  • ⁇ represents measurement using the kit of Comparative Example 1
  • the vertical axis represents the reaction absorbance ( ⁇ 10 ⁇ 4 Abs)
  • the horizontal axis represents the theoretical concentration of HbA1c ( ⁇ mol / L).
  • ⁇ represents measurement using the kit of Example 6,
  • ⁇ represents measurement using the kit of Comparative Example 1
  • the vertical axis represents the reaction absorbance ( ⁇ 10 ⁇ 4 Abs)
  • the horizontal axis represents the theoretical concentration of HbA1c ( ⁇ mol / L).
  • the method for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample comprises glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme, which are represented by the following general formula (I ), A phosphonium salt represented by the following general formula (II), an imidazolium salt represented by the following general formula (III), and an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV). It is a method characterized by reacting in the presence of at least one selected from the group, allowing fructosyl peptide oxidase to act on the resulting reaction product, and measuring the generated hydrogen peroxide. Specifically, it is a measuring method including the following steps.
  • Glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme are converted into a pyridinium salt represented by the following general formula (I), a phosphonium salt represented by the following general formula (II), a general formula (III) And a reaction in an aqueous medium containing at least one selected from the group consisting of an imidazolium salt represented by formula (IV) and an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV); (2) a step of producing hydrogen peroxide by allowing fructosyl peptide oxidase to act on the reaction product obtained in step (1); (3) measuring hydrogen peroxide produced in step (2); and (4) A calibration curve representing the relationship between the amount of hydrogen peroxide and the concentration of glycated hemoglobin prepared in advance using a known concentration of glycated hemoglobin is compared with the amount of hydrogen peroxide measured in step (3) to contain hemoglobin. Determining the glycated hemoglobin concentration in the sample.
  • the method for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample of the present invention includes a method for calculating the ratio of the amount of glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample to the total hemoglobin (that is, the total hemoglobin obtained by combining hemoglobin and glycated hemoglobin). Include.
  • the method for measuring glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample of the present invention is specifically a measurement method including the following steps.
  • the measurement of the total hemoglobin amount in the above step (1) is performed on a hemoglobin-containing sample by using a pyridinium salt represented by the following general formula (I), a phosphonium salt represented by the following general formula (II), and a general formula described later.
  • a pyridinium salt represented by the following general formula (I) a phosphonium salt represented by the following general formula (II), and a general formula described later.
  • At least one selected from the group consisting of an imidazolium salt represented by (III) and an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV) is added to denature hemoglobin and glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample. It can also be done after.
  • the measurement of the total amount of hemoglobin in the hemoglobin-containing sample is carried out using a proteolytic enzyme, a pyridinium salt represented by the following general formula (I), a phosphonium salt represented by the following general formula (II), Denatured hemoglobin and glycated hemoglobin by adding at least one selected from the group consisting of an imidazolium salt represented by the following general formula (III) and an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV) It can also be carried out after degrading with a proteolytic enzyme.
  • the hemoglobin-containing sample in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it contains hemoglobin and can be applied to the measurement method of glycated hemoglobin of the present invention.
  • whole blood, blood cells, and blood cells mixed with plasma And samples obtained by hemolyzing these samples.
  • the hemolysis treatment is not particularly limited as long as it is a treatment that hemolyzes whole blood, blood cells, and a sample in which blood cells are mixed with plasma, and examples thereof include physical methods, chemical methods, and biological methods.
  • Examples of the physical method include a method using a hypotonic solution such as distilled water and a method using ultrasonic waves.
  • Examples of the chemical method include a method using an organic solvent such as methanol, ethanol, and acetone, and a method using a polyoxyethylene surfactant.
  • biological methods include a method using an antibody or complement.
  • the glycated hemoglobin in the present invention is produced by binding sugar such as glucose to hemoglobin, and examples thereof include hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, hemoglobin A1c, and hemoglobin A1c is preferable.
  • a pyridinium salt represented by the following general formula (I) [hereinafter referred to as compound (I)] is used as the pyridinium salt.
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • R a represents a hydrogen atom, substituted or unsubstituted alkyl, or substituted or unsubstituted alkenyl
  • n represents an integer of 1 to 5
  • X ⁇ represents a monovalent anion.
  • Examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl in R 1 include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms, branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms, and the like. A branched alkyl having 8 to 20 is preferable.
  • linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (Cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl , Isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like.
  • linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms examples include octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl Etc.
  • Examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl, isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like. It is done.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 2 to 20 carbon atoms, and preferably alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include vinyl, propyl, allyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, oleyl, nonadecenyl, icocenyl Etc.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms examples include octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, oleyl, nonadecenyl, icocenyl and the like.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • X in the compound (I) - represents a monovalent anion.
  • monovalent anions include halogen ions, OH ⁇ , PF 6 ⁇ , BF 4 ⁇ , CH 3 CH 2 OSO 3 ⁇ , (CF 3 SO 2 ) 2 N ⁇ and the like.
  • halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • Specific examples (products) of compound (I) include, for example, 1-dodecylpyridinium chloride (hereinafter referred to as C12py; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 1-cetylpyridinium chloride (hereinafter referred to as C16py; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), Examples thereof include 1-cetyl-4-methylpyridinium chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), N-octadecyl-4-stilbazole bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and the like.
  • C12py 1-dodecylpyridinium chloride
  • C16py manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • Examples thereof include 1-cetyl-4-methylpyridinium chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), N-octadecyl-4-stilbazole bromide (manufactured by Tokyo
  • the concentration of compound (I) in the reaction solution in the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • a phosphonium salt represented by the following general formula (II) [hereinafter referred to as compound (II)] is used.
  • R 2 to R 5 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, and Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the substituent in the substituted alkyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • Examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • the substituent in the substituted alkyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • Examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • Y ⁇ represents a monovalent anion.
  • monovalent anions include halogen ions, OH ⁇ , PF 6 ⁇ , BF 4 ⁇ , CH 3 CH 2 OSO 3 ⁇ , (CF 3 SO 2 ) 2 N ⁇ , B (C 6 H 5 ) 4 ⁇ , And anions such as benzotriazolate.
  • halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • Specific examples (products) of compound (II) include, for example, tetraoctyl phosphonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), tributyl octyl phosphonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), tributyl dodecyl phosphonium bromide (hereinafter referred to as C12TBP); Product), tributylhexadecylphosphonium bromide (hereinafter referred to as C16TBP; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and the like.
  • the concentration of compound (II) in the reaction solution is usually 0.0001 to 10%.
  • an imidazolium salt represented by the following general formula (III) [hereinafter referred to as compound (III)] is used.
  • R 6 and R 8 are the same or different and each represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl
  • R 7 , R 9 , and R 10 are hydrogen atoms, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or represents unsubstituted alkenyl
  • Z - represents a monovalent anion
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • examples of the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl include alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • examples of the alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • Z ⁇ represents a monovalent anion.
  • the halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • compound (III) examples include, for example, 1-methyl-3-octylimidazolium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 1-methyl-3-octylimidazolium chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), And dodecyl-2-methyl-3-benzylimidazolium chloride (hereinafter referred to as C12MBI; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • C12MBI dodecyl-2-methyl-3-benzylimidazolium chloride
  • the concentration of compound (III) in the reaction solution is usually 0.0001 to 10%.
  • an isoquinolinium salt represented by the following general formula (IV) [hereinafter referred to as compound (IV)] is used as the isoquinolinium salt.
  • R 11 represents substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, and W ⁇ represents a monovalent anion.
  • examples of the alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the alkenyl in the substituted or unsubstituted alkenyl includes, for example, alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • examples of the substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • examples of the phenyl group-substituted alkyl include benzyl and 1-phenylethyl.
  • examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • W ⁇ represents a monovalent anion.
  • the monovalent anion include anions such as halogen ions.
  • the halogen ion include Cl ⁇ , Br ⁇ , I ⁇ and the like.
  • product (products) of compound (IV) include, for example, N-laurylisoquinolinium chloride (manufactured by NOF Corporation), N-larlylisoquinolinium bromide (manufactured by NOF Corporation) and the like.
  • the concentration of compound (IV) in the reaction solution is usually 0.0001 to 10%.
  • the total hemoglobin amount can be determined by a known method, for example, the cyanmethemoglobin method, the oxyhemoglobin method, the SLS-hemoglobin method, or the like.
  • the total amount of hemoglobin is not only the hemoglobin-containing sample itself but also at least one selected from the group consisting of compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV) to the hemoglobin-containing sample.
  • Sample obtained by adding at least one selected from the group consisting of compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV) to a sample obtained or a hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme On the other hand, it can also be determined by applying a cyanmethemoglobin method, an oxyhemoglobin method, an SLS-hemoglobin method, or the like.
  • the reaction can be performed under any conditions as long as the proteolytic enzyme can act on glycated hemoglobin.
  • the reaction between the glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme is preferably performed in an aqueous medium. Examples of the aqueous medium include an aqueous medium described later. 1.
  • the reaction temperature in the reaction of glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample with a proteolytic enzyme is usually 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is usually 1 minute to 3 hours. 5 minutes to 1 hour is preferred.
  • the concentration of the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as the reaction between the glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme proceeds, and is usually 50 to 25000 kU / L, preferably 250 to 10,000 kU / L. L.
  • the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and generates a glycated peptide from glycated hemoglobin.
  • serine protease chymotrypsin, subtilisin, etc.
  • cysteine protease papain, caspase
  • Etc. aspartic protease
  • pepsin, cathepsin D, etc. metalloprotease (thermolysin, etc.)
  • N-terminal threonine protease glutamic acid protease and the like.
  • commercially available proteolytic enzymes can also be used.
  • protease P “Amano” 3G examples include protease P “Amano” 3G, protease K “Amano” (above, Amano Enzyme), actinase AS, actinase E (above).
  • protease P “Amano” 3G examples include protease P “Amano” 3G, protease K “Amano” (above, Amano Enzyme), actinase AS, actinase E (above).
  • Kaken Pharma Co., Ltd. examples include thermolysin (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.), Sumiteam MP (manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.) and the like.
  • a reaction product containing a glycated peptide is generated by a reaction between glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme.
  • the glycated peptide in the reaction product then reacts with fructosyl peptide oxidase to produce hydrogen peroxide.
  • the reaction between the glycated peptide and fructosyl peptide oxidase is preferably performed in an aqueous medium. Examples of the aqueous medium include an aqueous medium described later.
  • the reaction temperature in the reaction between the glycated peptide and fructosyl peptide oxidase is usually 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is usually 1 minute to 3 hours, and 2.5 minutes to 1 Time is preferred.
  • the concentration of fructosyl peptide oxidase is not particularly limited as long as the reaction between glycated hemoglobin and fructosyl peptide oxidase proceeds, and is usually 0.1 to 30 kU / L, preferably 0.2 to 15 kU / L.
  • the fructosyl peptide oxidase used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on a glycated peptide to generate hydrogen peroxide.
  • it is derived from filamentous fungi, yeast, actinomycetes, bacteria, Examples include fructosyl peptide oxidase derived from bacteria.
  • commercially available fructosyl peptide oxidase can also be used. Examples of commercially available products include FPOX-CE (manufactured by Kikkoman), FPOX-EE (manufactured by Kikkoman), and FPOX-CET (manufactured by Kikkoman). Etc.
  • the method for measuring the generated hydrogen peroxide is not particularly limited as long as it is a method capable of measuring hydrogen peroxide. Examples thereof include a method using an electrode and a method using a reagent for measuring hydrogen peroxide. A method using a measuring reagent is preferred.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent for converting hydrogen peroxide into a detectable substance. Examples of the detectable substance include a dye, light (luminescence), fluorescence, and the like, and a dye is preferable.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and an oxidative coloring type chromogen.
  • examples of the oxidative coloring type chromogen include an oxidative coupling type chromogen and a leuco chromogen, and a leuco chromogen is preferred.
  • leuco chromogen examples include phenothiazine chromogen, triphenylmethane chromogen, diphenylamine chromogen, o-phenylenediamine, hydroxypropionic acid, diaminobenzidine, tetramethylbenzidine and the like, and phenothiazine.
  • a chromogen is preferred.
  • the phenothiazine chromogen examples include 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino).
  • -10H-phenothiazine MCDP
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • triphenylmethane chromogen examples include N, N, N ′, N ′, N ′′, N ′′ -hexa (3-sulfopropyl) -4,4 ′, 4 ′′ -triaminotriphenyl And methane (TPM-PS).
  • diphenylamine chromogen examples include N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sodium salt (DA-64), 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA) and the like.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and a chemiluminescent substance.
  • examples of the chemiluminescent substance include luminol, isoluminol, lucigenin, and acridinium ester.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and a fluorescent substance.
  • examples of the fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and coumarin.
  • the glycated hemoglobin measurement reagent in a hemoglobin-containing sample of the present invention includes a proteolytic enzyme, fructosyl peptide oxidase, compound (I), compound (II), and compound It is a reagent containing at least one selected from the group consisting of (III) and compound (IV), and is used in the method for measuring glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample of the present invention.
  • the measurement reagent of the present invention may further contain a hydrogen peroxide measurement reagent.
  • proteolytic enzyme fructosyl peptide oxidase, compound (I), compound (II), compound (III), compound (IV) and hydrogen peroxide measuring reagent in the measuring reagent of the present invention
  • examples include proteolytic enzyme, fructosyl peptide oxidase, compound (I), compound (II), compound (III), compound (IV), and a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the concentration of the proteolytic enzyme in the measurement reagent of the present invention is usually 50 to 25000 kU / L, preferably 250 to 10000 kU / L.
  • the concentration of fructosyl peptide oxidase in the measurement reagent of the present invention is usually 0.1 to 30 kU / L, preferably 0.2 to 15 kU / L.
  • the concentration of compound (I) in the measurement reagent of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the concentration of compound (II) in the measurement reagent of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the concentration of compound (III) in the measurement reagent of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the concentration of compound (IV) in the measurement reagent of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the measurement reagent of the present invention may contain an aqueous medium, a stabilizer, an antiseptic, a salt, an interference substance erasing agent, an organic solvent, and the like, if necessary.
  • the aqueous medium include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
  • the pH of the aqueous medium is not particularly limited as long as it enables the measurement method of glycated hemoglobin using the glycated hemoglobin measurement reagent of the present invention, and is, for example, pH 4 to 10.
  • a buffer solution is used as the aqueous medium, it is desirable to use a buffering agent corresponding to the set pH.
  • the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer, and the like.
  • Good buffering agents include, for example, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) Piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) ), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfone Acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethane Sulfonic acid (HEPE
  • the concentration of the buffer is usually 0.001 to 2.0 mol / L, preferably 0.005 to 1.0 mol / L.
  • stabilizers include polyoxyethylene surfactants such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride, calcium acetate, calcium nitrate, potassium ferrocyanide, bovine serum albumin (BSA), and polyoxyethylene alkylphenyl ether. Agents and the like.
  • the preservative include sodium azide and antibiotics.
  • the salts include sodium chloride, sodium nitrate, sodium sulfate, sodium carbonate, sodium formate, sodium acetate, potassium chloride, potassium nitrate, potassium sulfate, potassium carbonate, potassium formate, and potassium acetate.
  • the interfering substance eliminating agent include ascorbic acid oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid.
  • organic solvent examples include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), dioxane, acetone, methanol, ethanol and the like as a solubilizing agent for the leuco chromogen in an aqueous medium.
  • Kit for measuring glycated hemoglobin in a sample containing hemoglobin The reagent for measuring glycated hemoglobin in a sample containing hemoglobin of the present invention may be stored, distributed and used in the form of a kit.
  • the kit for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample of the present invention is used in the method for measuring glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample of the present invention.
  • Examples of the measurement kit of the present invention include a two-reagent kit, a three-reagent kit, and the like, and a two-reagent kit is preferable.
  • the glycated hemoglobin measurement kit in the hemoglobin-containing sample of the present invention is not particularly limited as long as it is a kit that enables the method for measuring glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample of the present invention.
  • a decomposing enzyme, a first reagent containing at least one selected from the group consisting of compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV); and a second reagent containing fructosyl peptide oxidase A kit comprising: a proteolytic enzyme; a first reagent comprising at least one selected from the group consisting of compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV); and a fructosyl peptide A second reagent containing an oxidase and a hydrogen peroxide measuring reagent in either or both of the first reagent and the second reagent, etc.
  • peroxidase and leuco chromogen are contained in separate reagents. That is, it is preferable that the peroxidase and the leuco chromogen are contained in the first reagent and the second reagent or in the second reagent and the first reagent, respectively.
  • the concentration of the proteolytic enzyme in the measurement kit of the present invention is usually 100 to 30000 kU / L, preferably 500 to 10000 kU / L.
  • the concentration of fructosyl peptide oxidase in the measurement kit of the present invention is usually 0.5 to 100 kU / L, preferably 1 to 50 kU / L.
  • the concentration of compound (I) in the reagent constituting the measurement kit of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the concentration of compound (II) in the measurement kit of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the concentration of compound (III) in the measurement kit of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the concentration of compound (IV) in the measurement kit of the present invention is usually 0.0001 to 10%.
  • the present invention relates to a method for preserving a leuco chromogen-containing aqueous solution.
  • the leuco chromogen is stably stored in the aqueous solution by the method for storing the leuco chromogen-containing aqueous solution of the present invention.
  • that the leuco chromogen is stably stored in an aqueous solution means that the leuco chromogen is stable to heat or stable to light in an aqueous solution. But preferably means stable to heat and light.
  • At least one selected from the group consisting of compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV) is leuco chromogen.
  • compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV) include the aforementioned compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV).
  • the concentration of the compound (I), the compound (II), the compound (III) and the compound (IV) in the method for preserving the leuco chromogen-containing aqueous solution of the present invention is usually 0.0001 to 10%. 0005 to 5% is preferable.
  • the storage stability of the leuco chromogen can be evaluated by coloring the aqueous solution containing the leuco chromogen.
  • the smaller the coloring of the leuco chromogen-containing aqueous solution, that is, the lower the absorbance of the leuco chromogen-containing aqueous solution the better the stability.
  • the leuco chromogen-containing aqueous solution in the present invention is an aqueous solution in which the leuco chromogen is dissolved in an aqueous medium, and can be prepared by adding and dissolving the leuco chromogen in an aqueous medium. it can.
  • the aqueous medium in which the leuco chromogen is dissolved is not particularly limited as long as the leuco chromogen is dissolved. Examples thereof include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
  • an organic solvent can be used as a solubilizing agent for the leuco chromogen in an aqueous medium.
  • a leuco chromogen-containing aqueous solution by adding a leuco chromogen dissolved in an organic solvent to an aqueous medium and dissolving the leuco chromogen in an aqueous medium.
  • the organic solvent is not particularly limited as long as it dissolves the leuco chromogen, and examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), dioxane, acetone, methanol, and ethanol.
  • the pH of the aqueous medium is not particularly limited as long as the leuco chromogen is dissolved, and is, for example, pH 4 to 10.
  • a buffer solution is used as the aqueous medium, it is desirable to use a buffering agent corresponding to the set pH.
  • the buffer used in the buffer include the aforementioned buffer.
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as the leuco chromogen is dissolved, and is usually 0.001 to 2.0 mol / L, preferably 0.005 to 1.0 mol / L.
  • Examples of the leuco chromogen in the present invention include the leuco chromogen described above.
  • the present invention relates to a method for stabilizing a leuco chromogen.
  • Stabilization of the leuco chromogen in the present invention means that the leuco chromogen in the leuco chromogen-containing aqueous solution is stabilized against heat or stabilized against light. But preferably means stabilized against heat and light.
  • the stabilization of the leuco chromogen can be evaluated by coloring the aqueous solution containing the leuco chromogen. The greater the coloration, that is, the greater the absorbance of the aqueous solution containing the leuco chromogen, the more stable the leuco chromogen is. Assess that the nature is bad. On the other hand, the smaller the coloration of the leuco chromogen-containing aqueous solution, that is, the lower the absorbance of the leuco chromogen-containing aqueous solution, the better the stability.
  • the leuco chromogen is selected from at least one selected from the group consisting of compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV). Coexist in aqueous solution.
  • the compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV) used in the method for stabilizing the leuco chromogen of the present invention the above-mentioned compound (I), compound (II), compound (III) and compound (IV) are mentioned.
  • the leuco chromogen and leuco chromogen-containing aqueous solution used in the stabilization method of the present invention include the leuco chromogen and the leuco chromogen-containing aqueous solution in the above-described storage method of leuco chromogen. Can be mentioned.
  • the concentration of the leuco chromogen in the aqueous solution containing the leuco chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration at which the leuco chromogen is dissolved in an aqueous medium. 0 mmol / L, preferably 0.0005 to 1.0 mmol / L.
  • the concentration of the compound (I), the compound (II), the compound (III) and the compound (IV) to be coexisted with the leuco chromogen in the aqueous solution is usually 0.0001 to 10%. 0005 to 5% is preferable.
  • the method for measuring the stability of the leuco chromogen to heat in the present invention is not particularly limited as long as the stability of the leuco chromogen to heat can be measured.
  • the leuco chromogen contains a leuco chromogen.
  • Examples include a method of measuring the color of the aqueous solution after storing the aqueous solution at 5 ° C. or 30 ° C. with an absorptiometer.
  • the method for measuring the stability of the leuco chromogen with light in the present invention is not particularly limited as long as the stability of the leuco chromogen with respect to light can be measured.
  • Examples include a method of irradiating the aqueous solution containing light for 15 hours and measuring the coloration of the aqueous solution after irradiation with an absorptiometer.
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.0) 10 mmol / L C12py 2.0g / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.0) 10 mmol / L C16py 0.35g / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.0) 10 mmol / L C12TBP 0.8g / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.0) 10 mmol / L C16TBP 0.2g / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.0) 10 mmol / L C12MBI 0.5g / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.0) 10 mmol / L Fillet Q 0.5g / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • Comparative Example 1 A kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.0) 10 mmol / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • the kit of Example 1 was used as a sample, and blood cells obtained by centrifuging human blood were diluted with deionized water and hemolyzed to prepare a KO500 method, which is a standard method for measuring HbA1c.
  • a KO500 method which is a standard method for measuring HbA1c.
  • the HbA1c concentration is 2.7 ⁇ mol / L, 3.4 ⁇ mol / L, 4.0 ⁇ mol / L, 5.0 ⁇ mol / L, and 6.8 ⁇ mol / L.
  • the reaction absorbance for each sample was measured by the following procedure.
  • FIG. 1 shows the relationship between the HbA1c concentration and ⁇ E in each sample.
  • Comparative Example 2 The reaction absorbance for each sample was calculated by the same method as in Example 7, except that the kit of Comparative Example 1 was used instead of the kit of Example 1 in Example 7. As shown in FIG. 1, in the kit of Comparative Example 1 not containing C12py, no quantitative relationship was found between the HbA1c concentration and the reaction absorbance, whereas in the kit of Example 1 containing C12py, A quantitative relationship was found between HbA1c concentration and reaction absorbance. Therefore, it was revealed that the HbA1c in the sample can be measured by using the kit of Example 1.
  • the reaction absorbance for each sample was calculated by the same method as in Example 7 except that the kit of Example 2 was used instead of the kit of Example 1 in Example 7.
  • FIG. 2 shows the relationship between the HbA1c concentration and ⁇ E in each sample.
  • the kit of Comparative Example 1 not containing C16py
  • no quantitative relationship was found between the HbA1c concentration and the reaction absorbance
  • the kit of Example 2 containing C16py A quantitative relationship was found between HbA1c concentration and reaction absorbance. Therefore, it became clear that the HbA1c in the sample can be measured by using the kit of Example 2.
  • FIG. 3 shows the relationship between the HbA1c concentration and ⁇ E in each sample.
  • a quantitative relationship was not found between the HbA1c concentration and the reaction absorbance
  • a quantitative relationship was found between HbA1c concentration and reaction absorbance. Therefore, it became clear that HbA1c in the sample can be measured by using the kit of Example 3.
  • FIG. 4 shows the relationship between the HbA1c concentration and ⁇ E in each sample.
  • a quantitative relationship was not found between the HbA1c concentration and the reaction absorbance
  • a quantitative relationship was found between HbA1c concentration and reaction absorbance. Therefore, it was revealed that the HbA1c in the sample can be measured by using the kit of Example 4.
  • FIG. 5 shows the relationship between the HbA1c concentration and ⁇ E in each sample.
  • FIG. 5 shows, in the kit of Comparative Example 1 not containing C12MBI, no quantitative relationship was found between the HbA1c concentration and the reaction absorbance, whereas in the kit of Example 5 containing C12MBI, A quantitative relationship was found between HbA1c concentration and reaction absorbance. Therefore, it became clear that HbA1c in the sample can be measured by using the kit of Example 5.
  • FIG. 6 shows the relationship between the HbA1c concentration and ⁇ E in each sample.
  • FIG. 6 shows, in the kit of Comparative Example 1 that does not contain fillet Q, no quantitative relationship is found between the HbA1c concentration and the reaction absorbance, whereas in the kit of Example 6 that contains fillet Q. A quantitative relationship was found between HbA1c concentration and reaction absorbance. Therefore, it became clear that the HbA1c in the sample can be measured by using the kit of Example 6.
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent MES pH 6.0
  • 10 mmol / L C16py 0.35g / L Calcium acetate monohydrate 10mmol / L Actinase AS 450kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA pH 7.0
  • the kit of Example 13 was used as a sample, and blood cells obtained by centrifuging human blood were diluted with deionized water and hemolyzed to prepare “Determiner L HbA1c” (Kyowa Medex Co., Ltd.).
  • the HbA1c concentration is 2.5 ⁇ mol / L, 3.7 ⁇ mol / L, 4.0 ⁇ mol / L, 4.7 ⁇ mol / L, and the SLS-hemoglobin method, which is one of the hemoglobin measurement methods.
  • the hemolyzed sample valued at 6.3 ⁇ mol / L the reaction absorbance for each sample was measured by the following procedure.
  • FIG. 7 shows the relationship between the HbA1c concentration and ⁇ E in each sample.
  • Comparative Example 4 The reaction absorbance for each sample was calculated in the same manner as in Example 14 except that the kit of Comparative Example 3 was used instead of the kit of Example 13 in Example 14. As shown in FIG. 7, in the kit of Comparative Example 3 not containing C16py, no quantitative relationship was found between the HbA1c concentration and the reaction absorbance, whereas in the kit of Example 13 containing C16py, A quantitative relationship was found between HbA1c concentration and reaction absorbance. Therefore, it became clear that HbA1c in the sample can be measured by using the kit of Example 13.
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 7.0) 10 mmol / L C12py 1.6g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 7.0) 10 mmol / L C12TBP 0.8g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • a kit for measuring HbA1c comprising the following first reagent and second reagent was prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 7.0) 10 mmol / L C12MBI 0.9g / L Calcium chloride dihydrate 10mmol / L Thermolysin 1200kU / L DA-67 20 ⁇ mol / L
  • Second reagent ADA (pH 7.0) 50 mmol / L FPOX-CE 12kU / L Peroxidase 120 kU / L
  • Example 15 Using the kit of Example 15 as the HbA1c measurement kit, and using whole blood derived from 10 subjects suspected of having diabetes as a sample, the total hemoglobin concentration (in HbA1c concentration (amount)) in each sample according to the following procedure. The ratio [HbA1c (%)] to the amount) was determined.
  • JDS Japan Diabetes Society
  • each blood cell HbA1c (%) in the fraction was determined by an immunoassay using a determiner L HbA1c (manufactured by Kyowa Medex) according to the method described in the package insert of the determiner L HbA1c.
  • DA-67-containing aqueous solution having the following composition was prepared.
  • DA-67-containing aqueous solution stored at 5 ° C. for 7 days and DA-67-containing aqueous solution stored at 30 ° C. for 7 days are used as samples, and DA-67 is stored at 5 ° C. for 7 days.
  • the absorbance with respect to the aqueous solution ( ⁇ E 5 ° C. ) and the absorbance with respect to the DA-67-containing aqueous solution stored at 30 ° C. for 7 days ( ⁇ E 30 ° C. ) were measured.
  • the DA-67-containing aqueous solution prepared in Example 21 was irradiated with 1100 lux of light for 15 hours, and the stability of DA-67 by light was evaluated. Using the DA-67-containing aqueous solution after light irradiation as a sample, the same method as in Example 21 was performed, and the absorbance ⁇ E 3 for the DA-67-containing aqueous solution after light irradiation was measured. The measurement results are shown in Table 2.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩及びイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。　本発明により、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定する方法が提供される。

Description

糖化ヘモグロビンの測定方法
　本発明は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キットに関する。さらに、本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。
　糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコースが結合した糖化物である。ヘモグロビンはα鎖、β鎖からなる四量体の構造を取っているが、β鎖のＮ末端が糖化したものはヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれ、血糖値が高い程、増加することから、糖尿病マーカーとして、血糖コントロールの指標に、臨床検査において日常的に測定されている。
　糖化ヘモグロビンの測定方法としては、ＨＰＬＣ法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定法、糖化タンパク質に作用する酵素と、糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素とを用いる酵素測定法等が知られている。
　糖化ヘモグロビンの酵素測定法としては、先ず、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを変性剤により変性させ、変性糖化ヘモグロビンにタンパク質分解酵素を作用させ、次いで生成した糖化ペプチドに糖化ペプチド酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法等が知られている。ここで、変性剤は、タンパク質分解酵素の糖化ヘモグロビンへの作用を可能とするために用いられ、これまでに、酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ－アシルタウリン又はその塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩（特許文献１）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩類等の陰イオン系界面活性剤（特許文献２）、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のスルホン酸化合物（特許文献３）、スルホン酸化合物およびニトロ化合物（特許文献４）、第四級アンモニウム塩、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウム、ラウリルジメチルアミンオキサイド等（特許文献５）の変性剤が知られている。
　また、糖化ヘモグロビンの酵素測定法においては、糖化ヘモグロビンを過酸化水素に変換し、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法がしばしば用いられる。ここで酸化発色型色原体として、しばしばロイコ型色原体が用いられる。ロイコ型色原体は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素と反応し、色素を生成する色原体の１種であり、カップリング型色原体とは異なり、それ単独で色素を生成する色原体であり、フェノチアジン系のロイコ型色原体、トリフェニルメタン系のロイコ型色原体、ジフェニルアミン系のロイコ型色原体等が知られている（例えば、特許文献６～８参照）。
　ロイコ型色原体は、高感度色原体として、糖化ヘモグロビンのように、試料中に微量しか存在しない定量すべき成分の定量に好適に用いられる（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、一方で、その保存安定性が悪く、特に、溶液中では時間と共に、自然発色してしまうという欠点を有し、このロイコ型色原体の有する安定性不良により、試料中の定量すべき成分が正確に測定できない、という問題が生じている。
　このロイコ型色原体の有する安定性不良という課題に対して、これまで、ロイコ型色原体の溶液中で安定化方法が検討され、報告されている（例えば、特許文献９、１０参照）。
ＷＯ２００６／０１３９２１パンフレット ＷＯ２００５／０４９８５８パンフレット ＷＯ２００４／００７７６０パンフレット ＷＯ２００３／１０７０１１パンフレット 特開２００９－１５９９８９号公報 特開昭５７－０２９２９７号公報 特開平３－２０６８９６号公報 特開昭６２－０９３２６１号公報 ＷＯ２００５／０８８３０５パンフレット ＷＯ２００７／０８３７０３パンフレット
臨床検査，1997年，Vol.41，No.9，p.1014-1019
　糖化ヘモグロビンの酵素測定法において、今まで知られている糖化ヘモグロビンの変性剤については、糖化ヘモグロビンの変性が充分でないために、タンパク質分解酵素反応が満足に進行せず、糖化ヘモグロビンの正確な測定が行えないという問題があった。また、糖化ヘモグロビンの測定方法において用いられるロイコ型色原体については、従来知られている保存方法は厳しい条件下での保存を要する等、必ずしも満足できる方法とは言えない。
　本発明の目的は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定する方法、試薬及びキット、並びに、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの正確な測定を可能にする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法を提供することにある。
　本発明者らは本課題を鋭意検討したところ、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、又は、イソキノリニウム塩存在下に反応させることにより、ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを充分に変性させることができ、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定できる、という知見を見出した。さらに、ピリジニウム塩、ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、又は、イソキノリニウム塩がロイコ型色原体を安定化する、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］～［１８］に関する。
［１］　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
［２］　過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、［１］記載の測定方法。
［３］　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［２］記載の測定方法。
［４］　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［３］記載の測定方法。
［５］　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［４］記載の測定方法。
［６］　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
［７］　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、［６］記載の測定試薬。
［８］　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である［７］記載の測定試薬。
［９］　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［８］記載の測定試薬。
［１０］　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［９］記載の測定試薬。
［１１］　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
［１２］　さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、［１１］記載の測定キット。
［１３］　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１２］記載の測定キット。
［１４］　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１３］記載の測定キット。
［１５］　ロイコ型色原体含有水溶液に、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
［１６］　ロイコ型色原体を、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
（式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
（式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
（式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
（式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
［１７］　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である［１５］または［１６］記載の方法。
［１８］　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである［１７］記載の方法。
　本発明により、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定する方法、試薬及びキット、並びに、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの正確な測定を可能にする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法が提供される。
実施例１及び比較例１のキットを用いる試料中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃとも記す）の測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例１のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。 実施例２及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例２のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。 実施例３及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例３のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。 実施例４及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例４のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。 実施例５及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。□は、実施例５のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。 実施例６及び比較例１のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。▲は、実施例６のキット、●は、比較例１のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。 実施例１３及び比較例３のキットを用いる試料中のＨｂＡ１ｃの測定における、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との関係を示すグラフである。■は、実施例１３のキット、●は、比較例３のキットを用いた測定を表し、縦軸は反応吸光度（×１０－４Ａｂｓ）を、横軸はＨｂＡ１ｃ理論濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表す。
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
　本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする方法である。
　具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
（１）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水性媒体中で反応させる工程；
（２）工程（１）で得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した過酸化水素を測定する工程；及び、
（４）既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン濃度との関係を表す検量線に、工程（３）で測定した過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン濃度を決定する工程。
　また、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量に対する割合を算出する方法をも包含する。この場合、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、具体的には、以下の工程を含む測定方法である。
（１）ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンを合わせた総ヘモグロビン）量を測定する工程；
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水性媒体中で反応させる工程；
（３）工程（２）で得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、過酸化水素を生成させる工程；
（４）工程（３）で生成した過酸化水素を測定する工程；
（５）既知量の糖化ヘモグロビンを用いて予め作成した、過酸化水素量と糖化ヘモグロビン量との関係を表す検量線に、工程（４）で測定した過酸化水素量を照らし合わせて、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量を測定する工程；及び、
（６）工程（１）で測定した総ヘモグロビン量と、工程（５）で測定した糖化ヘモグロビン量から、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン量の総ヘモグロビン量に対する割合を算出する工程。
　尚、上記工程（１）の総ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン含有試料に、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加して、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンを変性させた後に行うこともできる。
　また、ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量の測定は、ヘモグロビン含有試料に、タンパク質分解酵素と、後述の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、後述の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、後述の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、後述の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種とを添加して、変性させたヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンをタンパク質分解酵素で分解させた後に行うこともできる。
　本発明の測定方法におけるヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを含有し、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法が適用可能な試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
　本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられ、ヘモグロビンＡ１ｃが好ましい。
　本発明において、ピリジニウム塩としては、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩［以下、化合物（Ｉ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。
　Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられ、炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキルが好ましい。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。
　Ｒ１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられ、炭素数８～２０のアルケニルが好ましい。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えばビニル、プロピル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
　Ｒ１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒａにおいて、置換もしくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルにとしては、例えば炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。
　Ｒａにおいて、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　ピリジン環上に２つ以上の置換基がある場合、置換基は同じであっても異なっていてもよい。化合物（Ｉ）におけるＸ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えば１－ドデシルピリジニウムクロライド（以下、Ｃ１２ｐｙと記す；東京化成社製）、１－セチルピリジニウムクロライド（以下、Ｃ１６ｐｙと記す；東京化成社製）、１－セチル－４－メチルピリジニウムクロライド（東京化成社製）、Ｎ－オクタデシル－４－スチルバゾールブロミド（東京化成社製）等が挙げられる。
　本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における化合物（Ｉ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１～１０％である。
　本発明において、ホスホニウム塩としては、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩［以下、化合物（ＩＩ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。
　Ｒ２において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｒ３～Ｒ５において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｙ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、B(C6H5)4 -、ベンゾトリアゾレート等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばテトラオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルオクチルホスホニウムブロマイド（東京化成社製）、トリブチルドデシルホスホニウムブロマイド（以下、Ｃ１２ＴＢＰと記す；東京化成社製）、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロマイド（以下、Ｃ１６ＴＢＰと記す；東京化成社製）等が挙げられる。
　本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法における化合物（ＩＩ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１～１０％である。
　本発明において、イミダゾリウム塩としては、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩［以下、化合物（ＩＩＩ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。
　Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒ６において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。
　Ｒ６において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、前述の炭素数１～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。
　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｚ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン、OH-、PF6 -、BF4 -、CH3CH2OSO3 -、(CF3SO2)2N-、(CH3O)2P(=O)O-、B(C6H5)4 -、FeCl4 -、CF3BF3 -、CF3SO3 -、(NC)2N-、CH3(OCH2CH2)2OSO3 -、CH3CH2OSO3 -、HSO4 -、4-CH3C6H4SO3 -等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（ＩＩＩ）の具体例（製品）としては、例えば１－メチル－３－オクチルイミダゾリウムブロマイド（東京化成社製）、１－メチル－３－オクチルイミダゾリウムクロライド（東京化成社製）、１－ドデシル－２－メチル－３－ベンジルイミダゾリウムクロライド（以下、Ｃ１２ＭＢＩと記す；和光純薬工業社製）等が挙げられる。
　本発明の測定方法における化合物（ＩＩＩ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１～１０％である。
　本発明において、イソキノリニウム塩としては、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩［以下、化合物（ＩＶ）という］が使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。
　Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０の直鎖アルキル、炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数８～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０の分岐アルキル等が挙げられる。
　Ｒ１１において、置換若しくは非置換のアルケニルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。
　Ｒ１１において、置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。フェニル基置換アルキルとしては、例えばベンジル、１－フェニルエチル等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　Ｗ－は、１価のアニオンを表す。１価のアニオンとしては、例えばハロゲンイオン等のアニオンが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、例えばCl-、Br-、I-等が挙げられる。
　化合物（ＩＶ）の具体例（製品）としては、例えばＮ－ラウリルイソキノリニウムクロライド（日油社製）、Ｎ－ラルリルイソキノリニウムブロマイド（日油社製）等が挙げられる。
　本発明の測定方法における化合物（ＩＶ）の反応液中の濃度は、通常０．０００１～１０％である。
　総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等によって決定することができる。総ヘモグロビン量は、ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、ヘモグロビン含有試料に、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加して得られる試料や、ヘモグロビン含有試料に、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種とタンパク質分解酵素とを添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等を適用することによっても決定することができる。
　化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水性媒体中での、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応は、タンパク質分解酵素が糖化ヘモグロビンに作用し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応における反応温度は、通常１０～５０℃であり、２０～４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間～３時間であり、２．５分間～１時間が好ましい。タンパク質分解酵素の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常５０～２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０～１００００ｋＵ／Ｌである。
　タンパク質分解酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから糖化ペプチドを生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えばセリンプロテアーゼ（キモトリプシン、スブチリシン等）、システインプロテアーゼ（パパイン、カスパーゼ等）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ等）、メタロプロテアーゼ（サーモリシン等）、Ｎ－末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。本発明においては、市販のタンパク質分解酵素も使用することができ、市販品としては例えばプロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＫ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＥ（以上、科研ファルマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、スミチームMP(新日本化学工業社製)等が挙げられる。
　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応により、糖化ペプチドを含む反応生成物が生成する。次いで、この反応生成物中の糖化ペプチドはフルクトシルペプチド酸化酵素と反応し、過酸化水素を生成する。糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応は、水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。糖化ペプチドとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応における反応温度は、通常１０～５０℃であり、２０～４０℃が好ましく、反応時間は、通常１分間～３時間であり、２．５分間～１時間が好ましい。フルクトシルペプチド酸化酵素の濃度としては、糖化ヘモグロビンとフルクトシルペプチド酸化酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常０．１～３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２～１５ｋＵ／Ｌである。
　本発明に用いられるフルクトシルペプチド酸化酵素としては、糖化ペプチドに作用して過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば糸状菌由来、酵母由来、放線菌由来、バクテリア由来、古細菌由来のフルクトシルペプチド酸化酵素等が挙げられる。本発明においては、市販のフルクトシルペプチド酸化酵素も使用することができ、市販品としては例えばＦＰＯＸ－ＣＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ－ＥＥ（キッコーマン社製）、ＦＰＯＸ－ＣＥＴ（キッコーマン社製）等が挙げられる。
　生成した過酸化水素の測定方法としては、過酸化水素を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
　検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７）が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳ）等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
　検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
　検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
（２）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
　本発明の、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む試薬であり、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法に用いられる。本発明の測定試薬は、さらに、過酸化水素測定試薬を含んでいてもよい。
　本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（ＩＶ）及び過酸化水素測定試薬としては、例えば、それぞれ、前述のタンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）、化合物（ＩＶ）及び過酸化水素測定試薬等が挙げられる。
　本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常５０～２５０００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは２５０～１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定試薬におけるフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．１～３０ｋＵ／Ｌであり、好ましくは０．２～１５ｋＵ／Ｌである。
　本発明の測定試薬における化合物（Ｉ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。本発明の測定試薬における化合物（ＩＩ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。本発明の測定試薬における化合物（ＩＩＩ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。本発明の測定試薬における化合物（ＩＶ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。
　本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、塩類、干渉物質消去剤、有機溶媒等が含有されてもよい。
　水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
　水性媒体のｐＨは、本発明の糖化ヘモグロビンの測定試薬を用いる糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とするｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４～１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
　グッドの緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は、通常０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
　安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等のポリオキシエチレン系界面活性剤等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。干渉物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤としてのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
（３）ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キット
　本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態で保存、流通及び使用されてよい。本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法に用いられる。本発明の測定キットとしては、例えば２試薬系のキット、３試薬系のキット等が挙げられ、２試薬系キットが好ましい。
　本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定キットは、本発明のヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定方法を可能とするキットであれば、特に制限はなく、２試薬系キットの場合は、例えばタンパク質分解酵素、及び、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むキットや、タンパク質分解酵素、及び、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含み、過酸化水素測定試薬を、第１試薬、第２試薬のいずれか又は両方に含むキット等が挙げられる。過酸化水素測定試薬として、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬を用いる場合は、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とは別々の試薬に含まれることが好ましい。すなわち、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とが、それぞれ第１試薬と第２試薬に、又は、第２試薬と第１試薬に含まれることが好ましい。
　本発明の測定キットにおけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常１００～３００００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは５００～１００００ｋＵ／Ｌである。本発明の測定キットにおけるフルクトシルペプチド酸化酵素の濃度は、通常０．５～１００ｋＵ／Ｌであり、好ましくは１～５０ｋＵ／Ｌである。
　本発明の測定キットを構成する試薬における化合物（Ｉ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。本発明の測定キットにおける化合物（ＩＩ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。本発明の測定キットにおける化合物（ＩＩＩ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。本発明の測定キットにおける化合物（ＩＶ）の濃度は、通常０．０００１～１０％である。
（４）ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法とロイコ型色原体の安定化方法
　本発明は、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法に関する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法により、水溶液中でロイコ型色原体が安定に保存される。本発明において、ロイコ型色原体が水溶液中で安定に保存されるとは、水溶液中でロイコ型色原体が熱に対して安定であるか、又は、光に対して安定であることを意味するが、好ましくは、熱及び光に対して安定であることを意味する。本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法においては、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種が、ロイコ型色原体含有水溶液に添加される。化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）としては、前述の化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）が挙げられる。
　本発明のロイコ型色原体含有水溶液の保存方法における化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）の濃度としては、通常０．０００１～１０％であり、０．０００５～５％が好ましい。
　本発明のロイコ型色原体の保存方法において、ロイコ型色原体の保存安定性は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価することができる。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価することができる。
　本発明におけるロイコ型色原体含有水溶液とは、ロイコ型色原体が水性媒体中に溶解された水溶液であり、ロイコ型色原体を水性媒体に添加して溶解させることにより調製することができる。ロイコ型色原体が溶解される水性媒体は、ロイコ型色原体が溶解されれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。また、ロイコ型色原体含有水溶液の調製に際して、ロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助剤として、有機溶媒を用いることもできる。有機溶媒に溶解させたロイコ型色原体を水性媒体に添加し、ロイコ型色原体を水性媒体に溶解させ、ロイコ型色原体含有水溶液を調製することもできる。有機溶媒としては、ロイコ型色原体を溶解させるものであれば特に制限はなく、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
　水性媒体のｐＨは、ロイコ型色原体が溶解されるｐＨであれば特に制限はなく、例えばｐＨ４～１０である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するｐＨに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えば前述の緩衝剤等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は、ロイコ型色原体が溶解される濃度であれば特に制限はなく、通常０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌであり、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌが好ましい。
　本発明におけるロイコ型色原体としては、例えば前述のロイコ型色原体等が挙げられる。
　さらに、本発明は、ロイコ型色原体の安定化方法に関する。本発明におけるロイコ型色原体の安定化とは、ロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体が、熱に対して安定化されるか、又は、光に対して安定化されることを意味するが、好ましくは、熱及び光に対して安定化されることを意味する。ここで、ロイコ型色原体の安定化は、ロイコ型色原体含有水溶液の着色により評価することができ、着色が大きい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が大きい程、安定性が悪いと評価する。一方、ロイコ型色原体含有水溶液の着色が小さい程、すなわち、ロイコ型色原体含有水溶液の吸光度が小さい程、安定性が良いと評価する。
　本発明のロイコ型色原体の安定化方法においては、ロイコ型色原体を化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させる。本発明のロイコ型色原体の安定化方法に用いられる化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）としては、前述の化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）が挙げられる。
　本発明の安定化方法において用いられるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液としては、前述のロイコ型色原体の保存方法におけるロイコ型色原体及びロイコ型色原体含有水溶液が挙げられる。本発明においてロイコ型色原体含有水溶液中のロイコ型色原体の濃度は、ロイコ型色原体が水性媒体に溶解される濃度であれば特に制限はされないが、通常０．０００１～２．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、０．０００５～１．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
　本発明において水溶液中にロイコ型色原体と共存させる化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）及び化合物（ＩＶ）の濃度としては、通常０．０００１～１０％であり、０．０００５～５％が好ましい。
　本発明におけるロイコ型色原体の熱に対する安定性を測定する方法は、熱に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はなく、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液を、５℃または３０℃で保存した後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
　また、本発明におけるロイコ型色原体の光による安定性を測定する方法は、光に対するロイコ型色原体の安定性を測定することができれば特に制限はなく、例えば、ロイコ型色原体を含有する水溶液に１５時間光を照射し、照射後の水溶液の着色を吸光度計により測定する方法等が挙げられる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
　尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＡＤＡ（同仁化学研究所社製）、ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、酢酸カルシウム１水和物（関東化学社製）、塩化カルシウム２水和物（和光純薬工業社製）、ＤＡ－６７（和光純薬工業社製）、１－ドデシルピリジニウムクロライド（Ｃ１２ｐｙ）（ピリジニウム塩；東京化成社製）、１－セチルピリジニウムクロライド（Ｃ１６ｐｙ）（ピリジニウム塩；東京化成社製）、ドデシルトリブチルホスホニウムクロライド（Ｃ１２ＴＢＰ）（ホスホニウム塩；東京化成社製）、ヘキサデシルトリブチルホスホニウムクロライド（Ｃ１６ＴＢＰ）（ホスホニウム塩；東京化成社製）、１－ドデシル－２－メチル－３－ベンジルイミダゾリウムクロライド（Ｃ１２ＭＢＩ）（イミダゾリウム塩；和光純薬工業社製）、Ｎ－ラウリルイソキノリニウムクロライド（フィレットＱ）（イソキノリニウム塩；日油社製）、サーモリシン（タンパク質分解酵素；大和化成社製）、アクチナーゼＡＳ（タンパク質分解酵素；科研ファルマ社製）、ＦＰＯＸ－ＣＥ（フルクトシルペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）。
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１６ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　０．３５ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ＴＢＰ　　　　　　　　　　　　　　０．８ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１６ＴＢＰ　　　　　　　　　　　　　　０．２ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ＭＢＩ　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　フィレットＱ　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
比較例１
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１のキットを、試料として、ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、ＨｂＡ１ｃ測定の基準法であるＫＯ５００法と、ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ－ヘモグロビン法とからＨｂＡ１ｃ濃度が２．７μｍｏｌ／Ｌ、３．４μｍｏｌ／Ｌ、４．０μｍｏｌ／Ｌ、５．０μｍｏｌ／Ｌ、６．８μｍｏｌ／Ｌと値付されている溶血試料を用いて、以下の手順により、各試料に対する反応吸光度を測定した。
　反応セルへ、各試料９．６μＬと、実施例１のキットの第一試薬１２０μＬとを添加し、３７℃で５分間加温し（第一反応）、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いでこの反応液に第二試薬４０μＬを添加しさらに３７℃で５分間加温し（第二反応）、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅを算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第１図に示す。
比較例２
　実施例７における実施例１のキットの代わりに、比較例１のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。
　第１図に示す通り、Ｃ１２ｐｙを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１２ｐｙを含む実施例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例１のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
　実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例２のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第２図に示す。
　第２図に示す通り、Ｃ１６ｐｙを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１６ｐｙを含む実施例２のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例２のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
　実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例３のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第３図に示す。
　第３図に示す通り、Ｃ１２ＴＢＰを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１２ＴＢＰを含む実施例３のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例３のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
　実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例４のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第４図に示す。
　第４図に示す通り、Ｃ１６ＴＢＰを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１６ＴＢＰを含む実施例４のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例４のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
　実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例５のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第５図に示す。
　第５図が示す通り、Ｃ１２ＭＢＩを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１２ＭＢＩを含む実施例５のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例５のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
　実施例７における実施例１のキットの代わりに、実施例６のキットを用いる以外は実施例７と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第６図に示す。
　第６図が示す通り、フィレットＱを含まない比較例１のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、フィレットＱを含む実施例６のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例６のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．０）　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１６ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　０．３５ｇ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＡＳ　　　　　　　　　　　　４５０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
比較例３
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　ＭＥＳ（ｐＨ６．０）　　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　酢酸カルシウム１水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　アクチナーゼＡＳ　　　　　　　　　　　　４５０ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１３のキットを、試料として、ヒトの血液を遠心分離して得られる血球を脱イオン水で希釈して溶血させて調製され、「デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ」（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法と、ヘモグロビン測定法の１つであるＳＬＳ－ヘモグロビン法とからＨｂＡ１ｃ濃度が２．５μｍｏｌ／Ｌ、３．７μｍｏｌ／Ｌ、４．０μｍｏｌ／Ｌ、４．７μｍｏｌ／Ｌ、６．３μｍｏｌ／Ｌと値付されている溶血試料を用いて、以下の手順により、各試料に対する反応吸光度を測定した。
　反応セルへ、各試料９．６μＬと、実施例１のキットの第一試薬１２０μＬとを添加し、３７℃で５分間加温し（第一反応）、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、次いでこの反応液に第二試薬４０μＬを添加しさらに３７℃で５分間加温し（第二反応）、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引き、吸光度差△Ｅを算出した。各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度と△Ｅとの関係を第７図に示す。
比較例４
　実施例１４における実施例１３のキットの代わりに、比較例３のキットを用いる以外は実施例１４と同様の方法により、各試料に対する反応吸光度を算出した。
　第７図に示す通り、Ｃ１６ｐｙを含まない比較例３のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出されないのに対して、Ｃ１６ｐｙを含む実施例１３のキットにおいては、ＨｂＡ１ｃ濃度と反応吸光度との間に定量関係が見出された。従って、実施例１３のキットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを測定できることが明らかとなった。
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　　１．６ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ＴＢＰ　　　　　　　　　　　　　　０．８ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　以下の第一試薬及び第二試薬からなるＨｂＡ１ｃ測定用キットを調製した。
第一試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ＭＢＩ　　　　　　　　　　　　　　０．９ｇ／Ｌ
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　サーモリシン　　　　　　　　　　　　　　１２００ｋＵ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
第二試薬
　ＡＤＡ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥ　　　　　　　　　　　　　１２ｋＵ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　１２０ｋＵ／Ｌ
　ＨｂＡ１ｃ測定用キットとして、実施例１５のキットを、試料として、糖尿病が疑われる１０名の被験者由来の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
　測定キットとして、総ヘモグロビン測定用キットであるヘモグロビンＢ－テストワコー（ＳＬＳ－ヘモグロビン法）（和光純薬工業社製）を用いて、検体として、ヘモグロビンＢ－テストワコーに付属の標準品（ヘモグロビン濃度：１５．３ｍｇ／ｍＬ）を用いて測定を行い、ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
　ラテックス免疫凝集法によりＨｂＡ１ｃ濃度が２．７７μｍｏｌ／Ｌ、６．３３μｍｏｌ／Ｌと値付けされている２つの血球画分について、実施例１５のＨｂＡ１ｃ測定用キットを用いて測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて、生理食塩水に対するＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度（０ Ａｂｓ）とから、ＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（３）各血球画分におけるヘモグロビン濃度の決定
　各試料に対して、２５℃、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ヘモグロビンＢ－テストワコーを用いて測定し、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中のヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
　各血球画分について、本発明の測定キットを用いて測定し、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を決定した。
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度のヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
　上記（３）で決定した各血球画分におけるヘモグロビン濃度（μｍｏｌ／Ｌ）と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度（μｍｏｌ／Ｌ）とから、以下の式により、日本糖尿病学会（Japan Diabetes Society；ＪＤＳ）値のＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000045
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）の免疫測定法での決定
　上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法により、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃの添付文書に記載の方法に従って決定した。
（７）本発明の測定方法と免疫測定法との相関
　本発明の測定方法を用いて、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、免疫測定法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法と免疫測定法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
　その結果、両測定法間の相関係数が０．９９４となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１５のキットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
　実施例１８における実施例１５のキットの代わりに、実施例１６のキットを用いて同様の手順により、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した結果、相関係数が０．９８４となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１６のキットを用いる本発明の測定方法により、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
　実施例１８における実施例１５のキットの代わりに、実施例１７のキットを用いて同様の手順により、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した結果、相関係数が０．９４９となり、両測定法間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１７のキットを用いる本発明の測定方法により試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることが明らかとなった。
（１）ＤＡ－６７含有水溶液、及び、ＤＡ－６７の安定性測定用試料の調製
　以下の組成からなるＤＡ－６７含有水溶液を調製した。
＜ＤＡ－６７含有水溶液＞
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　　２０μｍｏｌ／Ｌ
　界面活性剤（第１表参照）　　　　　　　　０．５％
　上記組成のＤＡ－６７含有水溶液を５℃で７日間保存したもの、及び、３０℃で７日間保存したものをＤＡ－６７安定性測定用試料として用いた。
（２）ＤＡ－６７安定性測定用試薬の調製
　以下の組成からなるＤＡ－６７安定性測定用試薬を調製した。
＜ＤＡ－６７安定性測定用試薬＞
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）　　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＢＳＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．００５％
（３）ＤＡ－６７含有水溶液中のＤＡ－６７の安定性の評価
　調製直後のＤＡ－６７含有水溶液３０μＬに（２）で調製したＤＡ－６７安定化測定用試薬１２０μＬを添加し、３７℃で５分間加温した後の溶液の吸光度（Ｅ直後）を、主波長６６０ｎｍ、副波長８００ｎｍで日立７１７０Ｓ形自動分析装置にて測定した。調製直後のＤＡ－６７含有水溶液の代わりに、（２）のＤＡ－６７安定化測定用試薬を用いて同様の測定を行い、吸光度（Ｅブランク）を測定した。Ｅ直後からＥブランクを差し引き、調製直後のＤＡ－６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ直後）とした。
　同様に、５℃で７日間保存したＤＡ－６７含有水溶液、及び、３０℃で７日間保存したＤＡ－６７含有水溶液を試料として用いて測定を行い、５℃で７日間保存したＤＡ－６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ５℃）、及び、３０℃で７日間保存したＤＡ－６７含有水溶液に対する吸光度（△Ｅ３０℃）を測定した。
　測定した△Ｅ５℃、△Ｅ３０℃それぞれから△Ｅ直後を差し引いた値を、それぞれ△Ｅ１、△Ｅ２とし、ＤＡ－６７の安定性の指標とした。その結果を第１表に示す。値が０に近い程、水溶液中での着色が抑制され、ＤＡ－６７が水溶液中で安定に保存されること、すなわち、水溶液中でＤＡ－６７が安定化されることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　第１表に示される通り、化合物（Ｉ）（Ｃ１２ｐｙ、Ｃ１６ｐｙ）を含む水溶液では、化合物（Ｉ）を含有しない場合と比較して、５℃でも３０℃においても保存後の着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（Ｉ）を含む水溶液中のＤＡ－６７が熱に対して安定であり、ＤＡ－６７含有水溶液が化合物（Ｉ）により安定に保存され、ＤＡ－６７が化合物（Ｉ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
　同様に、化合物（ＩＩ）（Ｃ１２ＴＢＰ、Ｃ１６ＴＢＰ）を含む水溶液では、化合物（ＩＩ）を含有しない場合と比較して、５℃でも３０℃においても保存後の着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（ＩＩ）を含む水溶液中のＤＡ－６７が熱に対して安定であり、ＤＡ－６７含有水溶液が化合物（ＩＩ）により安定に保存され、ＤＡ－６７が化合物（ＩＩ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
　実施例２１で調製したＤＡ－６７含有水溶液に対して、１１００ルクスの光を１５時間照射し、光によるＤＡ－６７の安定性を評価した。光照射後のＤＡ－６７含有水溶液を試料として用いて、実施例２１と同様の方法を行い、光照射後のＤＡ－６７含有水溶液に対する吸光度△Ｅ３を測定した。測定結果を第２表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
　第２表に示される通り、化合物（Ｉ）（Ｃ１２ｐｙ、Ｃ１６ｐｙ）を含む水溶液では、化合物（Ｉ）を含有しない場合と比較して、光照射による着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（Ｉ）を含む水溶液中のＤＡ－６７が光に対して安定であり、ＤＡ－６７含有水溶液が化合物（Ｉ）により安定に保存され、ＤＡ－６７が化合物（Ｉ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
　同様に、化合物（ＩＩ）（Ｃ１２ＴＢＰ、Ｃ１６ＴＢＰ）を含む水溶液では、化合物（ＩＩ）を含有しない場合と比較して、光照射による着色が顕著に抑制されていた。このことから、化合物（ＩＩ）を含む水溶液中のＤＡ－６７が光に対して安定であり、ＤＡ－６７含有水溶液が化合物（ＩＩ）により安定に保存され、ＤＡ－６７が化合物（ＩＩ）により水溶液中で安定化されることが明らかとなった。
　本発明により、糖尿病の診断に有用な糖化ヘモグロビンの測定等に有用な、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット、並びに、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法、及び、ロイコ型色原体の安定化方法が提供される。
 

Claims (18)

  1. 　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素とを、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の存在下に反応させ、得られる反応生成物にフルクトシルペプチド酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
  2. 　過酸化水素の測定が、過酸化水素測定試薬により行われる、請求項１記載の測定方法。
  3. 　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項２記載の測定方法。
  4. 　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項３記載の測定方法。
  5. 　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項４記載の測定方法。
  6. 　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するための試薬であって、タンパク質分解酵素、フルクトシルペプチド酸化酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定試薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
  7. 　さらに、過酸化水素測定試薬を含む、請求項６記載の測定試薬。
  8. 　過酸化水素測定試薬が、ペルオキシダーゼとロイコ型色原体とを含む試薬である請求項７記載の測定試薬。
  9. 　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項８記載の測定試薬。
  10. 　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項９記載の測定試薬。
  11. 　ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンを測定するためのキットであって、タンパク質分解酵素、及び、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む第１試薬と、フルクトシルペプチド酸化酵素を含む第２試薬とを含むことを特徴とする糖化ヘモグロビン測定キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     （式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     （式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
  12. 　さらに、ペルオキシダーゼ及びロイコ型色原体を、それぞれ第１試薬と第２試薬、又は、第２試薬と第１試薬に含む、請求項１１記載の測定キット。
  13. 　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項１２記載の測定キット。
  14. 　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項１３記載の測定キット。
  15. 　ロイコ型色原体含有水溶液に、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を添加することを特徴とする、ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     （式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     （式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
  16. 　ロイコ型色原体を、以下の一般式（Ｉ）で表わされるピリジニウム塩、以下の一般式（ＩＩ）で表わされるホスホニウム塩、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされるイミダゾリウム塩、及び、以下の一般式（ＩＶ）で表わされるイソキノリニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む水溶液中で共存させることを特徴とする、ロイコ型色原体の安定化方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     （式中、Ｒ１は、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒａは、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、又は、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、ｎは、１～５の整数を表し、Ｘ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     （式中、Ｒ２～Ｒ５は、同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキルを表し、Ｙ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     （式中、Ｒ６とＲ８は同一又は異なって、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０は、水素原子、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニルを表し、Ｚ－は、１価のアニオンを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     （式中、Ｒ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニルを表し、Ｗ－は、１価のアニオンを表す。）
  17. 　ロイコ型色原体が、フェノチアジン系色原体である請求項１５または１６記載の方法。
  18. 　フェノチアジン系色原体が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンである請求項１７記載の方法。
     
PCT/JP2011/068104 2010-08-11 2011-08-09 糖化ヘモグロビンの測定方法 WO2012020745A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA 2807133 CA2807133A1 (en) 2010-08-11 2011-08-09 Method for measuring glycated hemoglobin
US13/811,914 US9090931B2 (en) 2010-08-11 2011-08-09 Method for measuring glycated hemoglobin
CN201180038604.XA CN103069003B (zh) 2010-08-11 2011-08-09 糖化血红蛋白的测定方法
JP2012528678A JP5955220B2 (ja) 2010-08-11 2011-08-09 糖化ヘモグロビンの測定方法
BR112013001393A BR112013001393A2 (pt) 2010-08-11 2011-08-09 métodos para medir hemoglobina glicada em uma amostra, para conservar uma solução aquosa contendo um leuco-cromogênio e para estabilizar um leuco-cromogênio, reagente de medição de hemoglobina glicada em uma amostra e kit para medir hemoglobina glicada em uma amostra
EP11816409.4A EP2604699B1 (en) 2010-08-11 2011-08-09 Method for measuring glycated hemoglobin
KR1020137002627A KR20130100972A (ko) 2010-08-11 2011-08-09 당화 헤모글로빈의 측정 방법

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-180563 2010-08-11
JP2010180563 2010-08-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012020745A1 true WO2012020745A1 (ja) 2012-02-16

Family

ID=45567708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/068104 WO2012020745A1 (ja) 2010-08-11 2011-08-09 糖化ヘモグロビンの測定方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9090931B2 (ja)
EP (1) EP2604699B1 (ja)
JP (1) JP5955220B2 (ja)
KR (1) KR20130100972A (ja)
CN (2) CN104313121A (ja)
BR (1) BR112013001393A2 (ja)
CA (1) CA2807133A1 (ja)
WO (1) WO2012020745A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150044764A1 (en) * 2012-04-24 2015-02-12 I-Sens, Inc. Biochemical assay cartridge
US20150132786A1 (en) * 2011-06-17 2015-05-14 Haruyo Soya Method for measuring glycosylated hemoglobin, measurement reagent, and measurement kit
JP2017515475A (ja) * 2014-05-06 2017-06-15 ダイアシス ダイアグノスティック システムズ ゲーエムベーハーＤｉａｓｙｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｇｍｂｈ ＨｂＡ１ｃの酵素的定量法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2921825C (en) * 2013-08-30 2021-07-27 Sekisui Medical Co., Ltd. Method for measuring cholesterol in high-density lipoprotein, and reagent for use in said method
KR102228913B1 (ko) * 2013-12-10 2021-03-17 삼성전자주식회사 미세유동장치 및 검사장치
CN104897628B (zh) * 2015-04-28 2018-04-10 扬州大学 一种荧光探针在测定表面活性剂临界胶束浓度上的应用
US11168349B2 (en) 2016-07-29 2021-11-09 Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd. Method for measuring glycated hemoglobin
WO2020113129A1 (en) * 2018-11-29 2020-06-04 Polymer Technology Systems, Inc. Systems and methods for electrochemical point-of-care detection of hemoglobin
CN111610283A (zh) * 2020-05-09 2020-09-01 上海大学 环境水体中异噻唑啉酮类杀菌剂和三氯生类杀菌剂的检测方法

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5729297A (en) 1980-07-30 1982-02-17 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Determining method of hydrogen peroxide and determining composition
JPS6293261A (ja) 1985-10-18 1987-04-28 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規なジフェニルアミン誘導体
JPH03206896A (ja) 1989-09-11 1991-09-10 Shinotesuto:Kk 体液中の微量成分定量法
US5384248A (en) * 1989-06-09 1995-01-24 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Process for measuring an analyte with an oxidase and an oxidizable color reagent and surfactants
JP2000241405A (ja) * 1999-02-24 2000-09-08 Toppan Printing Co Ltd 酸素インジケーター用組成物及び酸素インジケーター
EP1312918A2 (en) * 2001-10-26 2003-05-21 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Oxygen detecting composition
WO2003107011A1 (ja) 2002-06-14 2003-12-24 アークレイ株式会社 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
WO2004007760A1 (ja) 2002-07-17 2004-01-22 Arkray, Inc. スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法
WO2005049858A1 (ja) 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法
WO2005088305A1 (ja) 2004-03-17 2005-09-22 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 被酸化性呈色試薬の安定化方法
WO2006013921A1 (ja) 2004-08-05 2006-02-09 Asahi Kasei Pharma Corporation プロテアーゼ反応促進剤及び／又は色素の安定化剤を含む試薬
WO2007083703A1 (ja) 2006-01-18 2007-07-26 Arkray, Inc. 発色剤の液体試薬、及び、その安定化方法
JP2009159989A (ja) 2001-01-31 2009-07-23 Asahi Kasei Pharma Kk 糖化蛋白質測定用組成物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2836865B2 (ja) * 1989-10-23 1998-12-14 東亜医用電子株式会社 血液中の白血球およびヘモグロビンの測定用試薬
JP3830613B2 (ja) * 1997-04-18 2006-10-04 シスメックス株式会社 血液中の白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬
WO2002006519A1 (fr) * 2000-07-14 2002-01-24 Arkray, Inc. Procede pour determiner de maniere selective le taux d'hemoglobine glycosylee
JP3997538B2 (ja) * 2002-05-23 2007-10-24 日本光電工業株式会社 赤血球溶血剤、白血球分類用試薬および試薬
JPWO2007072941A1 (ja) * 2005-12-22 2009-06-04 協和メデックス株式会社 糖化タンパク質の測定方法
JP4697809B2 (ja) 2007-02-22 2011-06-08 旭化成ファーマ株式会社 ロイコ色素の安定化方法

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5729297A (en) 1980-07-30 1982-02-17 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Determining method of hydrogen peroxide and determining composition
JPS6293261A (ja) 1985-10-18 1987-04-28 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規なジフェニルアミン誘導体
US5384248A (en) * 1989-06-09 1995-01-24 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Process for measuring an analyte with an oxidase and an oxidizable color reagent and surfactants
JPH03206896A (ja) 1989-09-11 1991-09-10 Shinotesuto:Kk 体液中の微量成分定量法
JP2000241405A (ja) * 1999-02-24 2000-09-08 Toppan Printing Co Ltd 酸素インジケーター用組成物及び酸素インジケーター
JP2009159989A (ja) 2001-01-31 2009-07-23 Asahi Kasei Pharma Kk 糖化蛋白質測定用組成物
EP1312918A2 (en) * 2001-10-26 2003-05-21 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Oxygen detecting composition
WO2003107011A1 (ja) 2002-06-14 2003-12-24 アークレイ株式会社 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
WO2004007760A1 (ja) 2002-07-17 2004-01-22 Arkray, Inc. スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法
WO2005049858A1 (ja) 2003-11-19 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. ヘモグロビン含有試料中の基質の測定方法
WO2005088305A1 (ja) 2004-03-17 2005-09-22 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 被酸化性呈色試薬の安定化方法
WO2006013921A1 (ja) 2004-08-05 2006-02-09 Asahi Kasei Pharma Corporation プロテアーゼ反応促進剤及び／又は色素の安定化剤を含む試薬
WO2007083703A1 (ja) 2006-01-18 2007-07-26 Arkray, Inc. 発色剤の液体試薬、及び、その安定化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF MEDICAL TECHNOLOGY, vol. 41, no. 9, 1997, pages 1014 - 1019
See also references of EP2604699A4

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150132786A1 (en) * 2011-06-17 2015-05-14 Haruyo Soya Method for measuring glycosylated hemoglobin, measurement reagent, and measurement kit
US20150044764A1 (en) * 2012-04-24 2015-02-12 I-Sens, Inc. Biochemical assay cartridge
JP2017515475A (ja) * 2014-05-06 2017-06-15 ダイアシス ダイアグノスティック システムズ ゲーエムベーハーＤｉａｓｙｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｇｍｂｈ ＨｂＡ１ｃの酵素的定量法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130100972A (ko) 2013-09-12
CN103069003B (zh) 2016-01-20
US20130115646A1 (en) 2013-05-09
EP2604699A1 (en) 2013-06-19
BR112013001393A2 (pt) 2016-05-24
JPWO2012020745A1 (ja) 2013-10-28
CN103069003A (zh) 2013-04-24
CN104313121A (zh) 2015-01-28
EP2604699A4 (en) 2014-03-26
EP2604699B1 (en) 2017-10-04
CA2807133A1 (en) 2012-02-16
JP5955220B2 (ja) 2016-07-20
US9090931B2 (en) 2015-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5871800B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JP5955220B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JP6236318B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット
JP7020413B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JPWO2003064683A1 (ja) 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット
JP6144208B2 (ja) アスコルビン酸の影響抑制方法
KR20140114267A (ko) 측정 대상 성분의 측정 방법
JP7195847B2 (ja) 糖化蛋白質の測定
WO2021192466A1 (ja) ヘモグロビンの影響軽減方法、糖化ヘモグロビンの測定方法、糖化ヘモグロビン測定試薬、及び糖化ヘモグロビン測定キット
WO2021192465A1 (ja) 異常ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法
US11313863B2 (en) Measurement of glycoprotein
WO2018221446A1 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201180038604.X

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11816409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012528678

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13811914

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2807133

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137002627

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2011816409

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011816409

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112013001393

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112013001393

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20130118