KR20130100972A - 당화 헤모글로빈의 측정 방법 - Google Patents

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마사시 마츠시타
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Abstract

헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소를, 피리디늄염, 포스포늄염, 이미다졸륨염 및 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 존재하에 반응시키고, 얻어지는 반응 생성물에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법.
본 발명에 의해 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 정확하게 측정하는 방법이 제공된다.

Description

당화 헤모글로빈의 측정 방법 {METHOD FOR MEASURING GLYCOSYLATED HEMOGLOBIN}
본 발명은 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 (糖化) 헤모글로빈의 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법, 류코형 색원체의 안정화 방법에 관한 것이다.
당화 헤모글로빈은 헤모글로빈에 글루코오스가 결합된 당화물이다. 헤모글로빈은 α 사슬, β 사슬로 이루어지는 4 량체의 구조를 취하고 있는데, β 사슬의 N 말단이 당화된 것은 헤모글로빈 A1c 라 불리며, 혈당치가 높을수록 증가하므로 당뇨병 마커로서, 혈당 컨트롤의 지표로, 임상 검사에 있어서 일상적으로 측정되고 있다.
당화 헤모글로빈의 측정 방법으로는, HPLC 법 등의 크로마토그래피법, 전기 영동법, 라텍스 면역 응집법 등 항체를 이용하는 면역 측정법, 당화 단백질에 작용하는 효소와 당화 펩티드 및/또는 당화 아미노산에 작용하는 효소를 사용하는 효소 측정법 등이 알려져 있다.
당화 헤모글로빈의 효소 측정법으로는, 먼저, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 변성제에 의해 변성시키고, 변성 당화 헤모글로빈에 단백질 분해 효소를 작용시키고, 이어서 생성된 당화 펩티드에 당화 펩티드 산화 효소를 작용시키고, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하에, 산화 발색형 색원체와 반응시켜서 색소로 유도하고, 생성된 색소의 흡광도로부터 당화 헤모글로빈을 측정하는 방법 등이 알려져 있다. 여기서, 변성제는 단백질 분해 효소의 당화 헤모글로빈에 대한 작용을 가능하게 하기 위해 사용되고, 지금까지, 아세트산기를 포함하는 화합물 또는 그 염, N-아실타우린 또는 그 염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산 또는 그 염 (특허문헌 1), 폴리옥시에틸렌알킬에테르황산염류, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산염류 등의 음이온계 계면활성제 (특허문헌 2), 라우릴황산나트륨, 도데실벤젠술폰산나트륨 등의 술폰산 화합물 (특허문헌 3), 술폰산 화합물 및 니트로 화합물 (특허문헌 4), 제 4 급 암모늄염, 염화알킬벤질디메틸암모늄, 라우릴디메틸아민옥사이드 등 (특허문헌 5) 의 변성제가 알려져 있다.
또, 당화 헤모글로빈의 효소 측정법에 있어서는, 당화 헤모글로빈을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하에, 산화 발색형 색원체와 반응시켜서 색소로 유도하고, 생성된 색소의 흡광도로부터 당화 헤모글로빈을 측정하는 방법이 자주 이용된다. 여기서 산화 발색형 색원체로서 자주 류코형 색원체가 사용된다. 류코형 색원체는 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하, 과산화수소와 반응하여, 색소를 생성하는 색원체의 1 종이고, 커플링형 색원체와는 달리, 그 단독으로 색소를 생성하는 색원체이며, 페노티아진계의 류코형 색원체, 트리페닐메탄계의 류코형 색원체, 디페닐아민계의 류코형 색원체 등이 알려져 있다 (예를 들면, 특허문헌 6 ∼ 8 참조).
류코형 색원체는 고감도 색원체로서, 당화 헤모글로빈과 같이, 시료 중에 미량밖에 존재하지 않는 정량해야 할 성분의 정량으로 적합하게 사용된다 (예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 그러나, 한편으로, 그 보존 안정성이 나쁘고, 특히, 용액 중에서는 시간과 함께 자연 발색되어 버린다는 결점을 가져, 이 류코형 색원체가 갖는 안정성 불량에 의해, 시료 중의 정량해야 할 성분을 정확하게 측정할 수 없다는 문제가 발생되었다.
이 류코형 색원체가 갖는 안정성 불량이라는 과제에 대하여, 지금까지 류코형 색원체의 용액 중에서 안정화 방법이 검토되어 보고되었다 (예를 들면, 특허문헌 9, 10 참조).
WO2006/013921 팜플렛 WO2005/049858 팜플렛 WO2004/007760 팜플렛 WO2003/107011 팜플렛 일본 공개특허공보 2009-159989호 일본 공개특허공보 소57-029297호 일본 공개특허공보 평3-206896호 일본 공개특허공보 소62-093261호 WO2005/088305 팜플렛 WO2007/083703 팜플렛
임상 검사, 1997년, Vol.41, No.9, p.1014-1019
당화 헤모글로빈의 효소 측정법에 있어서, 지금까지 알려져 있는 당화 헤모글로빈의 변성제에 대해서는, 당화 헤모글로빈의 변성이 충분하지 않기 때문에, 단백질 분해 효소 반응이 만족스럽게 진행되지 않아, 당화 헤모글로빈의 정확한 측정을 실시할 수 없다는 문제가 있었다. 또, 당화 헤모글로빈의 측정 방법에 있어서 사용되는 류코형 색원체에 대해서는, 종래 알려져 있는 보존 방법은 엄격한 조건하에서의 보존을 필요로 하는 등, 반드시 만족할 수 있는 방법이라고는 할 수 없다.
본 발명의 목적은 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 정확하게 측정하는 방법, 시약 및 키트, 그리고, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 정확한 측정을 가능하게 하는 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법 및 류코형 색원체의 안정화 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 본 과제를 예의 검토한 바, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소를, 피리디늄염, 포스포늄염, 이미다졸륨염, 또는 이소퀴놀리늄염 존재하에 반응시킴으로써 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 충분히 변성시킬 수 있어, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 정확하게 측정할 수 있다는 지견을 알아냈다. 또한 피리디늄염, 포스포늄염, 이미다졸륨염, 또는 이소퀴놀리늄염이 류코형 색원체를 안정화시킨다는 지견을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 [1] ∼ [18] 에 관한 것이다.
[1] 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소를, 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 존재하에 반응시키고, 얻어지는 반응 생성물에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법.
[화학식 1]
Figure pct00001
(식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 3]
Figure pct00003
(식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 4]
Figure pct00004
(식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[2] 과산화수소의 측정이 과산화수소 측정 시약에 의해 실시되는 [1] 에 기재된 측정 방법.
[3] 과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 [2] 에 기재된 측정 방법.
[4] 류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 [3] 에 기재된 측정 방법.
[5] 페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 [4] 에 기재된 측정 방법.
[6] 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 시약으로서, 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소 및 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 시약.
[화학식 5]
Figure pct00005
(식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 6]
Figure pct00006
식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 7]
Figure pct00007
(식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 8]
Figure pct00008
(식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[7] 추가로 과산화수소 측정 시약을 포함하는 [6] 에 기재된 측정 시약.
[8] 과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 [7] 에 기재된 측정 시약.
[9] 류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 [8] 에 기재된 측정 시약.
[10] 페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 [9] 에 기재된 측정 시약.
[11] 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 키트로서, 단백질 분해 효소, 및 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 키트.
[화학식 9]
Figure pct00009
(식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 10]
Figure pct00010
(식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 11]
Figure pct00011
(식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 12]
Figure pct00012
(식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[12] 추가로 퍼옥시다아제 및 류코형 색원체를 각각 제 1 시약과 제 2 시약, 또는 제 2 시약과 제 1 시약에 포함하는 [11] 에 기재된 측정 키트.
[13] 류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 [12] 에 기재된 측정 키트.
[14] 페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 [13] 에 기재된 측정 키트.
[15] 류코형 색원체 함유 수용액에, 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 첨가하는 것을 특징으로 하는 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법.
[화학식 13]
Figure pct00013
(식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 14]
Figure pct00014
(식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 15]
Figure pct00015
(식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 16]
Figure pct00016
(식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[16] 류코형 색원체를, 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 수용액 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 류코형 색원체의 안정화 방법.
[화학식 17]
Figure pct00017
(식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 18]
Figure pct00018
(식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 19]
Figure pct00019
(식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[화학식 20]
Figure pct00020
(식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
[17] 류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 [15] 또는 [16] 에 기재된 방법.
[18] 페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 [17] 에 기재된 방법.
본 발명에 의해, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 정확하게 측정하는 방법, 시약 및 키트, 그리고, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 정확한 측정을 가능하게 하는 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법 및 류코형 색원체의 안정화 방법이 제공된다.
도 1 은 실시예 1 및 비교예 1 의 키트를 사용하는 시료 중의 헤모글로빈 A1c (이하, HbA1c 라고도 기재한다) 의 측정에 있어서의 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ▲ 는 실시예 1 의 키트, ● 는 비교예 1 의 키트를 사용한 측정을 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10-4 Abs) 를, 가로축은 HbA1c 이론 농도 (μ㏖/ℓ) 를 나타낸다.
도 2 는 실시예 2 및 비교예 1 의 키트를 사용하는 시료 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ▲ 는 실시예 2 의 키트, ● 는 비교예 1 의 키트를 사용한 측정을 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10-4 Abs) 를, 가로축은 HbA1c 이론 농도 (μ㏖/ℓ) 를 나타낸다.
도 3 은 실시예 3 및 비교예 1 의 키트를 사용하는 시료 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ▲ 는 실시예 3 의 키트, ● 는 비교예 1 의 키트를 사용한 측정을 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10-4 Abs) 를, 가로축은 HbA1c 이론 농도 (μ㏖/ℓ) 를 나타낸다.
도 4 는 실시예 4 및 비교예 1 의 키트를 사용하는 시료 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ▲ 는 실시예 4 의 키트, ● 는 비교예 1 의 키트를 사용한 측정을 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10-4 Abs) 를, 가로축은 HbA1c 이론 농도 (μ㏖/ℓ) 를 나타낸다.
도 5 는 실시예 5 및 비교예 1 의 키트를 사용하는 시료 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. □ 는 실시예 5 의 키트, ● 는 비교예 1 의 키트를 사용한 측정을 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10-4 Abs) 를, 가로축은 HbA1c 이론 농도 (μ㏖/ℓ) 를 나타낸다.
도 6 은 실시예 6 및 비교예 1 의 키트를 사용하는 시료 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ▲ 는 실시예 6 의 키트, ● 는 비교예 1 의 키트를 사용한 측정을 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10-4 Abs) 를, 가로축은 HbA1c 이론 농도 (μ㏖/ℓ) 를 나타낸다.
도 7 은 실시예 13 및 비교예 3 의 키트를 사용하는 시료 중의 HbA1c 의 측정에 있어서의 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. ■ 는 실시예 13 의 키트, ● 는 비교예 3 의 키트를 사용한 측정을 나타내고, 세로축은 반응 흡광도 (×10-4 Abs) 를, 가로축은 HbA1c 이론 농도 (μ㏖/ℓ) 를 나타낸다.
(1) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법
본 발명의, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법은 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소를, 후술하는 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 후술하는 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 후술하는 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 후술하는 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 존재하에 반응시키고, 얻어지는 반응 생성물에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법이다.
구체적으로는 이하의 공정을 포함하는 측정 방법이다.
(1) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소를, 후술하는 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 후술하는 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 후술하는 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 후술하는 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 수성 매체 중에서 반응시키는 공정；
(2) 공정 (1) 에서 얻어지는 반응 생성물에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 과산화수소를 생성시키는 공정；
(3) 공정 (2) 에서 생성된 과산화수소를 측정하는 공정；및,
(4) 이미 알려진 농도의 당화 헤모글로빈을 사용하여 미리 작성한, 과산화수소량과 당화 헤모글로빈 농도의 관계를 나타내는 검량선에, 공정 (3) 에서 측정한 과산화수소량을 대조하여, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 농도를 결정하는 공정.
또, 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법은 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 양의 총 헤모글로빈 (즉, 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 합한 총 헤모글로빈) 양에 대한 비율을 산출하는 방법도 포함 한다. 이 경우, 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법은 구체적으로는 이하의 공정을 포함하는 측정 방법이다.
(1) 헤모글로빈 함유 시료 중의 총 헤모글로빈 (즉, 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 합한 총 헤모글로빈) 양을 측정하는 공정；
(2) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소를, 후술하는 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 후술하는 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 후술하는 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 후술하는 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 수성 매체 중에서 반응시키는 공정；
(3) 공정 (2) 에서 얻어지는 반응 생성물에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 과산화수소를 생성시키는 공정；
(4) 공정 (3) 에서 생성된 과산화수소를 측정하는 공정；
(5) 이미 알려진 양의 당화 헤모글로빈을 사용하여 미리 작성한, 과산화수소량과 당화 헤모글로빈 양의 관계를 나타내는 검량선에, 공정 (4) 에서 측정한 과산화수소량을 대조하여, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 양을 측정하는 공정；및,
(6) 공정 (1) 에서 측정한 총 헤모글로빈 양과 공정 (5) 에서 측정한 당화 헤모글로빈 양으로부터, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 양의 총 헤모글로빈 양에 대한 비율을 산출하는 공정.
또한, 상기 공정 (1) 의 총 헤모글로빈 양의 측정은 헤모글로빈 함유 시료에, 후술하는 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 후술하는 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 후술하는 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 후술하는 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 첨가하여, 헤모글로빈 함유 시료 중의 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 변성시킨 후에 실시할 수도 있다.
또, 헤모글로빈 함유 시료 중의 총 헤모글로빈 양의 측정은 헤모글로빈 함유 시료에, 단백질 분해 효소와, 후술하는 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 후술하는 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 후술하는 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 후술하는 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 첨가하여, 변성시킨 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 단백질 분해 효소로 분해시킨 후에 실시할 수도 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의 헤모글로빈 함유 시료는 헤모글로빈을 함유하고, 본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법이 적용 가능한 시료이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 전혈, 혈구, 혈구에 혈장이 혼재된 시료, 이들 시료를 용혈 처리한 시료 등을 들 수 있다. 용혈 처리로는, 전혈, 혈구, 혈구에 혈장이 혼재된 시료를 용혈시키는 처리이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 물리적 방법, 화학적 방법, 생물학적 방법 등을 들 수 있다. 물리적 방법으로는, 예를 들면, 증류수 등의 저장액 (低張液) 을 사용하는 방법, 초음파를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 화학적 방법으로는, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 유기 용매를 사용하는 방법, 폴리옥시에틸렌계 계면활성제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 생물학적 방법으로는, 예를 들면, 항체나 보체 (補體) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 당화 헤모글로빈은 헤모글로빈에 글루코오스 등의 당이 결합되어 생성된 것으로, 헤모글로빈 A1a, 헤모글로빈 A1b, 헤모글로빈 A1c 등을 들 수 있고, 헤모글로빈 A1c 가 바람직하다.
본 발명에 있어서, 피리디늄염으로는, 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염 [이하, 화합물 (I) 이라 한다] 이 사용된다.
[화학식 21]
Figure pct00021
식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다.
R1 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있고, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬이 바람직하다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 에이코실 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐, 이소데실, 이소운데실, 이소도데실, 이소트리데실, 이소테트라데실, 이소펜타데실, 이소헥사데실, 이소헵타데실, 이소옥타데실, 이소노나데실, 이소에이코실, 옥틸도데실 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 (라우릴), 트리데실, 테트라데실 (미리스틸), 펜타데실, 헥사데실 (세틸), 헵타데실, 옥타데실 (스테아릴), 노나데실, 에이코실 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 이소옥틸, 이소노닐, 이소데실, 이소운데실, 이소도데실, 이소트리데실, 이소테트라데실, 이소펜타데실, 이소헥사데실, 이소헵타데실, 이소옥타데실, 이소노나데실, 이소에이코실, 옥틸도데실 등을 들 수 있다.
R1 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있고, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐이 바람직하다. 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 비닐, 프로필, 알릴, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 올레일, 노나데세닐, 에이코세닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 올레일, 노나데세닐, 에이코세닐 등을 들 수 있다.
R1 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
Ra 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.
Ra 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.
Ra 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
피리딘 고리 상에 2 이상의 치환기가 있는 경우, 치환기는 동일해도 되고 상이해도 된다. 화합물 (I) 에 있어서의 X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온, OH-, PF6 -, BF4 -, CH3CH2OSO3 -, (CF3SO2)2N- 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl-, Br-, I- 등을 들 수 있다.
화합물 (I) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, 1-도데실피리디늄클로라이드 (이하, C12py 라고 기재한다；도쿄 카세이사 제조), 1-세틸피리디늄클로라이드 (이하, C16py 라고 기재한다；도쿄 카세이사 제조), 1-세틸-4-메틸피리디늄클로라이드 (도쿄 카세이사 제조), N-옥타데실-4-스틸바졸브로마이드 (도쿄 카세이사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법에 있어서의 화합물 (I) 의 반응액 중의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다.
본 발명에 있어서, 포스포늄염으로는, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염 [이하, 화합물 (II) 라 한다] 이 사용된다.
[화학식 22]
Figure pct00022
식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다.
R2 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 치환 알킬에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
R3 ∼ R5 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 치환 알킬에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온, OH-, PF6 -, BF4 -, CH3CH2OSO3 -, (CF3SO2)2N-, B(C6H5)4 -, 벤조트리아졸레이트 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl-, Br-, I- 등을 들 수 있다.
화합물 (II) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, 테트라옥틸포스포늄브로마이드 (도쿄 카세이사 제조), 트리부틸옥틸포스포늄브로마이드 (도쿄 카세이사 제조), 트리부틸도데실포스포늄브로마이드 (이하, C12TBP 라고 기재한다；도쿄 카세이사 제조), 트리부틸헥사데실포스포늄브로마이드 (이하, C16TBP 라고 기재한다；도쿄 카세이사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 방법에 있어서의 화합물 (II) 의 반응액 중의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다.
본 발명에 있어서, 이미다졸륨염으로는, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 [이하, 화합물 (III) 이라 한다] 이 사용된다.
[화학식 23]
Figure pct00023
식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다.
R6 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.
R6 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.
R6 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
R7, R8, R9 및 R10 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 전술한 탄소수 1 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 3 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.
R7, R8, R9 및 R10 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 2 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.
R7, R8, R9 및 R10 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온, OH-, PF6 -, BF4 -, CH3CH2OSO3 -, (CF3SO2)2N-, (CH3O)2P(=O)O-, B(C6H5)4 -, FeCl4 -, CF3BF3 -, CF3SO3 -, (NC)2N-, CH3(OCH2CH2)2OSO3 -, CH3CH2OSO3 -, HSO4 -, 4-CH3C6H4SO3 - 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl-, Br-, I- 등을 들 수 있다.
화합물 (III) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, 1-메틸-3-옥틸이미다졸륨브로마이드 (도쿄 카세이사 제조), 1-메틸-3-옥틸이미다졸륨클로라이드 (도쿄 카세이사 제조), 1-도데실-2-메틸-3-벤질이미다졸륨클로라이드 (이하, C12MBI 라고 기재한다；와코 준야쿠 공업사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의 화합물 (III) 의 반응액 중의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다.
본 발명에 있어서, 이소퀴놀리늄염으로는, 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염 [이하, 화합물 (IV) 라 한다] 이 사용된다.
[화학식 24]
Figure pct00024
식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다.
R11 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알킬에 있어서의 알킬로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬, 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 직사슬 알킬 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 분기 알킬 등을 들 수 있다.
R11 에 있어서, 치환 혹은 비치환의 알케닐에 있어서의 알케닐로는, 예를 들면, 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다. 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐로는, 예를 들면, 전술한 탄소수 8 ∼ 20 의 알케닐 등을 들 수 있다.
R11 에 있어서, 치환 알킬 및 치환 알케닐에 있어서의 치환기로는, 예를 들면, 페닐기, 수산기, 술포기, 시아노기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 페닐기 치환 알킬로는, 예를 들면, 벤질, 1-페닐에틸 등을 들 수 있다. 할로겐 원자로는, 예를 들면, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다. 1 가의 아니온으로는, 예를 들면, 할로겐 이온 등의 아니온을 들 수 있다. 할로겐 이온으로는, 예를 들면, Cl-, Br-, I- 등을 들 수 있다.
화합물 (IV) 의 구체예 (제품) 로는, 예를 들면, N-라우릴이소퀴놀리늄클로라이드 (니치유사 제조), N-라우릴이소퀴놀리늄브로마이드 (니치유사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의 화합물 (IV) 의 반응액 중의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다.
총 헤모글로빈 양은 공지된 방법, 예를 들면 시안메트헤모글로빈법, 옥시헤모글로빈법, SLS-헤모글로빈법 등에 의해 결정할 수 있다. 총 헤모글로빈 양은 헤모글로빈 함유 시료 그 자체뿐만 아니라, 헤모글로빈 함유 시료에, 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 첨가하여 얻어지는 시료나, 헤모글로빈 함유 시료에, 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종과 단백질 분해 효소를 첨가하여 얻어지는 시료에 대해, 시안메트헤모글로빈법, 옥시헤모글로빈법, SLS-헤모글로빈법 등을 적용함으로써도 결정할 수 있다.
화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 수성 매체 중에서의, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응은, 단백질 분해 효소가 당화 헤모글로빈에 작용할 수 있는 조건이면, 어떠한 조건하에서도 실시할 수 있다. 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응은 수성 매체 중에서 실시하는 것이 바람직하다. 수성 매체로는, 후술하는 수성 매체 등을 들 수 있다. 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응에 있어서의 반응 온도는 통상적으로 10 ∼ 50 ℃ 이며, 20 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 반응 시간은 통상적으로 1 분간 ∼ 3 시간이며, 2.5 분간 ∼ 1 시간이 바람직하다. 단백질 분해 효소의 농도로는, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응이 진행되는 농도이면 특별히 제한되지는 않고, 통상적으로 50 ∼ 25000 kU/ℓ이며, 바람직하게는 250 ∼ 10000 kU/ℓ이다.
단백질 분해 효소로는, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈에 작용하고, 당화 헤모글로빈으로부터 당화 펩티드를 생성시키는 효소이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 세린프로테아제 (키모트립신, 서브틸리신 등), 시스테인프로테아제 (파파인, 카스파아제 등), 아스파르트산프로테아제 (펩신, 카텝신 D 등), 메탈로프로테아제 (서몰리신 등), N-말단 트레오닌프로테아제, 글루탐산프로테아제 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 시판되는 단백질 분해 효소도 사용할 수 있으며, 시판품으로는, 예를 들면, 프로테아제 P 「아마노」 3G, 프로테아제 K 「아마노」 (이상, 아마노 엔자임사 제조), 액티나아제 AS, 액티나아제 E (이상, 카켄 파머사 제조), 서몰리신 (다이와 카세이사 제조), 수미자임 MP (신니혼 화학 공업사 제조) 등을 들 수 있다.
헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소의 반응에 의해 당화 펩티드를 함유하는 반응 생성물이 생성된다. 이어서, 이 반응 생성물 중의 당화 펩티드는 프럭토실펩티드 산화 효소와 반응하여, 과산화수소를 생성한다. 당화 펩티드와 프럭토실펩티드 산화 효소의 반응은 수성 매체 중에서 실시하는 것이 바람직하다. 수성 매체로는, 후술하는 수성 매체 등을 들 수 있다. 당화 펩티드와 프럭토실펩티드 산화 효소의 반응에 있어서의 반응 온도는 통상적으로 10 ∼ 50 ℃ 이며, 20 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 반응 시간은 통상적으로 1 분간 ∼ 3 시간이며, 2.5 분간 ∼ 1 시간이 바람직하다. 프럭토실펩티드 산화 효소의 농도로는, 당화 헤모글로빈과 프럭토실펩티드 산화 효소의 반응이 진행되는 농도이면 특별히 제한되지는 않고, 통상적으로 0.1 ∼ 30 kU/ℓ이며, 바람직하게는 0.2 ∼ 15 kU/ℓ이다.
본 발명에 사용되는 프럭토실펩티드 산화 효소로는, 당화 펩티드에 작용하여 과산화수소를 생성시키는 효소이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 사상균 유래, 효모 유래, 방선균 유래, 박테리아 유래, 고세균 유래의 프럭토실펩티드 산화 효소 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 시판되는 프럭토실펩티드 산화 효소도 사용할 수 있으며, 시판품으로는, 예를 들면, FPOX-CE (키코만사 제조), FPOX-EE (키코만사 제조), FPOX-CET (키코만사 제조) 등을 들 수 있다.
생성된 과산화수소의 측정 방법으로는, 과산화수소를 측정할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면, 전극을 사용하는 방법, 과산화수소 측정용 시약을 사용하는 방법 등을 들 수 있고, 과산화수소 측정용 시약을 사용하는 방법이 바람직하다. 과산화수소 측정용 시약은 과산화수소를 검출 가능한 물질로 변환하기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들면, 색소, 광 (발광), 형광 등을 들 수 있고, 색소가 바람직하다.
검출 가능한 물질이 색소인 경우, 과산화수소 측정용 시약은 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질과 산화 발색형 색원체를 포함하는 시약 등을 들 수 있다. 산화 발색형 색원체로는, 산화 커플링형 색원체, 류코형 색원체 등을 들 수 있고, 류코형 색원체가 바람직하다. 류코형 색원체로는, 예를 들면, 페노티아진계 색원체, 트리페닐메탄계 색원체, 디페닐아민계 색원체, o-페닐렌디아민, 하이드록시프로피온산, 디아미노벤지딘, 테트라메틸벤지딘 등을 들 수 있고, 페노티아진계 색원체가 바람직하다. 페노티아진계 색원체로는, 예를 들면, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진나트륨염 (DA-67) 등을 들 수 있다. 페노티아진계 색원체 중에서도, 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진나트륨염 (DA-67) 이 특히 바람직하다. 트리페닐메탄계 색원체로는, 예를 들면, N,N,N',N',N'',N''-헥사(3-술포프로필)-4,4',4''-트리아미노트리페닐메탄 (TPM-PS) 등을 들 수 있다. 디페닐아민계 색원체로는, 예를 들면, N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
검출 가능한 물질이 광 (발광) 인 경우, 과산화수소 측정용 시약은 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질과 화학 발광 물질을 포함하는 시약 등을 들 수 있다. 화학 발광 물질로는, 예를 들면, 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르 등을 들 수 있다.
검출 가능한 물질이 형광인 경우, 과산화수소 측정용 시약은 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질과 형광 물질을 포함하는 시약 등을 들 수 있다. 형광 물질로는, 예를 들면, 4-하이드록시페닐아세트산, 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산, 쿠마린 등을 들 수 있다.
(2) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 시약
본 발명의, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 시약은 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소 및 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 시약이며, 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 방법에 사용된다. 본 발명의 측정 시약은 추가로 과산화수소 측정 시약을 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 측정 시약에 있어서의 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소, 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III), 화합물 (IV) 및 과산화수소 측정 시약으로는, 예를 들면, 각각, 전술한 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소, 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III), 화합물 (IV) 및 과산화수소 측정 시약 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 시약에 있어서의 단백질 분해 효소의 농도는 통상적으로 50 ∼ 25000 kU/ℓ이며, 바람직하게는 250 ∼ 10000 kU/ℓ이다. 본 발명의 측정 시약에 있어서의 프럭토실펩티드 산화 효소의 농도는 통상적으로 0.1 ∼ 30 kU/ℓ이며, 바람직하게는 0.2 ∼ 15 kU/ℓ이다.
본 발명의 측정 시약에 있어서의 화합물 (I) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다. 본 발명의 측정 시약에 있어서의 화합물 (II) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다. 본 발명의 측정 시약에 있어서의 화합물 (III) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다. 본 발명의 측정 시약에 있어서의 화합물 (IV) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다.
본 발명의 측정 시약에는, 필요에 따라, 수성 매체, 안정화제, 방부제, 염류, 간섭 물질 소거제, 유기 용매 등이 함유되어도 된다.
수성 매체로는, 예를 들면, 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다.
수성 매체의 pH 는 본 발명의 당화 헤모글로빈의 측정 시약을 사용하는 당화 헤모글로빈의 측정 방법을 가능하게 하는 pH 이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 pH 4 ∼ 10 이다. 수성 매체로서 완충액을 사용하는 경우에는, 설정하는 pH 에 따른 완충제를 사용하는 것이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들면, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다.
굿 완충제로는, 예를 들면, 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-하이드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-하이드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산[(H)EPPS], N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-하이드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다.
완충액의 농도는 통상적으로 0.001 ∼ 2.0 mol/ℓ이며, 0.005 ∼ 1.0 mol/ℓ가 바람직하다.
안정화제로는, 예를 들면, 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA), 슈크로오스, 염화칼슘, 아세트산칼슘, 질산칼슘, 페로시안화칼륨, 소혈청 알부민 (BSA), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌계 계면활성제 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들면, 아지화나트륨, 항생 물질 등을 들 수 있다. 염류로는, 예를 들면, 염화나트륨, 질산나트륨, 황산나트륨, 탄산나트륨, 포름산나트륨, 아세트산나트륨, 염화칼륨, 질산칼륨, 황산칼륨, 탄산칼륨, 포름산칼륨, 아세트산칼륨 등을 들 수 있다. 간섭 물질 소거제로는, 예를 들면, 아스코르브산의 영향을 소거하기 위한 아스코르브산옥시다아제 등을 들 수 있다. 유기 용매로는, 예를 들면, 류코형 색원체의 수성 매체에 대한 용해 보조제로서의 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸술폭사이드 (DMSO), 디옥산, 아세톤, 메탄올, 에탄올 등을 들 수 있다.
(3) 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 키트
본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 시약은 키트의 형태로 보존, 유통 및 사용되어도 된다. 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 키트는 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법에 사용된다. 본 발명의 측정 키트로는, 예를 들면, 2 시약계 키트, 3 시약계 키트 등을 들 수 있고, 2 시약계 키트가 바람직하다.
본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 키트는 본 발명의 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈 측정 방법을 가능하게 하는 키트이면 특별히 제한되지는 않고, 2 시약계 키트인 경우는, 예를 들면, 단백질 분해 효소, 및 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 키트나, 단백질 분해 효소, 및 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 포함하며, 과산화수소 측정 시약을 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양방에 포함하는 키트 등을 들 수 있다. 과산화수소 측정 시약으로서 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약을 사용하는 경우에는, 퍼옥시다아제와 류코형 색원체는 각각의 시약에 포함되는 것이 바람직하다. 즉, 퍼옥시다아제와 류코형 색원체가 각각 제 1 시약과 제 2 시약에, 또는 제 2 시약과 제 1 시약에 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 측정 키트에 있어서의 단백질 분해 효소의 농도는 통상적으로 100 ∼ 30000 kU/ℓ이며, 바람직하게는 500 ∼ 10000 kU/ℓ이다. 본 발명의 측정 키트에 있어서의 프럭토실펩티드 산화 효소의 농도는 통상적으로 0.5 ∼ 100 kU/ℓ이며, 바람직하게는 1 ∼ 50 kU/ℓ이다.
본 발명의 측정 키트를 구성하는 시약에 있어서의 화합물 (I) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다. 본 발명의 측정 키트에 있어서의 화합물 (II) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다. 본 발명의 측정 키트에 있어서의 화합물 (III) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다. 본 발명의 측정 키트에 있어서의 화합물 (IV) 의 농도는 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이다.
(4) 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법과 류코형 색원체의 안정화 방법
본 발명은 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법에 관한 것이다. 본 발명의 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법에 의해, 수용액 중에서 류코형 색원체가 안정적으로 보존된다. 본 발명에 있어서, 류코형 색원체가 수용액 중에서 안정적으로 보존된다는 것은, 수용액 중에서 류코형 색원체가 열에 대해 안정적이거나 또는 광에 대해 안정적인 것을 의미하는데, 바람직하게는 열 및 광에 대해 안정적인 것을 의미한다. 본 발명의 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법에 있어서는, 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종이 류코형 색원체 함유 수용액에 첨가된다. 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로는, 전술한 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 를 들 수 있다.
본 발명의 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법에 있어서의 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 의 농도로는, 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이며, 0.0005 ∼ 5 ％ 가 바람직하다.
본 발명의 류코형 색원체의 보존 방법에 있어서, 류코형 색원체의 보존 안정성은 류코형 색원체 함유 수용액의 착색에 의해 평가할 수 있고, 착색이 클수록, 즉, 류코형 색원체 함유 수용액의 흡광도가 클수록 안정성이 나쁘다고 평가할 수 있다. 한편, 류코형 색원체 함유 수용액의 착색이 작을수록, 즉, 류코형 색원체 함유 수용액의 흡광도가 작을수록 안정성이 좋다고 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서의 류코형 색원체 함유 수용액이란, 류코형 색원체가 수성 매체 중에 용해된 수용액으로, 류코형 색원체를 수성 매체에 첨가하여 용해시킴으로써 조제할 수 있다. 류코형 색원체가 용해되는 수성 매체는 류코형 색원체가 용해되면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다. 또, 류코형 색원체 함유 수용액의 조제시에, 류코형 색원체의 수성 매체에 대한 용해 보조제로서 유기 용매를 사용할 수도 있다. 유기 용매에 용해시킨 류코형 색원체를 수성 매체에 첨가하고, 류코형 색원체를 수성 매체에 용해시켜, 류코형 색원체 함유 수용액을 조제할 수도 있다. 유기 용매로는, 류코형 색원체를 용해시키는 것이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸술폭사이드 (DMSO), 디옥산, 아세톤, 메탄올, 에탄올 등을 들 수 있다.
수성 매체의 pH 는 류코형 색원체가 용해되는 pH 이면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면 pH 4 ∼ 10 이다. 수성 매체로서 완충액을 사용하는 경우에는 설정하는 pH 에 따른 완충제를 사용하는 것이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들면 전술한 완충제 등을 들 수 있다.
완충액의 농도는 류코형 색원체가 용해되는 농도이면 특별히 제한되지는 않고, 통상적으로 0.001 ∼ 2.0 mol/ℓ이며, 0.005 ∼ 1.0 mol/ℓ가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 류코형 색원체로는, 예를 들면 전술한 류코형 색원체 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 류코형 색원체의 안정화 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서의 류코형 색원체의 안정화란, 류코형 색원체 함유 수용액 중의 류코형 색원체가 열에 대해 안정화되거나 또는 광에 대해 안정화되는 것을 의미하는데, 바람직하게는 열 및 광에 대해 안정화되는 것을 의미한다. 여기서, 류코형 색원체의 안정화는 류코형 색원체 함유 수용액의 착색에 의해 평가할 수 있고, 착색이 클수록, 즉, 류코형 색원체 함유 수용액의 흡광도가 클수록 안정성이 나쁘다고 평가한다. 한편, 류코형 색원체 함유 수용액의 착색이 작을수록, 즉, 류코형 색원체 함유 수용액의 흡광도가 작을수록 안정성이 좋다고 평가한다.
본 발명의 류코형 색원체의 안정화 방법에 있어서는 류코형 색원체를 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 수용액 중에서 공존시킨다. 본 발명의 류코형 색원체의 안정화 방법에 사용되는 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 로는, 전술한 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 를 들 수 있다.
본 발명의 안정화 방법에 있어서 사용되는 류코형 색원체 및 류코형 색원체 함유 수용액으로는, 전술한 류코형 색원체의 보존 방법에 있어서의 류코형 색원체 및 류코형 색원체 함유 수용액을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 류코형 색원체 함유 수용액 중의 류코형 색원체의 농도는 류코형 색원체가 수성 매체에 용해되는 농도이면 특별히 제한되지는 않지만, 통상적으로 0.0001 ∼ 2.0 m㏖/ℓ이며, 0.0005 ∼ 1.0 m㏖/ℓ가 바람직하다.
본 발명에 있어서 수용액 중에 류코형 색원체와 공존시키는 화합물 (I), 화합물 (II), 화합물 (III) 및 화합물 (IV) 의 농도로는, 통상적으로 0.0001 ∼ 10 ％ 이며, 0.0005 ∼ 5 ％ 가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 류코형 색원체의 열에 대한 안정성을 측정하는 방법은 열에 대한 류코형 색원체의 안정성을 측정할 수 있으면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면, 류코형 색원체를 함유하는 수용액을 5 ℃ 또는 30 ℃ 에서 보존한 후의 수용액의 착색을 흡광도계에 의해 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에 있어서의 류코형 색원체의 광에 의한 안정성을 측정하는 방법은 광에 대한 류코형 색원체의 안정성을 측정할 수 있으면 특별히 제한되지는 않고, 예를 들면, 류코형 색원체를 함유하는 수용액에 15 시간 광을 조사하고, 조사 후의 수용액의 착색을 흡광도계에 의해 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 실시예, 비교예 및 시험예에 있어서는 하기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.
Bis-Tris (도진 화학 연구소사 제조), ADA (도진 화학 연구소사 제조), MES (도진 화학 연구소사 제조), 아세트산칼슘 1 수화물 (칸토 화학사 제조), 염화칼슘 2 수화물 (와코 준야쿠 공업사 제조), DA-67 (와코 준야쿠 공업사 제조), 1-도데실피리디늄클로라이드 (C12py) (피리디늄염；도쿄 카세이사 제조), 1-세틸피리디늄클로라이드 (C16py) (피리디늄염；도쿄 카세이사 제조), 도데실트리부틸포스포늄클로라이드 (C12TBP) (포스포늄염；도쿄 카세이사 제조), 헥사데실트리부틸포스포늄클로라이드 (C16TBP) (포스포늄염；도쿄 카세이사 제조), 1-도데실-2-메틸-3-벤질이미다졸륨클로라이드 (C12MBI) (이미다졸륨염；와코 준야쿠 공업사 제조), N-라우릴이소퀴놀리늄클로라이드 (필레트 Q) (이소퀴놀리늄염；니치유사 제조), 서몰리신 (단백질 분해 효소；다이와 카세이사 제조), 액티나아제 AS (단백질 분해 효소；카켄 파머사 제조), FPOX-CE (프럭토실펩티드 산화 효소；키코만사 제조), 퍼옥시다아제 (토요 방적사 제조).
실시예 1
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
C12py 2.0 g/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 2
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
C16py 0.35 g/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 3
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
C12TBP 0.8 g/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 4
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
C16TBP 0.2 g/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 5
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
C12MBI 0.5 g/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 6
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
필레트 Q 0.5 g/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
비교예 1
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 7
HbA1c 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트를, 시료로서 사람의 혈액을 원심 분리하여 얻어지는 혈구를 탈이온수로 희석하여 용혈시켜서 조제되고, HbA1c 측정의 기준법인 KO500 법과 헤모글로빈 측정법의 하나인 SLS-헤모글로빈법으로부터 HbA1c 농도가 2.7 μ㏖/ℓ, 3.4 μ㏖/ℓ, 4.0 μ㏖/ℓ, 5.0 μ㏖/ℓ, 6.8 μ㏖/ℓ 로 값이 매겨져 있는 용혈 시료를 사용하여, 이하의 순서에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 측정하였다.
반응 셀에 각 시료 9.6 ㎕ 와 실시예 1 의 키트의 제 1 시약 120 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 가온하고 (제 1 반응), 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하고, 이어서 이 반응액에 제 2 시약 40 ㎕ 를 첨가하고 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온하고 (제 2 반응), 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하여, E2 에서 E1 을 빼어 흡광도차 (△E) 를 산출하였다. 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도와 △E 의 관계를 제 1 도에 나타낸다.
비교예 2
실시예 7 에 있어서의 실시예 1 의 키트 대신에 비교예 1 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 7 과 동일한 방법에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 산출하였다.
제 1 도에 나타내는 바와 같이, C12py 를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되지 않는 반면에, C12py 를 포함하는 실시예 1 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되었다. 따라서, 실시예 1 의 키트를 사용함으로써, 시료 중의 HbA1c 를 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 8
실시예 7 에 있어서의 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 2 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 7 과 동일한 방법에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 산출하였다. 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도와 △E 의 관계를 제 2 도에 나타낸다.
제 2 도에 나타내는 바와 같이, C16py 를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되지 않는 반면에, C16py 를 포함하는 실시예 2 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되었다. 따라서, 실시예 2 의 키트를 사용함으로써, 시료 중의 HbA1c 를 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 9
실시예 7 에 있어서의 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 3 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 7 과 동일한 방법에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 산출하였다. 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도와 △E 의 관계를 제 3 도에 나타낸다.
제 3 도에 나타내는 바와 같이, C12TBP 를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되지 않는 반면에, C12TBP 를 포함하는 실시예 3 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되었다. 따라서, 실시예 3 의 키트를 사용함으로써, 시료 중의 HbA1c 를 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 10
실시예 7 에 있어서의 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 4 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 7 과 동일한 방법에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 산출하였다. 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도와 △E 의 관계를 제 4 도에 나타낸다.
제 4 도에 나타내는 바와 같이, C16TBP 를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되지 않는 반면에, C16TBP 를 포함하는 실시예 4 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되었다. 따라서, 실시예 4 의 키트를 사용함으로써, 시료 중의 HbA1c 를 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 11
실시예 7 에 있어서의 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 5 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 7 과 동일한 방법에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 산출하였다. 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도와 △E 의 관계를 제 5 도에 나타낸다.
제 5 도가 나타내는 바와 같이, C12MBI 를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되지 않는 반면에, C12MBI 를 포함하는 실시예 5 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되었다. 따라서, 실시예 5 의 키트를 사용함으로써, 시료 중의 HbA1c 를 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 12
실시예 7 에 있어서의 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 6 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 7 과 동일한 방법에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 산출하였다. 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도와 △E 의 관계를 제 6 도에 나타낸다.
제 6 도가 나타내는 바와 같이, 필레트 Q 를 포함하지 않은 비교예 1 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되지 않는 반면에, 필레트 Q 를 포함하는 실시예 6 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되었다. 따라서, 실시예 6 의 키트를 사용함으로써, 시료 중의 HbA1c 를 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 13
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
C16py 0.35 g/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
액티나아제 AS 450 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
비교예 3
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.0) 10 m㏖/ℓ
아세트산칼슘 1 수화물 10 m㏖/ℓ
액티나아제 AS 450 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 14
HbA1c 측정용 키트로서 실시예 13 의 키트를, 시료로서 사람의 혈액을 원심 분리하여 얻어지는 혈구를 탈이온수로 희석하여 용혈시켜서 조제되고, 「데타미나-L HbA1c」 (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하는 면역 측정법과 헤모글로빈 측정법의 하나인 SLS-헤모글로빈법으로부터 HbA1c 농도가 2.5 μ㏖/ℓ, 3.7 μ㏖/ℓ, 4.0 μ㏖/ℓ, 4.7 μ㏖/ℓ, 6.3 μ㏖/ℓ 로 값이 매겨져 있는 용혈 시료를 사용하여, 이하의 순서에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 측정하였다.
반응 셀에 각 시료 9.6 ㎕ 와 실시예 1 의 키트의 제 1 시약 120 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 가온하고 (제 1 반응), 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하고, 이어서 이 반응액에 제 2 시약 40 ㎕ 를 첨가하고 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온하고 (제 2 반응), 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 측정하고, E2 에서 E1 을 빼어 흡광도차 △E 를 산출하였다. 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도와 △E 의 관계를 제 7 도에 나타낸다.
비교예 4
실시예 14 에 있어서의 실시예 13 의 키트 대신에 비교예 3 의 키트를 사용하는 것 이외에는 실시예 14 와 동일한 방법에 의해 각 시료에 대한 반응 흡광도를 산출하였다.
제 7 도에 나타내는 바와 같이, C16py 를 포함하지 않은 비교예 3 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되지 않는 반면에, C16py 를 포함하는 실시예 13 의 키트에 있어서는 HbA1c 농도와 반응 흡광도의 사이에 정량 관계가 발견되었다. 따라서, 실시예 13 의 키트를 사용함으로써, 시료 중의 HbA1c 를 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 15
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 10 m㏖/ℓ
C12py 1.6 g/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 16
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 10 m㏖/ℓ
C12TBP 0.8 g/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 17
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HbA1c 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 10 m㏖/ℓ
C12MBI 0.9 g/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
서몰리신 1200 kU/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
제 2 시약
ADA (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
퍼옥시다아제 120 kU/ℓ
실시예 18
HbA1c 측정용 키트로서 실시예 15 의 키트를, 시료로서 당뇨병이 의심되는 10 명의 피험자 유래의 전혈을 사용하여, 이하의 순서에 의해 각 시료에 있어서의 HbA1c 농도 (양) 의 총 헤모글로빈 농도 (양) 에 대한 비율 [HbA1c (％)] 을 결정하였다.
(1) 총 헤모글로빈 농도 결정을 위한 검량선의 작성
측정 키트로서 총 헤모글로빈 측정용 키트인 헤모글로빈 B-테스트 와코 (SLS-헤모글로빈법) (와코 준야쿠 공업사 제조) 를 사용하고, 검체로서 헤모글로빈 B-테스트 와코에 부속되는 표준품 (헤모글로빈 농도：15.3 ㎎/㎖) 을 사용하여 측정을 실시하고, 헤모글로빈 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.
(2) HbA1c 농도 결정을 위한 검량선의 작성
라텍스 면역 응집법에 의해 HbA1c 농도가 2.77 μ㏖/ℓ, 6.33 μ㏖/ℓ 로 값이 매겨진 2 개의 혈구 획분에 대해, 실시예 15 의 HbA1c 측정용 키트를 사용하여 측정해서, 각 혈구 획분에 대한 흡광도를 측정하였다. 당해 혈구 획분 대신에 생리 식염수를 사용하여, 생리 식염수에 대한 HbA1c 농도를 측정하였다. 당해 혈구 획분에 대한 각각의 흡광도로부터, 생리 식염수에 대한 흡광도를 빼어 산출한 값을 당해 혈구 획분에 대한 블랭크 보정 흡광도로 하였다. 당해 혈구 획분에 대한 블랭크 보정 흡광도와 생리 식염수에 대한 블랭크 보정 흡광도 (0 Abs) 로부터, HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 와 흡광도 사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.
(3) 각 혈구 획분에 있어서의 헤모글로빈 농도의 결정
각 시료에 대해 25 ℃, 3000 rpm 으로 5 분간 원심 분리를 실시하여 혈구 획분을 얻었다. 각 혈구 획분에 대해 헤모글로빈 B-테스트 와코를 사용하여 측정하고, 얻어진 측정값과 (1) 의 검량선으로부터 각 혈구 획분 중의 헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ) 를 결정하였다.
(4) 각 혈구 획분에 있어서의 HbA1c 농도의 결정
각 혈구 획분에 대해, 본 발명의 측정 키트를 사용하여 측정하고, 얻어진 측정값과 (2) 의 검량선으로부터 각 혈구 획분 중의 HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 를 결정하였다.
(5) HbA1c (％) (= HbA1c 농도의 헤모글로빈 농도에 대한 비율) 의 결정
상기 (3) 에서 결정한 각 혈구 획분에 있어서의 헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ) 와, 상기 (4) 에서 결정한 각 혈구 획분에 있어서의 HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ) 로부터, 이하의 식에 의해 일본 당뇨병 학회 (Japan Diabetes Society；JDS) 값의 HbA1c (％) 를 산출하였다.
[수학식 1]
HbA1c (％) =
[HbA1c 농도 (μ㏖/ℓ)] / [헤모글로빈 농도 (μ㏖/ℓ)] ×0.0963＋1.62
(6) 동일 혈구 획분 중의 HbA1c (％) 의 면역 측정법에 의한 결정
상기 (5) 에서의 HbA1c (％) 의 결정에 사용한 혈구 획분과 동일한 혈구 획분을 사용하여, 각 혈구 획분 중의 HbA1c (％) 를, 데타미나-L HbA1c (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용하는 면역 측정법에 의해 데타미나-L HbA1c 의 첨부 문서에 기재된 방법에 따라 결정하였다.
(7) 본 발명의 측정 방법과 면역 측정법의 상관
본 발명의 측정 방법을 이용하여 상기 (5) 에서 결정한 HbA1c (％) 와, 면역 측정법을 이용하여 상기 (6) 에서 결정한 HbA1c (％) 로부터, 본 발명의 측정 방법과 면역 측정법 사이의 상관 관계를 검증하여, 상관 계수를 결정하였다.
그 결과, 양 측정법간의 상관 계수가 0.994 로 되어, 양 측정법간에 양호한 상관 관계가 확인되었다. 따라서, 실시예 15 의 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법에 의해, 시료 중의 HbA1c 를 정확하게 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 19
실시예 18 에 있어서의 실시예 15 의 키트 대신에 실시예 16 의 키트를 사용하여 동일한 순서에 의해 데타미나-L HbA1c (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용한 측정 과의 사이의 상관 계수를 결정한 결과, 상관 계수가 0.984 로 되어, 양 측정법간에 양호한 상관 관계가 확인되었다. 따라서, 실시예 16 의 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법에 의해 시료 중의 HbA1c 를 정확하게 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 20
실시예 18 에 있어서의 실시예 15 의 키트 대신에 실시예 17 의 키트를 사용하여 동일한 순서에 의해 데타미나-L HbA1c (쿄와 메덱스사 제조) 를 사용한 측정과의 사이의 상관 계수를 결정한 결과, 상관 계수가 0.949 가 되어, 양 측정법간에 양호한 상관 관계가 확인되었다. 따라서, 실시예 17 의 키트를 사용하는 본 발명의 측정 방법에 의해 시료 중의 HbA1c 를 정확하게 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.
실시예 21
(1) DA-67 함유 수용액 및 DA-67 의 안정성 측정용 시료의 조제
이하의 조성으로 이루어지는 DA-67 함유 수용액을 조제하였다.
＜DA-67 함유 수용액＞
Bis-Tris (pH 7.0) 10 m㏖/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
계면활성제 (제 1 표 참조) 0.5 ％
상기 조성의 DA-67 함유 수용액을 5 ℃ 에서 7 일간 보존한 것 및 30 ℃ 에서 7 일간 보존한 것을 DA-67 안정성 측정용 시료로서 사용하였다.
(2) DA-67 안정성 측정용 시약의 조제
이하의 조성으로 이루어지는 DA-67 안정성 측정용 시약을 조제하였다.
＜DA-67 안정성 측정용 시약＞
Bis-Tris (pH 7.0) 10 m㏖/ℓ
BSA 0.005 ％
(3) DA-67 함유 수용액 중의 DA-67 의 안정성 평가
조제 직후의 DA-67 함유 수용액 30 ㎕ 에 (2) 에서 조제한 DA-67 안정화 측정용 시약 120 ㎕ 를 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 가온한 후의 용액의 흡광도 (E직후) 를, 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 로 히타치 7170S 형 자동 분석 장치로 측정하였다. 조제 직후의 DA-67 함유 수용액 대신에 (2) 의 DA-67 안정화 측정용 시약을 사용하여 동일한 측정을 실시하여 흡광도 (E블랭크) 를 측정하였다. E직후에서 E블랭크를 빼어, 조제 직후의 DA-67 함유 수용액에 대한 흡광도 (△E직후) 로 하였다.
마찬가지로, 5 ℃ 에서 7 일간 보존한 DA-67 함유 수용액 및 30 ℃ 에서 7 일간 보존한 DA-67 함유 수용액을 시료로서 사용하여 측정을 실시하고, 5 ℃ 에서 7 일간 보존한 DA-67 함유 수용액에 대한 흡광도 (△E5 ℃) 및 30 ℃ 에서 7 일간 보존한 DA-67 함유 수용액에 대한 흡광도 (△E30 ℃) 를 측정하였다.
측정한 △E5 ℃, △E30 ℃ 각각에서 △E직후를 뺀 값을, 각각 △E1, △E2 로 하고, DA-67 의 안정성 지표로 하였다. 그 결과를 제 1 표에 나타낸다. 값이 0 에 가까울수록 수용액 중에서의 착색이 억제되어, DA-67 이 수용액 중에서 안정적으로 보존되는 것, 즉, 수용액 중에서 DA-67 이 안정화되는 것을 나타내고 있다.
Figure pct00025
제 1 표에 나타내는 바와 같이, 화합물 (I) (C12py, C16py) 를 포함하는 수용액에서는 화합물 (I) 을 함유하지 않는 경우와 비교하여, 5 ℃ 에서도 30 ℃ 에 있어서도 보존 후의 착색이 현저하게 억제되었다. 이로부터, 화합물 (I) 을 포함하는 수용액 중의 DA-67 이 열에 대해 안정적이고, DA-67 함유 수용액이 화합물 (I) 에 의해 안정적으로 보존되고, DA-67 이 화합물 (I) 에 의해 수용액 중에서 안정화되는 것이 분명해졌다.
마찬가지로, 화합물 (II) (C12TBP, C16TBP) 를 포함하는 수용액에서는 화합물 (II) 를 함유하지 않는 경우와 비교하여, 5 ℃ 에서도 30 ℃ 에 있어서도 보존 후의 착색이 현저하게 억제되었다. 이로부터, 화합물 (II) 를 포함하는 수용액 중의 DA-67 이 열에 대해 안정적이고, DA-67 함유 수용액이 화합물 (II) 에 의해 안정적으로 보존되고, DA-67 이 화합물 (II) 에 의해 수용액 중에서 안정화되는 것이 분명해졌다.
실시예 22
실시예 21 에서 조제한 DA-67 함유 수용액에 대해 1100 럭스의 광을 15 시간 조사하고, 광에 의한 DA-67 의 안정성을 평가하였다. 광 조사 후의 DA-67 함유 수용액을 시료로서 사용하여 실시예 21 과 동일한 방법을 실시하고, 광 조사 후의 DA-67 함유 수용액에 대한 흡광도 △E3 을 측정하였다. 측정 결과를 제 2 표에 나타낸다.
Figure pct00026
제 2 표에 나타내는 바와 같이, 화합물 (I) (C12py, C16py) 를 포함하는 수용액에서는 화합물 (I) 을 함유하지 않는 경우와 비교하여, 광 조사에 의한 착색이 현저하게 억제되었다. 이로부터, 화합물 (I) 을 포함하는 수용액 중의 DA-67 이 광에 대해 안정적이고, DA-67 함유 수용액이 화합물 (I) 에 의해 안정적으로 보존되고, DA-67 이 화합물 (I) 에 의해 수용액 중에서 안정화되는 것이 분명해졌다.
마찬가지로, 화합물 (II) (C12TBP, C16TBP) 를 포함하는 수용액에서는 화합물 (II) 를 함유하지 않는 경우와 비교하여, 광 조사에 의한 착색이 현저하게 억제되었다. 이로부터, 화합물 (II) 를 포함하는 수용액 중의 DA-67 이 광에 대해 안정적이고, DA-67 함유 수용액이 화합물 (II) 에 의해 안정적으로 보존되고, DA-67 이 화합물 (II) 에 의해 수용액 중에서 안정화되는 것이 분명해졌다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, 당뇨병 진단에 유용한 당화 헤모글로빈의 측정 등에 유용한, 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법, 측정 시약 및 측정 키트, 그리고, 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법 및 류코형 색원체의 안정화 방법이 제공된다.

Claims (18)

  1. 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈과 단백질 분해 효소를, 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 존재하에 반응시키고, 얻어지는 반응 생성물에 프럭토실펩티드 산화 효소를 작용시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈의 측정 방법.
    [화학식 25]
    Figure pct00027

    (식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 26]
    Figure pct00028

    (식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 27]
    Figure pct00029

    (식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 28]
    Figure pct00030

    (식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
  2. 제 1 항에 있어서,
    과산화수소의 측정이 과산화수소 측정 시약에 의해 실시되는 측정 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 측정 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 측정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 측정 방법.
  6. 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 시약으로서, 단백질 분해 효소, 프럭토실펩티드 산화 효소 및 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 시약.
    [화학식 29]
    Figure pct00031

    (식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 30]
    Figure pct00032

    (식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 31]
    Figure pct00033

    (식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 32]
    Figure pct00034

    (식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
  7. 제 6 항에 있어서,
    추가로 과산화수소 측정 시약을 포함하는 측정 시약.
  8. 제 7 항에 있어서,
    과산화수소 측정 시약이 퍼옥시다아제와 류코형 색원체를 포함하는 시약인 측정 시약.
  9. 제 8 항에 있어서,
    류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 측정 시약.
  10. 제 9 항에 있어서,
    페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 측정 시약.
  11. 헤모글로빈 함유 시료 중의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 키트로서, 단백질 분해 효소, 및 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 함유하는 제 1 시약과, 프럭토실펩티드 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 당화 헤모글로빈 측정 키트.
    [화학식 33]

    (식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 34]
    Figure pct00036

    (식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 35]
    Figure pct00037

    (식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 36]
    Figure pct00038

    (식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
  12. 제 11 항에 있어서,
    추가로 퍼옥시다아제 및 류코형 색원체를 각각 제 1 시약과 제 2 시약, 또는 제 2 시약과 제 1 시약에 포함하는 측정 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 측정 키트.
  14. 제 13 항에 있어서,
    페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 측정 키트.
  15. 류코형 색원체 함유 수용액에, 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 첨가하는 것을 특징으로 하는 류코형 색원체 함유 수용액의 보존 방법.
    [화학식 37]
    Figure pct00039

    (식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 38]
    Figure pct00040

    (식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 39]
    Figure pct00041

    (식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 40]
    Figure pct00042

    (식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
  16. 류코형 색원체를, 이하의 일반식 (I) 로 나타내는 피리디늄염, 이하의 일반식 (II) 로 나타내는 포스포늄염, 이하의 일반식 (III) 으로 나타내는 이미다졸륨염 및 이하의 일반식 (IV) 로 나타내는 이소퀴놀리늄염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 포함하는 수용액 중에서 공존시키는 것을 특징으로 하는 류코형 색원체의 안정화 방법.
    [화학식 41]
    Figure pct00043

    (식 중, R1 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, Ra 는 수소 원자, 치환 혹은 비치환의 알킬, 또는 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, n 은 1 ∼ 5 의 정수를 나타내고, X- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 42]
    Figure pct00044

    (식 중, R2 ∼ R5 는 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬을 나타내고, Y- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 43]
    Figure pct00045

    (식 중, R6 과 R8 은 동일하거나 또는 상이하며, 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, R7, R9, R10 은 수소 원자, 치환 혹은 비치환 알킬, 치환 혹은 비치환 알케닐을 나타내고, Z- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
    [화학식 44]
    Figure pct00046

    (식 중, R11 은 치환 혹은 비치환의 알킬, 치환 혹은 비치환의 알케닐을 나타내고, W- 는 1 가의 아니온을 나타낸다)
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    류코형 색원체가 페노티아진계 색원체인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    페노티아진계 색원체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 방법.
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