JPWO2013161675A1 - 血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法 - Google Patents

Abstract

血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法、及び、血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法を提供する。血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下で保存することを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の安定化方法；血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下で保存することを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の保存方法。本発明の血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法、及び、血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法は、臨床診断に有用である。

Description

本発明は、血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法、血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法、及び、血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法に関する。

アスコルビン酸は生体に必須のビタミンであり、特にヒトにおいては生体内で合成することができず、その欠乏は壊血病などの重篤な疾病を引き起こすことが知られている。このように生体中、特にヒト血液中のアスコルビン酸を測定することは非常に重要である。

生体中のアスコルビン酸を測定する方法としてはHPLCを使用する方法や化学反応を用いる方法が知られている（非特許文献１）が、後者は非特異反応に起因する測定誤差の問題があり、測定値の正確性の面から前者が広く用いられている。

しかしながらHPLC法は手技が煩雑であり、測定に要する時間が長いという欠点がある。この欠点を克服した方法として、多数検体を簡便で迅速かつ正確に測定し得る酵素的測定法が知られている（特許文献１）。
アスコルビン酸は非常に酸化されやすい物質であるため、測定法の種類を問わず、例えば検体が血液の場合は除蛋白上清を速やかに凍結しなければならない等、煩雑な安定化処理が必須であった（非特許文献１）。

近年、癌の治療やQOLの向上、美容や健康維持増進を目的として高濃度ビタミンC点滴療法(IVC)が普及しつつある（非特許文献２、３）。この療法は週に1〜2回の頻度で実施されることが多く、点滴を受けたヒトや動物の点滴後の血中アスコルビン酸濃度を知ることは次回の点滴条件を判断及び決定する上で極めて有用である。

しかしながらIVCを実施している施設では、血清分離や除蛋白操作に必須な遠心分離機が無い場合が多いため、上述の検体の安定化処理が十分に実施できず、その結果として測定値の正確性が担保され難いという問題がある。また、それらの施設内では生体試料中のアスコルビン酸測定ができないため、HPLC法測定を外部の分析施設に依頼することが多く、測定結果が得られるまで点滴後一週間以上を要することが多いため、次回の点滴の点滴条件の判断及び決定に間に合わないケースが多発するという問題がある。

上記のようなIVCを実施している施設をはじめ、血液中のアスコルビン酸濃度測定を外注する施設においては、測定用の検体を、遠心分離操作を行わずに冷蔵状態で、宅配便等で外部の分析施設に輸送する方法は、自ら除蛋白上清を作製して凍結状態で輸送する方法に比較してはるかに負担の少ない簡便な方法である。冷蔵状態で宅配便等を利用して輸送する場合は、通常は採血から2〜4日後に外部の分析施設に到着して測定が可能になる。

血液中のアスコルビン酸濃度の測定を外注する施設において理想的なことは、そのような簡便な検体操作方法と冷蔵輸送を実施しても採血時の90%以上の正確性が担保された測定値が得られることである。

全血中のアスコルビン酸は冷蔵保存で比較的安定であるという報告（非特許文献４、５、６）もあるが、より安定的に血清又は血漿中のアスコルビン酸を保存し、血清又は血漿中のアスコルビン酸を簡便、かつ、正確に測定する方法が求められている。

国際公開第1998/031829号パンフレット

日本臨床 68(1) 176-178 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，第102巻，第38号，13604-13609頁，2005年 Anticancer Research，第29巻，第3号，第809-815頁，2009年 Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention，第5巻，第10号，811-814頁，1996年 Journal of Chromatography，第612巻，第1号，63-70頁，1993年 The American Journal of Clinical Nutrition，第48巻，第2号， 286-290頁，1988年

本発明の目的は、血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法、血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法、及び、血清又は血漿中のアスコルビン酸を簡便かつ正確に測定するための方法を提供することにある。

本発明者らは本課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下で保存することにより、血清又は血漿中アスコルビン酸を安定に保存し得る、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［１７］に関する。
［１］ 血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下で保存することを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の安定化方法。
［２］ 保存が、-1℃〜15℃での保存である［１］記載の安定化方法。
［３］ 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体が、0.5%〜2.0%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体である［１］又は［２］記載の安定化方法。
［４］ 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合が、0.1%〜70%である［１］〜［３］のいずれかに記載の安定化方法。

［５］ 血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下で保存することを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の保存方法。
［６］ 保存が、-1℃〜15℃での保存である［５］記載の保存方法。
［７］ 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体が、0.5%〜2.0%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体である［５］又は［６］記載の保存方法。
［８］ 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合が、0.1%〜70%である［５］〜［７］のいずれかに記載の保存方法。

［９］ ［５］〜［８］記載のいずれかの保存方法により保存された血漿又は血清を用いることを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の測定方法。
［１０］ 以下の工程を含むことを特徴とする、血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法。
（１）全血を全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体で希釈し、全血溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した全血溶液を保存する工程；
（３）工程（２）の全血溶液中の血球と血清又は血漿とを分離する工程；
（４）工程（３）で分離された血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度を測定する工程；
（５）工程（３）で分離された血清又は血漿の、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体に対する希釈倍率を算出する工程；
（６）工程（４）で測定されたアスコルビン酸濃度と、工程（５）で算出された希釈倍率とから、血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度を決定する工程。
［１１］ 希釈倍率が、ヘマトクリット値を用いて算出される［１０］記載の測定方法。
［１２］ 希釈倍率が、既知濃度の対照成分を用いて算出される［１０］記載の測定方法。
［１３］ 対照成分が、色素、色原体、蛍光物質、発光物質、及び、血清又は血漿中に一定濃度で含まれる成分からなる群より選ばれる物質である、［１２］記載の測定方法。
［１４］ 工程（４）におけるアスコルビン酸濃度の測定が、アスコルビン酸から過酸化水素を生成させるアスコルビン酸酸化酵素を用いて行なわれる、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の測定方法。
［１５］ 工程（２）における全血溶液の保存が、-1℃〜15℃での保存である［１０］〜［１４］のいずれかに記載の測定方法。
［１６］ 工程（１）における全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体が、0.5%〜2.0%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体である［１０］〜［１５］のいずれかに記載の測定方法。
［１７］ 工程（１）における全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合が、0.1%〜70%である［１０］〜［１６］のいずれかに記載の測定方法。

本発明により、血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法、血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法、及び、血清又は血漿中のアスコルビン酸を簡便かつ正確に測定する方法が提供される。

本発明の血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法は、血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下に保存することを特徴とする。

本発明の血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法は、血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下に保存することを特徴とする。

本発明における血清及び血漿とは、ヒト又は動物より採取して得られた全血から調製される血清及び血漿であれば特に制限はない。血清は、抗凝固剤を含まない採血管を用いて採取された全血を遠心分離すること、自然沈降させること等により調製することができる。血漿は、抗凝固剤入り採血管によって採取された全血を遠心分離すること、自然沈降させること等により調製することができる。抗凝固剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)２カリウム塩、ヘパリン、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。動物としては、例えばイヌ、サル、ネコ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ロバ、ラクダ、タヌキ、キツネ、クマ、パンダ、イノシシ、ニワトリ、ハト、魚類、甲殻類等が挙げられる。

本発明における、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体としては、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有し、血清及び血漿中のアスコルビン酸を安定に保持し得る水性媒体であれば特に制限はなく、例えば0.5〜2.0%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体等が挙げられ、0.65%〜1.3%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体等が好ましい。水性媒体としては、塩類、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤等を含む水溶液等が挙げられる。

塩類としては特に制限はないが、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等のハロゲン化アルカリ金属塩や塩化マグネシウム、塩化カルシウム等のハロゲン化アルカリ土類金属塩や硝酸塩、硫酸塩等が挙げられる。

緩衝剤としては特に制限はないが、乳酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、グリシン塩、3,3−ジメチルグルタル酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、バルビツール塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、イミダゾール−酢酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、グッド緩衝剤等が挙げられる。

グッド緩衝剤としては、例えば2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(Tris)、ビス（2−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、N−（2−アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−N,N’−ビス（2−エタンスルホン酸）(PIPES)、N−（2−アセトアミド）−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、2−〔4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3−〔N,N−ビス（2−ヒドロキシエチル）アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−N,N’−ビス（2−ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、3−〔4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジニル〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3−〔4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、N−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、N,N−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、N−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。

防腐剤としては例えば、アジ化ナトリウム、硫酸ストレプトマイシン等が挙げられる。

安定化剤としては例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)又はその塩等のキレート剤、アルブミン、グロブリン等の蛋白質、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子化合物等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。

界面活性剤としては例えば、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、トリトンX-100等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。

全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体のpHは通常、3〜11であり、5〜9が好ましい。

本発明における、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合は、血清及び血漿中のアスコルビン酸を安定に保持し得る割合であれば特に制限はなく、例えば0.1%〜70%であり、0.1%〜20%が好ましく、0.1%〜6%が特に好ましい。

本発明の、血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法、及び、血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法における保存温度は、血清又は血漿中のアスコルビン酸が安定に保持される温度であれば特に制限はなく、全血を溶血させない温度が好ましい。全血を溶血させない温度としては、例えば-1℃〜15℃であり、-1℃〜10℃が好ましい。

血清又は血漿中のアスコルビン酸は、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中で血球が共存した状態で保存される。検体として全血を用いる場合は、全血を全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体で希釈することにより、血清又は血漿中のアスコルビン酸は、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中で血球が共存した状態で保存されることになる。

本発明の、血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法は、本発明の保存方法により保存された血漿又は血清を用いることを特徴とする。具体的には、以下の工程を含む方法が挙げられる。
（１）全血を全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体で希釈し、全血溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した全血溶液を保存する工程；
（３）工程（２）の全血溶液中の血球と血清又は血漿とを分離する工程；
（４）工程（３）で分離された血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度を測定する工程；
（５）当該全血由来の血清又は血漿の、工程（３）で分離された血清又は血漿に対する希釈倍率を算出する工程；
（６）工程（４）で測定されたアスコルビン酸濃度と、工程（５）で算出された希釈倍率とから、血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度を決定する工程。

工程（５）における希釈倍率を算出する方法としては、工程（３）で分離された血清又は血漿を全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体で希釈した時の希釈倍率を算出できる方法であれば、いかなる方法でもよく、例えばヘマトクリット値を用いて算出する方法、既知濃度の対照成分を用いて算出する方法等が挙げられる。

ヘマトクリット値を用いて希釈倍率を算出する方法としては、下記の方法が挙げられる。

全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の容量の、当該全血の容量に対する比(A)と、当該全血におけるヘマトクリット値Ht(%)とから下記の方法により希釈倍率を算出する。

Htは全血に占める血球部分の容積比率を%で表したものである。従って、全血容積に対する血清又は血漿の比率は、以下の式(I)で表わされる。

この血清又は血漿が、全血のA倍の、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体で希釈されたのであるから、全血由来の血清又は血漿の希釈倍率は、以下の式(II)で表わされる。

工程（６）において、上記式(II)により算出された希釈倍率と、工程（４）で測定されたアスコルビン酸濃度(z)とから、下記式(III)により、当該全血由来の血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度(v)を決定することができる。

既知濃度の対照成分を用いて希釈倍率を算出する方法としては、下記の方法が挙げられる。
（１）全血と、既知濃度(d)の対照成分を含有し、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体とを混合して、全血溶液を調製する工程；
（２）工程（１）で調製した全血溶液を保存する工程；
（３）工程（２）で保存した全血溶液中の血球と血清又は血漿とを分離する工程；
（４）工程（３）で分離された血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度(z)を測定する工程；
（５）工程（３）で分離された血清又は血漿中の対照成分濃度(D)を測定する工程；
（６）式(IV)により、当該全血由来の血清又は血漿の、工程（３）で分離された血清又は血漿に対する希釈倍率を算出する工程；

（７）工程（４）でのアスコルビン酸濃度(z)と、工程（６）で算出した希釈倍率とから、式(V)により、当該全血由来の血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度(v)を決定する工程。

本発明のアスコルビン酸の測定方法における、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合は、アスコルビン酸を安定に保持し得る割合であれば特に制限はなく、例えば0.1%％〜70%であり、0.1%〜20%が好ましく、0.1%〜6%が特に好ましい。ここで、血清又は血漿、及び、血球の容量は、全血の容量であるので、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合は、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体と全血の総容量に対する全血の容量の割合となる。この総容量に対する全血の容量が小さい程、測定に必要な全血の量が少なくてすむが、総容量に対する全血の容量が小さすぎると測定誤差の原因となるため、総容量に対する全血の割合は、血清又は血漿中の予想されるアスコルビン酸の濃度や、測定に用いるアスコルビン酸の測定方法に応じて適宜調整することが好ましい。

本発明のアスコルビン酸の測定方法における、全血溶液の保存温度は、血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、全血を溶血させない温度が好ましい。全血を溶血させない温度としては、例えば-1℃〜15℃であり、-1℃〜10℃が好ましい。

既知濃度の対照成分を用いて希釈倍率を算出する工程を含む、本発明の血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法においては、用いる全血の容量は、既知容量であっても、未知容量であってもよく、また、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の容量は、既知容量であっても、未知容量であってもよい。

既知濃度の対照成分を用いて希釈倍率を算出する工程を含む、本発明の血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法において使用される対照成分としては、血清又は血漿の、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体に対する希釈倍率の算出が可能な対照成分であれば特に制限はなく、例えば色素、色原体、蛍光物質、発光物質、糖類の他、血清又は血漿中に一定濃度で含まれる成分等が挙げられる。血清又は血漿中に一定濃度で含まれる成分を対照成分として用いる場合、血清又は血漿中の当該成分そのものを対照成分として用いることができるが、希釈倍率算出の正確性を向上させるため、血清又は血漿に当該成分を添加したものを対照成分として用いるのが好ましい。

色素としては、例えば、アシッドイエロー3、アシッドイエロー23、アシッドイエロー25、アシッドイエロー36、アシッドオレンジ5、アシッドオレンジ6、アシッドオレンジ7、アシッドオレンジ10、アシッドオレンジ19、アシッドオレンジ52、アシッドグリーン16、アシッドグリーン25、アシッドバイオレット43、アシッドブルー3、アシッドブルー9（ブリリアントブルーFCF）、アシッドブルー40、アシッドブルー45、アシッドブルー47、アシッドブルー59、アシッドブルー74、アシッドブルー113、アシッドブルー158、アシッドレッド1、アシッドレッド2、アシッドレッド14、アシッドレッド18、アシッドレッド27、アシッドレッド37、アシッドレッド51、アシッドレッド52、アシッドレッド87、アシッドレッド88、アシッドレッド92、アシッドレッド94、アシッドレッド95、アシッドレッド111、フードレッド17、フードイエロー3、ベーシックイエロー1、ベーシックイエロー2、ベーシックイエロー11、ベーシックオレンジ1、ベーシックオレンジ22、ベーシックグリーン4（マラカイトグリーン）、ベーシックバイオレット3、ベーシックバイオレット4、ベーシックバイオレット10、ベーシックブルー1、ベーシックブルー3、ベーシックブルー9、ベーシックブルー24、ベーシックレッド1、ベーシックレッド2、ベーシックレッド5、ベーシックレッド9、ベーシックレッド18等が挙げられる。

色原体としては、還元発色型色原体、酸化発色型色原体等が挙げられる。
還元発色型色原体としては、例えば、3−（4，5−ジメチルー2−チアゾリル）−2，5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム ブロミド（MTT）、2−（4−ヨードフェニル）−3−（4−ニトロフェニル）−5−（2，4（ジスルホフェニル）一2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩（WST−1）、2−（4−ヨードフェニル）−3−（2，4−ジニトロフェニル）−5−（2，4−ジスルホフェニル）−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩（WST−3）等が挙げられる。

酸化発色型色原体としては、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の共存下、単独で色素へ変換される色原体（以下、ロイコ型色原体とよぶ）と、二つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する色原体（以下、カップリング型色原体とよぶ）とが挙げられる。

ロイコ型色原体としては、例えば、10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3，7−ビス（ジメチルアミノ）−10H−フェノチアジン(CCAP)、10−N−メチルカルバモイル−3，7−ビス（ジメチルアミノ）−10H−フェノチアジン(MCDP)、N−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−4，4’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA−64)、4，4’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3，7−ビス（ジメチルアミノ）−10H−フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)、ビス［3−ビス（4−クロロフェニル）メチル−4−ジメチルアミノフェニル］アミン(BCMA)等が挙げられる。

カップリング型色原体としては、例えば、4−アミノアンチピリン（4−AA）や3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等のカプラーと、アニリン類又はフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。アニリン類としては、例えばN−エチル−N−（3−メチルフェニル）−N’サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N−（3，5−ジメトキシフェニル）−N’サクシニルエチレンジアミン・ナトリウム塩(DOSE)、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3一スルホプロピル）−m−トルイジン、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3，5−ジメトキシアニリン、N−スルホプロピル−3，5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−スルホプロピル−3，5−ジメチルアニリン、N一エチル−N−スルホプロピル−m−トルイジン、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−m−アニシジン、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）アニリン、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン・ナトリウム塩2水和物(TOOS)、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメトキシアニリン、N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩(HSDA)、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメチルアニリン、N−スルホプロピルアニリン、N−エチル−N−スルホプロピルアニリンプロピル−m−アニシジン、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−4−フルオロ−3，5−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩(F−DAOS)等が挙げられる。フェノール類としては、例えばフェノール、3−ヒドロキシ−2，4，6−トリヨード酢酸等が挙げられる。

蛍光物質としては、p−ヒドロキシフェニル酢酸、p−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、クマリン等が挙げられる。

発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。

生体中に一定濃度で含まれる成分としては、例えばカリウム、マグネシウム、セレン、マンガン、カルシウム、ヒ素、カドミウム、銅、鉛、亜鉛、ニッケル、アルミニウム、フルクトサミン、ポリアミン、ヨウ素、1,5-アンヒドログルシトール(1,5-AG)、グルコース−6−リン酸、遊離脂肪酸、胆汁酸、クレアチニン、クレアチン、アミノ酸類、ポルフィリン、D−アラビニトール、β−D−グルカン、カルニチン、ビリルビン、ウロビリノーゲン、尿酸、シアル酸、セルロプラスミン、25−水酸化ビタミンD、過酸化脂質、インスリン、カタラーゼ、モノアミンオキシダーゼ等が挙げられる。胆汁酸類としては、例えばコール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、7−オキソリトコール酸、12−オキソリトコール酸、12−オキソケノデオキシコール酸、7−オキソデオキシコール酸等が挙げられる。

既知濃度の対照成分により希釈倍率を算出する工程を含む、本発明の血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法において、対照成分濃度(D)は以下の方法により測定することができる。

対照成分が色素である場合には、例えば当該上清中の色素の吸光度を分光光度計により用いて測定し、得られた吸光度を、予め作成した色素濃度と吸光度との関係を表す検量線に照らし合わせることにより決定することができる。

対照成分が還元発色型色原体である場合には、例えば当該上清中の還元発色型色原体を、NAD(P)H等の還元型補酵素、ジアホラーゼ及び1-メトキシ-5-メチルフェナジウムメチルサルフェート等の電子キャリアーの作用により色素に変換し、生成した色素の吸光度を分光光度計により測定し、得られた吸光度を、予め作成した色素濃度と吸光度との関係を表す検量線に照らし合わせることにより決定することができる。

対照成分が酸化発色型色原体である場合には、例えば当該上清中の酸化発色型色原体を、過酸化水素、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の作用により色素に変換し、生成した色素の吸光度を分光光度計により測定し、得られた吸光度を、予め作成した色素濃度と吸光度との関係を表す検量線に照らし合わせることにより決定することができる。

対照成分が蛍光物質である場合には、例えば当該上清中の蛍光物質に、過酸化水素、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を作用させて、蛍光を生成させて、生成した蛍光の強度を蛍光強度計により測定し、得られた蛍光強度を、予め作成した蛍光物質濃度と蛍光強度との関係を表す検量線に照らし合わせることにより決定することができる。

対照成分が発光物質である場合には、例えば当該上清中の発光物質に、過酸化水素、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を作用させて、光（フォトン）を生成させて、生成した光（フォトン）の強度をルミノメータで測定し、得られた光強度を、予め作成した発光物質濃度と光強度との関係を表す検量線に照らし合わせることにより決定することができる。

対照成分が血清又は血漿中に一定濃度で含まれる成分である場合には、例えば血清又は血漿中の当該成分と、当該成分測定用試薬とを反応させて、得られた情報（色素、蛍光、光等）を、予め作成した当該成分濃度と情報量との関係を表す検量線に照らし合わせることにより決定することができる。当該成分測定用試薬として、市販の試薬を用いることができる。

本発明において、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体として、前記の塩類、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤等を含む水溶液の他に、前記の対照成分を含む水溶液、前記の対照成分と共に、前記の塩類、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤等を含む水溶液も用いることができる。

本発明におけるアスコルビン酸の測定方法としては、アスコルビン酸濃度を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えばHPLC法、酵素法、化学法等が挙げられ、酵素法が好ましい。

酵素法としては、アスコルビン酸に、アスコルビン酸から過酸化水素を生成させるアスコルビン酸酸化酵素を作用して過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を測定することにより、アスコルビン酸を測定する方法等が挙げられる。アスコルビン酸から過酸化水素を生成させるアスコルビン酸酸化酵素の具体例（市販品）としては、例えばアスコルビン酸酸化酵素III天野（アマノエンザイム社製）等が挙げられる。化学法としては、例えば2,4−ジニトロフェニルヒドラジン法（DNPH法）等が挙げられる。化学法を利用した測定キットの具体例（市販品）としては、例えば「ビタミンＣ定量キット（DNPH法）」（シマ研究所社製）等が挙げられる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
尚、本実施例、比較例及び試験例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
ＭＥＳ（同仁化学研究所社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、塩化カリウム（和光純薬工業社製）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ（同仁化学研究所社製）、ノニオンＨＳ−２１０（非イオン性界面活性剤；日油社製）、ＭＣＤＰ（ロイコ型色原体；協和メデックス社製）、アスコルビン酸酸化酵素III天野（アスコルビン酸酸化酵素；アマノエンザイム社製）、アスコルビン酸（和光純薬工業社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、デオキシコール酸（和光純薬工業社製）。

血清と測定用試料のアスコルビン酸測定値比較（ヘマトクリット値補正）
（１）全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の調製
塩化ナトリウム水溶液（塩化ナトリウム濃度：0.9%）を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体とした。
（２）測定用試料の調製
健常者から採血した全血0.1 mLを（１）の水溶液0.2 mLに混合した。容積比A、すなわち、全血に対する（１）の水溶液の容積比は2となる。

（３）アスコルビン酸測定用キットの調製
以下の組成からなるアスコルビン酸測定用キットを調製した。
第１試薬
ＭＥＳ（ｐＨ５．５） 0.05 mol/L
塩化カリウム 9 g/L
ＥＤＴＡ・２Ｎａ 0.5 g/L
ノニオンＨＳ−２１０ 1 g/L
ＭＣＤＰ 0.025 g/L
第２試薬
ＭＥＳ（ｐＨ５．５） 0.05 mol/L
塩化カリウム 1.5 g/L
アスコルビン酸酸化酵素 200 kU/L
ペルオキシダーゼ 1 kU/L

（４）アスコルビン酸測定用標準液の調製
以下の組成からなるアスコルビン酸測定用標準液を調製した。

グリシン（ｐＨ３．０） 0.01 mol/L
ＥＤＴＡ・２Ｎａ 0.1 g/L
アスコルビン酸 50 mg/L

（５）検量線の作成
上記（４）で調製したアスコルビン酸測定用標準液30μLに（３）で調製したキットの第１試薬2 mLを添加し、37℃で5分間加温後、第１試薬1 mLを添加し、37℃で5分間加温した後の反応液の吸光度を、波長660 nmで測定し、アスコルビン酸濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。

（６）血清中のアスコルビン酸の測定
同様の操作を、健常者の血清（全血由来の血清）についても行い、得られた吸光度を（５）で作成した検量線に関連付けることにより、血清中のアスコルビン酸濃度を決定した。決定されたアスコルビン酸濃度を第１表に記す。

（７）測定用試料中のアスコルビン酸の測定
上記と同一の健常者より採取した全血から調製した上記（２）の測定用試料を2,000 rpmで2分間遠心分離し、その上清のアスコルビン酸濃度z(μg/mL)を上記と同様に決定した。

（８）ヘマトクリット値の測定
上記と同一の健常者から採血した全血をヘマトクリット毛細管（テルモ株式会社製）に採取し、ミクロヘマトクリット法にてヘマトクリット値Ht%を測定した。

（９）測定用試料の血清部分のアスコルビン酸濃度の算出
測定用試料調製に使用された全血に由来する血清中のアスコルビン酸の濃度v(μg/mL)を式（II）により算出した。ここで、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の容量の、当該全血の容量に対する比(A)は上記（２）より２であることから、vは以下の式(VI)で算出される。

実際の測定値及び算出値を第１表に示す。

第１表から明らかなように、全血から調製した測定用試料から得られる血清中アスコルビン酸濃度は、全血由来の血清を用いた測定により得られたアスコルビン酸濃度と良く一致する結果となった。

血清と測定用試料のアスコルビン酸測定値比較（対照成分補正）
（１）全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の調製
以下の組成からなる全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体を調製した。
塩化ナトリウム 0.9%
デオキシコール酸ナトリウム 1 mmol/L
（２）測定用試料の調製
健常者から採血した全血0.1 mLを（１）の水溶液0.2 mLに混合した。
（３）アスコルビン酸測定用キットの調製
実施例１の（３）のアスコルビン酸測定用キットを調製した。
（４）アスコルビン酸測定用標準液の調製
実施例１の（４）のアスコルビン酸測定用標準液を調製した。
（５）検量線の作成
実施例１の（５）と同様に、上記（４）で調製したアスコルビン酸測定用標準液を用いて、アスコルビン酸濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。

（６）血清中のアスコルビン酸の測定
同様の操作を、健常者の血清（全血由来の血清）についても行い、得られた吸光度を（５）で作成した検量線に関連付けることにより、血清中のアスコルビン酸濃度を決定した。決定されたアスコルビン酸濃度を第２表に記す。
（７）測定用試料中のアスコルビン酸の測定
上記と同一の健常者より採取した全血から調製した上記（２）の測定用試料を2,000 rpmで2分間遠心分離し、その上清のアスコルビン酸濃度Z(μg/mL)を上記と同様に決定した。
（８）測定用試料中のデオキシコール酸（対照成分）の測定
上記（２）の測定用試料を2,000 rpmで2分間遠心分離して得られた上清中のデオキシコール酸濃度D (mmol/L)を、デオキシコール酸測定用キット「アクアオートカイノス ＴＢＡ試薬」（カイノス社製）を用いて測定した。
（９）血清の希釈倍率の決定
ここで、用いた全血由来の血清の希釈倍率は、式(V)にdとして1 (mmol/L)を代入した式(VII)で表わされる。

（１０）測定用試料中の血清部分のアスコルビン酸濃度の算出
上記（７）で決定された測定用試料中のアスコルビン酸濃度Z(μg/mL)と、上記（９）で決定された希釈倍率とから、測定用試料調製に使用された全血に由来する血清中のアスコルビン酸の濃度V(μg/mL)は、以下の式(VIII)で表わされることになる。

実際の測定値及び算出値を第２表に示す。

第２表から明らかなように、全血から調製した測定用試料から得られる血清中アスコルビン酸濃度は、全血由来の血清を用いた測定により得られたアスコルビン酸濃度と良く一致する結果となった。

生体試料中のアスコルビン酸の安定性評価
5名の健常者Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅから採血した全血を用いて、除蛋白上清検体、血清検体を調製した。除蛋白上清検体は、血清に10%濃度のメタリン酸を等量添加した後に十分混和し、遠心分離により蛋白を除くことにより調製した。血清検体は、全血を遠心分離（1,200 G×10分間）することにより調製した。

除蛋白上清検体を-20℃にて保存し、保存直後から1週間後までの当該検体中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法により決定した。また、上記血清検体を5℃にて保存し、保存直後から1週間後までの当該血清検体中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法により決定した。同様に、全血検体を5℃にて保存し、保存直後から1週間後までの当該全血検体に由来する血清中のアスコルビン酸濃度を実施例１と同様の方法により決定した。全血検体に由来する血清中のアスコルビン酸濃度の測定に際しては、実施例１と同様の方法により当該全血検体より分離した上清を使用した。

各検体の保存後の残存率を、保存直後の検体中のアスコルビン酸の測定値を100とした場合の、各測定値の相対値として第３表に記す。

第３表から明らかなように、いずれの被採血者の検体も除蛋白上清-20℃保存では1週間後まで90%以上の残存率を示しているが、血清5℃保存では1日後でも90%未満の残存率となった。一方、全血5℃保存では健常者Ｄでは3日後でも90%以上の残存率を示したが、他の健常者ではいずれも3日後には残存率が90％未満となった。

測定用試料中のアスコルビン酸の安定性評価
（１）全血を用いた検討
実施例３で最も保存安定性が悪かった健常者Ａから採血した全血(α)を用いて、除蛋白上清検体、血清検体、及び、測定用試料を調製した。除蛋白上清検体は、血清に10%濃度のメタリン酸を等量添加した後に十分混和し、遠心分離により蛋白を除くことにより調製した。血清検体は、全血を遠心分離（1,200 G×10分間）することにより調製した。全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体として塩化ナトリウム水溶液（塩化ナトリウム濃度：0.9%）を用い、全血と、0.9%塩化ナトリウム水溶液とを混合して、全血と当該水溶液の総容量に対する全血の容量の割合が(1)70%、(2)50%、(3)33%、(4)20%、(5)12%、(6)6%、(7)3%である測定用試料(1)〜(7)を調製した。

除蛋白上清検体を-20℃にて保存し、保存直後から1週間後までの当該検体中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法により決定した。同様に、当該血清検体を5℃にて保存し、保存直後から1週間後までの当該血清検体中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法により決定した。また、全血検体を5℃にて保存し、保存直後から1週間後までの当該全血検体由来の血清中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法により決定した。さらに、各測定用試料(1)〜(7)を5℃にて保存し、保存直後から1週間後までの当該各測定用試料(1)〜(7)由来の血清中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法により決定した。尚、全血由来の血清中のアスコルビン酸濃度の測定に際しては、実施例１と同様の方法により全血より分離した上清を使用した。同様に、各測定用試料(1)〜(7)由来の血清中のアスコルビン酸濃度の測定に際しては、実施例１と同様の方法により各測定用試料より分離した上清を使用した。

保存直後の検体中のアスコルビン酸の測定値を100とした場合の、各測定値の相対値を第４表に記す。

第４表から明らかなように全血を用いた場合、測定用試料(1)〜(7)においては、全血5℃保存と比較して試料中のアスコルビン酸が安定であった。全血と0.9%塩化ナトリウム水溶液の総容量に対する全血の容量の割合が小さい程、アスコルビン酸は安定であり、特に、当該割合が3〜20%の測定用試料を用いた場合、採血後5℃保存で2〜4日以内の測定であれば、採血時の測定値の90%以上の測定値が得られ、正確な測定が可能となることが分かった。

（２）アスコルビン酸高値疑似全血を用いた検討
全血に4,000μg/mLとなる様にアスコルビン酸を添加して調製したアスコルビン酸高値疑似全血と、塩化ナトリウム水溶液（塩化ナトリウム濃度：0.9%）とを混合して、アスコルビン酸高値疑似全血と当該水溶液の総容量に対するアスコルビン酸高値疑似全血の容量の割合が(8)70%、(9)50%、(10)33%、(11)20%、(12)12%、(13)6%、(14)3%、(15)1.5%、(16)0.75%、(17)0.2%、(18)0.1%である測定用試料(8)〜(14)を調製した。測定用試料(8)〜(14)を用いる以外は（１）と同様の方法により、保存期間中のアスコルビン酸の安定性を評価した。その結果を第５表に記す。

第５表から明らかなようにアスコルビン酸高値疑似全血を用いた場合でも、測定用試料(8)〜(18)においては、全血5℃保存と比較して試料中のアスコルビン酸が安定であった。全血と0.9%塩化ナトリウム水溶液の総容量に対する全血の容量の割合が小さい程、アスコルビン酸は安定であり、特に、当該割合が0.1〜20%の測定用試料を用いた場合、採血後5℃保存で2〜4日以内の測定であれば、採血時の測定値の90%以上の測定値が得られ、正確な測定が可能となることが分かった。

測定用試料を宅配便などで医療機関から測定施設まで搬送する場合においても、2〜4日間は十分余裕のある期間である。従って、本発明のアスコルビン酸の安定化方法は、測定用試料を実際に医療機関から測定施設まで搬送する場合においても、正確なアスコルビン酸の測定を可能とする方法であることが判明した。

全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の塩濃度がアスコルビン酸の安定性に与える影響の評価
（１）全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の調製
塩化ナトリウム水溶液（塩化ナトリウム濃度：0.5〜2.0%）を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体とした。
（２）アスコルビン酸高値疑似全血の調製
健常者から採血した全血にアスコルビン酸を添加し、2,000μg/mLのアスコルビン酸高値疑似全血を調製した。
（３）測定用試料の調製
上記（２）で調製したアスコルビン酸高値疑似全血と、（１）の塩化ナトリウム水溶液とを混合し、アスコルビン酸高値疑似全血と（１）の塩化ナトリウム水溶液の総容量に対するアスコルビン酸高値疑似全血の容積の割合が70%、50%、33%、20%、12%、6%、3%、1.5%、0.75%、0.2%である測定用試料を調製した。

（４）アスコルビン酸濃度の変動
上記（２）のアスコルビン酸高値疑似全血、及び、上記（３）で調製した各測定用試料を5℃に保存し、保存直後から4日後までの各試料由来の血清中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法で決定した。尚、全血及び各測定用試料由来の血清中のアスコルビン酸濃度の測定に際しては、実施例１と同様に、全血及び各測定用試料より分離した上清を用いた。

保存直後の検体中のアスコルビン酸の測定値を100とした場合の、各測定値の相対値を第６−１〜６−５表に記す。尚、第６−１〜６−５表において、“総容量”とは、アスコルビン酸高値疑似全血と塩化ナトリウム水溶液の総容量を表し、“全血”とは、アスコルビン酸高値疑似全血を表す。

第６−１〜６−５表から明らかなように、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体としての塩化ナトリウム水溶液（塩化ナトリウム濃度：0.5%〜2.0%）と全血とを用いて調製した測定用試料においては、全血5℃保存と比較して試料中のアスコルビン酸が安定であった。従って、試料中のアスコルビン酸は、全血状態で保存するよりも、全血を0.5%〜2.0%の塩化ナトリウム水溶液中で保存する方が、より安定に保持されることが判明した。

測定用試料の保存温度がアスコルビン酸の安定性に与える影響の評価
（１）全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体の調製
塩化ナトリウム濃度水溶液（塩化ナトリウム濃度：1.0%）を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体とした。
（２）測定用試料の調製
健常者から採血した全血にアスコルビン酸を添加し、4,000μg/mLのアスコルビン酸高値疑似全血を調製した。
（３）測定用試料の調製
上記（２）で調製したアスコルビン酸高値疑似全血と、（１）の水溶液とを混合し、アスコルビン酸高値疑似全血と（１）の水溶液の総容量に対するアスコルビン酸高値疑似全血の容積の割合が70%、50%、33%、20%、12%、6%、3%、1.5%、0.75%、0.2%、0.1%である測定用試料を調製した。

（４）アスコルビン酸濃度の変動
上記（２）のアスコルビン酸高値疑似全血の調製に使用した全血、及び、上記（３）で調製した各測定用試料を-1℃、2℃、5℃、8℃、10℃、15℃の各温度で保存し、保存直後から4日後までの各試料由来の血清中のアスコルビン酸濃度を、実施例１と同様の方法で決定した。尚、アスコルビン酸高値疑似全血及び各測定用試料由来の血清中のアスコルビン酸濃度の測定に際しては、実施例１と同様に、アスコルビン酸高値疑似全血及び各測定用試料より分離した上清を用いた。

保存直後の検体中のアスコルビン酸の測定値を100とした場合の、各測定値の相対値を第７−１〜７−６表に記す。尚、第７−１〜７−６表において、“総容量”とは、アスコルビン酸高値疑似全血と1.0%塩化ナトリウム水溶液の総容量を表し、“全血”とは、アスコルビン酸高値疑似全血を表す。

第７−１〜７−６表から明らかなように、-1〜15℃の全ての保存温度において、試料中のアスコルビン酸は、全血状態で保存するよりも、全血を1.0%塩化ナトリウム水溶液中で保存する方が、より安定に保持されることが判明した。

本発明により、血清又は血漿中のアスコルビン酸の安定化方法、血清又は血漿中のアスコルビン酸の保存方法、及び、血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法が提供される。本発明の方法は、臨床診断等に有用である。

Claims (17)

1. 血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下で保存することを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の安定化方法。
2. 保存が、-1℃〜15℃での保存である請求項１記載の安定化方法。
3. 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体が、0.5%〜2.0%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体である請求項１又は２記載の安定化方法。
4. 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合が、0.1%〜70%である請求項１〜３のいずれかに記載の安定化方法。
5. 血清又は血漿中のアスコルビン酸を、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体中に血球の共存下で保存することを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の保存方法。
6. 保存が、-1℃〜15℃での保存である請求項５記載の保存方法。
7. 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体が、0.5%〜2.0%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体である請求項５又は６記載の保存方法。
8. 全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合が、0.1%〜70%である請求項５〜７のいずれかに記載の保存方法。
9. 請求項５〜８記載のいずれかの保存方法により保存された血漿又は血清を用いることを特徴とする、血漿又は血清中のアスコルビン酸の測定方法。
10. 以下の工程を含むことを特徴とする、血清又は血漿中のアスコルビン酸の測定方法。
    （１）全血を全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体で希釈し、全血溶液を調製する工程；
    （２）工程（１）で調製した全血溶液を保存する工程；
    （３）工程（２）の全血溶液中の血球と血清又は血漿とを分離する工程；
    （４）工程（３）で分離された血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度を測定する工程；
    （５）工程（３）で分離された血清又は血漿の、全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体に対する希釈倍率を算出する工程；
    （６）工程（４）で測定されたアスコルビン酸濃度と、工程（５）で算出された希釈倍率とから、血清又は血漿中のアスコルビン酸濃度を決定する工程。
11. 希釈倍率が、ヘマトクリット値を用いて算出される請求項１０記載の測定方法。
12. 希釈倍率が、既知濃度の対照成分を用いて算出される請求項１０記載の測定方法。
13. 対照成分が、色素、色原体、蛍光物質、発光物質、及び、血清又は血漿中に一定濃度で含まれる成分からなる群より選ばれる物質である、請求項１２記載の測定方法。
14. 工程（４）におけるアスコルビン酸濃度の測定が、アスコルビン酸から過酸化水素を生成させるアスコルビン酸酸化酵素を用いて行なわれる、請求項１０〜１３のいずれかに記載の測定方法。
15. 工程（２）における全血溶液の保存が、-1℃〜15℃での保存である請求項１０〜１４のいずれかに記載の測定方法。
16. 工程（１）における全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体が、0.5%〜2.0%の食塩水と等しい浸透圧を有する水性媒体である請求項１０〜１５のいずれかに記載の測定方法。
17. 工程（１）における全血中の血球を溶血させない浸透圧を有する水性媒体、血清又は血漿、及び、血球の総容量に対する、血清又は血漿、及び、血球の容量の割合が、0.1%〜70%である請求項１０〜１６のいずれかに記載の測定方法。