KR20140114267A - 측정 대상 성분의 측정 방법 - Google Patents

측정 대상 성분의 측정 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140114267A
KR20140114267A KR1020137014501A KR20137014501A KR20140114267A KR 20140114267 A KR20140114267 A KR 20140114267A KR 1020137014501 A KR1020137014501 A KR 1020137014501A KR 20137014501 A KR20137014501 A KR 20137014501A KR 20140114267 A KR20140114267 A KR 20140114267A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
reagent
kit
acid
measured
hydrogen peroxide
Prior art date
Application number
KR1020137014501A
Other languages
English (en)
Inventor
도모미 무라카미
Original Assignee
교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 교와 메덱스 가부시키가이샤 filed Critical 교와 메덱스 가부시키가이샤
Publication of KR20140114267A publication Critical patent/KR20140114267A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B21/00—Thiazine dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/64—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving ketones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/908—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 α-케토산 존재 하에 산화 발색형 색원체를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법. 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 산화 발색형 색원체를 사용하여 측정하는 방법에 있어서, α-케토산을 사용하는 것을 특징으로 하는, 과산화물의 영향 억제 방법. 본 발명의 α-케토산을 사용하는 측정 방법, 및 억제 방법에 의해서 과산화물의 영향이 억제되어, 정확한 검체 중의 측정 대상 성분의 측정이 가능해진다.

Description

측정 대상 성분의 측정 방법{METHOD FOR ANALYSIS FOR COMPONENT TO BE ASSAYED}
본 발명은 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 측정용 시약, 및 측정용 키트, 그리고 과산화물의 영향 억제 방법에 관한 것이다.
임상 진단에 있어서는, 전혈, 혈청, 혈장, 뇨 등의 생체 시료를 사용하여, 생체 시료 중의 측정 대상 성분을 측정한다. 생체 시료 중의 측정 대상 성분은 효소를 사용하는 방법이나 항원 항체를 사용한 면역 측정법 등에 의해서 측정된다. 효소를 사용하는, 생체 시료 중의 측정 대상 성분의 측정에 있어서는, 측정 대상 성분을 산화 효소에 의해서 과산화수소로 변환한 후, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 존재 하에 산화 발색형 색원체와 반응시키고, 생성된 색소의 흡광도를 측정하는 것이 자주 행해진다.
이 과산화수소 정량계에 기초하는 생체 시료 중의 측정 대상 성분의 측정은 원만한 반응 조건이나 조작의 간편성 등 때문에 자동 분석 장치를 사용한 다검체의 연속 측정에 다용되고 있다. 그러나, 이 방법은 생체 시료 중에 존재하는 빌리루빈이나 헤모글로빈 등의 영향을 받아, 측정치가 이론치보다 낮아진다고 하는 소위 부 (負) 의 영향을 받는 것이 문제로 되어 있다. 이 문제에 대해서, 지금까지 철시아노 화합물을 사용하는 방법 (예를 들어, 비특허문헌 1) 등의 방법이 보고되어 있다.
한편, 과산화수소 정량계에 기초하는 생체 시료 중의 측정 대상 성분의 측정에 있어서는 계면활성제가 자주 사용된다. 계면활성제는 효소의 기질과의 상호 작용에 의한 효소의 특이성 제어나, 효소와의 상호 작용에 의한 효소의 반응성 제어, 검체의 전처리 등을 위해서 사용된다. 그 중에서도, 폴리옥시에틸렌계 계면활성제, 폴리옥시프로필렌계 계면활성제 등의 폴리옥시알킬렌계 계면활성제는 그 종류의 다양성과 입수 가능성 때문에 다용된다.
그러나, 폴리옥시알킬렌계 계면활성제는 그 구조로부터 과산화물을 생성하기 쉽고 (예를 들어, 특허문헌 1), 생성된 과산화물은 과산화수소 정량계에 정 (正) 의 영향을 주어 측정치가 이론치보다 높아지는 것이 문제로 되어 있다. 특히, 생체 시료 측정용 시약이나 생체 시료 측정용 키트의 보존 상태가 불충분한 경우에는, 이들 시약이나 키트에 있어서 과산화물이 자주 생성되어 시약이나 키트의 성능 저하를 일으킨다.
또, 진단용 키트 중에는, 염, 완충제, 효소, 방부제 등의 첨가물이 함유되는 경우가 많지만, 이들 첨가물을 사용한 키트 제조 공정 중에서 생성 또는 혼입된 과산화물이나, 장기 보존 중에 산화에 의해 생성된 과산화물에 의해서 측정에 정의 영향을 주는 경우가 있다. 나아가서는, 생체 중에서의 산화 스트레스나 효소 반응 등, 혹은 약제 투여 등에 의해서, 전혈, 혈청, 혈장, 뇨 등의 생체 시료 중에 과산화물이 생성되고, 이 과산화물이 측정에 정의 영향을 주는 경우도 있다.
피루브산은 α-케토산의 하나로서, 생체 내에서는 해당계 (解糖系) 에 있어서 중간 생성물로서 생성된다. 피루브산은 비교적 강한 항산화 활성을 갖는 것이 알려져 있고 (예를 들어, 특허문헌 2), 세포 중의 산소 라디칼을 중화하는 작용이 보고되어 있다 (예를 들어, 특허문헌 3).
과산화수소 정량계에 기초하는 생체 시료 중의 측정 대상 성분의 측정에 있어서, 과산화물의 영향이 억제된 측정 방법이 요구되고 있다.
일본 공개특허공보 2007-204701호 일본 공개특허공보 2004-217932호 일본 공표특허공보 평9-511746호
클리니컬 케미스트리, 제26권, 제2호, 227-231페이지 (1980년)
본 발명의 목적은 과산화수소 정량계에 있어서의 과산화물의 영향이 억제된, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 측정용 시약, 및 측정용 키트, 그리고 과산화물의 영향 억제 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 본 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 측정하는 방법에 있어서, α-케토산을 사용함으로써 과산화수소 정량계에 영향을 미치지 않고 과산화물의 영향이 억제되어, 정확한 검체 중의 측정 대상 성분의 측정을 할 수 있다는 지견 (知見) 을 알아내어 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 [1] ∼ [20] 에 관한 것이다.
[1] 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 α-케토산 존재 하에 산화 발색형 색원체를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법.
[2] 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 산화 발색형 색원체와 반응시키는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법에 있어서, 생성된 과산화수소와 산화 발색형 색원체의 반응을 α-케토산 존재 하에 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법에 있어서의 과산화물의 영향 억제 방법.
[3] α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 [1] 또는 [2] 에 기재된 방법.
[4] 산화 발색형 색원체가 류코형 색원체인 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 류코형 색원체가 페노티아진 유도체인 [4] 에 기재된 방법.
[6] 페노티아진 유도체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 [5] 에 기재된 방법.
[7] 산화 발색형 색원체가 산화 커플링형 색원체인 [1] ∼ [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[8] 산화 커플링형 색원체가 커플러와, 아닐린 유도체 또는 페놀 유도체의 조합인 [7] 에 기재된 방법.
[9] 과산화수소 생성 시약, α-케토산, 과산화 활성 물질 및 산화 발색형 색원체를 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약.
[10] α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 [9] 에 기재된 시약.
[11] 산화 발색형 색원체가 류코형 색원체인 [9] 또는 [10] 에 기재된 시약.
[12] 류코형 색원체가 페노티아진 유도체인 [11] 에 기재된 시약.
[13] 페노티아진 유도체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 [12] 에 기재된 시약.
[14] 산화 발색형 색원체가 산화 커플링형 색원체인 [9] 또는 [10] 에 기재된 시약.
[15] 산화 커플링형 색원체가 커플러와, 아닐린 유도체 또는 페놀 유도체의 조합인 [14] 에 기재된 시약.
[16] 제 1 시약 및 제 2 시약을 함유하는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 키트로서, 류코형 색원체와 과산화 활성 물질이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 별개의 시약에 함유되고, 과산화수소 생성 시약 및 α-케토산이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 일방 또는 양방에 함유되는 것을 특징으로 하는 키트.
[17] 류코형 색원체가 페노티아진 유도체인 [16] 에 기재된 키트.
[18] 페노티아진 유도체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 [17] 에 기재된 키트.
[19] 제 1 시약 및 제 2 시약을 함유하는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 키트로서, 커플러와, 아닐린 유도체 또는 페놀 유도체가 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 별개의 시약에 함유되고, 과산화 활성 물질, 과산화수소 생성 시약 및 α-케토산이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 일방 또는 양방에 함유되는 것을 특징으로 하는 키트.
[20] α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 [16] ∼ [19] 중 어느 하나에 기재된 키트.
본 발명에 의해서, 과산화물의 영향이 억제된 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 측정용 시약, 및 측정용 키트, 그리고 과산화물의 영향 억제 방법이 제공된다.
도 1 은 실시예 5(1) 의 피루브산을 함유하는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트, 및 실시예 5(4) 의 α-케토산을 함유하지 않는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트를 사용한 헤모글로빈 A1c 측정 방법에 있어서의, 헤모글로빈 A1c 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. 가로축은 헤모글로빈 A1c 농도 (μ㏖/ℓ) 를, 세로축은 흡광도 (Abs) 를 나타낸다. ○ 는 피루브산을 함유하는 키트를 사용한 측정의 그래프를 나타내고, △ 는 α-케토산을 함유하지 않는 키트를 사용한 측정 그래프를 나타낸다.
도 2 는 실시예 5(2) 의 α-케토글루타르산을 함유하는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트, 및 실시예 5(4) 의 α-케토산을 함유하지 않는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트를 사용한 헤모글로빈 A1c 측정 방법에 있어서의, 헤모글로빈 A1c 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. 가로축은 헤모글로빈 A1c 농도 (μ㏖/ℓ) 를, 세로축은 흡광도 (Abs) 를 나타낸다. ○ 는 α-케토글루타르산을 함유하는 키트를 사용한 측정 그래프를 나타내고, △ 는 α-케토산을 함유하지 않는 키트를 사용한 측정 그래프를 나타낸다.
도 3 은 실시예 5(3) 의 옥살로아세트산을 함유하는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트, 및 실시예 5(4) 의 α-케토산을 함유하지 않는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트를 사용한 헤모글로빈 A1c 측정 방법에 있어서의, 헤모글로빈 A1c 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 그래프이다. 가로축은 헤모글로빈 A1c 농도 (μ㏖/ℓ) 를, 세로축은 흡광도 (Abs) 를 나타낸다. ○ 는 옥살로아세트산을 함유하는 키트를 사용한 측정 그래프를 나타내고, △ 는 α-케토산을 함유하지 않는 키트를 사용한 측정 그래프를 나타낸다.
(1) 측정 대상 성분의 측정 방법
본 발명의 측정 대상 성분의 측정 방법은 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 α-케토산 존재 하에 산화 발색형 색원체를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 측정 대상 성분의 측정 방법은 검체 중에 존재하는 과산화물의 영향이 억제되어, 정확하게 검체 중의 측정 대상 성분을 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서의 검체로는, 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 한에서는 특별히 제한은 없고, 예를 들어 전혈, 혈청, 혈장, 뇨 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법은 과산화물의 영향이 억제되는 한에서는 특별히 제한은 없고, 예를 들어 이하의 공정을 포함하는 방법 등을 들 수 있다.
공정 1 : 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소 생성 시약과 반응시켜 과산화수소를 생성시키는 공정 ；
공정 2 : 공정 1 에서 생성된 과산화수소를, α-케토산 및 과산화 활성 물질의 존재 하에 산화 발색형 색원체와 반응시켜 색소를 생성시키는 공정 ；
공정 3 : 공정 2 에서 생성된 색소의 흡광도를 측정하는 공정 ；
공정 4 : 이미 알려진 농도의 측정 대상 성분을 사용하여 작성된, 측정 대상 성분의 농도 또는 활성과 흡광도의 관계를 나타내는 검량선에, 공정 3 에서 측정한 흡광도를 상관시키는 공정 ；
공정 5 : 검체 중의 측정 대상 성분의 농도 또는 활성을 결정하는 공정.
상기 공정 1 의 반응은 α-케토산 존재 하에 실시해도 된다. 또, 공정 1 과 공정 2 는 동시에 실시해도 되고 단계적으로 실시해도 된다.
공정 1 에 있어서의, 검체 중의 측정 대상 성분과 과산화수소 생성 시약의 반응은 과산화수소를 생성하는 조건이면 어떠한 반응 조건이어도 되고, 예를 들어 10 ∼ 50 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 40 ℃ 이고, 1 분간 ∼ 3 시간, 바람직하게는 2.5 분간 ∼ 1 시간 실시한다.
공정 2 에 있어서의, α-케토산 및 과산화 활성 물질의 존재 하에서의, 과산화수소와 산화 발색형 색원체의 반응은 색소를 생성하는 조건이면 어떠한 반응 조건이어도 되고, 예를 들어 10 ∼ 50 ℃, 바람직하게는 20 ∼ 40 ℃ 이고, 1 분간 ∼ 3 시간, 바람직하게는 2.5 분간 ∼ 1 시간 실시한다. 이 반응에 있어서의 α-케토산의 농도로는, 과산화물의 영향을 억제할 수 있는 농도이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 0.001 ∼ 20 g/ℓ 이다.
공정 3 에 있어서의, 생성된 색소의 흡광도를 측정하는 방법은 흡광도를 측정할 수 있는 방법이면 어떠한 방법에서도 되고, 예를 들어 분광 광도계를 사용하여 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
공정 1 에 있어서의 과산화수소 생성 시약은 측정 대상 성분과 반응하여 과산화수소를 생성시키는 시약으로서, 예를 들어 (A) 측정 대상 성분을 직접 과산화수소로 변환하는 시약 [이하, 시약 (A) 로 기재한다], (B) 측정 대상 성분을 간접적으로 과산화수소로 변환하는 시약 [이하, 시약 (B) 로 기재한다], (C) 측정 대상 성분으로부터 직접 과산화수소를 생성시키는 시약 [이하, 시약 (C) 로 기재한다], (D) 측정 대상 성분으로부터 간접적으로 과산화수소를 생성시키는 시약 [이하, 시약 (D) 로 기재한다] 등을 들 수 있다.
시약 (A) 는 검체 중의 측정 대상 성분을 직접 과산화수소로 변환하는 시약이다. 시약 (A) 가 적용되는 측정 대상 성분은, 예를 들어, 산화 효소의 기질 등이다. 시약 (A) 로는, 예를 들어 측정 대상 성분의 산화 효소를 함유하는 시약 등을 들 수 있다. 측정 대상 성분과 시약 (A) 의 조합의 구체예를 표 1 에 나타낸다.
Figure pct00001
또 상기에 있어서 각종 리포단백이란, HDL, LDL, VLDL, IDL, 렘넌트 리포단백, sdLDL 등을 말한다. 이하, 동일하다.
또, 측정 대상이 되는 산화 효소의 기질은 복수의 반응을 거쳐 유도되는 것이어도 된다. 이 경우, 산화 효소의 기질로 변환되는 측정 대상 성분이 복수의 반응을 거쳐 산화 효소의 기질로 변환된 후, 산화 효소와의 반응에 의해서 과산화수소가 생성된다. 이 산화 효소의 기질로 변환되는 물질, 산화 효소의 기질, 및 산화 효소의 조합으로는, 예를 들어 표 2 에 나타내는 조합 등을 들 수 있다.
Figure pct00002
또한, 총콜레스테롤은 모든 리포단백 중의 유리형 콜레스테롤과 에스테르형 콜레스테롤을 합친 것을 의미하고, 각종 리포단백 중의 콜레스테롤은 각종 리포단백 중의 유리형 콜레스테롤과 에스테르형 콜레스테롤을 합친 것을 의미하고, 총 에스테르형 콜레스테롤은 모든 리포단백 중의 에스테르형 콜레스테롤을 의미한다.
시약 (B) 는 검체 중의 측정 대상 성분을 간접적으로 과산화수소로 변환하는 시약이다. 시약 (B) 가 적용되는 측정 대상 성분은, 예를 들어, 2 개 이상의 효소 반응에 의해서 과산화수소로 변환되는 효소의 기질 등을 들 수 있다. 시약 (B) 로는, 예를 들어 그 기질과 반응하는 효소, 그 기질이 변환되어 생성하는 물질을 대응하는 산화 효소가 존재하는 물질로 변환하는 효소 또는 효소와 그 기질, 및 그 산화 효소를 함유하는 시약 등을 들 수 있다. 측정 대상 성분과 시약 (B) 의 조합을 표 3 에 나타낸다.
Figure pct00003
시약 (C) 는 측정 대상 성분으로부터 직접 과산화수소를 생성시키는 시약이다. 시약 (C) 가 적용되는 측정 대상 성분은, 예를 들어, 과산화수소를 생성하는 산화 효소 등을 들 수 있다. 시약 (C) 로는, 예를 들어 그 산화 효소의 기질을 함유하는 시약 등을 들 수 있다. 측정 대상 성분과 시약 (C) 의 조합의 구체예를 표 4 에 나타낸다.
Figure pct00004
시약 (D) 는 측정 대상 성분으로부터 간접적으로 과산화수소를 생성시키는 시약이다. 시약 (D) 가 적용되는 측정 대상 성분은, 예를 들어, 2 가지 이상의 반응에 의해서 과산화수소를 생성시키는 효소 등을 들 수 있다. 시약 (D) 로는, 예를 들어 그 효소의 기질, 그 효소와 그 기질의 반응에 의해서 생성하는 물질을 대응하는 산화 효소가 존재하는 물질로 변환하는 효소 또는 효소와 그 기질, 및 그 산화 효소를 함유하는 시약 등을 들 수 있다. 측정 대상 성분과 시약 (D) 의 조합의 구체예를 표 5 에 나타낸다.
Figure pct00005
본 발명에 있어서, 산화 발색형 색원체는 과산화 활성 물질의 존재 하에 과산화수소와 반응하여 색소가 생성된다. 과산화 활성 물질로는 예를 들어 퍼옥시다아제 등을 들 수 있다. 산화 발색형 색원체로는 산화 커플링형 색원체, 류코형 색원체 등을 들 수 있고, 류코형 색원체가 바람직하다.
류코형 색원체는 과산화수소 및 과산화 활성 물질의 존재 하에 단독으로 색소로 변환되는 물질이다.
류코형 색원체로는, 예를 들어 페노티아진계 색원체, 트리페닐메탄계 색원체, 디페닐아민계 색원체, o-페닐렌디아민, 하이드록시프로피온산, 디아미노벤지딘, 테트라메틸벤지딘 등을 들 수 있고, 페노티아진계 색원체가 바람직하다.
페노티아진계 색원체로는, 예를 들어 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 나트륨염 (DA-67) 등을 들 수 있다. 페노티아진계 색원체 중에서도, 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 나트륨염 (DA-67) 이 특히 바람직하다.
트리페닐메탄계 색원체로는, 예를 들어 N,N,N',N',N'',N''-헥사(3-술포프로필)-4,4',4''-트리아미노트리페닐메탄 (TPM-PS) 등을 들 수 있다.
디페닐아민계 색원체로는, 예를 들어 N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
산화 커플링형 색원체는, 과산화수소 및 과산화 활성 물질의 존재 하에, 2 개의 화합물이 산화적 커플링되어 색소를 생성하는 물질이다. 2 개의 화합물의 조합으로는 커플러와 아닐린류 (트린더 시약) 의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다.
커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논하이드라진 등을 들 수 있다.
아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-비스(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다.
페놀류로는 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-하이드록시-2,4,6-트리요오도벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 과산화물이란 본 발명의 측정 방법에 있어서 정의 영향을 주는 물질로서, 과산화물을 생성할 수 있는 계면활성제에서 유래하는 과산화물 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 과산화물은 검체 유래의 과산화물이어도 되고 측정 시약 유래의 과산화물이어도 된다. 과산화물을 생성할 수 있는 계면활성제로는, 예를 들어 폴리옥시알킬렌계 계면활성제 등을 들 수 있다. 폴리옥시알킬렌계 계면활성제로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌계 계면활성제, 폴리옥시프로필렌계 계면활성제, 폴리옥시부틸렌계 계면활성제 등을 들 수 있다. 폴리옥시알킬렌계 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양쪽이온성 계면활성제 등을 들 수 있고, 비이온성 계면활성제가 바람직하다. 비이온성 계면활성제로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알케닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알케닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌알킬아릴에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌 공중합체 등을 들 수 있다.
과산화물은 과산화물가, 카르보닐가, 티오바르비트르산가 등의 유지 산화의 지표에 의해서 검출, 측정 또는 정량할 수 있다.
본 발명에 있어서의 α-케토산은 본 발명의 측정 방법을 가능하게 할 수 있는 한 특별히 제한은 없고, 예를 들어 피루브산, 옥살로아세트산, α-케토글루타르산, 옥살산 등을 들 수 있고, 피루브산, 옥살로아세트산, α-케토글루타르산이 바람직하고, 피루브산이 특히 바람직하다. 본 발명에 있어서의 α-케토산은 염의 형태이어도 되고, 염으로는 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 암모늄염, 칼슘염 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서 사용되는 α-케토산의 농도는 본 발명의 측정 방법을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 0.001 ∼ 20 g/ℓ 이다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의, 측정 대상 성분과 과산화수소 생성 시약의 반응은 수성 매체 중에서 행해지는 것이 바람직하다. 또, 측정 대상 성분과 과산화수소 생성 시약의 반응은 안정화제, 방부제, 간섭 물질 소거제, 반응 촉진제 등을 공존시켜 실시할 수도 있다.
수성 매체로는 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있으나, 완충액이 바람직하다. 완충액의 pH 로는 pH 4.0 ∼ 10.0 이고, pH 6.0 ∼ 8.0 이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는 예를 들어 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다.
굿 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (Tris), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-하이드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-하이드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 [(H)EPPS], N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-하이드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다.
완충액의 농도는 측정에 적절한 농도이면 특별히 제한은 되지 않지만, 0.001 ∼ 2.0 ㏖/ℓ 가 바람직하고, 0.005 ∼ 10 ㏖/ℓ 가 보다 바람직하다.
안정화제로는 예를 들어 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA), 수크로오스, 염화칼슘, 페로시안화칼륨, 소 혈청 알부민 (BSA) 등을 들 수 있다. 방부제로는 예를 들어 아지화나트륨, 항생 물질 등을 들 수 있다. 간섭 물질 소거제로는 예를 들어 아스코르브산의 영향을 소거하기 위한 아스코르브산옥시다아제 등을 들 수 있다. 반응 촉진제로는 예를 들어 콜리파아제, 포스폴리파아제 등의 효소, 황산나트륨, 염화나트륨 등의 염류를 들 수 있다.
(2) 측정 대상 성분의 측정용 시약 및 측정용 키트
본 발명의, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약은 본 발명의 측정 방법에 사용되는 시약으로서, 과산화수소 생성 시약, α-케토산, 과산화 활성 물질 및 산화 발색형 색원체를 함유한다.
본 발명의, 측정용 시약의 구체적 양태를 이하에 나타낸다.
·측정용 시약 1
과산화수소 생성 시약, α-케토산, 과산화 활성 물질 및 류코형 색원체를 함유하는 시약.
·측정용 시약 2
과산화수소 생성 시약, α-케토산, 과산화 활성 물질 및 커플링형 색원체를 함유하는 시약.
본 발명의, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약은 키트의 형태로 보존, 유통, 사용되어도 된다. 본 발명의 측정용 키트는 본 발명의 측정 방법에 사용되고, 2 시약계, 3 시약계 등의 키트를 들 수 있고, 2 시약계의 키트가 바람직하다.
본 발명의 측정용 키트에 대해서, 산화 발색형 색원체로서 류코형 색원체를 사용하는 2 시약계의 키트의 경우, 류코형 색원체와 과산화 활성 물질이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 별개의 시약에 함유되고, 과산화수소 생성 시약 및 α-케토산이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 일방 또는 양방에 함유되는 키트 등을 들 수 있다.
또, 본 발명의 측정용 키트에 대해서, 산화 발색형 색원체로서 산화 커플링형 색원체를 사용하는 2 시약계의 키트의 경우, 커플러와, 아닐린 유도체 또는 페놀 유도체가 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 별개의 시약에 함유되고, 과산화 활성 물질, 과산화수소 생성 시약 및 α-케토산이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 일방 또는 양방에 함유되는 키트 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정용 키트의 구체적 양태를 이하에 기재한다.
·측정용 키트 1
제 1 시약
류코형 색원체 및 α-케토산을 함유하는 시약.
제 2 시약
과산화 활성 물질 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 2
제 1 시약
류코형 색원체, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
과산화 활성 물질 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 3
제 1 시약
류코형 색원체, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
과산화 활성 물질, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 4
제 1 시약
과산화 활성 물질 및 α-케토산을 함유하는 시약.
제 2 시약
류코형 색원체 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 5
제 1 시약
과산화 활성 물질, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
류코형 색원체 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 6
제 1 시약
과산화 활성 물질, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
류코형 색원체, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 7
제 1 시약
커플러 및 α-케토산을 함유하는 시약.
제 2 시약
아닐린 유도체 또는 페놀 유도체, 과산화 활성 물질, 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 8
제 1 시약
아닐린 유도체 또는 페놀 유도체, 및 α-케토산을 함유하는 시약.
제 2 시약
커플러, 과산화 활성 물질 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 9
제 1 시약
커플러, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
아닐린 유도체 또는 페놀 유도체, 과산화 활성 물질, 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 10
제 1 시약
아닐린 유도체 또는 페놀 유도체, α-케토산, 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
커플러, 과산화 활성 물질 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 11
제 1 시약
커플러, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
아닐린 유도체 또는 페놀 유도체, 과산화 활성 물질, α-케토산, 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
·측정용 키트 12
제 1 시약
아닐린 유도체 또는 페놀 유도체, α-케토산, 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
제 2 시약
커플러, 과산화 활성 물질, α-케토산 및 과산화수소 생성 시약을 함유하는 시약.
본 발명의 측정용 시약 및 측정용 키트에 있어서의 과산화수소 생성 시약으로는, 상기에 나타낸 시약 (A) ∼ 시약 (D) 등을 들 수 있다. 본 발명의 측정용 시약 및 측정용 키트에 있어서의 α-케토산, 과산화 활성 물질 및 산화 발색형 색원체로는 상기 (1) 에 기재한 것을 들 수 있다.
본 발명의 측정용 시약 및 측정용 키트는 필요에 따라서 안정화제, 방부제, 간섭 물질 소거제, 반응 촉진제 등을 함유해도 된다. 안정화제, 방부제, 간섭 물질 소거제, 반응 촉진제는 상기 (1) 에 기재한 것을 들 수 있다.
(3) 과산화물의 영향 억제 방법
본 발명의 과산화물의 영향 억제 방법은, 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 산화 발색형 색원체와 반응시키는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법에 있어서, 생성된 과산화수소와 산화 발색형 색원체의 반응을 α-케토산 존재 하에 실시하는 것을 특징으로 하는 억제 방법이다.
본 발명의 과산화물의 영향 억제 방법에 있어서의 검체, 측정 대상 성분, 산화 발색형 색원체, α-케토산으로는, 각각 전술한 검체, 측정 대상 성분, 산화 발색형 색원체, α-케토산 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 억제 방법에 의해서 그 영향이 억제되는 과산화물로는, 예를 들어 전술한 과산화물 등을 들 수 있다.
본 발명의 과산화물의 영향 억제 방법에 의해서 검체 중의 측정 대상 성분을 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 과산화물의 영향의 억제는 예를 들어 이하의 공정에 의해서 평가할 수 있다.
공정 1 : α-케토산을 함유하는 시약 [이하, 시약 (＋) 라고 한다] 과, α-케토산을 함유하지 않는 시약 [이하, 시약 (-) 라고 한다] 을 조제하는 공정
공정 2 : 검체와 시약 (＋) 를 반응시켜, 생성된 색소의 흡광도를 측정하는 공정
공정 3 : 검체와 시약 (-) 를 반응시켜, 생성된 색소의 흡광도를 측정하는 공정
공정 4 : 공정 2 에서 측정한 흡광도와, 공정 3 에서 측정한 흡광도를 비교하는 공정.
상기 공정 4 에 있어서, 공정 2 에서 측정한 흡광도, 즉, 시약 (＋) 를 사용한 경우의 흡광도가 공정 3 에서 측정한 흡광도, 즉, 시약 (-) 를 사용한 경우의 흡광도와 비교하여 낮으면, α-케토산에 의해서 과산화물의 영향이 억제되고 있다고 평가할 수 있다.
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 실시예, 비교예 및 시험예에 있어서는, 하기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.
MES (도진 화학 연구소사 제조), Bis-Tris (도진 화학 연구소사 제조), ADA (도진 화학 연구소사 제조), 퍼옥시다아제 (POD ； 토요 방적사 제조), 피루브산나트륨 (칸토 화학사 제조), α-케토글루타르산 (칸토 화학사 제조), 옥살로아세트산 (칸토 화학사 제조), DA-67 (와코 준야쿠 공업사 제조), 4-AA (사이쿄 화성사 제조), EMSE (다이토 케믹스사 제조), 염화칼슘 2 수화물 (와코 준야쿠 공업사 제조), 황산나트륨 (칸토 화학사 제조), 질산나트륨 (칸토 화학사 제조), 데실트리메틸암모늄 브로마이드 (C10TMA ； 토쿄 화성사 제조), 1-도데실피리디늄 클로라이드 (토쿄 화성사 제조), 글루코오스 (MERCK 제조), 프럭토실 VHLTPE (프럭토실헥사펩티드 ； 펩티드 연구소사 제조), 글루코오스 산화 효소 (GOD ； 토요 방적사 제조), 서몰리신 (프로테아제 ； 아마노엔자임사 제조), 액티나아제 E (프로테아제 ； 카켄 제약사 제조), FPOX-CE (프럭토실펩티드 산화 효소 ； 키코망사 제조), FPOX-CET (프럭토실펩티드 산화 효소 ； 키코망사 제조), 디스파놀 TOC (폴리옥시에틸렌트리데실에테르 ； 니치유사 제조), 논이온 E230 (폴리옥시에틸렌올레일에테르 ； 니치유사 제조).
실시예 1
(1) 피루브산 함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 A) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
DA-67 50 μ㏖/ℓ
피루브산나트륨　　　　　　　　 5 g/ℓ
제 2 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
POD 10 kU/ℓ
GOD 5 kU/ℓ
(2) 피루브산 비함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 a) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
DA-67 50 μ㏖/ℓ
제 2 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
POD 10 kU/ℓ
GOD 5 kU/ℓ
(3) 과산화물 함유 검체의 조제
이하의 4 개의 검체를 조제하였다.
·검체 1 : 글루코오스 및 디스파놀 TOC 를 각각 90 μ㏖/ℓ, 0 ％ 함유하는 수용액
·검체 2 : 글루코오스 및 디스파놀 TOC 를 각각 90 μ㏖/ℓ, 0.25 ％ 함유하는 수용액
·검체 3 : 글루코오스 및 디스파놀 TOC 를 각각 90 μ㏖/ℓ, 0.5 ％ 함유하는 수용액
·검체 4 : 글루코오스 및 디스파놀 TOC 를 각각 90 μ㏖/ℓ, 1 ％ 함유하는 수용액
디스파놀 TOC 는 폴리옥시에틸렌계 계면활성제이고, 과산화물의 생성원이다. 검체 1 ∼ 4 에 있어서 디스파놀 TOC 농도에 의존하여, 과산화물이 많이 함유된다.
(4) 피루브산에 의한, 과산화수소 정량계에 있어서의 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
상기 (3) 에서 조제한 검체 1 (1.5 ㎕) 과, (1) 에서 조제한 키트 A 의 제 1 시약 (150 ㎕) 을 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E1) 을 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 이어서, 키트 A 의 제 2 시약 (50 ㎕) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E2) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 측정은 히타치 H7180 으로 실시하였다. 흡광도 (E2) 에서 흡광도 (E1) 을 빼어, 검체 1 의 반응 흡광도 (E1A) 로 하였다.
이어서, 검체 1 대신에 생리 식염수를 사용하여 동일하게 측정하여, 블랭크 흡광도 (E블랭크) 로 하였다. 검체 1 의 반응 흡광도 (E1A) 에서 블랭크 흡광도 (E블랭크) 를 빼어, 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1A) 로 하였다.
검체 1 에 대해서 실시한 일련의 조작을 검체 2 ∼ 4 각각에 대해서도 실시하여, 검체 2 에 대한 흡광도 (ΔE2A), 검체 3 에 대한 흡광도 (ΔE3A), 검체 4 에 대한 흡광도의 측정치 (ΔE4A) 를 결정하였다. 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1A) 를 100 으로 했을 때의, 검체 2 ∼ 4 에 대한 흡광도 (ΔE2A ∼ ΔE4A) 의 상대치를 표 6 에 나타낸다.
또한 (1) 에서 조제한 키트 A 대신에, (2) 에서 조제한 키트 a 를 사용하는 것 이외에는 동일한 방법을 실시하여, 검체 1 ∼ 4 각각에 대한 흡광도의 상대치 (ΔE1a ∼ ΔE4a) 를 결정하였다. 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1a) 를 100 으로 했을 때의, 검체 2 ∼ 4 에 대한 흡광도 (ΔE2a ∼ ΔE4a) 의 상대치를 표 6 에 나타낸다.
Figure pct00006
표 6 으로부터 분명한 바와 같이, 류코형 색원체인 DA-67 을 사용하는 글루코오스 정량계에 있어서, 피루브산을 함유하는 키트 A 를 사용한 측정은, 피루브산을 함유하지 않는 키트 a 를 사용한 측정과 비교하여, 디스파놀 TOC 유래의 과산화물에 의한 영향이 현저히 억제되어 있어, 보다 정확한 글루코오스의 측정이 가능하다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
(1) 피루브산 함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 B) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
　EMSE 0.3 g/ℓ
　피루브산나트륨 5 g/ℓ
제 2 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
POD 10 kU/ℓ
4-AA 0.1 g/ℓ
GOD 5 kU/ℓ
(2) 피루브산 비함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 b) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
　EMSE 0.3 g/ℓ
제 2 시약
MES (pH 6.25) 20 m㏖/ℓ
POD 10 kU/ℓ
4-AA 0.1 g/ℓ
GOD 　 5 kU/ℓ
(3) 과산화물 함유 검체의 조제
실시예 1 에서 조제한 검체 1 ∼ 4 를 사용하였다.
(4) 피루브산에 의한, 과산화수소 정량계에 있어서의 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
상기 (3) 에서 조제한 검체 1 (15 ㎕) 과, (1) 에서 조제한 키트 A 의 제 1 시약 (150 ㎕) 을 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E1) 을 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 이어서, 키트 A 의 제 2 시약 (50 ㎕) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E2) 를 주파장 546 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 측정은 히타치 H7180 으로 실시하였다. 흡광도 (E2) 에서 흡광도 (E1) 을 빼어, 검체 1 의 반응 흡광도 (E1B) 로 하였다.
이어서, 검체 1 대신에 생리 식염수를 사용하여 동일하게 측정하여, 블랭크 흡광도 (E블랭크) 로 하였다. 검체 1 의 반응 흡광도 (E1B) 에서 블랭크 흡광도 (E블랭크) 를 빼어, 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1B) 로 하였다.
검체 1 에 대해서 실시한 일련의 조작을 검체 2 ∼ 4 각각에 대해서도 실시하여, 검체 2 에 대한 흡광도 (ΔE2B), 검체 3 에 대한 흡광도 (ΔE3B), 검체 4 에 대한 흡광도의 측정치 (ΔE4B) 를 결정하였다. 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1B) 를 100 으로 했을 때의, 검체 2 ∼ 4 에 대한 흡광도 (ΔE2B ∼ ΔE4B) 의 상대치를 표 7 에 나타낸다.
또한 (1) 에서 조제한 키트 B 대신에, (2) 에서 조제한 키트 b 를 사용하는 것 이외에는 동일한 방법을 실시하여, 검체 1 ∼ 4 각각에 대한 흡광도의 상대치 (ΔE1b ∼ ΔE4b) 를 결정하였다. 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1b) 를 100 으로 했을 때의, 검체 2 ∼ 4 에 대한 흡광도 (ΔE2b ∼ ΔE4b) 의 상대치를 표 7 에 나타낸다.
Figure pct00007
표 7 로부터 분명한 바와 같이, 커플링형 색원체인 4-AA 와 EMSE 의 조합을 사용하는 글루코오스 정량계에 있어서, 피루브산을 함유하는 키트 B 를 사용한 측정은, 피루브산을 함유하지 않는 키트 b 를 사용한 측정과 비교하여, 디스파놀 TOC 유래의 과산화물에 의한 영향이 현저히 억제되어 있어, 보다 정확한 글루코오스의 측정이 가능하다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
(1) 피루브산 함유 프럭토실 VHLTPE 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 프럭토실 VHLTPE 측정용 키트 (키트 C) 를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 10 m㏖/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
　황산나트륨 7.5 m㏖/ℓ
　C10TMA 17 g/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
　서몰리신 1200 kU/ℓ
　피루브산나트륨 5 g/ℓ
제 2 시약
　ADA (pH 7.0) 　50 m㏖/ℓ
POD 120 kU/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
(2) 피루브산 비함유 프럭토실 VHLTPE 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 프럭토실 VHLTPE 측정용 키트 (키트 c) 를 조제하였다.
제 1 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 10 m㏖/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
　황산나트륨 7.5 m㏖/ℓ
　C10TMA 17 g/ℓ
DA-67 20 μ㏖/ℓ
　서몰리신 1200 kU/ℓ
제 2 시약
　ADA (pH 7.0) 　50 m㏖/ℓ
POD 120 kU/ℓ
FPOX-CE 12 kU/ℓ
(3) 과산화물 함유 검체의 조제
이하의 4 개의 검체를 조제하였다.
·검체 1 : 프럭토실 VHLTPE 및 디스파놀 TOC 를 각각 18 μ㏖/ℓ, 0 ％ 함유하는 수용액
·검체 2 : 프럭토실 VHLTPE 및 디스파놀 TOC 를 각각 18 μ㏖/ℓ, 0.05 ％ 함유하는 수용액
·검체 3 : 프럭토실 VHLTPE 및 디스파놀 TOC 를 각각 18 μ㏖/ℓ, 0.1 ％ 함유하는 수용액
·검체 4 : 프럭토실 VHLTPE 및 디스파놀 TOC 를 각각 18 μ㏖/ℓ, 0.2 ％ 함유하는 수용액
디스파놀 TOC 는 폴리옥시에틸렌계 계면활성제이고, 과산화물의 생성원이다. 검체 1 ∼ 4 에 있어서 디스파놀 TOC 농도에 의존하여, 과산화물이 많이 함유된다.
(4) 피루브산에 의한, 과산화수소 정량계에 있어서의 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
상기 (3) 에서 조제한 검체 1 (9.6 ㎕) 과, (1) 에서 조제한 키트 C 의 제 1 시약 (120 ㎕) 을 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E1) 을 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 이어서, 키트 C 의 제 2 시약 (40 ㎕) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E2) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 측정은 히타치 H7180 으로 실시하였다. 흡광도 (E2) 에서 흡광도 (E1) 을 빼어, 검체 1 의 반응 흡광도 (E1C) 로 하였다.
이어서, 검체 1 대신에 생리 식염수를 사용하여 동일하게 측정하여, 블랭크 흡광도 (E블랭크) 로 하였다. 검체 1 의 반응 흡광도 (E1C) 에서 블랭크 흡광도 (E블랭크) 를 빼어, 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1C) 로 하였다.
검체 1 에 대해서 실시한 일련의 조작을 검체 2 ∼ 4 각각에 대해서도 실시하여, 검체 2 에 대한 흡광도 (ΔE2C), 검체 3 에 대한 흡광도 (ΔE3C), 검체 4 에 대한 흡광도의 상대치 (ΔE4C) 를 결정하였다. 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1C) 를 100 으로 했을 때의, 검체 2 ∼ 4 에 대한 흡광도 (ΔE2C ∼ ΔE4C) 의 상대치를 표 8 에 나타낸다.
또한, (1) 에서 조제한 키트 C 대신에, (2) 에서 조제한 키트 c 를 사용하는 것 이외에는 동일한 방법을 실시하여, 검체 1 ∼ 4 각각에 대한 흡광도의 상대치 (ΔE1c ∼ ΔE4c) 를 결정하였다. 검체 1 에 대한 흡광도 (ΔE1c) 를 100 으로 했을 때의, 검체 2 ∼ 4 에 대한 흡광도 (ΔE2c ∼ ΔE4c) 의 상대치를 표 8 에 나타낸다.
Figure pct00008
표 8 로부터 분명한 바와 같이, 류코형 색원체인 DA-67 을 사용하는 프럭토실 VHLTPE 정량계에 있어서, 피루브산을 함유하는 키트 C 를 사용한 측정은, 피루브산을 함유하지 않는 키트 c 를 사용한 측정과 비교하여, 디스파놀 TOC 유래의 과산화물에 의한 영향이 현저히 억제되어 있어, 보다 정확한 프럭토실 VHLTPE 의 측정이 가능하다는 것을 알 수 있다.
실시예 4
글루코오스 측정계에 있어서의, α-케토산에 의한, 시약 중의 과산화물의 영향 경감 효과의 검토
(1) 피루브산 함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 D1 ∼ D3) 를 조제하였다. 키트 D1 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0 ％ 인 키트를, 키트 D2 는 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.02 ％ 인 키트를, 키트 D3 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.1 ％ 인 키트를 나타낸다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 50 m㏖/ℓ
　EMSE 0.3 g/ℓ
논이온 E230 0, 0.02 또는 0.1 ％
　피루브산나트륨 5 g/ℓ
제 2 시약
MES (pH 6.5) 　50 m㏖/ℓ
4-AA 0.1 g/ℓ
POD 40 kU/ℓ
GOD 100 kU/ℓ
(2) α-케토글루타르산 함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 E1∼ E3) 를 조제하였다. 키트 E1 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0 ％ 인 키트를, 키트 E2 는 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.02 ％ 인 키트를, 키트 E3 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.1 ％ 인 키트를 나타낸다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 　50 m㏖/ℓ
　EMSE 0.3 g/ℓ
논이온 E230 0, 0.02 또는 0.1 ％
α-케토글루타르산 1 g/ℓ
제 2 시약
MES (pH 6.5) 　50 m㏖/ℓ
4-AA 0.1 g/ℓ
POD 40 kU/ℓ
GOD 100 kU/ℓ
(3) 옥살로아세트산 함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 F1 ∼ F3) 를 조제하였다. 키트 F1 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0 ％ 인 키트를, 키트 F2 는 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.02 ％ 인 키트를, 키트 F3 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.1 ％ 인 키트를 나타낸다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 　50 m㏖/ℓ
　EMSE 0.3 g/ℓ
논이온 E230　　　　　　　　　　 0, 0.02 또는 0.1 ％
　옥살로아세트산 　 0.2 g/ℓ
제 2 시약
MES (pH 6.5) 　50 m㏖/ℓ
4-AA 0.1 g/ℓ
POD 40 kU/ℓ
GOD 100 kU/ℓ
(4) α-케토산 비함유 글루코오스 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 글루코오스 측정용 키트 (키트 d1 ∼ d3) 를 조제하였다. 키트 d1 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0 ％ 인 키트를, 키트 d2 는 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.02 ％ 인 키트를, 키트 d3 은 제 1 시약 중의 논이온 E230 농도가 0.1 ％ 인 키트를 나타낸다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 　50 m㏖/ℓ
EMSE 0.3 g/ℓ
논이온 E230　　　　　　　　　 0, 0.02 또는 0.1 ％
제 2 시약
MES (pH 6.5) 　50 m㏖/ℓ
4-AA 0.1 g/ℓ
POD 40 kU/ℓ
GOD 100 kU/ℓ
(5) 피루브산에 의한 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
생리 식염수 (2.0 ㎕) 와, (1) 에서 조제한 키트 D1 의 제 1 시약 (180 ㎕) 을 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E1) 을 주파장 546 ㎚, 부파장 700 ㎚ 에서 측정하였다. 이어서, 키트 D1 의 제 2 시약 (60 ㎕) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E2) 를 주파장 546 ㎚, 부파장 700 ㎚ 에서 측정하였다. 측정은 히타치 H7170 으로 실시하였다. 흡광도 (E2) 에서 흡광도 (E1) 을 빼어, 생리 식염수의 블랭크 흡광도 (ED1) 로 하였다.
이어서, 키트 D1 대신에 키트 D2 를 사용하여 동일하게 측정하여, 생리 식염수의 블랭크 흡광도 (ED2) 를 산출하였다.
또한 키트 D1 대신에 키트 D3 을 사용하여 동일하게 측정하여, 생리 식염수의 블랭크 흡광도 (ED3) 을 산출하였다.
키트 D1 의 블랭크 흡광도 (ΔED1) 을 0 으로 하고, 블랭크 흡광도 (ED2) 에서 블랭크 흡광도 (ED1) 을 빼어, 키트 D2 의 블랭크 흡광도 (ΔED2) 로 하였다. 동일하게, 블랭크 흡광도 (ED3) 에서 블랭크 흡광도 (ED1) 을 빼어, 키트 D3 의 블랭크 흡광도 (ΔED3) 으로 하였다. 키트 D1 ∼ 키트 D3 의 각각의 키트의 블랭크 흡광도 (ΔED1 ∼ ΔED3) 을 표 9 에 나타낸다.
(6) α-케토글루타르산에 의한 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
키트 D1 ∼ D3 대신에, 상기 (2) 에서 조제한 α-케토글루타르산을 함유하는 키트 E1∼ E3 을 각각 사용하는 것 이외에는 (5) 와 동일한 방법에 의해서, 키트 E1∼ E3 의 각각의 키트의 블랭크 흡광도 (ΔEE1∼ ΔEE3) 을 산출하였다. 키트 E1∼ 키트 E3 의 각각의 키트의 블랭크 흡광도 (ΔEE1∼ ΔEE3) 을 표 9 에 나타낸다.
(7) 옥살로아세트산에 의한 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
키트 D1 ∼ D3 대신에, 상기 (3) 에서 조제한 옥살로아세트산을 함유하는 키트 F1 ∼ F3 을 각각 사용하는 것 이외에는 (5) 와 동일한 방법에 의해서, 키트 F1 ∼ F3 의 각각의 키트의 블랭크 흡광도 (ΔEF1 ∼ ΔEF3) 을 산출하였다. 키트 F1 ∼ 키트 F3 의 각각의 키트의 블랭크 흡광도 (ΔEF1 ∼ ΔEF3) 을 표 9 에 나타낸다.
(8) α-케토산 비함유 키트를 사용한 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
키트 D1 ∼ D3 대신에, 상기 (4) 에서 조제한 α-케토산을 함유하지 않는 키트 d1 ∼ d3 을 각각 사용하는 것 이외에는 (5) 와 동일한 방법에 의해서, 키트 d1 ∼ d3 의 각각의 키트의 블랭크 흡광도 (ΔEd1 ∼ ΔEd3) 을 산출하였다. 키트 d1 ∼ 키트 d3 의 각각의 키트의 블랭크 흡광도 (ΔEd1 ∼ ΔEd3) 을 표 9 에 나타낸다.
Figure pct00009
표 9 로부터 분명한 바와 같이, α-케토산으로서 피루브산, α-케토글루타르산 또는 옥살로아세트산을 함유하는 키트를 사용한 경우에는, α-케토산을 함유하지 않는 키트와 비교하여, 논이온 E230 농도가 높아진 경우라도, 블랭크 흡광도가 현저히 낮아져 있는 것이 판명되었다. 논이온 E230 은 과산화물을 생성하기 쉬운 계면활성제이다. 따라서, α-케토산에 의해서, 논이온 E230 에서 기인하는 과산화물의 영향이 현저히 억제되어, 보다 정확한 글루코오스의 측정이 가능하다는 것이 판명되었다.
실시예 5
헤모글로빈 A1c 측정계에 있어서의, α-케토산에 의한, 시약 중의 과산화물의 영향 억제 효과의 검토
(1) 피루브산 함유 헤모글로빈 A1c 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트 (키트 G) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 50 m㏖/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
질산나트륨 100 m㏖/ℓ
1-도데실피리디늄 클로라이드 1.4 g/ℓ
액티나아제 E 340 kU/ℓ
DA-67 30 μ㏖/ℓ
논이온 E230 0.01 ％
　피루브산나트륨 2 g/ℓ
제 2 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CET 6 kU/ℓ
POD 120 kU/ℓ
(2) α-케토글루타르산 함유 헤모글로빈 A1c 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트 (키트 H) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 50 m㏖/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
질산나트륨 100 m㏖/ℓ
1-도데실피리디늄 클로라이드 1.4 g/ℓ
액티나아제 E 340 kU/ℓ
DA-67 　 30 μ㏖/ℓ
논이온 E230 0.01 ％
α-케토글루타르산 0.3 g/ℓ
제 2 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CET 6 kU/ℓ
POD 120 kU/ℓ
(3) 옥살로아세트산 함유 헤모글로빈 A1c 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트 (키트 I) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 50 m㏖/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
질산나트륨 100 m㏖/ℓ
1-도데실피리디늄 클로라이드 1.4 g/ℓ
액티나아제 E 340 kU/ℓ
DA-67 30 μ㏖/ℓ
논이온 E230 0.01 ％
　옥살로아세트산 0.3 g/ℓ
제 2 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CET 6 kU/ℓ
POD 120 kU/ℓ
(4) α-케토산 비함유 헤모글로빈 A1c 측정용 키트
이하의 조성으로 이루어지는 헤모글로빈 A1c 측정용 키트 (키트 e) 를 조제하였다.
제 1 시약
MES (pH 6.5) 50 m㏖/ℓ
염화칼슘 2 수화물 10 m㏖/ℓ
질산나트륨 100 m㏖/ℓ
1-도데실피리디늄 클로라이드 1.4 g/ℓ
액티나아제 E 340 kU/ℓ
DA-67 30 μ㏖/ℓ
논이온 E230 0.01 ％
제 2 시약
Bis-Tris (pH 7.0) 50 m㏖/ℓ
FPOX-CET 6 kU/ℓ
POD 120 kU/ℓ
(5) 피루브산에 의한 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
헤모글로빈 A1c 농도가 3.2, 4.0, 4.9, 5.6, 6.5, 7.6, 9.7 μ㏖/ℓ 인 각 혈구, 및 생리 식염수 (헤모글로빈 A1c 농도 : 0 μ㏖/ℓ) 를 검체로서 사용하였다.
각 검체 (12 ㎕) 와, (1) 에서 조제한 피루브산을 함유하는 키트 G 의 제 1 시약 (150 ㎕) 을 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E1) 을 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 이어서, 키트 G 의 제 2 시약 (50 ㎕) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 반응시켜, 흡광도 (E2) 를 주파장 660 ㎚, 부파장 800 ㎚ 에서 측정하였다. 측정은 히타치 H7170 으로 실시하였다. 흡광도 (E2) 에서 흡광도 (E1) 을 빼어, 키트 G 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (EG) 로 하였다.
α-케토산을 함유하지 않는 상기 (4) 의 키트 e 를 사용하여 동일하게 산출한, 키트 e 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (Ee) 를 대조로 하였다. 키트 G 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (EG) 및 키트 e 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (Ee) 를 도 1 에 나타낸다.
(6) α-케토글루타르산에 의한 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
키트 G 대신에, 상기 (2) 에서 조제한 α-케토글루타르산을 함유하는 키트 H 를 사용하는 것 이외에는 (5) 와 동일한 방법에 의해서, 키트 H 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (ΔEH) 를 산출하였다. 키트 H 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (EH) 및 키트 e 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (Ee) 를 도 2 에 나타낸다.
(7) 옥살로아세트산에 의한 과산화물의 영향 억제 효과의 평가
키트 G 대신에, 상기 (3) 에서 조제한 옥살로아세트산을 함유하는 키트 I 를 사용하는 것 이외에는 (5) 와 동일한 방법에 의해서, 키트 I 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (ΔEI) 을 산출하였다. 키트 I 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (EI) 및 키트 e 에 있어서의 각 검체의 반응 흡광도 (Ee) 를 도 3 에 나타낸다.
도 1 ∼ 도 3 으로부터 분명한 바와 같이, α-케토산을 함유하지 않는 키트를 사용한 측정에 있어서는, 검체로서 생리 식염수를 사용한 경우에는, 블랭크로서 과산화물 유래의 발색에 의한 흡광도를 얻을 수 있었다. 또, 검체로서 헤모글로빈 A1c 농도 3.2 μ㏖/ℓ 의 혈구를 사용한 경우에는, 블랭크의 흡광도보다 낮은 흡광도를 얻을 수 있었다. 이것은, 혈구 중에 함유되는 헤모글로빈의 환원 작용에 의해서, 과산화물, 및 헤모글로빈 A1c 유래의 과산화수소가 소거된 것에 의한 것으로 생각할 수 있다.
한편, α-케토산을 함유하는 키트를 사용한 측정에 있어서는, 헤모글로빈 A1c 농도 3.2 μ㏖/ℓ 의 혈구를 사용한 경우라도 흡광도의 감소는 보이지 않고, 헤모글로빈 A1c 농도와 흡광도 사이에 양호한 직선성이 확인되었다. 이것은, α-케토산이 과산화물과 상호 작용하여 과산화물이 소거되는 한편, α-케토산은 과산화수소와는 상호 작용하지 않고, 헤모글로빈 A1c 유래의 과산화수소는 소거되지 않는 것에 의한 것으로 생각할 수 있다.
이와 같이, 피루브산, α-케토글루타르산 또는 옥살로아세트산을 함유하는 키트를 사용한 측정에 있어서는, 논이온 E230 유래의 과산화물의 영향이 억제되어, 보다 정확한 헤모글로빈 A1c 농도의 측정이 가능해지는 것이 판명되었다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해서, 과산화수소 정량계에 있어서의 과산화물의 영향이 억제된 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법, 측정용 시약, 및 측정용 키트, 그리고 과산화물의 영향 억제 방법이 제공된다. 본 발명은 임상 진단 등에 유용하다.

Claims (20)

  1. 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 α-케토산 존재 하에 산화 발색형 색원체를 사용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법.
  2. 검체 중의 측정 대상 성분을 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 산화 발색형 색원체와 반응시키는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법에 있어서, 생성된 과산화수소와 산화 발색형 색원체의 반응을 α-케토산 존재 하에 실시하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법에 있어서의 과산화물의 영향 억제 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 발색형 색원체가 류코형 색원체인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    류코형 색원체가 페노티아진 유도체인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    페노티아진 유도체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산화 발색형 색원체가 산화 커플링형 색원체인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    산화 커플링형 색원체가 커플러와, 아닐린 유도체 또는 페놀 유도체의 조합인 방법.
  9. 과산화수소 생성 시약, α-케토산, 과산화 활성 물질 및 산화 발색형 색원체를 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 시약.
  10. 제 9 항에 있어서,
    α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 시약.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    산화 발색형 색원체가 류코형 색원체인 시약.
  12. 제 11 항에 있어서,
    류코형 색원체가 페노티아진 유도체인 시약.
  13. 제 12 항에 있어서,
    페노티아진 유도체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 시약.
  14. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    산화 발색형 색원체가 산화 커플링형 색원체인 시약.
  15. 제 14 항에 있어서,
    산화 커플링형 색원체가 커플러와, 아닐린 유도체 또는 페놀 유도체의 조합인 시약.
  16. 제 1 시약 및 제 2 시약을 함유하는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 키트로서, 류코형 색원체와 과산화 활성 물질이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 별개의 시약에 함유되고, 과산화수소 생성 시약 및 α-케토산이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 일방 또는 양방에 함유되는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제 16 항에 있어서,
    류코형 색원체가 페노티아진 유도체인 키트.
  18. 제 17 항에 있어서,
    페노티아진 유도체가 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진인 키트.
  19. 제 1 시약 및 제 2 시약을 함유하는, 검체 중의 측정 대상 성분의 측정용 키트로서, 커플러와, 아닐린 유도체 또는 페놀 유도체가 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 별개의 시약에 함유되고, 과산화 활성 물질, 과산화수소 생성 시약 및 α-케토산이 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 일방 또는 양방에 함유되는 것을 특징으로 하는 키트.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    α-케토산이 피루브산, α-케토글루타르산 및 옥살로아세트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 α-케토산인 키트.
KR1020137014501A 2010-12-13 2011-12-12 측정 대상 성분의 측정 방법 KR20140114267A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2010-276550 2010-12-13
JP2010276550 2010-12-13
PCT/JP2011/078669 WO2012081539A1 (ja) 2010-12-13 2011-12-12 測定対象成分の測定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140114267A true KR20140114267A (ko) 2014-09-26

Family

ID=46244639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137014501A KR20140114267A (ko) 2010-12-13 2011-12-12 측정 대상 성분의 측정 방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9671348B2 (ko)
EP (1) EP2653551B1 (ko)
JP (1) JP6004942B2 (ko)
KR (1) KR20140114267A (ko)
CN (1) CN103261434B (ko)
BR (1) BR112013013288A2 (ko)
CA (1) CA2819040A1 (ko)
WO (1) WO2012081539A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6218894B2 (ja) * 2015-07-06 2017-10-25 ヤマサ醤油株式会社 Ｌ−グルタミン酸測定キット
CN105891202B (zh) * 2016-06-03 2017-08-22 广州市进德生物科技有限公司 一种单组份tmb显色液及其制备方法
JP7047759B2 (ja) 2016-07-29 2022-04-05 ミナリスメディカル株式会社 ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法
CZ2017271A3 (cs) * 2017-05-16 2018-11-28 Prevention Medicals s.r.o. Reakční směs pro kvantitativní stanovení sarkosinu ve vzorku lidské moči, séra nebo plazmy
CN111175292A (zh) * 2020-01-20 2020-05-19 杭州联晟生物科技有限公司 一种检测乳酸的试纸条及其制备方法
TW202227639A (zh) 2020-09-11 2022-07-16 日商積水醫療股份有限公司 降低測定誤差之方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57147058A (en) * 1981-03-06 1982-09-10 Wako Pure Chem Ind Ltd Measuring method for hydrogen peroxide
US4614714A (en) * 1982-08-21 1986-09-30 Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha Use of novel L-glutamic acid oxidase
JPS59182361A (ja) * 1983-03-31 1984-10-17 Kyowa Medetsukusu Kk 過酸化水素の定量方法
JPH0653075B2 (ja) * 1984-02-24 1994-07-20 大日本印刷株式会社 ブドウ糖検出用インキ組成物およびそれを用いて形成された検査体
JPH0653074B2 (ja) 1984-02-24 1994-07-20 大日本印刷株式会社 体液検査体
JPS61284661A (ja) * 1985-06-12 1986-12-15 Dainippon Printing Co Ltd ブドウ糖検出用検査体
US5037738A (en) * 1987-06-03 1991-08-06 Abbott Laboratories Simultaneous assay for glucose and urea
JPH0349695A (ja) * 1989-07-17 1991-03-04 Dainippon Printing Co Ltd ブドウ糖検出用印刷インキ組成物及びこれを用いた血糖検出用検査体
JP2893139B2 (ja) * 1990-11-27 1999-05-17 日水製薬株式会社 免疫比濁法及びこれに用いる測定試薬
US5856364A (en) 1991-03-01 1999-01-05 Warner Lambert Company Therapeutic antiviral-wound healing compositions and methods for preparing and using same
PH31403A (en) * 1991-03-01 1998-10-29 Warner Lambert Co Therapeutic compositions to protect and recuscitate mammalian cells and methods for preparing same.
JP3283348B2 (ja) * 1993-07-29 2002-05-20 協和メデックス株式会社 物質の測定法
JP4068722B2 (ja) * 1998-05-20 2008-03-26 アークレイ株式会社 ギベレラ属由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼ
JP4527950B2 (ja) * 2002-08-09 2010-08-18 シスメックス株式会社 脂質測定試薬
US7074581B2 (en) * 2002-08-09 2006-07-11 Sysmex Corporation Reagent for assaying lipid
US7041840B2 (en) 2002-12-18 2006-05-09 Alberta Research Council Inc. Antioxidant triacylglycerols and lipid compositions
US20080241816A1 (en) * 2004-03-17 2008-10-02 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd Method for Stabilizing Oxidizable Color Developing Reagent
JP5027648B2 (ja) 2005-02-14 2012-09-19 協和メデックス株式会社 レムナント様リポ蛋白（ｒｌｐ）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット
JP5120682B2 (ja) 2006-02-06 2013-01-16 日油株式会社 アルケニル基含有ポリオキシアルキレン誘導体及びその製造方法
CN101097200A (zh) * 2006-06-26 2008-01-02 苏州艾杰生物科技有限公司 5'-核苷酸酶诊断试剂盒及5'-核苷酸酶活性浓度测定方法
CN101173939A (zh) * 2006-10-30 2008-05-07 苏州艾杰生物科技有限公司 无机磷诊断试剂盒及无机磷浓度测定方法
JP2008125368A (ja) * 2006-11-16 2008-06-05 Amano Enzyme Inc 新規なジペプチド分解酵素及びその製造方法並びにジペプチド分解酵素を用いる糖化蛋白質等の測定方法及びそれに用いる試薬組成物
JP4697809B2 (ja) 2007-02-22 2011-06-08 旭化成ファーマ株式会社 ロイコ色素の安定化方法
JP5297637B2 (ja) * 2007-11-28 2013-09-25 富士フイルム株式会社 高密度リポ蛋白コレステロールの測定方法
EP2065708B1 (en) 2007-11-28 2014-01-01 FUJIFILM Corporation Method for measuring high-density lipoprotein cholesterol
CN101609017A (zh) * 2008-06-19 2009-12-23 苏州艾杰生物科技有限公司 同型半胱氨酸诊断试剂盒及同型半胱氨酸浓度测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2012081539A1 (ja) 2014-05-22
EP2653551B1 (en) 2018-02-07
CN103261434A (zh) 2013-08-21
BR112013013288A2 (pt) 2016-09-06
US9671348B2 (en) 2017-06-06
CN103261434B (zh) 2016-06-01
JP6004942B2 (ja) 2016-10-12
US20130288283A1 (en) 2013-10-31
EP2653551A1 (en) 2013-10-23
CA2819040A1 (en) 2012-06-21
WO2012081539A1 (ja) 2012-06-21
EP2653551A4 (en) 2014-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5871800B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JP6236318B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法、測定試薬、及び、測定キット
EP2604699B1 (en) Method for measuring glycated hemoglobin
KR20140114267A (ko) 측정 대상 성분의 측정 방법
JP7020413B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
KR20150003739A (ko) 검체 중의 측정 대상 성분의 측정 방법
EP2813577A1 (en) Method for suppressing the effects of ascorbic acid
JP6132837B2 (ja) アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法
KR101943673B1 (ko) 스핑고미엘린의 측정 방법 및 측정용 키트
JP7020484B2 (ja) 糖化ヘモグロビンの測定方法
JP5808617B2 (ja) 溶血干渉を抑制する高精度な生体成分測定試薬及び測定方法
WO2021192466A1 (ja) ヘモグロビンの影響軽減方法、糖化ヘモグロビンの測定方法、糖化ヘモグロビン測定試薬、及び糖化ヘモグロビン測定キット
JP2012024014A (ja) 全血コリンの測定方法
KR20230066051A (ko) 측정 오차 저감 방법

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid