KR20230066051A - 측정 오차 저감 방법 - Google Patents

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히로키 오사코
고지 야마모토
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Abstract

본 발명은, 효소법에 의해 검체 중의 측정 대상을 측정하는 방법에 있어서, 검체에서 유래하는 과산화물의 정의 영향을 억제할 수 있는 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 더 상세하게는, 무카탈라아제 검체인지 여부에 관계 없이 고치화를 억제할 수 있는 측정 방법 및 측정 시약의 제공을 과제로 한다. 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 또는 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물의 존재 하에서, 검체와 효소를 접촉시킴으로써 검체 유래의 영향을 받지 않고 측정 대상에서 유래하는 과산화수소를 정확하게 정량할 수 있는 측정 방법을 제공한다.
Figure pct00019

단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.

Description

측정 오차 저감 방법
본 발명은, 검체 중의 측정 대상을 효소법에 기초하여 측정하는 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 검체 중의 측정 대상을 효소와 반응시켜 발생시킨 과산화수소를 정량함으로써 측정 대상을 정량하는 측정 방법에 관한 것이다.
임상 진단에 있어서, 전혈, 혈청, 혈장, 소변 등의 생체 시료 유래의 검체 중의 성분량을, 효소 반응을 사용하여 검출하는 측정 방법이 알려져 있다. 본 측정 방법은, 소위 효소법이라고 불리는 측정 방법이고, 검체 중의 측정 대상 성분을, 그것을 기질로 하는 효소와 반응시켜 과산화수소를 생성시키고, 생성된 과산화수소에 대하여 퍼옥시다아제(POD) 존재 하에서 발색제를 작용시켜, 정색 변화를 검출함으로써 측정 대상 성분의 정량을 행하는 측정 방법이다.
이러한 효소법에 근거하는 생체 시료 유래의 검체 중의 측정 대상 성분의 측정은, 조작의 간편성 등의 이유로부터 자동 분석 장치를 사용한 연속 측정에 다용되고 있다. 그러나, 효소법은, 생체 시료나 시약에서 유래하는 측정 대상 이외의 성분의 영향을 받기 쉽고, 측정값이 이론값보다도 높아지는 정의 영향 또는 낮아진다는 부의 영향을 받는 것이 문제가 되어 있다.
예를 들어, 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 과산화수소에 의해 측정값이 고치화된다는 문제를 해결하는 방법으로서, 측정 대상 성분과 효소가 반응하는 「주반응」보다 빠르게, 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 과산화수소를 카탈라아제의 첨가에 의해 소거하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1). 그러나, 본 방법에서는, 제1 시약에 아지화물이 포함되는 경우나 프로테아제가 포함되는 경우, 이것들에 의해 카탈라아제가 불안정화되는 경우가 있다.
또한, 효소법의 측정 시약에는, 효소의 반응성 제어, 검체의 전처리 등을 위해 계면 활성제가 사용되는 경우가 많지만, 계면 활성제의 종류에 따라서는, 시약의 보존 중에 당해 계면 활성제로부터 과산화물이 생성되기 쉽고, 그러한 경우는, 그 과산화물이 주반응에 영향을 미쳐, 마찬가지로 측정값이 고치화된다는 문제가 있었다. 이러한 문제에 대해서는, 효소 반응을 α-케토산을 포함하는 수용액 중에서 행함으로써, 시약 중의 성분에 포함되는 과산화물을 소거함으로써, 측정 대상으로부터 발생하는 과산화수소의 정량에 의한 정색 변화에 대한 영향을 방지하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 2).
그런데, 무카탈라아제 혈액증(Acatalasia, Acatalasemia), 또는 다카하라병(Takahara's disease)은, 1946년에 다카하라에 의해 발견된, 카탈라아제를 거의 결여하는 상염색체 열성 유전자의 체질 이상이고(비특허문헌 1, 2), 무카탈라아제 혈액증(비특허문헌 1, 2)의 환자의 생체 시료 중에는, 카탈라아제가 포함되지 않는다. 여기서, 무카탈라아제 혈액증이 아닌 환자의 생체 시료 중에는 내인성의 카탈라아제가 포함되기 때문에, 당해 환자의 생체 시료 중에 내인성의 과산화물이 존재하는 경우, 환자 자신의 내인성의 카탈라아제에 의해 미리 과산화물이 소거되어, 측정 대상으로부터 발생하는 과산화수소의 정량에 의한 정색 변화에 영향을 미치지 않는 경우가 많다. 그러나, 상기 무카탈라아제 혈액증의 환자의 생체 시료 중에는, 카탈라아제가 포함되지 않는 점에서, 생체 시료에 포함되는 내인성의 과산화물을 미리 소거할 수 없다. 따라서, 당해 환자 생체 시료에서 유래하는 내인성의 과산화물이 존재하는 경우, 효소법에 있어서 측정 대상에서 유래하는 과산화수소 이외의 과산화수소에 의한 정색 변화에 정의 영향을 미쳐 버려, 측정값이 고치화된다는 문제가 있었다.
본원 발명자들은, 이러한 환자 생체 시료에서 유래하는 내인성의 과산화물의 정의 영향에 대하여, 특허문헌 2에 개시되는 α-케토산의 일례인 피루브산을 사용하여 검토를 행한바, 무카탈라아제 혈액증 환자의 생체 시료에서 유래하는 검체(이하, 단순히 무카탈라아제 검체라고 하는 경우가 있음)에 있어서의 고치화를 억제 가능한 한편, 건강인의 생체 시료에서 유래하는 검체나 구경 측정기 등에 있어서도 측정 흡광도값이 저하되어 버린다는 문제를 알아냈다(본원 명세서에 있어서 후술하는 실시예에 기재된 비교예). 이 이유는 명확하지는 않지만, 아마도 α-케토산이, 측정 대상에 기인하는 과산화수소와 퍼옥시다아제 및 발색제와 반응하는 주반응 자체를 방해했을 가능성이 높다고 생각되었다.
일본 특허 공개 제2007-236234호 공보 국제 공개 WO2012/081539호 팸플릿
가와사키 의료 복지 학회지, Vol.5, No.1, 1995, 19-29 Acta Med. Okayama, 2008, Vol.62, No.6, 345-361
본 발명은, 효소법에 의해 검체 중의 측정 대상을 측정하는 방법에 있어서, 검체에서 유래하는 과산화물의 정의 영향을 억제할 수 있는 측정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 더 상세하게는, 건강인의 검체나 구경 측정기 등의 발색에는 영향을 미치지 않고, 무카탈라아제 검체에 있어서 고치화를 억제할 수 있는 측정 방법 및 측정 시약의 제공을 과제로 한다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위한 것이며, 검체 중의 측정 대상 성분을 효소와 반응시켜 생성되는 과산화수소를 정량함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서, 건강인의 검체나 구경 측정기 등의 발색에 영향을 미치지 않고, 「무카탈라아제 검체」에 있어서의 고치화를 억제할 수 있는 화합물의 탐색을 예의 검토한 결과, 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물의 존재 하에서, 검체와 효소를 접촉시킴으로써 검체 유래의 영향을 받지 않고 측정 대상에서 유래하는 과산화수소를 정확하게 정량할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하는 데 이르렀다.
Figure pct00001
단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
<1>
검체 중의 측정 대상 성분을 효소와 반응시켜 생성되는 과산화수소를 정량함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법이며, 이하의 공정을 포함하는 상기 측정 방법;
(A) 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물의 존재 하,
검체와 효소를 접촉시킴으로써 과산화수소를 생성하는 공정
(B) 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 존재 하, 발색제와 반응시키는 공정
(C) 색조 변화를 검출하는 공정
Figure pct00002
단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
<2>
식 (I)의 R1, R2가, 수소, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 알킬기, 페닐기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기의 어느 것인, <1>에 기재된 측정 방법.
<3>
식 (I)의 R1 또는 R2의 어느 한쪽이 수소 또는 메틸기이며, 다른 한쪽이 수소, 메틸기, 에틸기, 페닐기, 메톡시기 및 에톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것인, <1>에 기재된 측정 방법.
<4>
식 (I)로 나타나는 화합물이, 페닐글리옥살, 글리옥살, 디아세틸, 2,3-펜탄디온, 피루브산메틸 또는 피루브산에틸인 <1>에 기재된 측정 방법.
<5>
2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체가, 2-아미노벤즈이미다졸인 <1>에 기재된 측정 방법.
<6>
측정 대상 성분이 HbA1c인 <1> 내지 <5>의 어느 것에 기재된 측정 방법.
<7>
측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소, 발색제, 퍼옥시다아제, 그리고 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는 측정 시약.
Figure pct00003
단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
<8>
식 (I)의 R1, R2가, 수소, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 알킬기, 페닐기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기의 어느 것인 <7>에 기재된 측정 시약.
<9>
식 (I)의 R1 또는 R2의 어느 한쪽이 수소 또는 메틸기이며, 다른 한쪽이 수소, 메틸기, 에틸기, 페닐기, 메톡시기 및 에톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것인, <7>에 기재된 측정 시약.
<10>
식 (I)로 나타나는 화합물이, 페닐글리옥살, 글리옥살, 디아세틸, 2,3-펜탄디온, 피루브산메틸 또는 피루브산에틸인 <5>에 기재된 측정 시약.
<11>
2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체가, 2-아미노벤즈이미다졸인 <7>에 기재된 측정 시약.
<12>
측정 대상 성분이 HbA1c이고, 측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소가, 프로테아제 및 프룩토실펩티드옥시다아제인 <7> 내지 <11>의 어느 것에 기재된 측정 시약.
<13>
측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소, 발색제, 퍼옥시다아제, 그리고 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는 측정 시약 키트이며,
제1 시약에 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하고,
제2 시약에 효소를 포함하는,
상기 측정 시약 키트.
Figure pct00004
단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
<14>
검체 중에 포함되는 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 과산화수소의 영향을 회피하고, 측정 대상 성분에서 유래하는 과산화수소를 효소법에 의해 정량함으로써, 상기 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서의 측정 오차 저감 방법이며,
검체와, 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 오차 저감 방법.
Figure pct00005
단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
본 발명은, 검체 중의 측정 대상 성분을 효소와 반응시켜 생성되는 과산화수소와 발색제를 반응시켜 측정 대상 성분을 측정하는 효소법에 기초하는 측정 방법에 있어서, 특정의 화합물의 존재 하에서 효소 반응을 행함으로써, 측정 대상 이외의 검체 유래 성분의 영향을 받지 않고 측정 대상에서 유래하는 과산화수소를 정확하게 정량할 수 있다. 특히, 무카탈라아제 검체 이외의 검체나 구경 측정기 등의 측정 대상 성분의 발색에는 영향을 미치지 않고, 무카탈라아제 검체에 있어서 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 고치화를 억제할 수 있는 측정 방법 및 측정 시약을 제공할 수 있다. 즉, 본 발명은, 검체가 무카탈라아제 검체인지 여부에 관계 없이, 측정 대상 성분 이외의 검체 유래 성분의 영향을 받는 일 없이, 효소법에 의해 정확한 측정을 하는 것이 가능하다.
(측정 방법)
본 발명의 측정 방법은, 검체 중의 측정 대상 성분을 효소와 반응시켜 생성되는 과산화수소를 정량함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법이며, 이하의 공정을 포함하는 방법이다.
(A) 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 특정 화합물의 존재 하, 검체와 효소를 포함하는 시약을 접촉시킴으로써 과산화수소를 생성하는 공정
(B) 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 존재 하, 발색제와 반응시키는 공정
(C) 색조 변화를 검출하는 공정
Figure pct00006
단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
공정 (A)에 있어서의, 특정 화합물의 존재 하에서 검체와, 측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소를 접촉시킴으로써 행해지는 측정 대상 성분과 효소의 반응은, 과산화수소를 생성하는 조건이라면, 어떤 반응 조건이어도 되고, 예를 들어 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃이고, 반응 시간은 5초 내지 60분, 바람직하게는 30초 내지 15분, 더욱 바람직하게는 1분 내지 10분, 가장 바람직하게는 3 내지 5분이다.
이 반응에 있어서의 특정 화합물의 농도는, 검체 중에 포함되는 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 과산화수소의 영향을 회피하고, 측정 오차를 저감시킬 수 있는 농도이면 된다. 구체적으로는, 반응이 행해지는 용액 중에서 0.001 내지 1v/v％이면 되고, 0.01 내지 0.5v/v％가 바람직하고, 0.05 내지 0.3％가 보다 한층 바람직하다.
또한, 측정 시약에 처방했을 때의 특정 화합물의 농도는, 반응이 행해지는 용액 중에서 상기 농도가 되도록 처방하면 된다.
공정 (B)에 있어서의 발색제는, 퍼옥시다아제의 존재 하에, 과산화수소와 반응하여, 색소가 생성되는 것이면 된다. 발색제로서는, 산화 커플링형 색원체, 류코형 색원체 등을 들 수 있다.
류코형 색원체는, 과산화수소 및 퍼옥시다아제의 존재 하, 단독으로 색소로 변환되는 물질이다.
류코형 색원체로서는, 예를 들어 페노티아진계 색원체, 트리페닐메탄계 색원체, 디페닐아민계 색원체, o-페닐렌디아민, 히드록시프로피온산, 디아미노벤지딘, 테트라메틸벤지딘 등을 들 수 있고, 페노티아진계 색원체가 바람직하다.
페노티아진계 색원체로서는, 예를 들어 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진(CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진(MCDP), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진나트륨염(DA-67) 등을 들 수 있다. 페노티아진계 색원체 중에서도, 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진나트륨염(DA-67)이 특히 바람직하다.
트리페닐메탄계 색원체로서는, 예를 들어 N,N,N',N',N",N"-헥사(3-술포프로필)-4,4',4"-트리아미노트리페닐메탄(TPM-PS) 등을 들 수 있다.
디페닐아민계 색원체로서는, 예를 들어 N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염(DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스〔3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐〕아민(BCMA) 등을 들 수 있다.
산화 커플링형 색원체는, 과산화수소 및 과산화 활성 물질의 존재 하, 2개의 화합물이 산화적 커플링하여 색소를 생성하는 물질이다. 2개의 화합물의 조합으로서는, 커플러와 아닐린류(트린더 시약)의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다.
커플러로서는, 예를 들어 4-아미노안티피린(4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라진 등을 들 수 있다.
아닐린류로서는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-비스(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-석시닐에틸렌디아민(EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린(F-DAOS) 등을 들 수 있다.
페놀류로서는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산(HTIB) 등을 들 수 있다.
공정 (C)에 있어서의, 생성된 색소의 색조 변화는, 흡광도의 측정에 의해 검출할 수 있다. 흡광도의 측정은, 예를 들어 분광 광도계를 사용하여 측정하는 방법 등을 들 수 있다.
색조 변화는, 기지 농도의 측정 대상 성분을 사용하여 작성된, 측정 대상 성분의 농도와 흡광도의 관계를 나타내는 검량선에, 공정 (C)에서 측정한 흡광도에 맞추어 농도를 산출할 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 의하면, 검체 중의 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 정의 영향을 회피하여, 측정 대상에서 유래하는 과산화수소를 정확하게 정량할 수 있다. 검체 중의 측정 대상 성분 이외의 성분으로서는, 생체 시료 중의 측정 대상 성분 이외의 과산화물, 측정 시약에 포함되는 과산화물, 생체 시료의 전처리에 의해 발생하는 과산화물 등을 들 수 있다. 무카탈라아제 혈액증의 환자의 생체 시료 중에는, 카탈라아제가 포함되지 않는 점에서, 생체 시료에 포함되는 내인성의 과산화물이 존재한 경우에는 이것을 미리 소거할 수 없어 정의 영향을 발생시키기 때문에, 본 발명은 이러한 내인성의 과산화물의 영향을 회피할 수 있기 때문에 특히 바람직하다.
(시료, 검체)
본 발명의 방법에서 사용하는 시료로서는, 생체 유래의 시료라면 어느 것이어도 되고, 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 전혈로부터 분리된 적혈구, 전혈로부터 분리되고, 또한 세정된 적혈구 등을 들 수 있다.
생체 시료는, 직접, 혹은 일정한 전처리, 희석 등이 행해지고, 본 측정 방법의 검체로서 사용된다. 전처리로서는, 필터에 의한 여과, 원심 분리, 항응고제에 의한 처리, 방부제에 의한 처리, 가열 혹은 냉각 처리 등, 생체 시료 중의 측정 대상을 측정하기 위해 필요한 전처리를 모두 포함한다.
(특정 화합물)
본 발명의 특정 화합물로서는, 이하의 1. 내지 3.의 화합물을 들 수 있다.
1. 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물
Figure pct00007
여기서, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 헥실기를 들 수 있다. 구체적으로는, 메틸글리옥살(R1=수소, R2=메틸기, CAS 번호 [78-98-8]), 디아세틸(R1=메틸기, R2=메틸기, CAS 번호 [431-03-8]), 2,3-펜탄디온(R1=메틸기, R2=에틸기, CAS 번호 [600-14-6]), 3,4-헥산디온(R1=에틸기, R2=에틸기, CAS 번호 [4437-51-8]), 2,3-헵탄디온(R1=메틸기, R2=n-부틸기, CAS 번호 [96-04-8]), 5-메틸-2,3-헥산디온(R1=메틸기, R2=tert-부틸기, CAS 번호 [13706-86-0])을 들 수 있다. 그 중에서도, R1, R2가 동일하거나 또는 달라도 되고, 수소, 메틸기, 에틸기인 화합물이 바람직하다. 치환기로서는 할로겐 원자, 메틸기, 아미노기, 술포기, 카르복실기 등을 들 수 있다.
아릴기로서는, 페닐기, 나프틸기를 들 수 있고, 치환기로서는 할로겐 원자, 메틸기, 아미노기, 술포기, 카르복실기 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 페닐글리옥살(R1=수소, R2=페닐기, CAS 번호 [1075-06-5]), 1-페닐-1,2-프로판디온(R1=메틸기, R2=페닐기, CAS 번호 [579-07-7]), 1-(4-클로로페닐)프로판-1,2-디온(CAS 번호 [10557-21-8]), 1-[4-(트리플루오로메틸)페닐]프로판-1,2-디온(CAS 번호 [10557-13-8]), 1-(4-니트로페닐)프로판-1,2-디온(CAS 번호 [6159-25-7])을 들 수 있다. 그 중에서도, R1이 수소 또는 메틸기, R2가 페닐기인 화합물이 바람직하다.
탄소수 1 내지 6의 알콕시기로서는, 메톡시기, 에톡시기, 프로피옥시기, 부톡시기, 펜톡시기, 헥속시기를 들 수 있다. 구체적으로는, 피루브산메틸(R1=메틸기, R2=메톡시기, CAS 번호 [600-22-6]), 2-옥소부티르산메틸(R1=에틸기, R2=메톡시기, CAS 번호 [3952-66-7]), 피루브산에틸(R1=메틸기, R2=에톡시기, CAS 번호 [617-35-6]), 옥살산디메틸(R1=R2=메톡시기, CAS 번호 [553-90-2]), 2-옥소발레르산메틸(R1=프로필기, R2=메톡시기, CAS 번호 [6376-59-6]), 옥살산디에틸(R1=R2=에톡시기, CAS 번호 [95-92-1]), 벤조일포름산메틸(R1=페닐기, R2=메톡시기, CAS 번호 [15206-55-0])을 들 수 있다. 이것들 중, 물에 잘 녹는 화합물이 바람직하고, 그 중에서도, R1, R2의 어느 한쪽이 수소 또는 메틸기이고, 다른 한쪽이 메톡시기 또는 에톡시기인 화합물이 바람직하다.
상술한 식 (I)로 나타나는 화합물로서는, R1, R2가, 수소, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 페닐기, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기의 어느 것인 경우가 보다 바람직하다. 또한, 한층 더 바람직하게는, R1, R2가, 수소, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지상 알킬기, 페닐기, 탄소수 1 내지 4의 알콕시기의 어느 것인 경우이다. 더 구체적으로는, 페닐글리옥살(R1=수소, R2=페닐기, CAS 번호 [1075-06-5])), 글리옥살(R1=수소, R2=수소, CAS 번호 [107-22-2]), 디아세틸(R1=메틸기, R2=메틸기, CAS 번호 [431-03-8]), 2,3-펜탄디온(R1=메틸기, R2=에틸기, CAS 번호 [600-14-6]), 1-페닐-1,2-프로판디온(R1=메틸기, R2=페닐기, CAS 번호 [579-07-7]), 피루브산메틸(R1=메틸기, R2=메톡시기, CAS 번호 [600-22-6]) 또는 피루브산에틸(R1=메틸기, R2=에톡시기, CAS 번호 [617-35-6])이 보다 바람직하고, 페닐글리옥살이 보다 한층 바람직하다.
2. 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체
본 발명의 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체로서는, 벤즈이미다졸 골격을 갖고, 2위가 치환기로 치환된 것이며, 효소법에 의해 검체 중의 측정 대상을 측정하는 방법에 있어서, 검체에서 유래하는 과산화물의 정의 영향을 억제하는 작용을 갖는 화합물이면 된다.
상기 작용을 갖는 유도체의 2위에 결합되어 있는 전자 공여성 치환기는, 아미노기(-NH2, -NR2: 단 R은 알킬기), 알콕시기, 알킬기, 아릴기 등을 들 수 있다.
이러한 화합물로서는, 2위가 아미노기로 치환된 2-아미노벤즈이미다졸(CAS 번호 [934-32-7]), 에틸기로 치환된 2-에틸-1H-벤즈이미다졸(CAS 번호 [1848-84-6])을 들 수 있다. 그 중에서도, 2-아미노벤즈이미다졸이 바람직하다.
3. 히스티딘
본 발명에 사용되는 히스티딘은, CAS 번호 [71-00-1]로 규정되는 화합물이다.
(측정 대상 성분)
본 발명에 있어서의 효소법은, 검체 중의 측정 대상 성분을, 그것을 기질로 하는 효소와 반응시켜 과산화수소를 생성시키고, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제(POD) 존재 하에서 발색제를 작용시켜, 정색 변화를 검출함으로써 측정 대상 성분의 정량을 행하는 측정 방법이다. 따라서, 측정 대상 성분으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 효소 반응에 의해 생성되는 과산화수소를 정량함으로써 측정이 가능한 성분은 모두 측정 가능하다. 측정 대상 성분과 반응하여 과산화수소를 생성시키는 효소에는, 예를 들어 측정 대상 성분을 직접 과산화수소로 변환하는 효소, 측정 대상 성분을 간접적으로 과산화수소로 변환하는 효소, 측정 대상 성분으로부터 직접 과산화수소를 생성시키는 효소, 측정 대상 성분으로부터 간접적으로 과산화수소를 생성시키는 효소 등을 들 수 있다. 따라서, 이러한 효소 반응에 의해 측정 가능한 성분이 모두 본 발명의 측정 대상이 될 수 있다.
구체적으로는, 헤모글로빈 A1c(HbA1c), 글리코알부민(GA), 요산, 크레아티닌, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 폴리아민, 담즙산, 1,5-안히드로글루시톨, 피루브산, 락트산, 인지질, 요소, 글루코오스, 콜린, 크레아틴, 유리 지방산 등을 들 수 있다. 또한, 상기한 측정 대상 성분 또는 그 파생물에 대하여 특이적인 산화 효소로서, 「측정 대상 성분(효소)」의 형식으로 이하와 같이 열거한다. 헤모글로빈 A1c(프로테아제, 프룩토실아미노산 산화 효소 또는 프룩토실펩티드산화 효소), GA(프로테아제, 케토아민 산화 효소), 요산(우리카아제), 크레아티닌(크레아티니나아제, 크레아티나아제, 사르코신옥시다아제), 콜레스테롤(콜레스테롤옥시다아제), 트리글리세라이드(리포프로테인리파아제, 글리세롤키나아제, 글리세롤-3-인산옥시다아제), 폴리아민(폴리아민아미드히드롤라제, 폴리아민옥시다아제, 퓨트레신옥시다아제), 담즙산(3-α-히드록시스테로이드디히드로게나아제, 디아포라아제), 1,5-안히드로글루시톨(1,5-안히드로글루시톨옥시다아제, 피라노오스옥시다아제), 피루브산(피르빈산옥시다아제), 락트산(락트산옥시다아제), 인지질(포스포리파제 D, 콜린옥시다아제), 요소(우레아아미드리아제, 피루브산키나아제, 피루브산옥시다아제) 등을 들 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의, 측정 대상 성분과, 측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소의 반응은, 수성 매체 중에서 행해지는 것이 바람직하다. 수성 매체로서는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있다. 완충액의 pH로서는, pH4.0 내지 10.0이고, pH6.0 내지 8.0이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로서는, 예를 들어 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿의 완충제 등을 들 수 있다.
또한, 측정 대상 성분과 상기 효소의 반응은, 안정화제, 방부제, 간섭 물질 소거제, 반응 촉진제 등을 공존시켜 행할 수도 있다.
(측정 시약)
본 발명의 측정 방법을 실시하기 위한 측정 시약 구성으로서는, 2시약계, 3시약계의 키트를 들 수 있다. 3시약으로서는, 시료를 전처리하기 위한 전처리액, 제1 시약, 제2 시약을 포함하는 구성을 들 수 있고, 2시약으로서는, 제1 시약, 제2 시약을 포함하는 구성을 들 수 있다.
발색제와 POD는 각각 별도의 시약에 포함되고, 본 발명의 특정의 화합물 성분은, 전처리액, 또는 제1 시약에 포함된다.
구체적인 시약 처방의 양태를 이하에 나타낸다.
(1) 헤모글로빈 A1c 측정 시약 키트
제1 시약 프로테아제, 발색제, 본 발명의 특정 화합물
제2 시약 프룩토실펩티드옥시다아제, POD
(2) 글리코알부민 측정 시약 키트
제1 시약 프로테아제, POD, 본 발명의 특정 화합물
제2 시약 케토아민 산화 효소, 발색제
본 발명의 측정 시약은, 종래와 같이, 각종 자동 분석 장치에 적용할 수 있다. 각종 자동 분석 장치에 적용함으로써, 검체 중의 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 정의 영향을 배제한 각 측정 대상 성분의 측정 방법을 제공할 수 있다.
(헤모글로빈 A1c의 측정 방법, 측정 시약)
본 발명의 측정 대상 성분으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 효소 반응에 의해 생성되는 과산화수소를 정량함으로써 측정이 가능한 성분은 모두 측정 가능하지만, 그 중에서도 특히 헤모글로빈 A1c를 측정하는 경우에 대하여 설명한다.
본 발명에 의한 HbA1c 측정 방법으로서는, 예를 들어, 이하의 헤모글로빈 A1c 측정 시약 키트를 사용하는 방법을 들 수 있다.
제1 시약 프로테아제, 발색제, 본 발명의 특정 화합물
제2 시약 프룩토실펩티드옥시다아제, POD
먼저, 검체에 제1 시약을 첨가하고, HbA1cβ쇄 N말단의 당화 디펩티드를 프로테아제에 의해 소화, 절단한다. 이어서, 제2 시약을 첨가하고, 상기 당화 디펩티드에 특이적인 산화 효소(프룩토실펩티드옥시다아제)를 작용시켜, 생성된 과산화수소에 대하여 퍼옥시다아제의 존재 하에서 발색제를 작용시켜, 비색 정량하는 방법을 들 수 있다. 측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소의 반응은, 제1 시약에 포함되는 본 발명의 특정 화합물의 존재 하에서 행해짐으로써, 측정 대상 성분에서 유래하는 정의 영향을 억제할 수 있다.
헤모글로빈 A1c는, 일반적으로 HbA1c％로 하여 구해진다. 「HbA1c％」란, 임상에 있어서 통상 사용되는, 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 A1c 농도의 비(％)를 의미한다.
HbA1c％의 측정 방법은, 기본적으로는, 시료 중의 헤모글로빈 농도를 광학적으로 측정하는 제1 공정과, 해당 시료 중의 HbA1c 농도를 광학적으로 측정하는 제2 공정과, 해당 시료 중의 헤모글로빈 농도에 대한 HbA1c 농도의 비율(HbA1c％)을 산출하는 공정을 포함한다. 전술한 헤모글로빈 A1c의 측정은, HbA1c％의 측정 방법의 제2 공정에 상당하게 된다.
A1c％의 측정 방법은, 제1 공정에 있어서, 해당 시료의 광학적 측정은, 제1 파장의 광과 제2 파장의 광을 각각 사용하여, 흡광도를 측정함으로써 행해진다. 해당 제1 파장에서 측정된 헤모글로빈 농도는, 해당 제2 파장에서의 측정값을 사용하여 보정된다. 해당 보정된 헤모글로빈 농도가, 해당 HbA1c％ 산출 공정에서 사용된다.
헤모글로빈 농도의 측정에 있어서, 메트화 등 공지의 방법에 의해 헤모글로빈을 일정한 구조로 하여 흡광도를 안정화시키는 처치를 행해도 된다. 또한, HbA1c 농도의 측정에 있어서, 프로테아제에 의한 소화, 절단 시에, 계면 활성제 등을 공존시킴으로써, HbA1cβ쇄보다 당화 디펩티드가 소화, 절단되기 쉽게 하는 처치를 행해도 된다.
본 명세서에 있어서 「제1 파장」이란, 헤모글로빈을 측정하기 위한 파장을 의미하고, 바람직하게는 본 발명의 방법의 제1 공정에 있어서의 헤모글로빈 농도의 광학적 측정에 사용하는 제1 광의 파장이다. 당해 제1 파장은, 450㎚ 내지 610㎚의 범위로부터 적절하게 선택할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「제2 파장」이란, 제1 파장에서 측정한 겉보기의 헤모글로빈 농도를 실제의 헤모글로빈 농도로 보정하기 위한 파장을 의미하고, 바람직하게는 본 발명의 방법의 제1 공정에서의 광학적 측정에 사용하는 제2 광의 파장이다. 제2 파장은, 690㎚ 내지 900㎚의 범위로부터 적절하게 선택할 수 있다.
(측정 오차 저감 방법)
본 발명의 측정 방법은, 바꾸어 말하면, 검체 중에 포함되는 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 과산화수소의 영향을 회피하고, 측정 대상 성분에서 유래하는 과산화수소를 효소법에 의해 정량함으로써, 상기 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서의 측정 오차 저감 방법이라고도 할 수 있다. 본 발명의 측정 오차 저감 방법은, 검체와, 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이고, 각 구성은 상술한 바와 같다.
Figure pct00008
단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[참고예 1] 무카탈라아제 모델 검체의 조제
EDTA 체혈관을 사용하여 채혈한 건강인 2명의 혈액 A, B를 원심 분리하여, 혈구 A, B를 얻었다. 이 혈구에 대하여 카탈라아제 활성을 저해하는 것이 알려져 있는 아지화나트륨의 수용액을 첨가하여, 무카탈라아제 모델 검체 A, B로 했다.
[실시예 1] 무카탈라아제 모델 검체를 사용한 검토
1. 측정 시약과 측정 샘플:
<프로테아제 함유 기질 시약(R1)>
50mM MES pH6.0
1.0％ 에말 20C(가오사)
프로틴 PC10F(다이와 가세이 고교사)
DA-67(10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진나트륨, 와코 준야쿠 고교사)
표 1 내지 4에 기재된 첨가제
또한, 표 1 내지 4에 기재된 첨가제의 제조 판매원은, 이하를 나타낸다.
TCI: 도쿄 가세이 고교 가부시키가이샤
기시다: 기시다 가가쿠 가부시키가이샤
후지: 후지 필름 와코 준야쿠 가부시키가이샤
<발색 시약(R2)>
50mM 시트르산 pH6.0
프룩토실펩티드옥시다아제(기코만사)
퍼옥시다아제(도요보사)
<측정 샘플>
(1) 노르디아 NHbA1c 구경 측정기(세키스이 메디컬 가부시키가이샤) 1, 2
(2) 참고예 1에서 조제한 무카탈라아제 모델 검체 A, B
2. 조작
자동 분석 장치 JCA-9130(니혼 덴시사)을 사용하여, 표 1 내지 4에 나타낸 각종 첨가제를 포함하는 시약 R1과 시약 R2를 조합하여, 이하의 측정 파라미터에 의해 측정 샘플의 HbA1c(％)의 흡광도를 측정했다. 또한 하기의 시간 설정은, R1이 첨가되어 제1 반응이 개시되고 약 5분 후에 R2가 첨가되는 설정이다.
파라미터:
[HbA1c]
분석 방법: EPA
계산 방법: MSTD
측정 파장(부/주): HbA1c 805/658
주DET.Pl-P.m-P.n: HbA1c 0-95-98
부DET.P.p-P.r: HbA1c 44-47
반응 시간: 10분
검체 희석 없음
반응 검체량(Sample량): 6.4μL
제1 시약량(R1): 60μL, 제2 시약량: 0μL,
제3 시약량(R2): 20μL, 제4 시약량: 0μL
3. 결과
각 조건에서 측정했을 때의 HbA1c(％)의 흡광도의, 조건 1(첨가제 없음)에서 얻어진 흡광도에 대한 상대값(％)을 산출하여, 표 1 내지 4에 나타냈다. 구경 측정기 1, 구경 측정기 2의 측정 흡광도의 상대값은, 조건 1에 대하여 100％에 가까운 값인 것이 바람직하다. 또한, 무카탈라아제 모델 검체 A, B의 측정 흡광도의 상대값은, 조건 1에 대하여 저하되어 있는 것이 바람직하다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
3-1. 일반식 (I)로 나타나는 화합물에 대하여
먼저, 특허문헌 2에 기재된 α-케토산인 피루브산을 0.10％ 첨가한 조건 2에서는, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 20.1 내지 22.1％로 저하되었지만, 구경 측정기 1, 2의 흡광도 상대값도 70.1 내지 87.1％로 저하되어, 주반응에 대한 영향이 인정되었다. 또한 피루브산을 1.0％ 첨가한 조건 3에서는, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 86.2 내지 97.7％로 저하되었지만, 구경 측정기의 흡광도 상대값은 204.3 내지 593.2％로, 발색 반응에 이상이 발생했다고 생각되었다. 또한, α-케토산의 유사 화합물인 2-케토글루타르산을 첨가한 조건 4, 5는, 피루브산과 마찬가지의 거동을 나타내고, 레불린산(3-아세틸프로피온산)을 첨가한 조건 6에서는, 구경 측정기의 흡광도 상대값이 저하된 한편, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 증가하여, 발색 반응에 이상이 발생했다고 생각되었다.
한편, 본원에서 알아낸 화합물인 조건 8: 0.10％ 페닐글리옥살을 사용한 경우, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 21.0 내지 21.6％로 저하되었지만, 구경 측정기 1, 2의 흡광도 상대값은 92.4 내지 110.4％로 유지되었다. 또한, 조건 9: 0.20％ 페닐글리옥살을 사용한 경우, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 17.1 내지 17.5％로 저하되었지만, 구경 측정기 1, 2의 흡광도 상대값은 80.6 내지 109.0％로 유지되었다. 0.01％의 페닐글리옥살을 첨가한 조건 7에서도, 구경 측정기의 흡광도가 저하되지 않고, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도만 저하되었다. 특히 조건 8, 9의 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은, 조건 2와 동 정도였지만, 조건 8, 9에서는 구경 측정기 1, 2의 흡광도 상대값이 유지되어 있는 점에서, 조건 2보다 우수했다.
마찬가지로, 일반식 (I)로 나타나는 화학 구조를 갖는 글리옥살(조건 10), 디아세틸(조건 11, 12), 2,3-펜탄디온(조건 30, 31, 32), 1-페닐-1,2-프로판디온(조건 33), 피루브산메틸(조건 34, 35), 피루브산에틸(조건 36, 37)에 있어서도, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값이 저하되는 한편, 구경 측정기 1, 2의 흡광도 상대값은 유지되었다.
이렇게 일반식 (I)의 구조를 갖는 화합물군은, 검체 중의 내인성 과산화물을 특이적으로 소거하는 한편, 측정 대상 물질로부터 발생한 과산화수소에 기인하는 주반응에 영향을 미치지 않고, 본 발명의 목적의 기능을 갖는 화합물인 것을 알 수 있었다.
3-2. 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체에 대하여
조건 13 내지 21, 38 내지 40에 대하여 검증한다. 이미다졸을 첨가한 경우, 0.01％(조건 13)에서는, 구경 측정기, 무카탈라아제 모델 검체의 어느 것에 대해서도 흡광도 변동을 일으키지 않았다. 0.1 내지 0.2％ 첨가한 경우(조건 14, 15)는, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값이 저하되는 것보다도, 구경 측정기의 흡광도 상대값의 저하 폭의 쪽이 크고, 측정에 적합하지 않다고 생각되었다. 벤즈이미다졸을 0.01％ 내지 0.2％ 첨가한 경우(조건 16 내지 18), 어느 농도에 있어서도 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 저하되었지만, 그 이상으로 구경 측정기의 흡광도 상대값이 저하되어, 이미다졸과 마찬가지의 거동을 나타냈다. 한편, 본원에서 확인된 2-아미노벤즈이미다졸을 0.01％ 내지 0.2％ 첨가한 경우(조건 19 내지 21), 어느 농도에 있어서도, 구경 측정기의 흡광도 상대값과 비교하여, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값이 유의미하게 저하되었다. 또한, 2-에틸-1H-벤즈이미다졸을 0.01％ 첨가한 경우(조건 38)도, 구경 측정기의 흡광도 상대값이 100.6 내지 101.4％로 유지된 것에 대하여, 검체의 흡광도 상대값이 저하되고, 본 발명의 목적의 기능을 갖는 화합물인 것을 알 수 있었다. 또한, 2-아미노이미다졸황산염(조건 39, 40)은, 검체의 흡광도 상대값이 저하되지 않았던 점에서, 본 발명의 기능을 갖는 화합물로서 벤즈이미다졸 골격이 필요하다고 생각되었다.
이렇게 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체는, 검체 중의 내인성 과산화물을 특이적으로 소거하는 한편, 측정 대상 물질로부터 발생한 과산화수소에 기인하는 주반응에 영향을 미치지 않고, 본 발명의 목적의 기능을 갖는 화합물인 것을 알 수 있었다.
3-3. 히스티딘에 대하여
조건 22 내지 25에 대하여 검증한다. 메티오닌을 0.1％ 첨가한 조건 22, 트립토판을 0.1％ 첨가한 조건 23에서는, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 거의 변동되지 않았다. 한편, L-히스티딘을 첨가한 조건 24, 25에서는, 무카탈라아제 모델 검체의 흡광도 상대값은 저하되고, 그 폭은 구경 측정기의 흡광도 상대값의 저하 폭보다도 컸다.
이와 같이, 아미노산 중에서도 히스티딘은, 본 발명의 목적의 기능을 갖는 화합물인 것을 알 수 있었다.
4. 판정 결과
또한, 표 1 내지 4에 나타낸 상대값의 판정 결과를 표 5에 나타냈다.
평가 기준은 이하와 같다.
4-1. 구경 측정기의 평가 기준
A: 구경 측정기 1, 2의 측정 흡광도의 상대값이 양쪽 모두 90 내지 110％이다
B: 구경 측정기 1, 2의 측정 흡광도의 상대값이 양쪽 모두 80 내지 120％이다
C: 구경 측정기 1, 2의 측정 흡광도의 상대값의 한쪽이 80％ 미만 또는 120％보다 크다
구경 측정기 1, 구경 측정기 2의 측정 흡광도의 상대값은, 첨가제 없음에 대하여 100％에 가까운 값인 것이 바람직하기 때문에, A가 가장 바람직하고, 다음으로 B의 순으로 바람직하고, C는 바람직하지 않다고 판단했다.
4-2. 검체의 평가 기준
구경 측정기의 판정이 A 또는 B인 조건에 있어서, 이하와 같이 했다.
A: 검체 A, B의 양쪽의 상대값이 60％ 이하이다
B: 또한 검체 A, B의 양쪽의 상대값이 90％ 이하이다
C: 검체 A, B의 양쪽의 상대값이 95％ 이하이다
D: 검체 A, B의 양쪽의 상대값이 95％ 이상이다
무카탈라아제 모델 검체 A, B의 측정 흡광도의 상대값은, 조건 1에 대하여 저하되어 있는 것이 바람직하기 때문에 A가 가장 바람직하고, 다음으로 B, C의 순으로 바람직하고, D는 요구하는 성능을 갖지 않는다고 판단했다. 또한, 구경 측정기의 판정이 「C」인 경우는 검체 평가의 대상 외로 했다(표 중, 「―」로 나타냄).
4-3. 종합 평가의 기준
구경 측정기 및 검체의 평가에 기초하여, 이하와 같이 했다.
A: 구경 측정기와 검체의 양쪽이 평가 A이다
B: 구경 측정기가 A이고 검체가 B, 또는 구경 측정기가 B이고 검체가 A 또는 B이다
C: 구경 측정기가 A 또는 B이고 검체가 C이다
D: 구경 측정기가 C 또는 검체가 D이다
종합 평가는, A가 가장 바람직하고, 다음으로 B, C의 순으로 바람직하고, D는 효과를 나타내지 않았다고 판단했다. 또한, 조건 14는 이 기준에 의하면 종합 평가 C이지만, 검체 A, B의 상대값이 구경 측정기 2보다 높았기 때문에, 종합 평가D로 했다.
4-4. 고찰
표 5로부터, 종합 평가 A가 포함되는 페닐글리옥살, 피루브산메틸, 피루브산에틸이 가장 바람직한 화합물이다. 또한 평가 B가 포함되는 글리옥살, 디아세틸, 2-아미노벤즈이미다졸, 히스티딘, 2,3-펜탄디온이 바람직한 화합물이다.
이상으로부터, 본 발명에서 확인된 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체, 또는 히스티딘은, 검체 중의 측정 대상 성분을 효소법에 의해 측정하는 방법에 있어서, 측정계 내에 존재시킴으로써, 모두 검체 중의 내인성 과산화물을 특이적으로 소거하는 한편, 측정 대상 성분으로부터 발생한 과산화수소에 기인하는 주반응에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.
Figure pct00013
[참고예 2] 건강인 검체 및 무카탈라아제증 검체의 측정
EDTA 체혈관을 사용하여 채혈한 건강인 2명의 혈액 C, D 및 무카탈라아제증 검체 E를 원심 분리하여, 혈구 C, D, E를 얻었다.
또한, 혈구 C, D, E를, 카탈라아제 유무의 영향을 받지 않는 측정법인 HPLC법으로 측정(도소 G11)했다. HbA1c(％)는, 건강 검체 C: 4.95％, 건강 검체 D: 6.50％, 무카탈라아제 검체 E: 6.20％였다.
[실시예 2] 무카탈라아제 검체를 사용한 검토
1. 측정 시약
<프로테아제 함유 기질 시약(R1-A)>
50mM MES pH6.0
1.0％ 에말 20C(가오사)
프로틴 PC10F(다이와 가세이 고교사)
DA-67(10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진나트륨, 와코 준야쿠 고교사)
<프로테아제 함유 기질 시약(R1-B)>
50mM MES pH6.0
1.0％ 에말 20C(가오사)
프로틴 PC10F(다이와 가세이 고교사)
DA-67(10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진나트륨, 와코 준야쿠 고교사)
0.10％ 페닐글리옥살
<발색 시약(R2)>
50mM 시트르산 pH6.0
프룩토실펩티드옥시다아제(기코만사)
퍼옥시다아제(도요보사)
2. 시험 시료
<구경 측정기>
노르디어 NHbA1c 구경 측정기를 사용했다.
<희석액>
정제수를 사용했다.
<측정 샘플>
참고예 2에서 조제한 정상 검체 C, D, 무카탈라아제 검체 E를 정제수로 26배 희석하여 측정했다.
2. 조작
자동 분석 장치 JCA-9130(니혼 덴시사)을 사용하여, 시약 R1-A와 시약 R2, 시약 R1-B와 시약 R2의 조합에 있어서, 이하의 측정 파라미터에 의해 시험 시료를 측정하여, HbA1c(％)를 산출했다.
파라미터:
[HbA1c, Hb]
분석 방법: EPA
계산 방법: MSTD
측정 파장(부/주): HbA1c 805/658, Hb 805/478
주DET.Pl-P.m-P.n: HbA1c 0-95-98, Hb 0-44-47
부DET.P.p-P.r: HbA1c 44-47, Hb 0-0
반응 시간: 10분
검체 희석 없음
반응 검체량(Sample량): 6.4μL
제1 시약량(R1): 60μL, 제2 시약량: 0μL,
제3 시약량(R2): 20μL, 제4 시약량: 0μL
3. 결과
제1 시약으로서 R1-A(첨가제 없음), R1-B(페닐글리옥살 첨가) 각각을 사용하여 측정한 결과를 표 6에 나타냈다. R1-A 시약을 사용한 경우, 건강 검체 C, D는 고정밀도로 측정할 수 있었던 한편, 무카탈라아제 검체 E는, HPLC 측정값 6.20％에 대하여 15.46％로, 대폭으로 고치화했다. 한편, 본 발명에서 알아낸 페닐글리옥살을 0.10％ 첨가한 R1-B 시약을 사용한 경우, 무카탈라아제 검체의 측정값은, HPLC값 6.20％에 대하여 6.84％로, 첨가제를 사용하고 있지 않은 R1-A 시약과 비교하여, 훨씬 높은 정밀도로 측정할 수 있었다. 또한, R1-B 시약을 사용한 경우, 건강 검체 C는 HPLC값 4.95％에 대하여 5.29％, 건강 검체 D는 HPLC값 6.50％에 대하여 6.65％로 약간 고치화했다. 이것은, R1-B 시약으로 캘리브레이션을 행할 때, R1-A 시약용으로 최적화된 구경 측정기를 사용했기 때문에 발생한 측정 오차라고 추측하고 있다. 따라서 R1-B 시약용으로 별도 구경 측정기의 최적화를 행하면, 더 고정밀도의 측정이 가능하다고 생각된다.
Figure pct00014
본 발명에 따르면, 효소법에 기초를 두는 측정 방법에 있어서, 측정 대상 이외의 검체 유래 성분의 영향을 받지 않고 측정 대상에서 유래하는 과산화수소를 정확하게 정량할 수 있는 측정 방법, 측정 시약을 제공할 수 있다. 특히, 무카탈라아제 검체인지 여부에 관계 없이, 측정 대상 이외의 검체 유래 성분의 영향을 받는 일 없이, 효소법에 의해 정확한 측정 대상의 측정이 가능하다.

Claims (14)

  1. 검체 중의 측정 대상 성분을 효소와 반응시켜 생성되는 과산화수소를 정량함으로써 측정 대상 성분을 측정하는 방법이며, 이하의 공정을 포함하는 상기 측정 방법;
    (A) 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물의 존재 하,
    검체와 효소를 접촉시킴으로써 과산화수소를 생성하는 공정
    (B) 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제 존재 하, 발색제와 반응시키는 공정
    (C) 색조 변화를 검출하는 공정
    Figure pct00015

    단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 식 (I)의 R1, R2가, 수소, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 알킬기, 페닐기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기의 어느 것인, 측정 방법.
  3. 제1항에 있어서, 식 (I)의 R1 또는 R2의 어느 한쪽이 수소 또는 메틸기이며, 다른 한쪽이 수소, 메틸기, 에틸기, 페닐기, 메톡시기 및 에톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것인, 측정 방법.
  4. 제1항에 있어서, 식 (I)로 나타나는 화합물이, 페닐글리옥살, 글리옥살, 디아세틸, 2,3-펜탄디온, 피루브산메틸 또는 피루브산에틸인, 측정 방법.
  5. 제1항에 있어서, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체가, 2-아미노벤즈이미다졸인, 측정 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 측정 대상 성분이 HbA1c인, 측정 방법.
  7. 측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소, 발색제, 퍼옥시다아제, 그리고 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는, 측정 시약.
    Figure pct00016

    단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
  8. 제7항에 있어서, 식 (I)의 R1, R2가, 수소, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 알킬기, 페닐기 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬옥시기의 어느 것인, 측정 시약.
  9. 제7항에 있어서, 식 (I)의 R1 또는 R2의 어느 한쪽이 수소 또는 메틸기이며, 다른 한쪽이 수소, 메틸기, 에틸기, 페닐기, 메톡시기 및 에톡시기로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 것인, 측정 시약.
  10. 제5항에 있어서, 식 (I)로 나타나는 화합물이, 페닐글리옥살, 글리옥살, 디아세틸, 2,3-펜탄디온, 피루브산메틸 또는 피루브산에틸인, 측정 시약.
  11. 제7항에 있어서, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체가, 2-아미노벤즈이미다졸인, 측정 시약.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 측정 대상 성분이 HbA1c이고, 측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소가, 프로테아제 및 프룩토실펩티드옥시다아제인, 측정 시약.
  13. 측정 대상 성분에 작용하여 과산화수소를 생성하는 효소, 발색제, 퍼옥시다아제, 그리고 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하는 측정 시약 키트이며,
    제1 시약에 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 포함하고,
    제2 시약에 효소를 포함하는,
    상기 측정 시약 키트.
    Figure pct00017

    단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
  14. 검체 중에 포함되는 측정 대상 성분 이외의 성분에서 유래하는 과산화수소의 영향을 회피하고, 측정 대상 성분에서 유래하는 과산화수소를 효소법에 의해 정량함으로써, 상기 측정 대상 성분을 측정하는 방법에 있어서의 측정 오차 저감 방법이며,
    검체와, 이하의 일반식 (I)로 나타나는 화합물, 2위에 전자 공여성 치환기를 갖는 벤즈이미다졸 유도체 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 오차 저감 방법.
    Figure pct00018

    단, 식 (I) 중, R1, R2는 동일해도 되고 달라도 되고, 수소, 치환기를 갖고 있어도 되는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 혹은 분지상 알킬기, 치환기를 갖고 있어도 되는 아릴기, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시기를 나타낸다.
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