WO2004007760A1 - スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法 - Google Patents

スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2004007760A1
WO2004007760A1 PCT/JP2003/005487 JP0305487W WO2004007760A1 WO 2004007760 A1 WO2004007760 A1 WO 2004007760A1 JP 0305487 W JP0305487 W JP 0305487W WO 2004007760 A1 WO2004007760 A1 WO 2004007760A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
sulfonic acid
protease
glycated
acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/005487
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Satoshi Yonehara
Kaori Ishimaru
Kaoru Hirai
Original Assignee
Arkray, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray, Inc. filed Critical Arkray, Inc.
Priority to JP2004521126A priority Critical patent/JP3973160B2/ja
Priority to AU2003235975A priority patent/AU2003235975A1/en
Priority to EP03720985A priority patent/EP1522593A4/en
Priority to US10/521,234 priority patent/US8021855B2/en
Priority to CN03817026.4A priority patent/CN1668760B/zh
Publication of WO2004007760A1 publication Critical patent/WO2004007760A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)

Definitions

  • the present invention relates to a method for degrading a protein, a method for treating a glycated protein in a sample with a protease, and a method for measuring the amount of the glycated protein using a redox reaction.
  • glycated protein in blood cells which is an important index in diabetes diagnosis and treatment, and in particular, glycated hemoglobin in red blood cells, which reflects the past history of living blood glucose levels
  • F ⁇ D fructosyl amino acid oxidase
  • peroxidase hereinafter, referred to as “POD”
  • POD peroxidase
  • a substrate that develops color by oxidation is added to the sample after the FAOD treatment, and the POD is used as a catalyst to form a reaction between the hydrogen peroxide and the substrate. Oxidation-reduction reaction.
  • the substrate develops color by oxidation, the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the color development, and as a result, You can know the amount of glycated protein.
  • FAOD acting on the glycated moiety is more susceptible to glycated amino acids and shorter peptide fragments than glycated proteins and glycated peptides.Therefore, glycated proteins and glycated peptides are degraded by protease in advance. In addition, the measurement accuracy is improved by facilitating the action of FAOD on the saccharified moiety.
  • protease since protease has substrate specificity and its degradation activity differs depending on the substrate to be treated, it takes a long time for degradation depending on the type of target protein, and it cannot be performed quickly. There's a problem. Furthermore, when the target protein is glycated, such as the glycated protein, it may be difficult to decompose due to steric hindrance or the like. For this reason, for example, even in the measurement of a glycated protein as described above, the whole measurement takes a long time due to the protease treatment performed in advance. For this reason, from the viewpoint of utilization in the field of clinical tests and the like, there is a need for a method that can more quickly measure the glycated protein. Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a protein hydrolyzate that degrades a protein quickly and with excellent efficiency, and further provides a method for decomposing glycated protein in a sample and measuring the amount of the glycated protein.
  • a method for producing a protein hydrolyzate of the present invention is characterized in that a protein is treated with a protease in the presence of a sulfonic acid compound.
  • the “protein” includes a peptide
  • the “protein degradation product” includes a degradation product of the peptide.
  • the protein in the sample can be rapidly decomposed.
  • the glycated protein is degraded by subjecting a sample containing the glycated protein to protease treatment, and the glycated portion of the obtained glycated protein hydrolyzate is degraded.
  • a method for measuring the amount of glycated protein by reacting FAOD with and measuring the redox reaction, wherein the protease treatment is performed in the presence of a sulfonic acid compound.
  • the term “glycated protein” includes glycated peptides.
  • protease treatment was required. Therefore, it takes a long time to measure a glycated protein by the enzymatic method, and it is difficult to say that the method is useful.
  • glycated proteins and the like can be decomposed in a short time, so that glycated proteins and the like can be rapidly measured.
  • the measurement method of the present invention for example, when the measurement is performed under the same conditions except that the sulfonic acid compound is added, it is about 10 to 200 times higher than in the absence of the sulfonic acid compound.
  • the measurement time can be reduced in the range of 0 times.
  • the measurement method of the present invention can be used for various tests in clinical medicine and the like as described above because the measurement method can be performed more quickly and with high accuracy.
  • the sulfonic acid compound includes, for example, General formula R— S ⁇ 3 X
  • X is, for example, Na, K, Li, H, etc.
  • N in R is, for example, in the range of 1 to 20.
  • "H" may be substituted with an acyl group, a nitro group, a nitroso group, a phenyl group, an alkyl group, an alkyl ether group or the like.
  • the sulfonic acid compound include, for example, sodium lauryl sulfate (hereinafter, referred to as “SLS”), sodium dodecylbenzenesulfonate (hereinafter, referred to as “SDBS”), lithium lauryl sulfate (hereinafter, “LiLS”).
  • SLS sodium lauryl sulfate
  • SDBS sodium dodecylbenzenesulfonate
  • LiLS lithium lauryl sulfate
  • ABSA 4-aminoazobenzene-4'-sodium sulfonate
  • ANDS 4-amino-4'-nitrostilbene-2,2'-disulfonate disodium
  • DADS 4,4'-Diazostilpene-2,2'-disulfonate disodium
  • N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid N-cyclohexyl-3-amido Nopropanesulfonic acid, N-cyclohexyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid, piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid),) ⁇ % Sulfonic acid and the like
  • SLS, SDBS, and LiLS are more preferable.
  • sulfonic acid compounds are generally excellent in solubility, so that they can be easily treated even if the concentration of glycated protein in the sample is high, and they are very low in cost, so that they are very expensive. Useful. Further, in the production method and the measurement method of the present invention, since the degradation of glycated protein can be further promoted, the sulfonic acid compound and It is preferable to perform the protease treatment in the presence of the compound.
  • the nitro compound is not particularly limited, and examples thereof include a nitrobenzene compound and a dinitrobenzene compound.
  • nitro compound examples include, for example, 2,4-dinitrophenol (2,4-DNP), 2,5-dinitrophenyl, 2,6-dinitrophenyl, 4,6-dinitro-2-methylphenol, 2-amino-4-nitrophenol, 2-amino-5-nitrophenol, 2-amino-4-nitrophenol, p-nitrophenol (P-NP), 2,4-dinitroaniline (2,4 - DNA), p - two Trois diphosphate (P-NA), sodium nitrite (NaN0 2), potassium nitrite (KN0 2), 4 - Amino - 4 '- to Nitorosuchiru' down - 2, 2 '- sheet' Disodium sulfonate (hereinafter referred to as “ANPS”), nitrobenzene, and the like can be used.
  • 2,4-dinitrophenol 2,4-DNP
  • 2,5-dinitrophenyl 2,6-dinitrophenyl
  • the protease is not particularly limited.
  • serine protease, thiol protease, meta-oral protease can be used, and specifically, trypsin, proteinase K :, Chymotrypsin, papain, bromelain, subtilisin, elasase, aminopeptidase and the like are preferred.
  • the protease is a protease that selectively degrades the glycated hemoglobin, and includes promeaine, papain, trypsin derived from pig kidney, meta-mouth proteinase, A protease derived from cillus subtil 1 is preferred.
  • Bacillus subtils-derived protease include Protease N (trade name, manufactured by Fluka), Protease N “Amano” (trade name, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), and the like.
  • the meta-oral proteinase include Bacillus genus metallob-oral protease (EC 3.4.24.4).
  • meta-oral proteinase bromelain and papain are more preferred, and meta-oral proteinase is particularly preferred.
  • a protease that selectively degrades a degradation product of a specific glycated protein can be selectively prepared.
  • the method for producing a protein hydrolyzate of the present invention is a method characterized by treating a protein with a protease in the presence of a sulfonic acid compound.
  • the amount of the sulfonic acid compound to be added is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on, for example, the type and amount of the protease, the type of the sample, the amount of the protein contained in the sample, and the like.
  • the sulfonic acid compound per sample for example, so as to be in the range of 0.01 to 10000 mo 1, more preferably 0.03 to 200 mol. It is in the range of mo 1, particularly preferably in the range of 0.05 to 40 mo 1.
  • the above-mentioned sulfonic acid compound in the range of 0.05 to 20 ⁇ 1 and the two-mouthed compound 0.005 to 2 It is preferable to add in the range of 5 ⁇ 1, more preferably in the range of 0.02 to 4 mol of the sulfonic acid compound and in the range of 0.01 to 5 mol of the nitro compound.
  • the conditions for the protease treatment are not particularly limited. It is preferable to set according to the optimal conditions of the enzyme to be used.
  • the temperature is in the range of 10 to 37
  • the treatment time is in the range of 30 seconds to 60 minutes, and preferably the temperature is in the range of 20 to 37.
  • the processing time is in a range of 30 seconds to 10 minutes, more preferably in a temperature range of 25 to 37, and a processing time is in a range of 30 seconds to 5 minutes.
  • the method for measuring a glycated protein of the present invention comprises subjecting a sample containing glycated protein to protease treatment to decompose the glycated protein, and saccharifying the resulting glycated protein degradation product.
  • a method for measuring the amount of the glycated protein by reacting the moiety with fructosyl amino acid oxidase and measuring the redox reaction, wherein the protease treatment is performed in the presence of a sulfonic acid compound. Is performed.
  • the amount of the sulfonic acid compound to be added is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type and amount of the protease, the type of the sample, the amount of saccharified protein contained in the sample, and the like. .
  • the sulfonic acid compound per sample IL for example, so as to be in a range of 0.01 to 1 000 mo 1, more preferably in a range of 0.03 to 200 It is in the range of mol, particularly preferably in the range of 0.05 to 40 mol.
  • the sulfonic acid compound is in the range of 0.005 to 20 mo1
  • the double-mouthed compound is 0.005 to 25 mo. It is preferable to add in the range of l, more preferably in the range of 0.02 to 4 mol of the sulfonic acid compound and in the range of 0.01 to 5 mol of the nitro compound.
  • the sample is not particularly limited, but may be whole blood.
  • blood samples such as blood plasma, serum, blood cells, and the like
  • biological samples such as urine, cerebrospinal fluid, and saliva
  • drinking water such as juice, foods such as soy sauce, sauces, and the like
  • a blood sample such as whole blood and a blood cell sample are preferable.
  • glycated proteins degraded by proteases include glycated hemoglobin and glycated albumin, among which glycated hemoglobin is preferable.
  • protease treatment can be performed in 20 seconds to 2 hours, and glycated hemoglobin can be measured quickly.
  • the measurement of the redox reaction is a measurement of the amount of hydrogen peroxide generated by a reaction between the saccharified portion of the saccharified protein and FAOD.
  • the amount of hydrogen peroxide is determined by, for example, reducing the generated hydrogen peroxide by an oxidizing enzyme such as POD and oxidizing a substrate that develops color by oxidation (hereinafter, referred to as a “chromogenic substrate”).
  • the chromogenic substrate is preferably determined by measuring the degree of color development of the substrate.
  • the chromogenic substrate is not particularly limited, and for example, the following chromogenic substrates can be used. These chromogenic substrates usually have an absorption above 400 nm, but sulfonic acid compounds and nitro compounds as described above generally have no absorption above 400 nm. Chromogenic substrate This is because there is no risk of measurement error if used together.
  • the chromogenic substrate include, for example, N- (carbo'xymethylaminocarbo'diyl) -4,4, -bis (dimethylamino) diphenylamine (hereinafter referred to as "DA -64 "), a combination of the Tinder reagent and 4-aminoantipyrine, ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ ', ⁇ , ', ⁇ ' ', -hexa (3-sulfoff.mouth pill) -4.
  • DA -64 N- (carbo'xymethylaminocarbo'diyl) -4,4, -bis (dimethylamino) diphenylamine
  • ⁇ -PSJ 4,, 4 '' -Triaminotriphenylmethane hexasodium salt
  • D-pill) -4, 4 ', 4' '-triaminotriphenylmethane oxaxotedium salt hereinafter referred to as ⁇ -OS J
  • 10- (carbo'xymethylaminocarbo) 'Nil) 3,7-bis (s-methylamino) phenothiazine sodium salt hereinafter referred to as “DA-67”
  • 10- (methylaminoaminophosphonyl) 3,7-bi (Ci-methylamino) phenothiazine hereinafter referred to as "MCDP”
  • MCDP 10- (Carpho'xyaminomethyl-4-hexaaminocarbophenyl) 3,7-bis (methylamino) phenyl Sodium salt
  • bandit a triaminotriphenylmethane-based chromogenic substrate is preferable.
  • the above-mentioned Tinder reagent examples include phenol, a phenol derivative, an aniline derivative, naphthol, a naphthol derivative, naphthylamine, and a naphthylamine derivative.
  • the compound to be combined with the above-mentioned Trinder reagent include, in addition to the above-mentioned 4-aminoantipyrine, an aminoantipyrine derivative, vanillindiaminesulfonic acid, methylpentizthiazolinone hydrazone (MBTH), sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone. (SMBTH) can also be used.
  • the FAOD is preferably a FAOD that catalyzes a reaction represented by the following formula (1).
  • R 1 represents a hydroxyl group or a residue (sugar residue) derived from a sugar before the saccharification reaction.
  • the sugar residue (R 1 ) is an aldose residue when the sugar before reaction is aldose, and is a ketose residue when the sugar before reaction is ketoose.
  • the sugar residue (R 1 ) is a glucose residue (aldose residue) It becomes. This sugar residue (R 1 )
  • n is an integer of 0-6.
  • R 2 is not particularly limited.
  • the case where the ⁇ -amino group is saccharified and the case where the other amino group is saccharified Is different.
  • R 2 is an amino acid residue or a peptide residue represented by the following formula (2).
  • R 3 represents an amino acid side chain group.
  • R 4 represents a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (3), for example.
  • ⁇ is an integer of 0 or more, and R 3 represents an amino acid side chain group as described above.
  • R 2 when an amino group other than the ⁇ -amino group is saccharified (the amino acid side chain group is saccharified), R 2 can be represented by the following formula (4).
  • R 5 represents a portion of the amino acid side chain group other than the glycated amino group. For example, if the glycated amino acid is lysine, R 5
  • R 5 is
  • R 6 is hydrogen, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (5), for example.
  • n is an integer of 0 or more, and R 3 represents an amino acid side chain group as described above. (CO—CHR 3 _NH) n —H... (5)
  • R 7 is a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue.
  • n is an integer of 0 or more, and R 3 represents an amino acid side chain group as described above. -(NH—CHR 3 —CO) n _ ⁇ H... (6)
  • the method for measuring a glycated protein of the present invention will be described with reference to specific examples. Not done.
  • the method for measuring a glycated protein of the present invention will be described with reference to an example in which the measurement target is glycated protein in blood cells.
  • whole blood is directly lysed, or a blood cell fraction is separated from whole blood by a conventional method such as centrifugation and lysed to prepare a hemolyzed sample.
  • the hemolysis method is not particularly limited.
  • a method using a surfactant, a method using ultrasonic waves, a method using a difference in osmotic pressure, and the like can be used.
  • a method using the surfactant is preferable. preferable.
  • the hemolytic surfactant is not particularly limited. Lioxyethylene-pt-t-octylphenyl I-ter (Triton-based surfactant, etc.), polyoxyethylene sorbitan alkyl ester (Tween-based surfactant, etc.), e.
  • Non-ionic surfactants such as virgin xylene ethylene-n (Brij-based surfactants and the like) can be used, and specifically, for example, trade name Trito nX—100, trade name Tween—2 0, trade name B rij 35, etc.
  • the treatment conditions with the surfactant are usually such that when the blood cell concentration in the treatment solution is 1 to 10% by volume, the surfactant is used so that the concentration in the treatment solution is 0.1 to 1% by weight. Add the agent and stir at room temperature for about 5 seconds to 1 minute.
  • hemolysis can be performed by adding 2 to 100 times the volume of purified water to the volume of whole blood. Next, the hemolyzed sample was subjected to the treatment in the presence of the sulfonic acid compound.
  • the saccharified protein is degraded by treating it with a protease, and a saccharified protein decomposed product is prepared. Treating glycated proteins with proteases in this way is because FAOD used in subsequent processing is unlikely to act on protein and long polypeptide chains as described above, and these are degraded to form glycated parts. This is for ease of use.
  • the protease treatment is performed in the presence of a sulfonic acid compound, glycated proteins can be degraded in a short time and with high degradation efficiency.Thus, even if the protease treatment time is short, FAOD sufficiently acts on the glycated portion. it can. Since the decomposition can be further promoted, the treatment may be carried out in the presence of a sulfonic acid compound and a nitrile compound, as described later.
  • the protease treatment is usually performed in a buffer.
  • the type of the buffer is not particularly limited, and includes, for example, Tris-HCl buffer, EPPS buffer, PIPES buffer, phosphate buffer, ADA buffer, citrate buffer, acetate buffer, glycine amide buffer, A CHES buffer or the like can be used, and its pH is preferably in the range of pH 5 to 12, more preferably in the range of 6 to 10, and particularly preferably in the range of 7 to 9.
  • protease for example, protease, subtilisin, trypsin, aminopeptidase and the like can be used.
  • the protease is added in an amount of 0.1 to: L 00 g / L. Is preferably added, more preferably in the range of 0.3 to 50 gZL, and particularly preferably in the range of 0.5 to 20 gZL.
  • the protease is, for example, a protease that selectively degrades glycated hemoglobin, and the protease is bromelain, papain, trypsin derived from pig kidney, Meta-mouth proteinase, Bacillus subtillis
  • the protease is derived from a protease.
  • the protease may be added at a rate of 0.1 to 50 g / L.
  • the protease is a meta-oral proteinase
  • it is preferably added to a pretreatment solution having a blood cell concentration of 0.3 to 5% by volume so as to be in a range of 0.1 to 30 g / L
  • It is more preferably in the range of 0.3 to 20 g / L, particularly preferably in the range of 1 to L 0 gZL.
  • the addition ratio of the sulfonic acid compound is, for example, when the blood cell concentration in the protease-treated solution is 1% by volume, it is preferable to add the sulfonic acid compound so that the concentration is in the range of 0.001 to 100 mmol ZL, more preferably It is in the range of 0.0003 to 60 mmo 1 ZL, particularly preferably in the range of 0.001 to 30 mmo 1 ZL.
  • the concentration is 0 :!
  • the sulfonic acid compound may be used as it is, but is preferably used as a solution of the sulfonic acid compound compound dissolved in a solvent, from the viewpoint of simplicity of operation and processing efficiency.
  • concentration of the solution can be appropriately determined depending on the type of the sulfonic acid compound and the like, and is, for example, in the range of 1 to 100 Ommo 1 ZL.
  • the solvent for example, distilled water, physiological saline, a buffer, or the like can be used.
  • the buffer for example, the above-mentioned buffer or the like can be used.
  • the sulfonic acid compound may be used alone or in combination of two or more.
  • the conditions for the protease treatment in the presence of the sulfonic acid compound are not particularly limited, but are, for example, a temperature in a range of 10 to 37, a treatment time in a range of 30 seconds to 60 minutes, and preferably a temperature of 20 to 60.
  • the range is 37T :
  • the processing time is 30 seconds to 10 minutes, more preferably the temperature is 25 to 37 ° C, and the processing time is 30 seconds to 5 minutes.
  • the degradation of the glycated protein in the sample can be promoted, so that a degraded product of the glycated protein can be obtained in a short time and with excellent degradation efficiency.
  • the decomposition by the protease can be further promoted.
  • the addition ratio of the nitro compound is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the amount of the sulfone compound added, the amount of the protease, and the like.
  • the blood cell concentration in the protease-treated solution is 1% by volume.
  • it is preferable to add so that the concentration is in the range of 0.01 to 25 mmo 1 ZL, and more preferably, it is in the range of 0.05 to: L 0 mm 01.
  • the degradation product obtained by the protease treatment is treated with the FAOD. This FA ⁇ D treatment catalyzes the reaction represented by the above formula (1).
  • This FAOD treatment is preferably performed in a buffer solution as in the protease treatment.
  • the treatment conditions are appropriately determined depending on the type of FAOD used, the type of glycated protein to be measured, its concentration, etc. Specifically, for example, the FAOD concentration in the reaction solution is 50 to 50,000 U ZL, blood cell concentration in reaction solution 0.0 1-1% by volume, reaction temperature 15-37 The reaction time ranges from 1 to 60 minutes and the pH ranges from 6 to 9.
  • the type of the buffer is not particularly limited, and the same buffer as used in the protease treatment can be used.
  • POD and the above-described color-developing substrate are added to the hydrogen peroxide generated by the FAOD treatment, and a color-developing reaction of the substrate is performed, and the degree of color development is measured.
  • POD acts on the hydrogen peroxide
  • the hydrogen peroxide is reduced, and the chromogenic substrate is oxidized to form a color. Since there is a correlation between the degree of coloring of the substrate colored by the oxidation and the amount of generated hydrogen peroxide, the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the degree of coloring.
  • the above-mentioned substrates can be used, and particularly preferred is sodium N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine.
  • the color reaction is usually performed in a buffer, and the conditions are appropriately determined depending on the concentration of the generated hydrogen peroxide and the like.
  • the POD concentration in the reaction solution is 10 to 20, 00 I UZL
  • the chromogenic substrate concentration is 0.001 to: L mmo 11
  • the reaction temperature is 20 to 37
  • the reaction time is 1 to 5.
  • Min pH 6-9.
  • the buffer is not particularly limited, and for example, the same buffer as used in the protease treatment and the FAD treatment can be used.
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the degree of coloring (absorbance) of the reaction solution with a spectrophotometer. Then, the amount of glycated protein in the sample can be determined by using the hydrogen peroxide concentration and the calibration curve and the like.
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by, for example, an electrical method in addition to the enzymatic method using the POD or the like. According to such a measurement method of the present invention, measurement can be performed quickly as described above. In addition, in the conventional method, if the protease treatment is performed in a short time, the measurement accuracy may be reduced. However, according to the measurement method of the present invention, the measurement can be performed with excellent accuracy even in a short time.
  • glycated hemoglobin was treated with protease in the presence of a sulfonic acid compound, and the degree of saccharification of the degradation product was measured using the chromogenic substrate TPM-PS.
  • TPM-PS chromogenic substrate
  • the hemoglobin freeze-dried product is dissolved in purified water, and a hemoglobin solution (HbAl Low) with a hemoglobin concentration of 50 g ZL and an HbAlc concentration of 6.5%, and a hemoglobin concentration of 50 gZL and a hemoglobin concentration of HbAlc concentration of 11.5%
  • a solution HbA lc: High
  • 60 L of each of these hemoglobin solutions and 240 L of purified water were mixed, and a sample having an HbAlc concentration of 6.5% (hereinafter referred to as “sample Low”) and a sample having an HbAlc concentration of 11.5% (hereinafter referred to as “sample Low”) were prepared.
  • Sample Hi ghj a sample having an HbAlc concentration of 11.5%
  • Sulfonic acid compound 6.4 mM surfactant (e. Polyoxydiethylene (9) to 'te' silyl-ter) 1.85 g / L CHES- CHESNa buffer (pH9.4) 40 mM MOPS-MOPSNa buffer (pH9.4) 15 mM
  • surfactant e. Polyoxydiethylene (9) to 'te' silyl-ter
  • 1.85 g / L CHES- CHESNa buffer pH9.4
  • MOPS-MOPSNa buffer pH9.4
  • MOPS- MOPSNa buffer (pH 6.5) 1.0 mM
  • the measurement was performed for each of the sample L 0 w and the sample High. First, after adding 8.26 ⁇ L of the first reagent to 0.14 L of the measurement sample, the second reagent 75.6 was further mixed and left at 37 for 5 minutes. Then, 18.9 L of the third reagent was mixed with the mixed solution, and the mixture was incubated at 37 to perform a color reaction. Then, 2.5 minutes after the addition of the third reagent, the absorbance of the reaction solution was measured with a trade name of JCA-BM8 (manufactured by JEOL Ltd.). The measurement wavelength was 571 nm for the main wavelength and 805 nm for the sub wavelength.
  • the absorbance was measured in the same manner as in the above example except that the sulfonic acid compound as the first reagent was not added.
  • the 1 ⁇ m sample at the time when the first and second reagents were mixed with the sample The amount of the sulfonic acid compound added to L was 0.378 mol.
  • the promotion of the decomposition facilitated the action of FAOD on more saccharified moieties than in the comparative example, thus improving the measurement accuracy.
  • the difference between the absorbance of the sample High and the absorbance of the sample Low was higher than that of the comparative example.
  • the sample High has a higher HbAlc concentration than the sample Low even at the same hemoglobin concentration.
  • the absorbance of Sample High is theoretically larger than the absorbance of Sample Low in proportion to the HbAlc concentration.
  • the protease treatment was performed in the absence of the sulfonic acid compound, and glycated hemoglobin was not easily decomposed.Therefore, the difference in absorbance between Sample High and Sample Low was observed despite the difference in HbAlc concentration of the sample. 7. ImAbs and low value .
  • the absorbance difference between the sample High and the sample Low increased about two to three times as compared with the comparative example. From this, it can be said that the measurement sensitivity and the measurement accuracy were improved by the method of the embodiment for the same reason as described above.
  • glycated hemoglobin was treated with a protease in the presence of a sulfonic acid compound, and the degree of saccharification of the degradation product was measured using a chromogenic substrate DA-64.
  • the following shows the samples, reagents and methods used.
  • Sulfonic acid compound Sulfonic acid compound (SLS: manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) 6.4 mM surfactant (e. Polyoxyethylene (9) Y 1 sil ether). 85 g / L CHES-CHES ⁇ Na buffer (pH 9.4) 40 mM MOPS-MOPSNa buffer (pH 9.4) 15 mM
  • 2,4-DNA manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • p-NA manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • P- NP manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 4-DNH manufactured by Wako Pure Chemical Industries Ltd.
  • Tris-HC1 buffer (PH7.0) 300 mM (method)
  • the measurement was performed for each of the sample Low and the sample High prepared in Example 1 above. After adding 8.26 L of the first reagent to the measurement sample 0.1, the second reagent 75.6 was further mixed and left at 37X for 5 minutes. Then, the third reagent 18 was mixed with this mixed solution, and incubated at 37 to perform a color reaction. After 5 minutes, the absorbance was measured using a trade name of JCA-BM8 (manufactured by JEOL Ltd.). The measurement wavelength was a main wavelength of 751 nm and a sub wavelength of 805 nm.
  • Sulfonic acid compound G compound Sample High sample Low High-Low (mM) (mM) _ (mAbs) (mAbs) (mAbs)
  • Example 2 As shown in Table 2 above, according to Example 2, as in Example 1, the absorbance of Sample High and the absorbance of Sample Low were higher than those of Comparative Example, respectively. was gotten. Also, the difference between the absorbance of Sample High and the absorbance of Sample Low was higher than that of Comparative Example 2. From the above, similarly to Example 1, the degradation of glycated hemoglobin was promoted by the protease treatment in the presence of the sulfonic acid compound and the nitro compound, whereby the measurement was performed. It can be said that the constant sensitivity and the measurement accuracy have been improved. Industrial potential
  • protein protein and the like can be decomposed in a short time by performing protease treatment in the presence of the sulfonic acid compound, so that glycated protein and the like can be quickly measured. It is possible. For this reason, more accurate measurement can be realized at any time, and the measurement method of the present invention is useful for various tests in clinical medicine and the like as described above.

Abstract

試料中の糖化タンパク質を酸化還元反応を用いて測定する方法であって、信頼性に優れる測定値が得られる測定方法を提供する。糖化タンパク質を含む試料をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理することによって、前記糖化タンパク質を分解し、得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとを反応させ、この酸化還元反応を測定することによって、前記糖化タンパク質の量を測定する。スルホン酸化合物としては、ラウリル硫酸ナトリウムが使用できる。

Description

明 細 書 スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法 技術分野
本発明は、 タンパク質を分解する方法、 および試料中の糖化タンパク 質をプロテアーゼで処理し、 前記糖化タンパク質の量を酸化還元反応を 用いて測定する方法に関する。 背景技術
従来から、 試料中の目的のタンパク質 （ペプチドを含む） を検出した り、 測定に影響を与えるタンパク質の機能を失活させるために、 前記夕 ンパク質をプロテア一ゼで分解する方法が、 各種測定方法等において適 用されている。
例えば、 糖尿病診断や治療等における重要な指標となる血球中の糖化 夕ンパク質、 特に生体血糖値の過去の履歴を反映している赤血球中の糖 化ヘモグロビンを、 酵素法により測定することが現在試みられており、 その際にも糖化タンパク質をプロテアーゼ分解する方法が適用されてい る。 前記酵素法では、 溶血試料中の糖化タンパク質の糖化部分にフルク トシルアミノ酸ォキシダーゼ （以下、 「F A〇D」 という） を作用させ 、 過酸化水素を発生させる。 この過酸化水素量は、 前記糖化タンパク質 量に対応する。 そして、 この F A O D処理後の前記試料に、 ペルォキシ ダ一ゼ （以下、 「P O D」 という） および酸化により発色する基質を添 加し、 前記 P O Dを触媒として前記過酸化水素と前記基質との間で酸化 還元反応させる。 この時、 前記基質が、 酸化によって発色するため、 そ の発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき、 この結果、 試料中の 糖化タンパク質量を知ることができる。
しかし、 前記糖化部分に作用させる F A O Dは、 糖化タンパク質や糖 化ペプチドよりも、 糖化アミノ酸や、 より短いペプチド断片に作用し易 レ^ そこで、 予め、 糖化タンパク質や糖化ペプチドをプロテア一ゼで分 解し、 F A O Dを糖化部分に作用し易くすることによって、 測定精度の 向上を図っている。
しかしながら、 プロテア一ゼは基質特異性を有し、 処理する基質によ つて分解活性が異なるため、 目的のタンパク質の種類によっては、 分解 に長時間を要し、 測定を迅速に行うことができないという問題がある。 さらに、 前記糖化タンパク質のように、 目的のタンパク質が糖化されて いる場合は、 その立体障害等が原因となり分解し難い場合もある。 この ような理由から、 例えば、 前述のような糖化タンパク質の測定において も、 予め行うプロテアーゼ処理のために、 測定全体に時間がかかってし まう。 このため、 臨床検査等の分野における利用の点からも、 前記糖化 タンパク質の測定をより迅速に行える方法が求められている。 発明の開示
そこで、 本発明の目的は、 迅速かつ優れた効率で、 タンパク質を分解 するタンパク質分解物の製造方法、 さらに試料中の糖化タンパク質を分 解し、 前記糖化タンパク質量を測定する方法の提供である。 前記目的を達成するために、 本発明のタンパク質分解物の製造方法は 、 夕ンパク質をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理す ることを特徴とする。 なお、 本発明において 「タンパク質」 とは、 ぺプ チドも含み、 また、 「タンパク質分解物」 とは、 前記ペプチドの分解物 を含む。 このように、 プロテアーゼ処理をスルホン酸化合物の存在下で行えば 、 試料中のタンパク質の分解を迅速に行うことができる。 つぎに、 本発明の本発明の糖化タンパク質の測定方法は、 糖化タンパ ク質を含む試料をプロテアーゼ処理することによって、 前記糖化タンパ ク質を分解し、 得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分と F A O Dと を反応させ、 この酸化還元反応を測定することによって、 前記糖化タン パク質の量を測定する糖化タンパク質の測定方法であって、 スルホン酸 化合物の存在下で前記プロテアーゼ処理を行うことを特徴とする。 なお 、 本発明において、 「糖化タンパク質」 とは、 糖化ペプチドも含む。 従来のスルホン酸化合物の非存在下での方法においては、 プロテア一 ゼによって糖化夕ンパク質を十分に分解し、 F A O Dを糖化部分に作用 し易くするためには、 例えば、 約 6〜4 0時間もの間、 プロテアーゼ処 理する必要があった。 このため、 前記酵素法により糖化タンパク質を測 定するには、 長時間を要し、 有用な方法とは言い難かった。 しかし、 本 発明の測定方法によれば、 短時間で糖化タンパク質等を分解できるため 、 迅速に糖化タンパク質等の測定を行うことが可能である。 本発明の測 定方法によれば、 例えば、 スルホン酸化合物を添加する以外は同じ条件 で測定を行った場合、 前記スルホン酸化合物の非存在下の場合に比べて 、 約 1 0〜 2 0 0 0倍の範囲で測定時間を短縮できる。 このため、 本発 明の測定方法は、 よりいつそう迅速であり、 かつ高精度な測定を実現で きるため、 前述のような臨床医療等における各種検査に有用である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のタンパク質分解物の製造方法および糖化タンパク質の測定方 法において、 前記スルホン酸化合物としては、 例えば、 一般式 R— S〇3X
で表わされる化合物が使用できる。 前記式において、 Xは、 例えば、 N a、 K、 L i 、 H等であり、 Rは、 疎水基であることが好ましく、 例え ば、 CH3(CH2)n- 、 CH3(CH2)n-C6H4 - 、 C6H5 - 、 C6H5-N=N-C6H4- 、 C6H5-CH=C H- C6H4 - 等があげられる。 前記 Rにおける nは、 例えば、 1〜 2 0の範 囲である。 なお、 前記 Rにおいて、 「H」は、 ァシル基、 ニトロ基、 ニト ロソ基、 フエニル基、 アルキル基、 アルキルエーテル基等で置換されて ちょい。
前記スルホン酸化合物の具体例としては、 例えば、 ラウリル硫酸ナト リウム （以下、 「SLS」 という） 、 ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ ゥム （以下、 「SDBS」 という） 、 ラウリル硫酸リチウム （以下、 「LiLS 」 という） 、 4-アミノアゾベンゼン— 4' -スルホン酸ナトリウム （以下 、 「ABSA」 という） 、 4-ァミノ- 4' -ニトロスチルベン- 2, 2' -ジスルホ ン酸 2ナトリウム （以下、 「ANDS」 という） 、 4, 4' -ジァゾスチルペン ゼン -2, 2' -ジスルホン酸 2ナトリウム （以下、 「DADS」 という） 、 N- シクロへキシル -2-アミノエタンスルホン酸、 N-シクロへキシル -3-アミ ノプロパンスルホン酸、 N-シクロへキシル -2-ハイ ドロキシ -3-アミノプ 口パンスルホン酸、 ピぺラジン- 1，4-ビス （2-エタンスルホン酸） 、 )~% ソフエナント口リンスルホン酸等が使用でき、 より好ましくは、 SLS、 S DBS, LiLSである。
これらのスルホン酸化合物は、 一般的に溶解性に優れるため、 試料中 の糖化タンパク質の濃度が高濃度であっても処理が容易であり、 また、 コストの面でも低価格であるため、 非常に有用である。 また、 本発明の製造方法および測定方法においては、 糖化タンパク質 の分解がより一層促進できることから、 スルホン酸化合物および二ト口 化合物の共存下でプロテアーゼ処理を行うことが好ましい。
前記ニトロ化合物としては、 特に制限されないが、 例えば、 ニトロべ ンゼン化合物ゃジニトロベンゼン化合物等があげられる。 これらの化合 物は、 ベンゼン環がニトロ基の他に、 例えば、 _ NH2、 -0H、 -C00H、 - SO 3、 - (CH2 ) n CH3 ( n = 2〜 9 ) 等の置換基を有することが好まし。 前記 置換基としては、 例えば、 ハロゲン基、 エーテル基、 フエニル基などが あげられる。
前記ニトロ化合物の具体例としては、 例えば、 2, 4-ジニトロフエノー ル （2 , 4-DNP) 、 2, 5-ジニトロフエニル、 2, 6-ジニトロフエニル、 4, 6- ジニトロ- 2-メチルフエノール、 2-ァミノ- 4-ニトロフエノール、 2-アミ ノ- 5 -二トロフエノール、 2-ァミノ- 4-ニトロフエノール、 p—ニトロフ ェノール （P- NP) 、 2， 4-ジニトロア二リン （2, 4- DNA) 、 p -二トロア二 リン （P-NA) 、 亜硝酸ナトリウム （NaN02 ) 、 亜硝酸カリウム （KN02 ) 、 4 -ァミノ- 4' -ニトロスチルへ'ン- 2， 2 ' -シ'スルホン酸 2ナトリウム (以下、 「ANPS」 と いう） 、 ニトロベンゼン等が使用できる。 このようにスルホン酸化合物 とニト口化合物とを共存させる場合、 これらの組み合わせは特に制限さ れない。 本発明の製造方法および測定方法において、 前記プロテアーゼは、 特 に制限されないが、 例えば、 セリンプロテアーゼ、 チオールプロテア一 ゼ、 メタ口プロテア一ゼ等が使用でき、 具体的には、 トリプシン、 プロ テナーゼ K：、 キモ卜リプシン、 パパイン、 ブロメライン、 ズブチリシン 、 エラス夕ーゼ、 アミノぺプチダーゼ等が好ましい。 また、 前記分解す る糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、 前記プロテアーゼは、 前 記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテア一ゼであり、 プロメラ イン、 パパイン、 ブタ塍臓由来トリプシン、 メタ口プロティナーゼ、 cillus subtil 1 is由来のプロテアーゼ等が好ましい。 前記 Bacillus sub tills由来プロテア一ゼとしては、 商品名プロテアーゼ N (例えば、 フ ルカ社製） 、 商品名プロテア一ゼ N「ァマノ」 （天野製薬社製） 等があげ られる。 前記メタ口プロティナ一ゼとしては、 Bacillus属由来メタロブ 口ティナ一ゼ （E C 3. 4. 24. 4) 等があげられる。 これらの中で もより好ましくはメタ口プロティナーゼ、 ブロメライン、 パパインであ り、 特に好ましくはメタ口プロティナ一ゼである。 このように、 選択的 に分解するプロテアーゼを使用すれば、 特定の糖化タンパク質の分解物 を選択的に調製できる。 前述のように、 本発明のタンパク質分解物の製造方法は、 タンパク質 をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理することを特徴 とする方法である。
前記スルホン酸化合物の添加量は、 特に制限されず、 例えば、 プロテ ァ一ゼの種類および添加量、 試料の種類、 前記試料に含まれるタンパク 質の量等によって適宜決定できる。
具体例としては、 試料 当たり、 例えば、 前記スルホン酸化合物 を、 0. 0 1〜 1 0 00 mo 1の範囲になるように添加することが好 ましく、 より好ましくは 0. 0 3〜 20 0 mo 1の範囲、 特に好まし くは、 0. 05〜 40 m o 1の範囲である。
また、 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を共存させる場合は、 試 料 1 1当たり、 例えば、 前記スルホン酸化合物 0. 0 0 5〜2 0 ΓΠ ο 1の範囲、 二ト口化合物 0. 00 5〜 2 5 ΓΠ Ο 1の範囲で添加する ことが好ましく、 より好ましくはスルホン酸化合物 0. 02〜4 mo 1の範囲、 ニトロ化合物 0. 0 1〜 5 m o 1の範囲である。
前記プロテアーゼ処理の条件は、 特に制限されないが、 例えば、 使用 する酵素の至適条件に従って設定することが好ましい。 前記プロテア一 ゼがメタ口プロティナーゼの場合には、 例えば、 温度 1 0〜3 7 の範 囲、 処理時間 30秒〜 6 0分の範囲であり、 好ましくは、 温度 2 0〜3 7 の範囲、 処理時間 3 0秒〜 1 0分の範囲であり、 より好ましくは、 温度 2 5〜 3 7での範囲、 処理時間 30秒〜 5分の範囲である。 つぎに、 本発明の糖化タンパク質の測定方法は、 前述のように、 糖化 夕ンパク質を含む試料をプロテア一ゼ処理することによって、 前記糖化 タンパク質を分解し、 得られた糖化タンパク質分解物の糖化部分とフル ク トシルアミノ酸ォキシダーゼとを反応させ、 この酸化還元反応を測定 することによって、 前記糖化タンパク質の量を測定する糖化タンパク質 の測定方法であって、 スルホン酸化合物の存在下で前記プロテアーゼ処 理を行うことを特徴とする方法である。
本発明の測定方法において、 前記スルホン酸化合物の添加量は、 特に 制限されず、 例えば、 プロテアーゼの種類および添加量、 試料の種類、 前記試料に含まれる糖化夕ンパク質の量等によって適宜決定できる。 具体例としては、 試料 I L当たり、 例えば、 前記スルホン酸化合物 を、 0. 0 1〜 1 000 m o 1の範囲になるように添加することが好 ましく、 より好ましくは 0. 0 3〜20 0 mo lの範囲、 特に好まし くは、 0. 0 5〜 40 m o 1の範囲である。
また、 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を共存させる場合は、 試 料 1 1当たり、 例えば、 前記スルホン酸化合物 0. 0 0 5〜20 m o 1の範囲、 二ト口化合物 0. 00 5~2 5 mo lの範囲で添加する ことが好ましく、 より好ましくはスルホン酸化合物 0. 02〜4 mo 1の範囲、 ニトロ化合物 0. 0 1〜 5 mo 1の範囲である。
本発明の測定方法において、 前記試料は、 特に制限されないが、 全血 、 血漿、 血清、 血球等の血液試料の他に、 例えば、 尿、 髄液、 唾液等の 生体試料や、 ジュース等の飲料水、 醤油、 ソース等の食品類等もあげら れる。 この中でも好ましくは、 全血等の血液試料や血球試料である。 本発明における測定対象物、 すなわちプロテアーゼで分解する糖化夕 ンパク質としては、 例えば、 糖化ヘモグロビン、 糖化アルブミン等があ げられ、 この中でも好ましくは糖化ヘモグロビンである。 血液中のへモ グロビンは、 その濃度が約 6 0〜 2 0 0 g Z Lと高く、 また、 分解が困 難であったため、 プロテアーゼ処理に数時間〜数日かかっていたが、 本 発明の測定方法によれば、 例えば、 2 0秒〜 2時間でのプロテアーゼ処 理が可能になり、 糖化ヘモグロビンの測定を迅速に行うことができる。 また、 本発明の測定方法においては、 スルホン酸化合物だけでなく、 糖化タンパク質の分解がより一層促進できることから、 スルホン酸化合 物および二トロ化合物の共存下において、 プロテア一ゼ処理することが 好ましい。 本発明の測定方法において、 前記酸化還元反応の測定は、 前記糖化夕 ンパク質の糖化部分と F A O Dとの反応によって発生した過酸化水素の 量の測定であることが好ましい。 そして、 この過酸化水素量は、 例えば 、 P O D等の酸化酵素によって、 発生した前記過酸化水素を還元し、 か つ、 酸化により発色する基質 （以下、 「発色基質」 という） を酸化させ 、 前記基質の発色程度を測定することによって、 求めることが好ましい 前記発色基質としては、 特に制限されないが、 例えば、 以下に示すよ うな発色基質が使用できる。 これらの発色基質は、 通常、 4 0 0 n m以 上に吸収を持つが、 前述のようなスルホン酸化合物やニトロ化合物は、 一般的に 4 0 0 n m以上に吸収を持たないため、 このような発色基質と 共に使用しても、 測定に誤差が生じるおそれがないためである。
前記発色基質の具体例としては、 例えば、 N -（カルホ'キシメチルァミノカルホ'二ル）- 4 ,4， -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウム （以下、 「DA-64」 という） 、 ト リ ンダー試薬と 4—ァミノアンチピリ ンとの組み合せ、 Ν,Ν,Ν' ,Ν' ，Ν， ' ,Ν' ' ，-へキサ（3-スルホフ。口ピル） -4, 4， ,4' ' -トリアミノトリフエニルメタン へキサソテ'ィゥム 塩 （以下、 ΓΤΡΜ-PSJ という） 、 Ν, Ν,Ν'，Ν',Ν'' ,Ν， ' -へキサ (2 -ヒドロキシ -3- スルホフ。 Dピル） -4， 4'、 4' ' -トリアミノトリフエニルメタン Λキサソテ'ィゥム塩 （以下、 ΓΤΡΜ-OS J という） 、 10- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'ニル） 3， 7-ビス（シ'メチルァミノ）フエノチアシ'ン ナトリ ゥム塩 （以下、 「DA-67」 という） 、 10- (メチルァミノカルホ'ニル） 3, 7-ビス（シ'メチルァミノ )フエノチアシ'ン (以下、 「MCDP」 という） 、 10- (カルホ'キシァミノメチル -4-へ'ンソ'ァミノカル ホ'ニル） 3, 7-ビス（シ'メチルァミノ）フ Iノチアシ'ンナトリウム塩 （以下、 「匪」 という） 等が あげられる。 これらの中でも、 例えば、 トリアミノ トリフエニルメタン 系の発色基質が好ましい。
前記トリ ンダー試薬としては、 例えば、 フエノール、 フエノール誘導 体、 ァニリン誘導体、 ナフ トール、 ナフ トール誘導体、 ナフチルァミン 、 ナフチルァミン誘導体等があげられる。 また、 前記トリンダー試薬と 組み合わせる化合物としては、 前記 4 _ァミノアンチピリンの他に、 例 えば、 ァミノアンチピリン誘導体、 バニリンジァミンスルホン酸、 メチ ルペンズチアゾリ ノンヒ ドラゾン （MB TH) 、 スルホン化メチルベン ズチアゾリノンヒ ドラゾン （SMBTH) 等も使用できる。 本発明において、 前記 FAODとしては、 下記式 （ 1 ) に示す反応を 触媒する FAODであることが好ましい。 R 1-CO- CH2-NH-R2 + H20 + O
→R 1 - C O - CHO + NH2 - R 2 + H202 ( 1 ) 前記式 （ 1 ) において、 R 1は、 水酸基もしくは糖化反応前の糖に由 来する残基 （糖残基） を示す。 前記糖残基 （R1) は、 反応前の糖がァ ルド一スの場合はアルド一ス残基であり、 反応前の糖がケト一スの場合 、 ケトース残基である。 例えば、 反応前の糖がグルコースの場合は、 ァ マドリ転位により、 反応後の構造はフルク トース構造をとるが、 この場 合、 糖残基 （R1) は、 グルコース残基 （アルドース残基） となる。 こ の糖残基 （R1) は、 例えば、
一 [CH (OH) ]n-CH2OH
で示すことができ、 nは、 0〜6の整数である。
前記式 （ 1 ) において、 R2は、 特に制限されないが、 例えば、 糖化 アミノ酸、 糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、 α—ァミノ基が 糖化されている場合と、 それ以外のァミノ基が糖化されている場合とで 異なる。
前記式 （ 1 ) において、 ひ —アミノ基が糖化されている場合、 R2は 、 下記式 （2) で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
— CHR3_CO— R4 . . . (2) 前記式 （2) において、 R3はアミノ酸側鎖基を示す。 また、 R4は水 酸基、 アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、 例えば、 下記式 （3) で示すことができる。 下記式 （3) において、 ηは、 0以上の整数であ り、 R3は、 前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。 一 (ΝΗ- CHR3-CO) n— OH . . . (3) また、 前記式 （ 1) において、 α—ァミノ基以外のァミノ基が糖化さ れている （アミノ酸側鎖基が糖化されている） 場合、 R2は下記式 （4 ) で示すことができる。 — R5— CH (ΝΗ- R6) -CO-R7 … （4) 前記式 （4) において、 R5は、 アミノ酸側鎖基のうち、 糖化された アミノ基以外の部分を示す。 例えば、 糖化されたアミノ酸がリジンの場 合、 R5は
-CH2-CH2-CH2-CH2- であり、
例えば、 糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、 R5は、
-CH2-CH2-CH2-NH-CH (題 2) - である。
また、 前記式 （4) において、 R6は、 水素、 アミノ酸残基またはべ プチド残基であり、 例えば、 下記式 （5) で示すことができる。 なお、 下記式 （ 5) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と同様 にアミノ酸側鎖基を示す。 一 (CO— CHR3_NH) n— H . . . (5) また、 前記式 （4) において、 R7は、 水酸基、 アミノ酸残基または ペプチド残基であり、 例えば、 下記式 （6) で示すことができる。 なお 、 下記式 （6) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と同 様にアミノ酸側鎖基を示す。 - (NH— CHR3— CO) n_〇H . . . (6) 以下に、 本発明の糖化タンパク質の測定方法について、 具体的な例を 上げて説明するが、 これらの実施形態には制限されない。
(実施形態 1)
本発明の糖化タンパク質の測定方法について、 測定対象物が血球中の 糖化夕ンパク質である例をあげて説明する。
まず、 全血をそのまま溶血し、 または全血から遠心分離等の常法によ り血球画分を分離してこれを溶血し、 溶血試料を調製する。 この溶血方 法は、 特に制限されず、 例えば、 界面活性剤を用いる方法、 超音波によ る方法、 浸透圧の差を利用する方法等が使用でき、 この中でも前記界面 活性剤を用いる方法が好ましい。
溶血用の界面活性剤としては、 特に制限されないが、 例えば、 ホ。リオキシ エチレン- p-t-才クチルフエニル I-テル (T r i t o n系界面活性剤等） 、 ホ°リ才キシエチレン ソルビタン アルキル エステル (Twe e n系界面活性剤等) 、 ホ。リ才キシエチレン アルキル ェ -n (B r i j系界面活性剤等） 等の非イオン性界面活性剤が使用でき 、 具体的には、 例えば、 商品名 T r i t o nX— 1 00、 商品名 Twe e n— 2 0、 商品名 B r i j 3 5等があげられる。 前記界面活性剤によ る処理条件は、 通常、 処理溶液中の血球濃度が 1〜 1 0体積％の場合、 前記処理溶液中の濃度が 0. 1〜 1重量％になるように前記界面活性剤 を添加し、 室温で 5秒〜 1分程度攪拌すればよい。
また、 前記浸透圧の差を利用する場合は、 例えば、 全血の体積に対し 2〜 1 00倍体積量の精製水を添加して溶血できる。 つぎに、 前記溶血試料を、 前記スルホン酸化合物の存在下で前記プロ テアーゼ処理することにより糖化夕ンパク質を分解し、 糖化夕ンパク質 分解物を調製する。 このように糖化タンパク質をプロテアーゼで処理す るのは、 前述のように後の処理に使用する FAODが夕ンパク質および 長いポリべプチド鎖に作用し難いため、 これらを分解して糖化部分に作 用し易くするためである。 前述のように、 スルホン酸化合物存在下でプ 口テアーゼ処理すれば、 短時間で、 かつ高い分解効率で糖化タンパク質 を分解できるため、 プロテアーゼ処理時間が短くても、 FAODは十分 に糖化部分に作用できる。 なお、 より分解を促進できることから、 後述 するように、 スルホン酸化合物および二ト口化合物の存在下で処理して もよい。
前記プロテア一ゼ処理は、 通常、 緩衝液中で行われる。 前記緩衝液の 種類は、 特に制限されず、 例えば、 トリス塩酸緩衝液、 E P P S緩衝液 、 P I P E S緩衝液、 リン酸緩衝液、 ADA緩衝液、 クェン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 グリシンアミ ド緩衝液、 CHE S緩衝液等が使用でき、 そ の pHは、 p H 5〜 1 2の範囲が好ましく、 より好ましくは 6〜 1 0の 範囲、 特に好ましくは 7〜 9の範囲である。
前記プロテアーゼは、 前述のように、 例えば、 プロテア一ゼ 、 ズブ チリシン、 トリプシン、 アミノぺプチダーゼ等が使用できる。 前記プロ テア一ゼの添加割合は、 例えば、 前処理溶液中の血球濃度が、 0. 1〜 10体積％の場合、 プロテア一ゼを 0. 1〜： L 00 g/Lの範囲になる ように添加することが好ましく、 より好ましくは 0. 3〜50 gZLの 範囲、 特に好ましくは 0. 5〜 20 gZLの範囲である。
また、 分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、 プロテア ーゼは、 前述のように、 例えば、 糖化ヘモグロビンを選択的に分解する プロテアーゼであり、 前記プロテアーゼが、 ブロメライン、 パパイン、 ブタ塍臓由来トリプシン、 メタ口プロティナ一ゼ、 Bacillus subtillis 由来のプロテア一ゼであることが好ましい。 これらのプロテア一ゼの添 加割合は、 例えば、 前処理溶液中の血球濃度が、 0. 1〜10体積％の 場合、 プロテア一ゼを 0. 1〜 50 g/Lの範囲になるように添加する ことが好ましく、 より好ましくは 0. 3〜30 gZLの範囲、 特に好ま しくは 1〜 20 gZLの範囲である。 具体的には、 プロテア一ゼがメタ 口プロティナーゼの場合、 血球濃度 0. 3〜 5体積％の前処理溶液に、 0. 1〜 30 g/Lの範囲になるように添加することが好ましく、 より 好ましくは 0. 3〜20 g/Lの範囲、 特に好ましくは 1〜： L 0 gZL の範囲である。
前記スルホン酸化合物の添加割合は、 例えば、 プロテアーゼ処理溶液 中の血球濃度が、 1体積％の場合、 濃度 0. 000 1〜100mmo l ZLの範囲になるように添加することが好ましく、 より好ましくは 0. 0003〜 60 mm o 1 ZLの範囲、 特に好ましくは 0. 00 1〜30 mmo 1 ZLの範囲である。 具体的には、 前記スルホン酸化合物が SLS であり、 プロテアーゼ処理溶液中の血球濃度が、 1体積％の場合、 濃度 0. ：！〜 100 mm o 1 ZLの範囲になるように添加することが好まし く、 より好ましくは 0. 2〜60 mmo 1 の範囲、 特に好ましくは 0. 5〜 30 mmo 1 ZLの範囲である。
前記スルホン酸化合物は、 そのまま使用してもよいが、 操作の簡便性 や処理効率等の点から、 溶媒に溶解したスルホン酸化合物化合物溶液と して使用することが好ましい。 前記溶液の濃度は、 スルホン酸化合物の 種類等により適宜決定でき、 例えば、 1〜 100 Ommo 1 ZLの範囲 である。 前記溶媒としては、 例えば、 蒸留水、 生理食塩水、 緩衝液等が 使用でき、 前記緩衝液としては、 例えば、 前述の緩衝液等が使用できる 。 なお、 前記スルホン酸化合物は、 一種類でもよいし、 二種類以上を併 用してもよい。 前記スルホン酸化合物存在下におけるプロテアーゼ処理の条件は、 特 に制限されないが、 例えば、 温度 1 0〜 3 7 :の範囲、 処理時間 30秒 〜60分の範囲であり、 好ましくは、 温度 2 0〜3 7T:の範囲、 処理時 間 30秒〜 1 0分の範囲であり、 より好ましくは、 温度 2 5〜 3 7°Cの 範囲、 処理時間 30秒〜 5分の範囲である。
このようにスルホン酸化合物存在下で試料のプロテアーゼ処理を行え ば、 試料中の糖化タンパク質の分解を促進できるため、 短時間で、 かつ 優れた分解効率で糖化タンパク質の分解物を得ることができる。
また、 このプロテアーゼ処理は、 前述のようにスルホン酸化合物だけ でなく、 スルホン酸化合物とニトロ化合物との共存下で行うことにより 、 さらにプロテアーゼによる分解を促進できる。
ニトロ化合物の添加割合は、 特に制限されず、 例えば、 スルホン酸化 合物の添加量、 プロテア一ゼ量等に応じて適宜決定できるが、 プロテア —ゼ処理溶液中の血球濃度が、 1体積％の場合、 例えば、 濃度 0. 0 1 〜2 5mmo 1 ZLの範囲になるように添加することが好ましく、 より 好ましくは 0. 0 5〜： L 0 mm 0 1 の範囲である。 つぎに、 前記プロテアーゼ処理により得られた分解物を、 前記 FAO Dで処理する。 この FA〇D処理により、 前記式 （ 1) に示す反応が触 媒される。
この FAOD処理は、 前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行う ことが好ましい。 その処理条件は、 使用する FAODの種類、 測定対象 物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される 具体的には、 例えば、 反応液中の FAOD濃度 5 0〜 50， 0 00 U ZL、 反応液中の血球濃度 0. 0 1〜 1体積％、 反応温度 1 5〜 37 、 反応時間 1〜 6 0分、 pH 6〜 9の範囲である。 前記緩衝液の種類も 特に制限されず、 前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。 つぎに、 前記 FAOD処理で生成した過酸化水素に、 PODおよび前 記発色基質を添加して、 前記基質の発色反応を行い、 その発色程度を測 定する。 前記過酸化水素に P ODを作用させれば、 過酸化水素は還元さ れ、 かつ前記発色性基質は酸化されて発色する。 前記酸化により発色し た基質の発色程度と生成した過酸化水素量との間には相関関係があるた め、 前記発色程度を測定することによって、 過酸化水素の量が測定でき るのである。
前記発色性基質としては、 前述のような基質が使用でき、 特に好まし くは、 N— (カルボキシメチルァミノカルボニル） — 4, 4 ' —ビス （ ジメチルァミノ） ジフエニルァミンナトリウムである。
前記発色反応は、 通常、 緩衝液中で行われ、 その条件は、 前記生成し た過酸化水素の濃度等により適宜決定される。 通常、 反応液中の POD 濃度 1 0〜2 0 , 0 0 0 I UZL、 発色性基質濃度 0. 0 0 1〜： L mm o 1 1、 反応温度 2 0〜 3 7 、 反応時間 1〜 5分、 pH 6〜 9であ る。 また、 前記緩衝液は、 特に制限されず、 例えば、 前記プロテアーゼ 処理および F AO D処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
前記発色反応において、 例えば、 前記発色基質を用いた場合、 前記反 応液の発色程度 （吸光度） を分光光度計で測定することにより、 過酸化 水素の量を測定できる。 そして、 この過酸化水素濃度と検量線等とを用 いて、 試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。
なお、 前記過酸化水素量は、 前記 POD等を用いた酵素的手法の他に 、 例えば、 電気的手法により測定することもできる。 このような本発明の測定方法によれば、 前述のように迅速に測定を行 うことができる。 また、 従来法では、 プロテア一ゼ処理を短時間にする と、 測定精度が低下するおそれがあつたが、 本発明の測定方法によれば 、 短時間でも優れた精度で測定できる。 実施例
つぎに、 実施例について比較例と併せて説明する。
(実施例 1、 比較例 1)
この実施例は、 スルホン酸化合物存在下で糖化ヘモグロビンをプロテ ァーゼ処理し、 その分解物の糖化程度を、 発色基質 TPM-PSを用いて測定 した例である。 以下に、 使用した試料、 試薬および方法を示す。 なお、 下記第 1試薬におけるスルホン酸化合物としては、 S L S (ナカライテスク社 製） を使用した。 (測定試料の調製）
ヘモグロビン凍結乾燥品を精製水で溶解し、 ヘモグロビン濃度 5 0 g ZL、 HbAlc濃度 6. 5 %のヘモグロビン溶液 （HbAl Low) と、 へモグ ロビン濃度 5 0 gZL、 HbAlc濃度 1 1. 5 %のヘモグロビン溶液 （HbA lc:High) とを調製した。 そして、 これらの各ヘモグロビン溶液 6 0 Lと精製水 240 Lとを混合して、 HbAlc濃度 6. 5 %の試料 （以下 、 「試料 Low」 という） と HbAlc濃度 1 1. 5 %の試料 （以下、 「試料 Hi ghj という） とした。
(第 1試薬）
スルホン酸化合物 6. 4mM 界面活性剤 （ホ。リオキシヱチレン（9)ト 'テ'シルヱ-テル） 1. 8 5 g/L CHES- CHES · Na緩衝液 (pH9.4) 40 mM MOPS-MOPS · Na緩衝液 (pH9.4) 1 5 mM
(第 2試薬）
メタ口プロテア一ゼ （アークレイ社製） 2. 0 MU/L C a C 1 2 2. 5 mM N a C 1 5 0 mM
MOPS- MOPS · Na緩衝液 (pH6.5) 1. 0 mM
(第 3試薬）
FAOD (アークレイ社製） 1 8 KU/L POD (キッコーマン社製） 6 7 KU/L TPM-PS (同仁化学社製) 0. 2 5 mM Tris-HCl緩衝液 (pH7.0) 3 0 0 mM
(方法）
前記試料 L 0 wおよび試料 H i ghのそれぞれについて測定を行った。 まず 、 前記測定試料 0. 1 4 Lに前記第 1試薬 8. 2 6 x Lを添加した後 、 さらに、 前記第 2試薬 7 5. 6 を混合して、 3 7 で 5分間放置 した。 そして、 この混合液に前記第 3試薬 1 8. 9 Lを混合し、 3 7 でインキュベートして発色反応を行った。 そして、 第 3試薬を添加し てから 2. 5分後における、 反応液の吸光度を商品名 J CA— BM8 ( 日本電子社製） で測定した。 測定波長は、 主波長 5 7 1 nm、 副波長 8 0 5 nmとした。 一方、 比較例としては、 第 1試薬のスルホン酸化合物 を添加してない以外は、 前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った 。 なお、 試料に第 1試薬および第 2試薬を混合した時点での、 試料 1 μ Lに対するスルホン酸化合物の添加量は、 0. 37 8 mo lであった
(表 1 )
吸光度
スルホン酸化合物 こトロ化合物 試料 High 試料 Low High-Low
_ _ (mM) _ _ (mM) (mAbs) (mAbs) (mAbs) 実施例 1 SLS (6.4) - 51.0 34.0 17.0 比較例 1 ― ― 16.7 16.0 0.7 前記表 1に示すように、 実施例 1によれば、 試料 Highの吸光度および 試料 Lowの吸光度は、 それぞれ比較例よりも高い値が得られた。 これは 、 スルホン酸化合物の存在下でプロテア一ゼ処理することによって、 糖 化ヘモグロビンの分解が促進されたため、 糖化部分に対して、 FAOD が作用し易くなつたからである。 つまり、 実施例によれば、 分解の促進 によって、 F AODが比較例よりも多くの糖化部分に作用し易くなつた ため、 測定精度が向上したといえる。 また、 実施例によれば、 試料 Highの吸光度と試料 Lowの吸光度との差 は、 比較例よりも高い値が得られた。 前記試料 Highは、 同じへモグロビ ン濃度であっても、 試料 Lowに比べて HbAlc濃度が高い。 つまり、 へモグ ロビンの糖化量が大きいため、 試料 Highの吸光度は、 理論上、 HbAlc濃 度に比例して、 試料 Lowの吸光度よりも大きな値となる。 しかし、 比較 例によると、 スルホン酸化合物非存在下でプロテアーゼ処理しており、 糖化ヘモグロビンが分解され難いため、 試料の HbAlc濃度が異なるにも 拘わらず、 試料 Hi ghと試料 Lowとの吸光度差が 7. ImAbsと低い値であった 。 これに対して、 スルホン酸化合物存在下でプロテアーゼ処理した実施 例によれば、 試料 Highと試料 Lowとの吸光度差が比較例に比べて約 2倍 〜3倍に増加した。 このことからも、 前述と同様の理由により、 実施例 の方法により測定感度および測定精度が向上したといえる。
(実施例 2 )
この実施例は、 スルホン酸化合物存在下で糖化ヘモグロビンをプロテ ァーゼ処理し、 その分解物の糖化程度を、 発色基質 DA- 64を用いて測定 した例である。 以下に、 使用した試料、 試薬および方法を示す。
(第 1試薬）
スルホン酸化合物 （SLS：ナカライテスク社製） 6. 4mM 界面活性剤 (ホ。リオキシエチレン (9) Y 1 シルエ-テル） . 8 5 g/L CHES-CHES · Na緩衝液 (pH9.4) 4 0 mM MOPS-MOPS · Na緩衝液 (pH9.4) 1 5 mM
(第 2試薬）
二ト口化合物 0.9mM 又は 1.8mM メタ口プロテアーゼ （アークレイ社製） 2. 0 MU/L C a C 1 2 2. 5 mM
N a C 1 5 0 mM
MOPS- MOPS · Na緩衝液 (pH6.5) 1. 0 mM 前記ニトロ化合物としては、 2，4— DNA (和光純薬工業社製） 、 p-NA ( 和光純薬工業社製） 、 P-NP (和光純薬工業社製） 、 NaN02 (ナカラィテ スク社製） 、 2，4-DNH (和光純薬工業社製） をそれぞれ使用した。 なお 、 ニトロ化合物を二種類添加する塲合は、 それぞれの濃度を 0. 9mM とし、 合計 1. 8mMとした。
(第 3試薬）
F AOD (アークレイ社製） 1 8 KUZL
POD (キッコーマン社製） 67 KUZL
DA-64 (和光純薬工業社製） 70 M
Tris- HC1緩衝液 （PH7.0) 3 00 mM (方法）
前記実施例 1で調製した試料 Lowおよび試料 Highのそれぞれについて 測定を行った。 測定試料 0. 1 に前記第 1試薬 8. 2 6 Lを添 加した後、 さらに、 前記第 2試薬 7 5. 6 を混合して、 3 7Xで 5 分間放置した。 そして、 この混合液に前記第 3試薬 1 8. を混合 し、 3 7 でインキュベートして発色反応を行った。 そして、 5分後の 吸光度を商品名 J C A— BM 8 (日本電子社製） で測定した。 測定波長 は、 主波長 7 5 1 nm、 副波長 8 0 5 nmとした。 一方、 比較例 2とし ては、 第 1試薬のスルホン酸化合物、 第 2試薬のニトロ化合物を添加し てない以外は、 前記実施例と同様にして吸光度の測定を行った。 これら の結果を下記表 2に示す。 なお、 下記表 2において 「High-Low(mAbs)」 は、 試料 Highの吸光度から試料 Lowの吸光度を引いた値である。 (表 2)
吸光度
スルホン酸化合物 ：：ト D化合物 試料 High 試料 Low High-Low (mM) (mM)_ (mAbs) (mAbs) (mAbs) 実施例
2-1 SLS (6. 4) 2, 4-DNA (0. 9) 4. 2 1. 6 2. 6
2-2 SLS (6. 4) p-NA (0. 9) 2. 6 1. 2 1. 4
2-3 SLS (6. 4) p-NP (0. 9) 3. 2 1. 6 1. 6
2-4 SLS (6. 4) NaN02 (0, .9) 2. .3 1 .3 1 .0
2-5 ( a Γ 1 c n
Z, 4_U1NA 9 6. 0 1. D 1. 9 p-NA (0. 9)
2-6 SLS (6. 4) 2, -DNA (0. 9) 2. 8 1. 1 1. 7 p-NA (0. 9)
2-7 SLS (6. 4) p-NP (0. 9) 3. 3 1. 3 2. 0 p-NA (0. 9)
2-8 SLS (6. 4) 2, 4-DNA (0. 9) 4. 0 1. 9 2. 1
NaN3 (0. 9)
比較例
2 1. 1 0. 9 0. 2 前記表 2に示すように、 実施例 2によれば、 実施例 1と同様に、 試料 Highの吸光度および試料 Lowの吸光度は、 それぞれ比較例よりも高い値 が得られた。 また、 試料 Highの吸光度と試料 Lowの吸光度との差も、 比 較例 2よりも高い値が得られた。 以上のことから、 前記実施例 1と同様 に、 スルホン酸化合物および二卜口化合物存在下でプロテア一ゼ処理す ることによって、 糖化ヘモグロビンの分解が促進され、 これによつて測 定感度および測定精度が向上したといえる。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明の測定方法は、 前記スルホン酸化合物の存在下 でプロテア一ゼ処理を行うことによって、 短時間で夕ンパク質等を分解 できるため、 迅速に糖化タンパク質等の測定を行うことが可能である。 このため、 よりいつそう高精度な測定を実現でき、 本発明の測定方法は 、 前述のような臨床医療等における各種検査に有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. タンパク質分解物の製造方法であって、
夕ンパク質をスルホン酸化合物の存在下においてプロテアーゼ処理する ことを特徴とするタンパク質分解物の製造方法。
2. タンパク質をスルホン酸化合物および二トロ化合物の存在下にお いてプロテア一ゼ処理する請求の範囲 1記載の製造方法。
3. スルホン酸化合物が、 ラウリル硫酸ナトリウム （S L S) 、 ドデ シルベンゼンスルホン酸ナトリウム （S DB S) 、 ラウリル硫酸リチウ ム （L i L S) 、 4-アミノアゾベンゼン一 4' -スルホン酸ナトリウム （ AB SA) 、 4-ァミノ- 4' -ニトロスチルベン- 2, 2' -ジスルホン酸 2ナ トリウム （AND S) 、 4,4' -ジァゾスチルベンゼン- 2, 2， -ジスルホ ン酸 2ナトリウム （DAD S) 、 N-シクロへキシル -2-アミノエタンス ルホン酸、 N-シクロへキシル -3-ァミノプロパンスルホン酸、 N-シクロ へキシル -2-ハイ ドロキシ -3-ァミノプロパンスルホン酸、 ピぺラジン- 1 ,4-ビス （2-エタンスルホン酸） およびバソフェナント口リンスルホン 酸からなる群から選択された少なくとも一つのである請求の範囲 1記載 の製造方法。
4. 前記ニトロ化合物が、 2, 4-ジニトロフエノール （2,4-DNP) 、 2, 5 -ジニトロフエニル、 2， 6-ジニトロフエニル、 4, 6-ジニトロ- 2-メチル フエノール、 2-ァミノ- 4-ニトロフエノール、 2-ァミノ- 5-ニトロフエノ —ル、 2-ァミノ- 4-ニトロフエノール、 p—ニトロフエノール （P- NP) 、 2, 4-ジニトロア二リン （2,4- DNA) 、 p-二トロア二リン （p-NA) 、 亜 硝酸ナトリウム （NaN02) 、 亜硝酸カリウム （KN02) 、 4-ァミノ- 4' -ニトロスチル へ'ン- 2,2'-シ'スルホン酸 2ナトリウム （以下、 「ANPS」 という） およびニト 口ベンゼンからなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲 2記載の製造方法。
5. プロテアーゼが、 メタ口プロテナ一ゼである請求の範囲 1記載の 製造方法。
6. 夕ンパク質が糖化夕ンパク質である請求の範囲 1記載の製造方法
7. 糖化タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理することによって 、 前記糖化タンパク質を分解し、 得られた糖化タンパク質分解物の糖化 部分とフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼとを反応させ、 この酸化還元 反応を測定することによって、 前記糖化タンパク質の量を測定する糖化 夕ンパク質の測定方法であって、
スルホン酸化合物の存在下で前記プロテアーゼ処理を行うことを特徴 とする糖化タンパク質の測定方法。
8. スルホン酸化合物および二ト口化合物の存在下で前記プロテア一 ゼ処理を行う請求の範囲 7記載の測定方法。
9. スルホン酸化合物が、 ラウリル硫酸ナトリウム （S L S) 、 ドデ シルベンゼンスルホン酸ナトリウム （S DB S) 、 ラウリル硫酸リチウ ム （L i L S) 、 4-アミノアゾベンゼン— 4' -スルホン酸ナトリウム （ AB SA) 、 4-ァミノ- 4， -ニトロスチルベン- 2, 2， -ジスルホン酸 2ナ トリウム （AND S ) 、 4， 4' -ジァゾスチルベンゼン- 2, 2' -ジスルホ ン酸 2ナトリウム （DAD S ) 、 N-シクロへキシル -2-アミノエ夕ンス ルホン酸、 N-シクロへキシル -3-ァミノプロパンスルホン酸、 N-シクロ へキシル -2-ハイ ドロキシ -3-ァミノプロパンスルホン酸、 ピぺラジン- 1 ， 4-ビス （2-エタンスルホン酸） およびバソフェナント口リンスルホン 酸からなる群から選択された少なくとも一つのである請求の範囲 7記載 の測定方法。
1 0. 前記ニトロ化合物が、 2, 4-ジニトロフエノール （2, 4- DNP) 、 2 , 5-ジニトロフエニル、 2， 6-ジニトロフエニル、 4， 6-ジニトロ- 2-メチル フエノール、 2-ァミノ- 4-ニトロフエノール、 2-ァミノ— 5-ニトロフエノ ール、 2-ァミノ- 4-ニトロフエノール、 p—ニトロフエノール （P- NP) 、 2,4-ジニトロア二リン （2,4-DNA) 、 p_二トロア二リン （p-NA) 、 亜 硝酸ナトリウム （NaN02) 、 亜硝酸カリウム （KN02) 、 4-ァミノ- 4' -ニト Πスチル へ'ン -2, 2' -シ'スルホン酸 2ナトリウム （以下、 「ANPS」 という） およびニト 口ベンゼンからなる群から選択された少なくとも一つである請求の範囲 7記載の測定方法。
1 1. プロテアーゼが、 メタ口プロテナーゼである請求の範囲 7記載 の測定方法。
1 2. 酸化還元反応の測定が、 前記糖化タンパク質の糖化部分とフル ク トシルアミノ酸ォキシダーゼとの反応によって発生した過酸化水素の 量の測定である請求の範囲 7記載の測定方法。
1 3. 酸化酵素によって、 発生した前記過酸化水素を還元し、 かつ 酸化により発色する基質を酸化させ、 前記基質の発色程度を測定するこ とによって、 過酸化水素量を測定する請求の範囲 1 2記載の測定方法。
1 4 . 前記発色程度の測定が、 前記基質の検出波長における吸光度測 定である請求の範囲 1 3記載の測定方法。
PCT/JP2003/005487 2002-07-17 2003-04-28 スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法 WO2004007760A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004521126A JP3973160B2 (ja) 2002-07-17 2003-04-28 スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法
AU2003235975A AU2003235975A1 (en) 2002-07-17 2003-04-28 Method of decomposing protein with sulfonic acid compound
EP03720985A EP1522593A4 (en) 2002-07-17 2003-04-28 PROCESS FOR DECOMPOSING PROTEIN WITH SULFONIC ACID COMPOUND
US10/521,234 US8021855B2 (en) 2002-07-17 2003-04-28 Method of decomposing protein with sulfonic acid compound
CN03817026.4A CN1668760B (zh) 2002-07-17 2003-04-28 使用磺酸化合物或十二烷基硫酸钠或十二烷基硫酸锂降解蛋白质的方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002208305 2002-07-17
JP2002-208305 2002-07-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004007760A1 true WO2004007760A1 (ja) 2004-01-22

Family

ID=30112841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/005487 WO2004007760A1 (ja) 2002-07-17 2003-04-28 スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8021855B2 (ja)
EP (1) EP1522593A4 (ja)
JP (1) JP3973160B2 (ja)
CN (1) CN1668760B (ja)
AU (1) AU2003235975A1 (ja)
WO (1) WO2004007760A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080423B2 (en) 2004-08-05 2011-12-20 Asahi Kasei Pharma Corporation Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer
WO2012020745A1 (ja) 2010-08-11 2012-02-16 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
US8268017B2 (en) 2007-02-22 2012-09-18 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for stabilizing leuco-type colorant
WO2014192200A1 (ja) * 2013-05-31 2014-12-04 パナソニックヘルスケア株式会社 糖化ヘモグロビンを定量する方法
CN104614459B (zh) * 2015-01-26 2016-09-07 温州医科大学 一种快速酶解糖化白蛋白的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102006021401A1 (de) * 2006-05-08 2007-12-13 Henkel Kgaa Amadoriasen in Wasch- und Reinigungsmitteln
CN103483229B (zh) * 2013-09-12 2015-06-17 杭州隆基生物技术有限公司 一种atp释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂
WO2018101389A1 (ja) * 2016-11-30 2018-06-07 東洋紡株式会社 ヘモグロビンの糖化率測定方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09503818A (ja) * 1993-10-14 1997-04-15 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー プロテアーゼ酵素を含んでなる漂白組成物
JPH09185021A (ja) * 1995-12-28 1997-07-15 Toray Ind Inc コンタクトレンズ用洗浄保存液
JPH09512586A (ja) * 1995-03-01 1997-12-16 ケミシェ・ファブリーク・ドクトル・ヴァイゲルト （ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング・ウント・コンパニー） 外科用器具用洗浄剤
JPH10210967A (ja) * 1996-11-29 1998-08-11 Ajinomoto Co Inc 高活性変異株及びそれを用いる蛋白加水分解物の製造法
JPH11196897A (ja) * 1998-01-09 1999-07-27 Kdk Corp 糖化タンパク質の測定方法及び測定装置

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3962125A (en) * 1975-01-13 1976-06-08 Coulter Diagnostics, Inc. Multi-purpose diluent for use in blood analysis by electronic instrumentation of the coulter type
US4119405A (en) * 1978-02-13 1978-10-10 Miles Laboratories, Inc. Test means and method for interference resistant determination of oxidizing substances
US4265810A (en) * 1978-10-26 1981-05-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for recovering zwitterionic diazonium salts by aggregation
DE3012368C2 (de) 1980-03-29 1982-04-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und diagnostische Mittel zum Nachweis von Redox-Reaktionen
US4310626A (en) 1980-06-02 1982-01-12 Miles Laboratories, Inc. Interference-resistant composition, device and method for determining a peroxidatively active substance in a test sample
JPS57161650A (en) 1981-03-16 1982-10-05 Miles Lab Test device for measuring peroxidizing active material in sample and manufacture thereof
ZA841185B (en) 1983-03-28 1984-09-26 Miles Lab Ascorbate interference-resistant composition,device and method for the determination of peroxidatively active substances
US4587220A (en) * 1983-03-28 1986-05-06 Miles Laboratories, Inc. Ascorbate interference-resistant composition, device and method for the determination of peroxidatively active substances
JPS60168050A (ja) 1984-02-10 1985-08-31 Wako Pure Chem Ind Ltd ヘモグロビンの影響回避方法
JPS60224063A (ja) * 1984-04-20 1985-11-08 Terumo Corp 試験用具
JPS6184A (ja) 1984-06-09 1986-01-06 Wako Pure Chem Ind Ltd 新規なテトラゾリウム化合物
US4755472A (en) 1986-01-16 1988-07-05 Miles Inc. Stable composition for the determination of peroxidatively active substances
IL85532A (en) * 1987-03-13 1992-03-29 Coulter Electronics Method and lytic reagent system for isolation,identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples
US4853338A (en) * 1987-05-20 1989-08-01 Technicon Instruments Corporation Cyanide-free hemoglobin reagent
JPH0269644A (ja) 1988-09-05 1990-03-08 Toshiba Corp セラミックス体の非破壊検査方法
US4954451A (en) * 1989-06-26 1990-09-04 Miles Inc. Agent for diminishing ascorbate interference in reagent systems and method relating thereto
JP4061348B2 (ja) * 1997-04-24 2008-03-19 アークレイ株式会社 糖化タンパク質の酵素的測定方法
US6656697B1 (en) 1998-09-28 2003-12-02 Lifescan, Inc. Diagnostics based on tetrazolium compounds
US5902731A (en) * 1998-09-28 1999-05-11 Lifescan, Inc. Diagnostics based on tetrazolium compounds
US6352835B1 (en) * 1998-11-17 2002-03-05 Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. Method of measuring substance in sample using a redox reaction
AU2001269513A1 (en) 2000-07-14 2002-01-30 Arkray, Inc. Method of selectively determining glycated hemoglobin
US20040063213A1 (en) 2000-09-28 2004-04-01 Kaoru Hirai Assay method with the use of redox reaction
ATE457063T1 (de) * 2000-09-28 2010-02-15 Arkray Inc Verfahren zur messung des glykierungsanteils von hämoglobin
ES2391802T3 (es) * 2001-01-31 2012-11-30 Asahi Kasei Pharma Corporation Composición para el ensayo de proteínas glicosiladas
US20020173043A1 (en) * 2001-04-04 2002-11-21 Eddine Merabet Cyanide-free reagent, and method for detecting hemoglobin
WO2003107011A1 (ja) * 2002-06-14 2003-12-24 アークレイ株式会社 スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09503818A (ja) * 1993-10-14 1997-04-15 ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー プロテアーゼ酵素を含んでなる漂白組成物
JPH09512586A (ja) * 1995-03-01 1997-12-16 ケミシェ・ファブリーク・ドクトル・ヴァイゲルト （ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング・ウント・コンパニー） 外科用器具用洗浄剤
JPH09185021A (ja) * 1995-12-28 1997-07-15 Toray Ind Inc コンタクトレンズ用洗浄保存液
JPH10210967A (ja) * 1996-11-29 1998-08-11 Ajinomoto Co Inc 高活性変異株及びそれを用いる蛋白加水分解物の製造法
JPH11196897A (ja) * 1998-01-09 1999-07-27 Kdk Corp 糖化タンパク質の測定方法及び測定装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1522593A4 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8080423B2 (en) 2004-08-05 2011-12-20 Asahi Kasei Pharma Corporation Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer
US8268017B2 (en) 2007-02-22 2012-09-18 Asahi Kasei Pharma Corporation Method for stabilizing leuco-type colorant
WO2012020745A1 (ja) 2010-08-11 2012-02-16 協和メデックス株式会社 糖化ヘモグロビンの測定方法
US9090931B2 (en) 2010-08-11 2015-07-28 Kyowa Medex Co., Ltd Method for measuring glycated hemoglobin
WO2014192200A1 (ja) * 2013-05-31 2014-12-04 パナソニックヘルスケア株式会社 糖化ヘモグロビンを定量する方法
CN104614459B (zh) * 2015-01-26 2016-09-07 温州医科大学 一种快速酶解糖化白蛋白的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1668760A (zh) 2005-09-14
EP1522593A1 (en) 2005-04-13
JP3973160B2 (ja) 2007-09-12
AU2003235975A1 (en) 2004-02-02
CN1668760B (zh) 2012-11-07
US8021855B2 (en) 2011-09-20
EP1522593A4 (en) 2008-07-23
US20050260735A1 (en) 2005-11-24
JPWO2004007760A1 (ja) 2005-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5097758B2 (ja) 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット
KR100601272B1 (ko) 산화환원반응을 이용한 측정방법
EP1329722A1 (en) Assay method with the use of redox reaction
JP4045322B2 (ja) 酸化還元反応を用いた測定方法
JP4061366B2 (ja) スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
WO2004007760A1 (ja) スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法
JPWO2002027012A1 (ja) タンパク質分解物の製造方法
JP4143698B2 (ja) Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの誤発色防止方法および前記方法を用いた試薬溶液ならびに測定方法
JP2007147630A (ja) スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法
JP4214277B2 (ja) ホルマザンを用いた酸化還元反応による測定方法
EP1452606B1 (en) Method for measurement using sodium azide
JP2007020581A (ja) 酸化還元反応を用いた測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004521126

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003720985

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10521234

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038170264

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003720985

Country of ref document: EP