CN104614459B - 一种快速酶解糖化白蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其通过以下步骤完成：1)配制含有离子液体、蛋白变性剂、蛋白酶K、CaCl2、聚乙二醇6000、TritonX‑100、叠氮钠的pH7.5‑8.5Tris‑HCl缓冲液；2)加入用HPLC法准确定值的糖化白蛋白样品液，反应一段时间；3)向步骤(2)所得的溶液中加入EDTA·2Na溶液，终止酶解反应；4)用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率。按该法进行糖化白蛋白样品的酶解，可实现在180‑600秒内将300‑900μmol/L的糖化白蛋白快速酶解，特别适合FAOD法测定糖化白蛋白的方法学及测定试剂开发。

Description

一种快速酶解糖化白蛋白的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质酶解技术领域，尤其涉及一种快速酶解糖化白蛋白的方法。
背景技术
糖化血清白蛋白(GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的产物，即血清白蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。糖化白蛋白半衰期较短，测定糖化白蛋白的浓度可有效反映患者过去2～3周内平均血糖的水平，并不受临时血糖浓度波动的影响。目前，临床广泛采用果糖氨基酸氧化酶(FAOD)法测定GA含量，该法在测定GA时，需要先用蛋白酶将糖化白蛋白酶解为糖化氨基酸，然后用特异性的果糖氨基酸氧化酶进行氧化，再偶联Trinder’s反应进行显色定量。已有的研究表明，用单纯的蛋白酶体系进行糖化白蛋白的酶解反应，需要数十分钟甚至数小时才能将高浓度的糖化白蛋白酶解完全，而应用于全自动生化分析仪的FAOD检测法通常要求GA的酶解效率在180-600秒内达到90％以上。为了达到此技术要求，现有的技术常采用加大蛋白酶浓度或加入高浓度的蛋白变性剂加快酶解反应的速度。采用加大蛋白酶浓度的酶解方法不仅增加了检测成本，而且使测定试剂的粘度增加从而对测定造成不利影响；加入高浓度蛋白变性剂的方法虽然加快了糖化白蛋白的酶解速度，但使蛋白酶的存储稳定性降低，对试剂的有效期产生不利影响。
因此，需求一种可在180-600秒内快速酶解糖化白蛋白、使酶解效率达到90％以上的方法，对于实现FAOD法测定GA含量显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是建立一种快速酶解糖化白蛋白的方法，该方法通过在含有低浓度蛋白酶和蛋白变性剂的酶解液中添加一定浓度的离子液体用于提高蛋白酶的活性和稳定性，实现在180-600秒内将糖化白蛋白快速酶解，特别适合FAOD法测定糖化白蛋白的方法学及测定试剂开发。
本发明采用如下技术方案：
本发明的快速酶解糖化白蛋白的方法的具体步骤如下：
(1)配制含有离子液体、蛋白变性剂、蛋白酶K、CaCl2、聚乙二醇6000、TritonX-100、叠氮钠的pH7.5-8.5Tris-HCl缓冲液；
(2)加入用HPLC法准确定值的糖化白蛋白样品液，在35-40℃水浴中反应180-600秒；
(3)向步骤(2)所得的溶液中加入EDTA·2Na溶液，终止酶解反应；
(4)用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率。
步骤(1)中，所述的离子液体为1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐。
步骤(1)中，所述的蛋白变性剂为十二烷基磺酸钠。
步骤(1)中，所述的pH7.5-8.5Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，含有的离子液体浓度为0.5-5g/L、蛋白变性剂浓度为5-25mmol/L、蛋白酶K浓度为5-15KU/L、CaCl2浓度为2-20mmol/L、聚乙二醇6000浓度为10-50g/L、TritonX-100浓度为0.5-10ml/L、叠氮钠为0.5-1.0g/L。
步骤(2)中，糖化白蛋白样品液的浓度CGA1为300-900μmol/L。
步骤(2)中，优选反应条件为在37℃水浴中反应180-600秒。
步骤(2)中，糖化白蛋白样品液体积VGA与Tris-HCl缓冲液体积VTris-HCl之比为VGA:VTris-HCl＝5:240。
步骤(3)中，EDTA·2Na溶液浓度为200mmol/L。
步骤(3)中，EDTA·2Na的加入量VEDTA·2Na与步骤(2)中VGA、VTris-HCl的体积比为：VGA:VTris-HCl:VEDTA·2Na＝5:240:60。
步骤(4)中，糖化白蛋白酶解率的计算公式为：糖化白蛋白酶解率(％)＝{CGA1-[CGA2×(VGA+VTris-HCl+VEDTA·2Na)/VGA]}/CGA1×100％；其中CGA1是步骤(2)中糖化白蛋白样品液的浓度，CGA2是步骤(4)中用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，VGA是步骤(2)中的糖化白蛋白样品液体积，VTris-HCl是步骤(1)中的pH7.5-8.5Tris-HCl缓冲液体积，VEDTA·2Na是步骤(3)中EDTA·2Na溶液的体积。
本发明的积极效果如下：
本发明的快速酶解糖化白蛋白的方法具有方法简单、方便快捷、易于操作的优点，并且可在180-600秒内快速酶解糖化白蛋白、使酶解效率达到90％以上，特别适合FAOD法测定糖化白蛋白的方法学及测定试剂开发。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
糖化白蛋白样品液的制备：精密称取优级纯糖化白蛋白，用去离子水稀释至糖化白蛋白浓度为300-900μmol/L。
糖化白蛋白酶解率的计算公式为：糖化白蛋白酶解率(％)＝{CGA1-[CGA2×(VGA+VTris-HCl+VEDTA·2Na)/VGA]}/CGA1×100％。其中CGA1是步骤(2)中糖化白蛋白样品液的浓度，CGA2是步骤(4)中用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，VGA是步骤(2)中的糖化白蛋白样品液体积，VTris-HCl是步骤(1)中的pH7.5-8.5Tris-HCl缓冲液体积，VEDTA·2Na是步骤(3)中EDTA·2Na溶液。
实施例1
(1)配制12ml pH7.5Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为20mmol/L，优选的离子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐的浓度为0.5g/L，优选的蛋白变性剂十二烷基磺酸钠的浓度为5mmol/L，蛋白酶K浓度为5KU/L、CaCl2浓度为2mmol/L、聚乙二醇6000浓度为10g/L、TritonX-100浓度为0.5ml/L、叠氮钠为0.5g/L；
(2)加入用HPLC法准确定值的300μmol/L糖化白蛋白样品液0.25ml，37℃水浴中反应180秒；
(3)向步骤(2)所得的溶液中加入浓度为200mmol/L的EDTA·2Na溶液3ml，终止酶解反应；
(4)用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率为98.6％。
可以看出，用本实施例所述方法在酶解300μmol/L糖化白蛋白样品液180秒时酶解效率已经达到90％以上。
实施例2
(1)配制12ml pH 8.0Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为110mmol/L，优选的离子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐的浓度为2.75g/L，优选的蛋白变性剂十二烷基磺酸钠的浓度为15mmol/L，蛋白酶K浓度为10KU/L、CaCl2浓度为11mmol/L、聚乙二醇6000浓度为30g/L、TritonX-100浓度为5.25ml/L、叠氮钠为0.75g/L；
(2)加入用HPLC法准确定值的600μmol/L糖化白蛋白样品液0.25ml，37℃水浴中反应390秒；
(3)向步骤(2)所得的溶液中加入浓度为200mmol/L的EDTA·2Na溶液3ml，终止酶解反应；
(4)用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率为96.3％。
可以看出，用本实施例所述方法在酶解600μmol/L糖化白蛋白样品液390秒时酶解效率已经达到90％以上。
实施例3
(1)配制12ml pH 8.5Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为200mmol/L，优选的离子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐的浓度为5g/L，优选的蛋白变性剂十二烷基磺酸钠的浓度为25mmol/L，蛋白酶K浓度为15KU/L、CaCl2浓度为20mmol/L、聚乙二醇6000浓度为50g/L、TritonX-100浓度为10ml/L、叠氮钠为1.0g/L；
(2)加入用HPLC法准确定值的900μmol/L糖化白蛋白样品液0.25ml，37℃水浴中反应600秒；
(3)向步骤(2)所得的溶液中加入浓度为200mmol/L的EDTA·2Na溶液3ml，终止酶解反应；
(4)用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率为94.8％。
可以看出，用本实施例所述方法在酶解900μmol/L糖化白蛋白样品液600秒时酶解效率已经达到90％以上。
实施例4
用本发明实施例1相同的方法酶解350μmol/L的糖化白蛋白样品液，同时配制单纯的蛋白酶解试剂作为对照组，所述单纯的蛋白酶解试剂为：12ml pH7.5Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为20mmol/L，蛋白酶K浓度为5KU/L、CaCl2浓度为2mmol/L、叠氮钠为0.5g/L，对照组的操作步骤(2)～(4)同实施例1的操作步骤(2)～(4)。本发明的糖化白蛋白酶解效率为98.2％，对照组的糖化白蛋白酶解效率为72.6％，以上结果显示了本发明的有效性。
实施例5
用本发明实施例1步骤(1)相同的方法配制144ml pH7.5Tris-HCl缓冲液，将此144ml pH7.5Tris-HCl缓冲液分成12份，置4℃保存，每个月取出1份，按实施例1所述步骤(2)～(4)对一份300μmol/L的糖化白蛋白样品液进行酶解，计算酶解率，结果见表1。
表1
置4℃保存时间 酶解率(％)
1月 98.4
2月 98.2
3月 98.1
4月 97.8
5月 97.5
6月 97.2
7月 97.0
8月 96.7
9月 96.4
10月 96.1
11月 95.6
12月 94.9
从表1可以看出，将本实施例所述的pH7.5Tris-HCl缓冲液置4℃保存12个月，按实施例1步骤(2)～(4)进行操作，仍能达到90％以上的酶解效率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)配制含有0.5-5g/L离子液体、5-25mmol/L蛋白变性剂、5-15KU/L蛋白酶K、2-20mmol/L CaCl2、10-50g/L聚乙二醇6000、0.5-10ml/L TritonX-100、0.5-1.0g/L叠氮钠的pH7.5-8.5Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为20-200mmol/L；
(2)加入用HPLC法准确定值的糖化白蛋白样品液，在35-40℃水浴中反应180-600秒；
(3)向步骤(2)所得的溶液中加入EDTA·2Na溶液，终止酶解反应；
(4)用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率。
2.根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的离子液体为1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐。
3.根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的蛋白变性剂为十二烷基磺酸钠。
4.根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)中，糖化白蛋白样品液的浓度CGA1为300-900μmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)中，反应条件为在37℃水浴中反应180-600秒。
6.根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)中，糖化白蛋白样品液体积VGA与Tris-HCl缓冲液体积VTris-HCl之比为VGA:VTris-HCl＝5:240。
7.根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(3)中，EDTA·2Na溶液浓度为200mmol/L。
8.根据权利要求7所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(3)中，EDTA·2Na的加入量VEDTA·2Na与步骤(2)中VGA、VTris-HCl的体积比为：VGA:VTris-HCl:VEDTA·2Na＝5:240:60。
9.根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)中，糖化白蛋白酶解率的计算公式为：糖化白蛋白酶解率(％)＝{CGA1-[CGA2×(VGA+VTris-HCl+VEDTA·2Na)/VGA]}/CGA1×100％；其中CGA1是步骤(2)中糖化白蛋白样品液的浓度，CGA2是步骤(4)中用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，VGA是步骤(2)中的糖化白蛋白样品液体积，VTris-HCl是步骤(1)中的pH7.5-8.5Tris-HCl缓冲液体积，VEDTA·2Na是步骤(3)中EDTA·2Na溶液的体积。
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