CN113416723A - 用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶k液体酶制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂,属于酶制剂领域。本发明提供的蛋白酶K液体酶制剂中,蛋白酶K的浓度10mg/ml≤C≤60mg/ml,缓冲液浓度为10mM‑200mM,Ca2+浓度为0.01‑10mM,固体形式的保护剂的添加量是蛋白质量的1%‑200%,液体形式的保护剂的添加量是酶液体积的10%‑200%,防腐剂的总添加量是0.01%‑0.5%。本发明实现了在常温条件下保持12个月或者42℃条件下孵育10天后的蛋白酶K溶液残余活力在90%以上,且长时间储存无RNase、DNase和微生物污染,简化了保存、运输和使用过程,同时解决了高浓度下蛋白易析出的难题。
Description
技术领域
本发明涉及用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂,具体涉及到一种在常温存储和性状稳定的蛋白酶K(EC 3.4.21.64)液体制剂及制备方法,属于酶制剂领域。
背景技术
蛋白酶K(PRK,EC 3.4.21.64)属丝氨酸蛋白酶类,它是林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)或布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)产生的一类主要蛋白酶。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性,能优先分解与疏水氨基酸、含硫芳香族C末端邻接的酯键和肽,常被用于降解蛋白生产短肽。蛋白酶K能将蛋白失活或降解,这个特性使得蛋白酶K在核酸纯化、丝绸、医药食品和酿造等领域都有着重要的应用。例如,在生化实验中,提取核酸时,可以利用蛋白酶K除去核酸中的DNA酶和RNA酶;在原位杂交实验中,可以利用蛋白酶K降解包围靶DNA的蛋白质,以及处理杂交前的样本以提高检测的敏感性;此外蛋白酶K还可以用于制备IVD生化检测试剂和分子诊断试剂。
蛋白酶K活性的活性主要受一些蛋白酶抑制剂和酶活性中心的Ca2+影响。加入螯合剂EDTA后,蛋白酶K催化活性将在6h内丧失80%左右,这可能是由于Ca2+的丢失会引起活性中心远端蛋白构象的变化,若再加入Ca2+则其活性又会恢复至28%左右。除Ca2+离子会影响外,蛋白酶K的酶活还会被DFP、PMSF等抑制,但是却不会被胰蛋白类丝氨酸蛋白酶抑制剂(TLCK)、糜蛋白类丝氨酸蛋白酶抑制剂(Tos-Lys-CH2Cl)或巯基试剂等抑制。
源自林伯氏白色念球菌的蛋白酶K的比活力是所知的肽链内切酶中最高的,在没有Ca2+的条件下蛋白酶K的剩余活性通常就足以满足降解蛋白质的应用要求,例如,在纯化核酸时,通常需加入EDTA螯合Mg2+以消除核酸酶的降解作用,在这个过程中,EDTA会同时螯合Ca2+,使得蛋白酶K处于无Ca2+的环境,但失去Ca2+的蛋白酶K活性仍可满足降解蛋白质的要求。但在消化如角蛋白一类对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白时,则需要在反应液中添加1mM Ca2+。除此之外,蛋白酶K在0.5%SDS和1%(w/v)Triton X-100中也能较好地保持活力。
酶制剂是指酶经过提纯、加工后的具有催化功能的生物制品,主要用于催化生产过程中的各种化学反应,具有催化效率高、高度专一性、作用条件温和、降低能耗、减少化学污染等特点,其应用领域遍布食品(面包烘烤业、面粉深加工、果品加工业等)、纺织、饲料、洗剂剂、造纸、皮革、医药以及能源开发、环境保护等方面。酶制剂来源于生物,一般地说较为安全,可按生产需要适量使用。酶制剂可以由细菌或真菌等产酶微生物来生产,大部分采用基因重组表达,也有部分采用原始菌提取的方法来获得。固体剂型的酶制剂最大的优点是易于保存,在存放过程中酶的稳定性比较好。固体剂型的最大弊病是针对发酵得到的酶需要或萃取或盐析提取或喷雾提取,都会消耗非常多的能源。液体酶制剂可以避开固体酶制剂的上述缺陷,但同时也存在两个主要的问题,一是产品存放过程不能变质沉积,而是在水分多的液体环境中酶不稳定容易变质丧失活性。因此,作为液体酶制剂,需要将生产和销售衔接得很好、贮存期不能太长。
现有的大部分酶制剂在工业上都是以酶粉形态或者全细胞的形态应用于催化合成行业中,催化合成行业对蛋白纯度要求很低或没有要求,而生化和分子用酶对蛋白纯度要求则很高。无论是粉末状态或液体状态都需要具备较好的稳定性,通常会使用一些糖类、醇类、金属离子、EDTA、乙酸钠、丁酸钠或柠檬酸钠,或一些蛋白类物质保护剂来提升酶制剂的稳定性。
市面上目前提供的蛋白酶K主要有两种制剂类型,酶粉和液体酶两种,主要以酶粉为主导产品。包括全球性的蛋白酶K生产商罗氏、默克在内厂家提供的产品,无论是酶粉或是液体制剂,均是储存在2-8℃;而国内近年来兴起的大部分PRK生产厂家的提供的酶粉储存温度是-20℃,液体制剂为2-8℃。在蛋白酶K的生产过程中,液体状态的产品省去了产品冻干这一会损失产品活力的关键步骤,液体制剂的蛋白酶K能够更好地保持原始状态下的酶活力。且,粉末制剂的产品在使用过程中漂浮在空气中影响实验室环境,存在较大的污染风险。目前,随着蛋白酶被用于提取各组织中的DNA成分而加入消化反应体系,越来越多的公司更青睐于使用液体制剂的蛋白酶K,同时,液体状态的蛋白酶K还有简化使用过程的优点。但是,2-8℃储存的液体蛋白酶K制剂在运输方面,尤其是进出口运输、向热带国家运输的过程,需要额外增加运输和储存成本来保证产品性质,并且,即使增加控温成本在高温下也还是很难保证蛋白酶K性质不受影响。
目前,液体酶制剂使用最为广泛的主要是用于进行分子生物学操作的分子酶产品,成分主要是一些buffer、表面活性剂和保护剂类型,但是也需要于-20℃或2-8℃保存,且也存在着不可反复冻融的情况。CN 108431219 A提供了α-淀粉酶的液体制剂配制方法,配制出来的α-淀粉酶液体制剂可以在25℃下具有至少1年的保存期限,其中配方包括酶、缓冲剂、保护剂和防腐剂,极好地匹配了α-淀粉酶的应用。CN 107326019A公开了一种液体酶制剂及制备方法,主要解决了谷氨酰胺转氨酶液体制剂在常温下难保存的技术问题,通过配方研发实现了酶制剂常温下保持6个月酶活80%以上、性状稳定、无微生物腐败、使用效果良好。其余一些已实现商业化的液体酶,如液体脂肪酶(CN 103525797A),果胶酶(CN104531653A)等已实现了保存运输过程中的便利性。但,目前在全球范围内还未有商业化的在常温条件下可稳定储存运输的液体蛋白酶K制剂的相关报道,且已报道的液体酶制剂也大部分都是工业化酶方面的应用较多,同时蛋白纯度也有限,无法直接套用蛋白酶K的液体制剂配制;而分子酶相关的液体制剂报道主要都是一些嗜热微生物方面的液体制剂,酶的稳定性极佳,不太需要考虑到酶的室温或-20℃储存稳定性,无法为蛋白酶K液体制剂的制备提供参考。
为此,为了解决用途广泛的蛋白酶K的更大规模化生产和常温储存运输问题,需要在降低生产成本、做好安全防护、包装问题以及迎合酶制剂未来的发展趋势,实现常温状态下蛋白酶K液体制剂的工业化生产显得极为迫切和意义重大。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是,蛋白酶K的液体制剂在常温储存运输、反复冻融时会出现活力损失问题。
[技术方案]
本发明提供了一种用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂及其制备方法,通过对配方筛选和优化,所得到的PRK液体酶具有热稳定性好、储存时间长和酶活力高的特性。
本发明所称分子生物学(Molecular biology)是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。分子生物学实验是指分子生物学领域的实验,主要包括植物、动物、微生物基因组DNA的提取与鉴定,哺乳动物组织总RNA的提取与鉴定,质粒DNA的提取与鉴定,PCR扩增,分子杂交技术,限制性内切酶消化,分子克隆全过程和基因文库的构建等。特别地,在分子生物学实验中,蛋白酶K可应用于核酸提取的过程。
本发明所称体外诊断(In Vitro Diagnosis),是指在人体之外,通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息,进而判断疾病或机体功能的产品和服务。特别地,蛋白酶K可应用于检测糖化白蛋白的过程。
所述用于分子生物学实验和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂的成分是:蛋白酶K、缓冲液、Ca2+、保护剂、防腐剂;液体酶制剂中,蛋白酶K的浓度10mg/ml≤C≤60mg/ml,缓冲液浓度为10mM-200mM,Ca2+浓度为0.01-10mM,保护剂的添加量是蛋白质质量的1%-200%(如果保护剂是液体的,则液体保护剂按照酶液体积的10%-200%添加),防腐剂的总添加量是0.01%-0.5%(质量体积百分比,g/100mL)。蛋白酶K优选蛋白比活力≥40U/mg。
所述蛋白酶K通常是指利用酵母重组表达得到的来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)或布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)的蛋白酶K。也可以是利用其他表达系统表达得到蛋白酶K。蛋白酶K中不含DNase、RNase,无微生物污染。
所述缓冲液在pH 5.0-pH 11.0的范围内,包括但不限于pH 5.0-pH 7.0的乙酸-乙酸钠缓冲液,或pH 7-pH 9的Tris-HCl缓冲液,或pH 9-pH 11的甘氨酸-NaOH缓冲液。所述缓冲液用于达到维持蛋白酶K在一个较为稳定的pH环境下保证催化活力不受影响的效果。
所述Ca2+是可溶性钙盐,可以是以氯化钙、乙酸钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙中的一种和几种复配添加到制剂中。所述Ca2+用于保证蛋白酶K使用时发挥最高活力。0.01-10mM的浓度可以维持蛋白酶K的活力的稳定性。
所述保护剂可以是丙三醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、PEG系列等,可以是其中的一种,也可以是多种、的复配。所述保护剂用于保证蛋白酶K活力长时间储存活力不降低。1%-200%的保护剂可以保证储存过程中蛋白酶K的活力的稳定性。
所述防腐剂可以是叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、PC300、ε-多聚赖氨酸等,可以是其中的一种防腐剂,或者是几种的复配。所述防腐剂用于在液体酶制剂的存储过程中抑制微生物的生长、繁殖,从而避免微生物生长繁殖所导致的DNase和RNase污染问题,所述微生物包括常见的细菌、真菌等。0.01%-0.5%的防腐剂可以抑制这些微生物的繁殖,避免杂酶污染。
本发明还提供了制备所述用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂的方法,包括以下步骤:重组蛋白酶K酶液的纯化、去除杂酶;蛋白酶K液体酶液的调配,即添加Ca2+、保护剂和防腐剂;将调配得到的酶液经无菌膜过滤及质检、分装,得到蛋白酶K液体酶制剂。制备流程的简图如图1所示。
本发明所提供的所述用于分子生物学和体外诊断的蛋白酶K液体酶制剂可以用于核酸提取以及作为糖化白蛋白检测试剂的配制原料。
[有益效果]
本发明向经过纯化的蛋白酶K溶液中添加Ca2+、保护剂、防腐剂,能够对蛋白酶K起到保护、稳定的作用,同时防止蛋白酶K液体酶制剂在储存过程中因感染微生物而被杂酶污染。
本发明获得的PRK液体酶制剂室温下储存1年也可以做到无DNase和RNase污染,生物负载为0,残余活力维持在90%以上,如此可以避免低温保存时冻融对酶活产生的影响;在25℃、湿度50%的条件下储存1年,残余活力达到90%以上,60℃半衰期则无明显变化;在37℃条件下储存1个月,液体酶制剂均澄清透明,无不溶物析出,残余活力达到90%以上;42℃加速孵育10天残余活力维持在90%以上;同时上述几种储存条件下的酶液可正常用于核酸提取,且可达到4℃储存酶液的使用效果。本发明提供的液体酶制剂在pH 5-11均具有较高活力。
附图说明
图1:液体PRK酶制剂的制备流程示意图
图2:PRK液体制剂添加不同保护剂后残余活力比较
图3:不同Ca2+浓度对PRK液体酶活力和稳定性的影响
图4:不同防腐剂对PRK液体酶活力的影响
图5:液体酶在室温下孵育12个月酶稳定性
图6:液体酶在25℃和50%湿度下孵育12个月酶稳定性
具体实施方式
技术术语
蛋白酶K:Proteinase K,是指如酶命名法所定义的EC 3.4.21.14类中的酶。出于本发明的目的,根据具体实施方式中提及的方法确定蛋白酶K活性。
DNase:指脱氧核糖核酸酶,用于从蛋白样品中去除DNA。
RNase:指核糖核酸酶,能水解RNA磷酸二酯键。
生物负载:是指医学装置、容器或组件中可见微生物的总数。
储存稳定性:通常情况下,各种制剂在贮存期间会慢慢发生物理化学变化,如粉剂、可湿性粉剂可能出现结块、发黏,流动性、悬浮率降低;有效成分会慢慢分解失效。蛋白酶K的储存稳定性是指,相比于刚开始储存时蛋白酶K的活力,在储存期间或储存结束后,蛋白酶K的活力的保留情况,蛋白酶K的活力保留得越多,说明储存稳定性越好。
残余活力(%):以某一条件下的酶活力作为基准,另一酶活力占该基准的比例,即为残余活力。
相对比活力(%):在不同温度条件处理后的酶液的蛋白比活力占未经不同温度条件处理的原始酶液(例如在4℃储存的酶液)的蛋白比活力的百分比。
半衰期(min):酶活力下降一半所需要的时间。
室温:指的是室内温度,没有人为干预温度和湿度。
实施例1:蛋白酶K的准备、活力检测及DNase、RNase和生物负载检测
蛋白酶K的准备:利用重组酵母发酵制备蛋白酶K,将发酵下罐的含蛋白酶K的发酵上清液过离子交换纯化,将所得纯化后的酶液用合适的缓冲液进行超滤置换,并浓缩到合适的浓度,以进行活力检测及DNase、RNase和生物负载检测。
(1)活力检测原理:
蛋白酶K可将血红蛋白水解为带酚基的氨基酸,在偏碱条件下酚基氨基酸可将福林酚试剂还原生成钼蓝和钨蓝,其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在750nm处测定蛋白酶K催化血红蛋白水解得到的水解液的吸光度,结合标准曲线可计算得到水解产生的酚基氨基酸的量,进而计算得到蛋白酶K的活力。
(2)蛋白酶K酶活检测
酶活定义:单位酶活定义为在下述条件下,每分钟水解血红蛋白生成1μmol酪氨酸所需的酶量。
具体检测方法如下:
反应底物:称取1.0g血红蛋白,溶于20ml H2O中,37℃恒温搅拌30min。添加4ml 1MNaOH溶液,37℃恒温搅拌20min。添加18g尿素,37℃恒温搅拌60min。添加5ml 1M KH2PO4溶液,37℃条件下用1M HCl调节至pH 7.5,用水定容至50ml,混匀,即为2.0%血红蛋白溶液。
酪氨酸标准品:称取0.01g L-酪氨酸,用H2O定容至50ml,70-80℃加热直至L-酪氨酸完全溶解,用0.22μm滤膜过滤,即为1.1mM L-酪氨酸标准品。
305mM TCA溶液:取6.1M TCA溶液2ml,用水定容至40ml,混匀。
0.5N福林酚溶液:取1M福林酚溶液,用水定容至40ml,混匀。
20mM CaCl2溶液:称取7.351g CaCl2·2H2O,用H2O定容至50ml,混匀,即为1M CaCl2溶液。取10ml 1M CaCl2溶液,用H2O定容至500ml,混匀,用0.22μm滤膜过滤,4℃存放。
标准曲线的制作:按照如下测活方法检测不同标准品酪氨酸溶液在显色体系中750nm处的吸光值,再根据不同浓度和对应的吸光值拟合得到酪氨酸浓度和吸光度的曲线,用于计算蛋白酶K的活力。
酶活测定方法:向15mL离心管中加入2.5mL的2%血红蛋白溶液,分为空白组和实验组,均置于37℃水浴锅中恒温10min,然后,空白组加入5mL 305mM TCA溶液,实验组加入0.5mL稀释至合适倍数的蛋白酶K溶液,震荡混匀后在37℃下恒温反应10min,再向反应组中加入5mL 305mM TCA溶液,空白组加入0.5mL稀释同样倍数后的酶液。室温静置20后,0.22μm滤膜过滤澄清反应液置于冰盒待用。
再取新的15mL离心管,将上述空白和实验组的反应液各取2.5mL加到15mL管中;为制作标准曲线,取新的15mL离心管,分别加入0、0.05、0.1、0.3、0.5、0.7mL标准酪氨酸溶液,以及2.5、2.45、2.4、2.2、2.0、1.8mL 200mM HCl;再向所有管(空白组、实验组、标准品)中加入5mL 500mM NaOH,所有样品震荡混匀后每管加入1.5mL 0.5M的福林酚溶液,室温静置30min,如有沉淀则过滤后立即在750nm分光光度计下读数。
根据检测出来的OD值,绘制ΔA750nm标准与酪氨酸含量(μmol)的标准曲线,从而计算得到蛋白酶K溶液的比活力。根据此方法计算得到的蛋白酶K酶液蛋白比活力为49.4U/mg。
(3)DNase,RNase和生物负载检测
蛋白酶K溶液中的RNase含量检测按照国标GB/T 34222-2017《核糖核酸酶活力检测方法》来进行,DNase含量检测按照国标GB/T 34801-2017《脱氧核糖核酸酶活力检测方法》来进行,生物负载量检测按照2015版《中国药典》微生物限度检查法计数法来进行。根据上述方法检测得到,蛋白酶K溶液中的RNase含量、DNase含量、生物负载量均为零。
(4)蛋白酶K的浓度检测
蛋白酶K溶液的浓度检测采用Bicinchoninic Acid(BCA)法进行检测,经上述方法检测得到蛋白酶K的浓度为22.1mg/mL。
实施例2
制备蛋白酶K液体酶制剂:选择实施例1中经缓冲液置换浓缩后的蛋白浓度为22.1mg/mL,比活力为49.4U/mg的蛋白酶K酶液,加入缓冲液:50mM pH 6.0乙酸-乙酸钠,保护剂:20%(体积比)甘油,防腐剂:0.01%叠氮钠,Ca2+0.5mM。其余不同的保护剂同样可参照此浓度配制液体蛋白酶K。
蛋白酶K液体酶制剂在37℃的储存稳定性:取10mL蛋白酶K液体酶制剂样品封口置于37℃培养箱(湿度50%)中保存1个月(31天),检测剩余蛋白酶K的活力,结果表明在37℃储存一个月的液体蛋白酶K残余活力依然维持在90%以上,且无微生物污染,无DNase、RNase活力。而不添加保护剂甘油的对照组,蛋白酶K残余活力只能维持50%左右。
蛋白酶K液体酶制剂在室温条件下的储存稳定性:将所得蛋白酶K液体酶制剂于室温下保存12个月,检测剩余蛋白酶K的残余活力,结果表明室温储存不会影响液体蛋白酶K的各项性质,无论是残余活力还是杂酶残留均和配制时性质一致,同时室温储存避免了冻融对酶活产生的影响。
实施例3~实施例8:不同保护剂对蛋白酶K液体制剂的稳定性
制备蛋白酶K液体酶制剂:在实施例2的基础上,将保护剂分别替换为:甘露醇(实施例3)、海藻糖(实施例4)、蔗糖(实施例5)、山梨醇(实施例6)、PEG20000(实施例7)、甘氨酸(实施例8),其中,保护剂甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、PEG20000、甘氨酸的添加量按照蛋白质量:保护剂质量=1:0.15的比例进行计算。
蛋白酶K液体酶制剂在37℃的储存稳定性:取10mL蛋白酶K液体酶制剂样品封口置于37℃培养箱中保存1个月,间隔不同时间取样检测蛋白残余活力,并观察在37℃下蛋白酶K液体制剂的溶解性。结果表明,无论是否添加保护剂,液体酶制剂均澄清透明,无不溶物析出;保存一个月后,蛋白酶K的残余活力如图2所示,添加保护剂的蛋白酶K液体酶制剂的残余活力均明显高于不加保护剂的对照组,甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、PEG20000、甘氨酸均对蛋白酶K的保护起到正向作用。
实施例9~实施例26
制备蛋白酶K液体酶制剂:选择实施例1中经缓冲液置换浓缩后的蛋白浓度为22.1mg/mL,比活力为49.4U/mg的蛋白酶K酶液,加入缓冲液:50mM pH 6.0乙酸-乙酸钠,保护剂则采用复配的保护剂,复配配方参加下表1,防腐剂:0.01%叠氮钠,Ca2+0.5mM。其余不同的保护剂同样可参照此浓度配制液体蛋白酶K。
表1不同保护剂复配对PRK液体酶活力的影响
注:所有调配好的样品置于37℃孵育1个月后和4℃对照样品检测残余蛋白活力,标记“–”的为不添加,标记为“+”的为添加,甘油保护剂量按照20%添加,其余保护剂按照蛋白量的5%添加,除保护剂外,另加Ca2+0.5mM,0.01%NaN3。
蛋白酶K液体酶制剂在37℃的储存稳定性:取10mL蛋白酶K液体酶制剂样品封口置于37℃培养箱中保存1个月,检测残余活力。结果表明,随机复配的各保护剂均可以很好地起到长期的保护作用。
实施例27~实施例35:金属离子保护剂的浓度对PRK液体酶稳定性影响
制备蛋白酶K液体酶制剂:将实施例1经离子交换纯化得到的蛋白酶K酶液用pH6.0的乙酸-乙酸钠buffer进行超滤置换并浓缩至45mg/ml,按照酶液和甘油体积比1:1加入甘油混匀,添加防腐剂:0.01%叠氮钠,按照10mL的规格分装至不同的离心管中;再配制1M的pH 6.0的Ca2+(以CaCl2为例)盐溶液(用NaOH和HCl调pH)作为母液,向各装有蛋白酶K的离心管中加入不同量的CaCl2溶液母液,保证各离心管中的Ca2+终浓度为0mM(实施例27)、0.01mM(实施例28)、0.05mM(实施例29)、0.1mM(实施例30)、0.5mM(实施例31)、1mM(实施例32)、2mM(实施例33)、5mM(实施例34)、10mM(实施例35)。
蛋白酶K液体酶制剂在37℃的储存稳定性:取10mL蛋白酶K液体酶制剂样品封口置于37℃培养箱中保存1个月,检测和4℃储存下的蛋白残余活力。结果如图3所示,添加适量浓度的Ca2+可以将PRK的酶活力提高30%左右,最重要的是,加入适量Ca2+可以明显提升酶在37℃的储存稳定性,推荐最佳添加量为0.1-1mM。
实施例36~实施例56:PRK液体制剂的防腐抑菌实验
PRK在分子层面使用过程中,杂酶活力会影响最终实验结果的准确性,杂酶,例如DNase、RNase可能是由于液体长时间放置导致一些微生物生长,这些微生物会滋生出一些DNase和RNase,从而导致液体酶制剂中的杂酶残留增加,进而影响产品的品质。向液体制剂中适量加入一些防腐剂可以有效的解决此问题。
制备蛋白酶K液体酶制剂:将实施例1得到的离子交换纯化后的PRK酶液用pH 6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液进行超滤置换并浓缩至45mg/mL,按照酶液和甘油体积比1:1的比例加入甘油并混匀,按照10mL的规格分装至不同的离心管中;再配制1M的pH 6.0的CaCl2溶液(用NaOH和HCl调pH),向分装有酶液的各离心管中加入CaCl2溶液,使得Ca2+终浓度为0.1mM,再加入0.1%叠氮钠(实施例36)、0.1%硫柳汞(实施例37)、0.1%庆大霉素(实施例38)、0.1%PC300(实施例39)、0.1%ε-多聚赖氨酸(实施例40),或者,复配的防腐剂(实施例41~56)。
蛋白酶K液体酶制剂的相对活力的检测:同时检测储存在4℃和其他不同温度下的酶液的蛋白比活力,计算相对活力。结果如图4所示,与不添加防腐剂的对照组相比,实施例36~40加入不同种类的保护剂对PRK的活力均无影响,活力基本保持不变。
DNase、RNase和微生物负载量的检测:将实施例36~56所得蛋白酶K液体酶制剂放入37℃培养箱中孵育一个月,检测酶液中的DNase、RNase和微生物负载量,以及残余活力,检测方法如实施例1所述。检测结果如表2所示,添加防腐剂对微生物生物负载有明显的抑制效果,否则,滋生的细菌和真菌会导致DNase和RNase杂酶的明显提高。防腐剂无论是单独添加还是复配添加均可以起到同等的防腐作用。
表2不同防腐剂及其复配对液体酶制剂蛋白活力、DNase、RNase和生物负载影响
注:所有调配好的样品置于37℃孵育1个月后,与于4℃储存的对照样品同时检测酶活力,然后计算残余蛋白活力,标记“–”的为不添加,标记为“+”的为添加,复配的防腐剂均按照总量0.1%加入,例如两种复配就各添加0.05%,四种防腐剂复配各添加0.025%,除防腐剂外,保护剂为20%甘油,Ca2+0.5mM。
实施例57:PRK液体酶调配后的制剂稳定性实验
制备蛋白酶K液体酶制剂:确保液体酶制剂的各成分均不含微生物污染、RNase和DNase污染;蛋白酶K的蛋白比活力44.3U/mg。白酶K液体酶制剂中各成分的终浓度分别为PRK酶液浓度21.6mg/ml,保护剂甘露醇10%(蛋白和保护剂质量比),金属离子保护剂Ca2+浓度1mM,防腐剂PC300添加量0.1%,调配均匀后需要对上述所有性质进行复检,合格后进行无菌管密封分装。
蛋白酶K液体酶制剂在室温的储存稳定性:将分装后的蛋白酶K液体酶制剂在室温条件下储存1年,检测残余活力。
蛋白酶K液体酶制剂在25℃的储存稳定性:将分装后的蛋白酶K液体酶制剂在25℃、50%湿度条件下储存1年,检测残余活力。
本实施例的PRK液体酶制剂的比活力为956U/mL,且无DNase、RNase和微生物污染。结果如图5和图6所示,室温和25℃储存1年的残余活力均在90%以上,60℃半衰期则无明显变化。
蛋白酶K液体酶制剂在42℃的储存稳定性:将分装后的蛋白酶K液体酶制剂在42℃、50%湿度条件下储存10d,检测残余活力。如表3所示,与存放在4℃的蛋白酶K液体酶制剂相比,于42℃储存10d的蛋白酶K液体酶制剂的比活力、60℃半衰期、DNase含量、RNase含量、生物负载量均无显著变化。这显示了本发明提供的液体PRK制剂具有极好的稳定性,可以简化PRK产品在应用端和运输端的稳定性问题,同时,液体状态的制品也避免了冻干过程造成的活力损失。
表3液体酶PRK制剂在42℃加速10天的性质检测
实施例58:蛋白酶K液体酶制剂在分子生物学实验中的应用
蛋白酶K在分子生物学中的应用主要体现在核酸提取方面。蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳,如组织细胞(包括石蜡包埋组织)、绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)、唾液、局部分泌物、尿,粪便等。例如蛋白酶K在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中的应用,大多数临床实验室采用实时荧光定量PCR(qPCR)对SARS-Cov-2进行核酸检测。然而,SARS-Cov-2核酸检测的阳性率并不高。其中,核酸提取效率是影响其检出率的重要元素之一。因为蛋白酶K(PRK)对生物标本中的蛋白质进行消化,同时还可降解标本中的RNA核酸酶,阻止RNA被降解,对标本进行PRK预处理可能会提高核酸的提取效率,从而降低其循环阈值(Ct值),提高阳性检出率。目前,国内大量研发了SARS-CoV-2的qPCR检测试剂盒,其中有9个已经获得了国家药品监督管理局批准。在符合国家药品监督管理局批准程序的临床试验中,所有试剂盒与确诊病例标本的灵敏度均超过90%。证明了蛋白酶K在核酸提取应用方面的不可替代作用,目前以此配方配制出的蛋白酶K液体容易可以较好的匹配在核酸提取这一方面的应用。
实施例59:蛋白酶K液体酶制剂在体外诊断中的应用
蛋白酶K在体外诊断中的应用主要是体现在用于检测糖化血清白蛋白(GA)。糖化血清白蛋白(GA)是血清白蛋白被葡萄糖糖化之后的产物,即血清白蛋白的赖氨酸残基上的ε-氨基基团被糖化。糖化白蛋白半衰期较短,测定糖化白蛋白的浓度可有效反映患者过去2~3周内平均血糖的水平,并不受临时血糖浓度波动的影响。
目前,临床广泛采用果糖氨基酸氧化酶(FAOD)法测定GA含量,该法在测定GA时,需要先用蛋白酶将糖化白蛋白酶解为糖化氨基酸,然后用特异性的果糖氨基酸氧化酶进行氧化,再偶联Trinder’s反应进行显色定量。已有的研究表明,用单纯的蛋白酶体系进行糖化白蛋白的酶解反应,需要数十分钟甚至数小时才能将高浓度的糖化白蛋白酶解完全,而应用于全自动生化分析仪的FAOD检测法通常要求GA的酶解效率在180~600s内达到90%以上。本发明的蛋白酶K液体酶制剂的性质与竞品PRK相比,起到了同样的应用效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.一种蛋白酶K液体酶制剂,其特征在于,主要包括蛋白酶K、缓冲液、Ca2+、保护剂、防腐剂,或者还含有其他不影响蛋白酶K性质和应用的成分;其中,蛋白酶K的浓度10mg/ml≤C≤60mg/ml,缓冲液浓度为10mM-200mM,Ca2+浓度为0.01-10mM,固体形式的保护剂的添加量是蛋白质量的1%-200%,液体形式的保护剂的添加量是酶液体积的10%-200%,防腐剂的总添加量是0.01%-0.5%。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂,其特征在于,所述蛋白酶K是来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)或布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)的蛋白酶K,通过基因工程手段表达得到或者从野生菌中分离提取得到。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂,其特征在于,所述蛋白酶K无杂酶和微生物污染,所述微生物包括常见细菌和真菌类微生物。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂,其特征在于,所述缓冲液包括但不限于乙酸-乙酸钠、Tris-HCl、甘氨酸-NaOH缓冲液,其中pH 5.0-pH 7.0为乙酸-乙酸钠缓冲液,pH 7-pH 9的为Tris-HCl缓冲液,pH 9-pH 11的为甘氨酸-NaOH缓冲液,缓冲液的用量为10mM-200mM。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂,其特征在于,所述Ca2+是以可溶性钙盐的形式添加到蛋白酶K液体酶制剂中,包括以氯化钙、乙酸钙、葡萄糖酸钙、磷酸二氢钙、硝酸钙、碳酸氢钙、硫酸氢钙、亚硫酸氢钙、次氯酸钙中的一种和几种复配的形式添加到制剂中,其中Ca2+的用量为0.01-10mM。
6.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂,其特征在于,所述保护剂选自丙三醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、PEG系列,可以是其中的一种,也可以是多种的复配,所述固体保护剂的用量为蛋白总量的1%-200%,液体形式的保护剂的添加量是酶液体积的10%-200%。
7.根据权利要求1所述的一种蛋白酶K液体酶制剂,其特征在于,所述防腐剂是叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、PC300、ε-多聚赖氨酸中的一种或者是几种的复配,用于在液体酶制剂的存储、使用过程中抑制微生物的生长、繁殖,所述防腐剂的用量为0.01%-0.05%。
8.权利要求1-7任一所述的蛋白酶K液体酶制剂在分子生物学和体外诊断试剂中的应用。
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