CN108431219A

CN108431219A - α-淀粉酶的液体制剂

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Publication number: CN108431219A
Application number: CN201680072983.7A
Authority: CN
Inventors: Y·韩
Original assignee: BASF Enzymes LLC
Current assignee: BASF Enzymes LLC
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-08-21
Also published as: EP3390626A1; EP3390626A4; US20190100738A1; WO2017106633A1; CA3007668A1; BR112018011954A2

Abstract

本公开书涉及含有一种或多种α‑淀粉酶的液体酶制剂，其用于淀粉处理，其中酶制剂的pH是大约pH 6.0‑8.0，以及应用所述液体酶制剂的方法。本公开书还涉及制备具有提高的稳定性的含有一种或多种α‑淀粉酶的液体酶制剂的方法，该方法包括将液体酶制剂的pH滴定至pH 6.0‑8.0的范围。

Description

α-淀粉酶的液体制剂

参照经EFS-WEB提交的序列表

本申请包括计算机可读形式(CRF)的氨基酸序列表，并符合37C.F.R.1.821～1.825的要求。本申请的序列表正通过MPEP§502.05中授权和提出的EFS-WEB服务器提交至USPTO。本申请的序列表以如下文指出的ASC II文本(.txt)文件提交，并在此将其全部引入本申请的说明书中作为参考，并用于所有目的。

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			SEQUENCELISTING_160035WO01	2016年12月16日	51.5KB(52,743字节)

背景

本公开书涉及含有一种或多种α-淀粉酶的液体酶制剂。α-淀粉酶可用于各种工业用途例如淀粉加工、食品生产、生物燃料、清洁产品、动物饲料或者纸浆和提高油采收。本公开书还涉及制备和利用具有提高的稳定性的含有一种或多种酶例如α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶的液体酶制剂的方法。

目前，一些α-淀粉酶制剂使酶保持于高的pH(pH 10.7)环境。在高pH制剂中的α-淀粉酶在所述高pH范围可具有降低的稳定性，这可导致缩短的产品保存期限。此外，对于高pH制剂，存在很少的稳定、相容和监管批准的缓冲剂。没有缓冲剂，α-淀粉酶制剂的pH会是不稳定的，并且随时间推移，可能偏向更低。此外，因为食品级防腐剂在所述pH范围不能非常好地工作，所以由于缺少起作用的防腐剂，存在微生物产长的可能性。尽管高pH起始具有一些抗微生物作用，但是pH最终降低。制剂还可能与大多数其他酶产品的常规制剂不相容，所述常规制剂通常是中性或略微酸性的pH范围。有时，淀粉水解期间，将两种不同性质的α-淀粉酶混合是有利的。例如，将高温活性的α-淀粉酶与低温活性的α-淀粉酶混合可以促进淀粉分解成寡糖，并降低原料的粘性。由于不同酶制剂的极端的pH差异，将具有高pH制剂的α-淀粉酶与具有低pH制剂的不同酶混合是困难的。

概述

文中公开的一些实施方案提供液体酶制剂，其含有：(a)α-淀粉酶；(b)缓冲剂；(c)稳定剂；和(d)防腐剂，其中酶制剂的pH是大约pH 6.0-8.0。

在一些实施方案中，液体酶制剂的pH是大约pH 6.3-6.7。在一些实施方案中，稳定剂包括蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、海藻糖、氯化钠、硫酸钠或其任何组合。在一些实施方案中，稳定剂是甘油。在一些实施方案中，甘油是大约30％至大约75％的浓度。在一些实施方案中，甘油是大约30％至大约70％的浓度。在一些实施方案中，甘油是大约30％至大约65％的浓度。在一些实施方案中，甘油是大约30％至大约50％的浓度。在一些实施方案中，甘油是大约38％至大约42％的浓度。在一些实施方案中，缓冲剂包括柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、乙酸钠、乙酸、磷酸钠、磷酸钾或其任何组合。在一些实施方案中，缓冲剂包括柠檬酸钠。在一些实施方案中，柠檬酸钠是大约0.1％至大约2.0％的浓度。在一些实施方案中，柠檬酸钠是大约0.1％至大约0.6％的浓度。在一些实施方案中，α-淀粉酶在4-40℃的温度下，保持其至少90％的活性。在一些实施方案中，α-淀粉酶在25-30℃的温度下，保持其至少90％的活性。在一些实施方案中，α-淀粉酶保持其至少90％的活性持续1年。在一些实施方案中，α-淀粉酶具有至少1年的保存期限。在一些实施方案中，α-淀粉酶在25℃下具有至少1年的保存期限。在一些实施方案中，防腐剂包括：山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸、苯甲酸钠、苯甲酸、尼泊金甲酯、丙酸钙、丙酸钠、丙酸铵、丙酸或其任何组合。在一些实施方案中，液体酶制剂包含至少两种防腐剂。在一些实施方案中，所述至少两种防腐剂包括尼泊金甲酯和山梨酸钾。在一些实施方案中，尼泊金甲酯是大约0.0％至大约0.3％的浓度。在一些实施方案中，尼泊金甲酯是大约0.1％的浓度。在一些实施方案中，尼泊金甲酯是大约0.1％至大约0.5％的浓度。在一些实施方案中，山梨酸钾是大约0.2％的浓度。在一些实施方案中，液体酶制剂包含：(a)α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列；(b)柠檬酸钠；(c)甘油；和(d)山梨酸钾，其中酶制剂的pH是大约pH 6.3-6.7。在一些实施方案中，液体酶制剂包含：(a)α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列；(b)柠檬酸钠和柠檬酸；(c)甘油；和(d)山梨酸钾和尼泊金甲酯，其中酶制剂的pH是大约pH 6.3-6.7。

在一些实施方案中，α-淀粉酶包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所述氨基酸序列中的任何一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，液体酶制剂包含第二种酶。在一些实施方案中，第二种酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶及其任何组合。

文中公开的一些实施方案提供制备液体酶制剂的方法，其包含：(a)提供含有α-淀粉酶的组合物，其中所述组合物具有大约8.0至大约10.5的pH值；(b)向含有α-淀粉酶的所述组合物中加入稳定剂，以得到液体酶制剂；和(c)将液体酶制剂的pH滴定至pH 6.0-8.0的范围。

在一些实施方案中，步骤(c)包括将液体酶制剂的pH滴定至pH 6.3-6.7的范围。在一些实施方案中，滴定步骤包括向液体酶制剂中加入缓冲的柠檬酸钠贮备溶液。在一些实施方案中，将缓冲的柠檬酸钠贮备溶液加至终浓度0.1-2.0％。在一些实施方案中，将缓冲的柠檬酸钠贮备溶液加至终浓度0.1-0.6％。在一些实施方案中，稳定剂包括甘油。在一些实施方案中，将甘油加至终浓度30-75％。在一些实施方案中，将甘油加至终浓度30-50％。在一些实施方案中，将甘油加至终浓度38-42％。

文中公开的一些实施方案提供液体酶制剂的用途，其包括：(a)提供包含α-淀粉酶、缓冲剂、稳定剂和防腐剂的液体酶制剂，其中所述液体酶制剂的pH值是约pH 6.0-8.0；(b)提供淀粉；和(c)使液体酶制剂与淀粉接触，由此水解淀粉。

在一些实施方案中，液体酶制剂的pH是大约pH 6.3-6.7。在一些实施方案中，液体酶制剂用于生产食品成分、食品产品、燃料、醇/酒精(alcohol)、清洁产品例如除垢剂、个人护理产品例如化妆品、动物饲料、纸、纸浆、纸产品或基于淀粉的产品。在一些实施方案中，液体酶制剂用于油气井作业(oil and gas well operation)，在另一实施方案中，油气井作业是提高油采收(enhanced oil recovery)。

附图简述

图1显示解释说明文中公开的制剂方法的非限制性实施方案的示例性流程图。

图2显示在6个月时，含有尼泊金甲酯的高pHα-淀粉酶酶制剂(三个不同生产批次)的酶稳定性。α-淀粉酶的酶制剂包含40％甘油、0.1％尼泊金甲酯，和pH 10.7。将样品分别贮存在5℃、22℃、30℃和37℃下。

图3显示在6个月时，不含尼泊金甲酯的高pHα-淀粉酶酶制剂(三个不同生产批次)的酶稳定性。α-淀粉酶的酶制剂包含40％甘油，和pH 10.7。将各种样品分别贮存在5℃、22℃、30℃和37℃下。

图4A、4B&4C显示在6个月时，示例性低pHα-淀粉酶(SEQ ID NO:1)酶制剂(三个不同生产批次)的酶稳定性。α-淀粉酶酶制剂包含40％甘油、0.2％山梨酸钾、0.1％尼泊金甲酯、pH 6.5和5mM、10mM或20mM的柠檬酸钠。将样品分别贮存在4℃、25℃和40℃下。

图5A&5C显示在6个月时，两种不同pH的α-淀粉酶酶制剂(三个不同生产批次)之间的酶稳定性比较。高pHα-淀粉酶的酶制剂包含40％甘油、0.1％尼泊金甲酯和pH 10.7；低pHα-淀粉酶的酶制剂包含40％甘油、0.1％尼泊金甲酯、0.2％山梨酸钾、10mM柠檬酸钠、pH6.5。将三个酶生产批次的每个配制成两种不同的制剂。将样品分别贮存在4℃、25℃、30℃和40℃下。

图6显示在12个月时，两种不同pH的α-淀粉酶酶制剂之间的酶稳定性比较。高pHα-淀粉酶的酶制剂包含40％甘油、0.1％尼泊金甲酯和pH10.7；低pHα-淀粉酶的酶制剂包含40％甘油、0.1％尼泊金甲酯、0.2％山梨酸钾、10mM柠檬酸钠、pH 6.5。将同一酶生产批次配制成两种不同的制剂。将样品分别贮存在4℃、25℃、30℃和40℃下。

图7A&7C显示在5个月时，高pH的两种不同α-淀粉酶酶制剂(三个不同生产批次)之间的酶稳定性比较。制剂A含有40％甘油、0.1％尼泊金甲酯、0.2％山梨酸钾、10mM柠檬酸钠、pH 6.5；制剂B含有50％甘油、0.2％山梨酸钾、10mM柠檬酸钠、pH 6.5。将三个酶生产批次的每个配制成两种不同的制剂。将样品分别贮存在4℃、25℃、30℃和40℃下。

详述

当前的α-淀粉酶高pH制剂包含40％w/v甘油、0.1％w/v尼泊金甲酯、pH 10.7。选择pH 10.7是由于在较低pH下有限的酶溶解度，以及下游回收后，经宽量程将pH向下滴定的处理困难。高pH制剂不提供必需的产品稳定性，因为其是未缓冲的，随时间推移发生的pH漂移在散装运输(bulk shipment)、仓库贮存或工厂产品储存期间，产生继发的微生物污染和商业损失风险。本公开书提供含有α-淀粉酶制剂的液体酶制剂，所述α-淀粉酶制剂具有中性或酸性pH，用于增加稳定性和保存期限。

定义

术语“液体酶制剂”意指含有酶的液体组合物。在一些实施方案中，液体酶制剂还包含缓冲剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，酶是α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶或所述酶的任何组合。

酶是含有氨基酸序列的生物分子，其中酶可催化反应。根据生物化学和分子生物学国际联合会命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union ofBiochemistry and Molecular Biology(IUBMB))的推荐，酶名称是本领域技术人员已知的。酶名称包括：EC(Enzyme Commission)编号、推荐名称、别名(如果有的话)、催化活性和其他因素。酶还指多肽、蛋白质、肽、氨基酸序列或者在本公开书中通过SEQ ID NO.标识。

如果在至少大约65℃至大约95℃或者大于95℃的温度下高温处理后，酶保持基本量的活性，那么酶是“热稳定的”。在一些实施方案中，热稳定的酶保持其酶活性的至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

淀粉可以是任何原始的(virgin)、改性的或降解的淀粉或者多糖/寡糖。原始淀粉可以由直链淀粉、支链淀粉(amylopectin)或其混合物组成。改性淀粉可以包括氧化淀粉、淀粉酯或淀粉醚。

被考虑的淀粉类型包括原始淀粉例如土豆淀粉；小麦淀粉、玉米淀粉、米淀粉或基于其他谷类的淀粉；或者木薯淀粉，优选玉米淀粉。淀粉还能是来源于植物或农业残余物(agricultural residue)的含有淀粉组分的任何生物质。还可以使用化学改性淀粉，例如羟乙基或羟丙基淀粉或者含阴离子基团的淀粉例如磷酸淀粉(phosphate starch)或者含季铵基团的阳离子淀粉，优选取代度DS为0.01-0.2。所述取代度DS表示淀粉中每一葡萄糖单位平均存在的阳离子基团的数目。特别优选的是两性淀粉，其不仅含有季铵基团，而且含有阴离子基团例如羧酸盐和/或磷酸盐基团，并且其还可以任选进行化学修饰，例如是已被羟基烷基化的或烷基-酯化的。可将淀粉单独使用或者相互地以任何需要的混合物使用。

淀粉可以与其他半纤维素或多糖一起存在，所述半纤维素或多糖例如但不限于半乳甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醛酸木聚糖(glucuronoxylans)、葡糖甘露聚糖、木糖葡聚糖(例如罗望子种子面粉(Tamarind seed flour))、果胶/果胶酸盐、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖。在其中所用淀粉含有其他多糖的情况下，任选的是半纤维素酶或多糖酶可以与淀粉酶组合使用，用于本公开书的表面淀粉组合物的制备。在一选项中，可以使用来自BASF的木聚糖酶(例如Luminase ^TM PB-100、Luminase ^TMPB-200)。事实上，使用来自任何供应商的半纤维素酶、木聚糖酶、纤维素酶和其他酶，包括来自Novozymes、Dyadic、Dupont和BASF的。如果淀粉原料含有蛋白质和脂肪，可任选地将蛋白酶和脂肪酶与上述包括淀粉酶的酶组合使用。

本公开书中所用的淀粉优选是天然淀粉或者基本未改性的淀粉。一个示例是来自Tate&Lyle的Pearl淀粉。然而，所用的淀粉还可以是任何改性或部分改性的淀粉，如经下述改性的淀粉：热处理、热-机械处理、酸水解、氧化、酯衍生化(例如乙酸淀粉、磷酸淀粉)、醚修饰或羟基-烷基衍生化(例如羟丙基淀粉、羟乙基淀粉或乙基化淀粉、磷酸羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、各种阳离子淀粉和先前酶改性淀粉，以及预胶化淀粉。常规示例包括来自A.E.Staley、Penford(Ingredion)、Tate&Lyle、ADM、Cargill、Rasio、Roguette和Amylum等的工业淀粉。

如文中所用，“碳水化合物”、“糖(saccharide)”或“糖(sugar)”指由碳(C)、氢(H)和氧(O)原子构成的大分子，通常具有2:1的氢：氧原子比率(如在水中)；换言之，具有经验式Cm(H2O)n(其中m可不同于n)。多糖可含有多于一个糖，并用于能量贮存。单糖仅含有一个糖单元，并且二糖可含有两个糖单元或者两个连接的单糖。

“缓冲剂”意指加入另一种酸或碱后，用于维持溶液的酸性(pH)接近所选值的弱酸或碱。

“稳定剂”意指使酶的不稳定性最小化并由此维持其稳定性的化学物质。酶的不稳定性可能是归因于构象的不稳定性、胶体不稳定性或者化学降解，其可导致酶活性的丧失。稳定剂的示例包括但不限于糖、多元醇和盐。

“防腐剂”是杀灭微生物或抑制其生长的物质，其包括消毒剂、抗菌剂(antiseptics)和抗生素等。

文中所用的术语“包含”与“包括”、“含有”或者“特征为”同义，并且是包括在内的或者开放的，其意指未提及的另外的元素或者未提及的方法步骤可以在本公开书的范围内。

应该理解：文中所述的本发明的方面和实施方案包括“由……构成”和/或“基本由……构成”的方面和实施方案。

贯穿本公开书，各种方面以范围形式提供。应该理解：范围形式的描述仅用于方便和简洁，并且不应该理解为对本公开书范围的僵硬限制。因此，范围的描述应考虑为含有具体公开的所有可能的亚范围，以及所述范围内的个体数值。例如，范围的描述诸如1-6应考虑为包含具体公开的亚范围例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及所述范围内的个体数值例如1、2、3、4、5和6。不考虑范围的宽度，这都是适用的。

根据下述说明以及附图，本公开书的其他目的、优点和特征将变得明显。

在下文描述中，提出众多具体的细节，以提供对本公开书的更彻底的理解。然而，在没有一个或多个所述具体细节的情况下，可以实施本公开书的方法，这对本领域技术人员将是显而易见的。在其他情况下，未描述众所周知的特征和本领域技术人员众所周知的方法，以避免使本公开书变得模糊。

液体酶制剂

文中公开的一些实施方案提供包含α-淀粉酶和缓冲剂的液体酶制剂，其中酶制剂的pH是大约pH 6.0-8.0。在一些实施方案中，液体酶制剂包含稳定剂。在一些实施方案中，液体酶制剂包含防腐剂。

酶是含有氨基酸序列的生物分子，其中酶可催化反应。根据生物化学和分子生物学国际联合会命名委员会(IUBMB)的推荐，酶名称是本领域技术人员已知的。酶名称包括：EC(Enzyme Commission)编号、推荐名称、别名(如果有的话)、催化活性和其他因素。酶还已知为多肽、蛋白质、肽、氨基酸序列或者在本公开书中通过SEQ ID NO.标识。在本公开书中，酶的别称可以互换使用。“α-淀粉酶”是催化1,4-α-D-葡糖苷连接水解，来降解多糖、寡糖和/或淀粉成为葡萄糖亚单位的酶。α-淀粉酶的酶分类是EC 3.2.1.1。

文中公开的液体酶制剂可以是适合于其中所含酶的稳定性和维持其中所含的酶活性的pH。例如，液体酶制剂的pH可以是这样的值，其是、大约是、是低于pH 6.0、pH 6.1、pH6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0或者上述任意两个值之间的范围。在一些实施方案中，液体酶制剂的pH是大约pH 6.0-7.5、pH 6.0-7.0、pH 6.0-6.7或pH 6.3-6.7。

各种适当的缓冲剂可用于调节文中公开的液体酶制剂的pH。例如液体酶制剂可包含缓冲剂，其选自：柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、乙酸钠、乙酸、磷酸钠、磷酸钾及其任何组合。在一些实施方案中，液体酶制剂包含缓冲剂，其是柠檬酸钠。柠檬酸钠可以以下述浓度包括于液体酶制剂中，所述浓度是、大约是、是低于、是大于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1.0％(w/v)、1.1％(w/v)、1.2％(w/v)、1.3％(w/v)、1.4％(w/v)、1.5％(w/v)、1.6％(w/v)、1.7％(w/v)、1.8％(w/v)、1.9％(w/v)、2.0％(w/v)或者任何上述两个值之间的范围。在一些实施方案中，液体酶制剂中，柠檬酸钠是0.1-2.0％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，液体酶制剂中，柠檬酸钠是0.1-0.6％(w/v)的浓度。

各种适当的稳定剂可包括于文中公开的液体酶制剂中。例如，液体酶制剂可包含稳定剂例如蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、海藻糖、氯化钠、硫酸钠或其任何组合。在一些实施方案中，液体酶制剂包含稳定剂，其是甘油。甘油可以以下述浓度包括于液体酶制剂中，所述浓度是、大约是、是低于、是大于30％(w/v)、31％(w/v)、32％(w/v)、33％(w/v)、34％(w/v)、35％(w/v)、36％(w/v)、37％(w/v)、38％(w/v)、39％(w/v)、40％(w/v)、41％(w/v)、42％(w/v)、43％(w/v)、44％(w/v)、45％(w/v)、46％(w/v)、47％(w/v)、48％(w/v)、49％(w/v)、50％(w/v)、51％(w/v)、52％(w/v)、53％(w/v)、54％(w/v)、55％(w/v)、56％(w/v)、57％(w/v)、58％(w/v)、59％(w/v)、60％(w/v)、61％(w/v)、62％(w/v)、63％(w/v)、64％(w/v)、65％(w/v)、66％(w/v)、67％(w/v)、68％(w/v)、69％(w/v)、70％(w/v)、71％(w/v)、72％(w/v)、73％(w/v)、74％(w/v)、75％(w/v)或者任何上述两个值之间的范围。在一些实施方案中，液体酶制剂中，甘油是30-75％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，液体酶制剂中，甘油是30-70％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，液体酶制剂中，甘油是30-65％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，液体酶制剂中，甘油是30-50％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，液体酶制剂中，甘油是38-42％(w/v)的浓度。

文中公开的液体酶制剂已提高稳定性特性。例如，文中公开的液体酶制剂的α-淀粉酶可在高温下高百分比地保持其活性，持续一段长时间，并由此液体酶制剂具有较长的保存期限。文中所用的“保存期限”指酶开始失去其酶活性之前，液体酶产品可在特定温度下贮存多长时间。在一些实施方案中，α-淀粉酶在例如4-40℃温度下，保持其活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，α-淀粉酶在25-30℃的温度下，保持其活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，α-淀粉酶保持其活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，持续1年。在一些实施方案中，α-淀粉酶具有至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长的保存期限。在一些实施方案中，α-淀粉酶在25℃下具有至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长的保存期限。在一些实施方案中，α-淀粉酶在37℃下具有至少2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长的保存期限。

根据文中所述，液体酶制剂可含有各种防腐剂，例如山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸、苯甲酸钠、苯甲酸、尼泊金甲酯、丙酸钙、丙酸钠、丙酸铵、丙酸或其任何组合。在一些实施方案中，文中公开的液体酶制剂不含防腐剂。在一些实施方案中，文中公开的液体酶制剂仅含一种防腐剂例如山梨酸钾。在一些实施方案中，文中公开的液体酶制剂包含至少两种防腐剂例如尼泊金甲酯和山梨酸钾。尼泊金甲酯可以以下述浓度包括于液体酶制剂中，所述浓度是、大约是、是低于、是大于0.00％(w/v)、0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)或者任何上述两个值之间的范围。在一些实施方案中，在液体酶制剂中，尼泊金甲酯是0.05-0.3％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，在液体酶制剂中，尼泊金甲酯是0.1％(w/v)的浓度。山梨酸钾可以以下述浓度包括于液体酶制剂中，所述浓度是、大约是、是低于、是大于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)或者任何上述两个值之间的范围。在一些实施方案中，在液体酶制剂中，山梨酸钾是0.1-0.5％(w/v)的浓度。在一些实施方案中，在液体酶制剂中，山梨酸钾是0.2％(w/v)的浓度。

在一些实施方案中，在液体酶制剂中，液体酶制剂可以以0.1-2.0％(w/v)的浓度包含柠檬酸钠，以30-75％(w/v)的浓度包含甘油，以0.0-0.3％(w/v)的浓度包含尼泊金甲酯，以及以0.1-0.5％(w/v)的浓度包含山梨酸钾。在一些实施方案中，在液体酶制剂中，液体酶制剂可以以0.1-0.6％(w/v)的浓度包含柠檬酸钠，以38-50％(w/v)的浓度包含甘油，以0.1％(w/v)的浓度包含尼泊金甲酯，以及以0.2％(w/v)的浓度包含山梨酸钾。

文中公开的一些实施方案提供具有淀粉酶活性的多肽，及其在食品、生物燃料、清洁产品、动物饲料或者纸浆等生产中以及提高油采收等中的用途。在一些实施方案中，淀粉酶可以是热稳定的α淀粉酶，例如源自细菌(例如芽孢杆菌属(Bacillus))或者真菌的热稳定的α淀粉酶，或者所述酶的任何组合(混合物)。

在一些实施方案中，α淀粉酶包含或具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14之一中提到的氨基酸序列。

在一些实施方案中，α淀粉酶是母体α淀粉酶的变体，其包含或者具有与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14中任何一个提到的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，α淀粉酶是下述专利申请中公开的α淀粉酶之一：WO2014007921、WO2011017093、WO2010074999、WO1994019454、WO2010008841、WO2011080352、WO2011080354、WO2011082429、WO199744361、WO2002068589、WO202068597、WO2002092802、WO2003083054、WO2004091544、WO2009020459、WO2013116175、WO2013148163、WO2008080093和WO2003018766。将所述专利申请的内容以其全部引入文中作为参考。

在一些实施方案中，α淀粉酶是FUELZYME^TM(BASF Enzymes LLC，San Diego，CA)。适合用于文中公开的方法和组合物的淀粉酶的其他非限制性示例包括：来自Novozymes的XTRA、CL、Alpha、RSL、FRED、LT 300、AmyS、AmyL、480L、Supra、SCDS、MAX-LIFE^TMP100、Maltogenase L、L、SC、SC、Veretase、SC4x、Supra 2.8、supra 2、X、120L、ALPHA、AA、Optitherm^TM和Takatherm^TM、Keistase^TM、Avantec。

除了α淀粉酶，文中公开的液体酶制剂可包括一种或多种另外的酶。在一些实施方案中，液体酶制剂包含第二种酶。在一些实施方案中，第二种酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶及其任何组合。在一些实施方案中，液体酶制剂包含两种或多种酶。例如，液体酶制剂可包含α淀粉酶、第二种酶和第三种酶。第三种酶可以是例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶或其任何组合。

在一些实施方案中，液体酶制剂包含纤维素酶或其变体。在一些实施方案中，纤维素酶是PCT公开文本WO 2009/020459(将其全部公开书引入文中作为参考)中所述的来源于超嗜热菌(hyperthermophilic bacteria)的任何纤维素酶和/或其非天然存在的变体。

在一些实施方案中，液体酶制剂包含β-葡糖苷酶或其变体。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶可以是市售产品或其任何混合物。在一些实施方案中，β-葡糖苷酶可以是来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima，BGT)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium，BGP)或者黑曲霉菌(Aspergillus niger，BG)(Sigma，St.Louis，MO)的任何β-葡糖苷酶。

制备液体酶制剂的方法

文中公开的一些实施方案提供制备液体酶制剂的方法，其中所述方法包括将液体酶制剂的pH滴定至pH 6.0-8.0的范围。在一些实施方案中，所述方法包括提供包含α-淀粉酶的组合物的步骤，其中所述组合物具有大约pH 8.0-10.5的pH。在一些实施方案中，所述方法包括将稳定剂加入含有α-淀粉酶的组合物中以得到液体酶制剂的步骤。

图1中所示的流程图解释说明根据文中公开的实施方案制备液体酶制剂的方法100的非限制性示例。如图1中所示，方法100可包括如通过一种或多种操作110-160所示的一种或多种功能、操作或行动。

方法100可以以任选的操作110“得到回收材料”开始。回收通常还称作下游回收，其是在发酵液中从表达微生物中分离酶的处理，并且可以将酶进一步浓缩、纯化、精制、洗涤或者在溶液中缓冲交换。在回收处理后但在配制步骤前，有时还称作酶浓缩物的回收材料含有在浓缩溶液中的酶。操作110之后可以是操作120“预配制(Pre-formulation)”。在该步骤中，向最终的配制产品中加入其他制剂成分和另外的调节剂之前，可将稳定剂加入到回收材料中，以初始地稳定酶。操作120之后可以是任选操作130“向预配制混合物中加入防腐剂”。操作130之后可以是任选操作140“小体积pH滴定试验”。在所述试验中，加入特定pH的浓缩的酸性缓冲液的贮备液，并逐渐混合至预配制混合物中，并测量溶液的pH。当溶液的pH达到最终制剂的目标范围时，记录需要的贮备缓冲溶液的体积。如果初次测试中使用太多体积的缓冲贮备液，可能需要较低pH的另外的缓冲贮备液来重复滴定试验。滴定试验的目的是确定所需酸性缓冲贮备溶液的精确pH和体积，以便在最终制剂中的缓冲试剂的浓度范围内，最终制剂溶液达到目标pH范围。在一些实施方案中，无另外的强酸用于pH滴定。在一些实施方案中，将设定体积的缓冲贮备液加入到预配制混合物中，然后在滴定试验中，用强酸将最终pH调节至制剂目标。记录所用的缓冲贮备液和酸的精确体积。操作140之后可以是操作150“滴定液体酶制剂的pH”。所述步骤可以基于操作140的结果来完成。将酸性缓冲贮备液和强酸的体积和pH要求按比例放大至整个生产体积。操作150之后可以是任选操作160“得到最终配制的液体产品并包装”。

图1中，操作110-160被解释说明从操作110开始并以操作160结束依次完成。然而，应该理解：为了适合具体的实施方案，根据需要，这些操作可以合并和/或分成另外或不同的操作。例如，可在一种或多种操作110-160之前、期间或之后，加入另外的操作。在一些实施方案中，一种或多种操作可以大约同时完成。在一些实施方案中，方法仅由操作120和150构成，而无任何其他操作。在一些实施方案中，方法基本由操作120和150构成。在一些实施方案中，方法仅由操作120、150，以及操作110、130、140和160中的一种构成，而无任何其他操作。在一些实施方案中，方法仅由操作120、150，以及操作110、130、140和160中的两种构成，而无任何其他操作。在一些实施方案中，方法仅由操作120、150，以及操作110、130、140和160中的一种或多种构成，而无任何其他操作。

在任选的操作110“得到回收材料”中，回收材料不被特别限制，并可以是含有α-淀粉酶的任何组合物。回收材料的pH不被特别限制。例如，含有α-淀粉酶的组合物可以具有下述pH值，其是、大约是、是小于、是大于pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0、pH 9.1、pH 9.2、pH 9.3、pH 9.4、pH 9.5、pH 9.6、pH9.7、pH 9.8、pH 9.9、pH 10.0、pH 10.1、pH 10.2、pH 10.3、pH 10.4、pH 10.5或者上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，如果需要，含有α-淀粉酶的组合物的pH可以调节至pH 10.0。在一些实施方案中，含有α-淀粉酶的组合物的pH是大约pH 8.0-10.5。在一些实施方案中，含有α-淀粉酶的组合物可以具有酶活性，例如α-淀粉酶活性，其是至少300,000MWU/g(Modified Wohlgemuth Units)。在一些实施方案中，含有α-淀粉酶的组合物可以具有酶浓度，例如α-淀粉酶，其是大约300,000–400,000MWU/g。

在操作120“预配制”中，可将各种稳定剂加入到含有α-淀粉酶的组合物中。例如，可将稳定剂诸如蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、海藻糖、氯化钠、硫酸钠或其任何组合加入到含有α-淀粉酶的组合物。在一些实施方案中，将甘油加入到含有α-淀粉酶的组合物中，作为稳定剂。可将甘油加入至含有α-淀粉酶的组合物中，至下述终浓度，所述浓度是、大约是、是小于、是大于30％(w/v)、31％(w/v)、32％(w/v)、33％(w/v)、34％(w/v)、35％(w/v)、36％(w/v)、37％(w/v)、38％(w/v)、39％(w/v)、40％(w/v)、41％(w/v)、42％(w/v)、43％(w/v)、44％(w/v)、45％(w/v)、46％(w/v)、47％(w/v)、48％(w/v)、49％(w/v)、50％(w/v)、51％(w/v)、52％(w/v)、53％(w/v)、54％(w/v)、55％(w/v)、56％(w/v)、57％(w/v)、58％(w/v)、59％(w/v)、60％(w/v)、61％(w/v)、62％(w/v)、63％(w/v)、64％(w/v)、65％(w/v)、66％(w/v)、67％(w/v)、68％(w/v)、69％(w/v)、70％(w/v)、71％(w/v)、72％(w/v)、73％(w/v)、74％(w/v)、75％(w/v)或者上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，将甘油加入到含有α-淀粉酶的组合物中，至终浓度30-50％(w/v)。在一些实施方案中，将甘油加入到含有α-淀粉酶的组合物中，至终浓度38-42％(w/v)。

在任选操作130“将防腐剂加入到预配制混合物中”中，可以加入各种防腐剂。可将防腐剂例如山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸、苯甲酸钠、苯甲酸、尼泊金甲酯、丙酸钙、丙酸钠、丙酸铵、丙酸或其任何组合加入到预配制混合物中。在一些实施方案中，无防腐剂加入到预配制混合物中。在一些实施方案中，一种防腐剂加入到预配制混合物中。在另一种实施方案中，所述加入到预配制混合物中的一种防腐剂是山梨酸钾。在一些实施方案中，可将至少两种防腐剂例如尼泊金甲酯和山梨酸钾加入到预配制混合物中。可将尼泊金甲酯加入到预配制混合物中，至下述终浓度，所述浓度是、大约是、是小于、是大于0.00％(w/v)、0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)或者上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，可将尼泊金甲酯加入到预配制混合物中，至终浓度0.05-0.3％(w/v)。在一些实施方案中，可将尼泊金甲酯加入到预配制混合物中，至终浓度0.1％(w/v)。可将山梨酸钾加入到预配制混合物中，至下述终浓度，所述浓度是、大约是、是小于、是大于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)或者上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，可将山梨酸钾加入到预配制混合物中，至终浓度0.1-0.5％(w/v)。在一些实施方案中，可将山梨酸钾加入到预配制混合物中，至终浓度0.2％(w/v)。

在任选操作140“小体积pH滴定试验”中，酸性缓冲贮备液的pH可以是下述值，其是、大约是、是小于、是大于pH 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或者上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，酸性缓冲贮备液的pH是大约pH 4.0。在其他实施方案中，酸性缓冲贮备液的pH是大约pH 3.5。缓冲贮备液的浓度可以是下述值，所述值是、大约是、是小于、是大于5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)、20％(w/v)、25％(w/v)、30％(w/v)、35％(w/v)、40％(w/v)或者上述任何两个值之间的范围。各种适当的强酸可用于在小体积滴定试验中滴定pH。例如，滴定试验期间，可以利用选自柠檬酸、乙酸、硫酸、磷酸、盐酸及其任何组合的酸来滴定pH。在该试验中的小体积是指样品体积，其对于实验室级别的滴定、溶液混合和pH测量是方便和一致的，例如100毫升至1升。

在操作150“滴定液体酶制剂的pH”中，液体酶制剂的pH可以变化。例如，液体酶制剂的pH可以是下述值，其是、大约是、是小于pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0或者上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，液体酶制剂的pH是大约pH 6.3-6.7。

各种适当的缓冲剂可用于滴定文中公开的液体酶制剂的pH。例如，可利用选自柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、乙酸钠、乙酸、磷酸钠、磷酸钾及其任何组合的缓冲剂，滴定液体酶制剂的pH。在优选的实施方案中，可利用为柠檬酸钠的缓冲剂滴定液体酶制剂的pH。可将柠檬酸钠加入到液体酶制剂中，至下述终浓度，所述终浓度是、大约是、是小于、是大于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1.0％(w/v)、1.1％(w/v)、1.2％(w/v)、1.3％(w/v)、1.4％(w/v)、1.5％(w/v)、1.6％(w/v)、1.7％(w/v)、1.8％(w/v)、1.9％(w/v)、2.0％(w/v)或者上述任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，可将柠檬酸钠加入到液体酶制剂中，至终浓度0.1-2.0％(w/v)。在一些实施方案中，可将柠檬酸钠加入到液体酶制剂中，至终浓度0.1-0.6％(w/v)。在一些实施方案中，可以使用柠檬酸钠缓冲贮备液，代替强酸溶液(包括柠檬酸)，以避免酶沉淀。在一些实施方案中，柠檬酸钠缓冲贮备液具有大约3.0-5.0的pH。

在任选操作160“得到最终配制的液体产品并包装”中，得到pH调节后的液体酶制剂。

液体酶制剂的用途

文中公开的液体酶制剂可用于α淀粉酶适合的任何应用。文中公开的一些实施方案提供包含α-淀粉酶、缓冲剂、稳定剂和防腐剂的液体酶制剂用于水解淀粉的用途，其中液体酶制剂的pH是大约pH 6.0-8.0。在一些实施方案中，液体酶制剂用于生产食品、生物燃料、清洁产品、动物饲料或纸浆。在一些实施方案中，液体酶制剂用于提高油采收。

实施例

下述实施例解释说明本公开书的方面。实施例中的百分比是重量百分比，除非另外说明。

为了便于理解，提供具体的实施方案，以帮助解释说明技术建议，也就是说，这些实施方案仅用于解释说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围。除非另外说明，不指明具体条件的实施方案，依据常规条件或生产商推荐的条件。

实施例1

用强酸滴定制备缓冲的低pH α-淀粉酶制剂

获得代表将被配制的产品的回收材料(“浓缩物”)，并且一旦收到，测定α-淀粉酶酶活性(MWU/g；MWU，Modified Wohlgemuth Units)、pH和微生物负荷(CFU/mL；CFU，菌落形成单位)。如果需要，将浓缩物的pH调节至10.7。浓缩物的活性目标是≥300,000MWU/g(加入40％w/v甘油后，必须满足185,000MWU/g的预配制目标)。

通过混合浓缩物、40％w/v甘油和DI-水，制备预配制混合物。用1N NaOH，将预配制混合物的pH调至10.7。预配制步骤的活性目标是185,000MWU/g。

通过在70℃加热1小时，任选地将预配制混合物进行巴氏灭菌。

为了制备低pH制剂，将100X柠檬酸盐磷酸盐缓冲贮备液(326mM柠檬酸、436mMNa₂HPO4、800mM NaOH,pH 6.5)加入到混合物中，至1X终浓度(3.3mM柠檬酸、4.4mM Na₂HPO₄、8mM NaOH)。缓冲液加入后，将防腐剂各自加至0.1％w/v的终浓度(尼泊金甲酯，从在100％乙醇中的25％w/v贮备液中加入；山梨酸钾，从在DI水中的25％w/v贮备液中加入)。向最终制剂溶液中，加入另外的甘油，以达到40％w/v甘油浓度。用12％柠檬酸，将制剂混合物的最终pH调至6.5。为了制备高pH制剂(未缓冲的，pH 10.7)，向预配制混合物中，加入0.1％w/v尼泊金甲酯，并用1N NaOH将pH调至10.7。向最终制剂溶液中，加入另外的甘油，以达到40％w/v甘油浓度。最终制剂的活性目标是160,000MWU/g。

在一些实施方案中，可以将制剂混合物等分至无菌塑料容器(瓶子或管)中，并贮存于监测其稳定性的指定温度下(-20℃、5℃、22℃、30℃和37℃)。

利用MWU测试，监测酶活性；利用HPLC/反相和SDS PAGE，监测蛋白质质量和完整性；每月监测pH和微生物稳定性，持续至少三个月。

通过获取在各指定温度下贮存的配制材料的等分试样，并测定溶液的pH，来测定pH稳定性。通过获取在各指定温度下贮存的配制材料的等分试样，并将200μl接种在20mmTSA板上(胰蛋白酶大豆琼脂，DIFCO Laboratories)，测定微生物稳定性。

实施例2

在没有强酸滴定的情况下，制备含尼泊金甲酯的缓冲的低pH α-淀粉酶制剂

获得代表将被配制的产品的回收材料(“浓缩物”)，并且一旦收到，测定酶(α-淀粉酶)活性(MWU/g；MWU，Modified Wohlgemuth Units)、pH和微生物负荷(CFU/mL；CFU，菌落形成单位)。浓缩物的活性目标是≥300,000MWU/g(加入40％w/v甘油后，必须满足185,000MWU/g的预配制目标)。

通过混合浓缩物、40％w/v甘油和DI-水，制备预配制混合物。预配制步骤的活性目标是185,000MWU/g。

为了制备低pH制剂，将防腐剂加入到预配制混合物中，对于尼泊金甲酯，至0.1％w/v的终浓度(从在100％乙醇中的25％w/v贮备液中加入或者从10％w/v的单丙二醇贮备液加入)，以及至0.2％山梨酸钾(从在DI水中的25％w/v贮备液中加入)。取回1千克含有防腐剂的该预配制混合物。以1g的步增方式，将小体积的1摩尔的(molar)柠檬酸钠缓冲贮备液(pH 4.0)加入到混合物中。将混合物充分混合，并且不断测量pH。当混合物pH达到6.5，停止滴定试验，并记录加入的柠檬酸钠贮备液的总量。基于该1-千克pH滴定试验，计算配制全部生产体积需要的缓冲贮备液的量。然后，将该体积的1摩尔柠檬酸钠缓冲贮备液(pH 4.0)加入到含有防腐剂的全部预配制混合物中。向最终制剂溶液中，加入另外的甘油，以达到40％w/v甘油浓度。最终制剂混合物的pH目标是6.5。如果需要另外的pH调整，将使用1摩尔的柠檬酸钠缓冲贮备液(pH 4.0)或者10％氢氧化钠。最终制剂的活性目标是160,000MWU/g。

将制剂混合物等分至无菌塑料容器(瓶子或管)中，并贮存于监测其稳定性的指定温度下(-20℃、4℃、25℃和40℃)。

实施例3

在没有强酸滴定的情况下，制备不含尼泊金甲酯的缓冲的低pH α-淀粉酶制剂

获得代表将被配制的产品的回收材料(“浓缩物”)，并且一旦收到，测定酶(α-淀粉酶)活性(MWU/g；MWU，Modified Wohlgemuth Units)、pH和微生物负荷(CFU/mL；CFU，菌落形成单位)。浓缩物的活性目标是≥325,000MWU/g(加入40％w/v甘油后，必须满足200,000MWU/g的预配制目标)。

通过混合浓缩物、40％w/v甘油和DI-水，制备预配制混合物。预配制步骤的活性目标是200,000MWU/g。

为了制备低pH制剂，将防腐剂加入到预配制混合物中，至0.2％山梨酸钾的终浓度(从在DI水中的25％w/v贮备液中加入)。取回1千克含有防腐剂的该预配制混合物。以1g的步增方式，将小体积的1摩尔的(molar)柠檬酸钠缓冲贮备液(pH 4.0)加入到混合物中。将混合物充分混合，并且不断测量pH。当混合物pH达到6.5，停止滴定试验，并记录加入的柠檬酸钠贮备液的总量。基于该1-千克pH滴定试验，计算配制全部生产体积需要的缓冲贮备液的量。然后，将该体积的1摩尔的柠檬酸钠缓冲贮备液(pH 4.0)加入到含有防腐剂的全部预配制混合物中。向最终制剂溶液中，加入另外的甘油，以达到50％w/v甘油浓度。最终制剂混合物的pH目标是6.5。如果需要另外的pH调整，将使用1摩尔的柠檬酸钠缓冲贮备液(pH4.0)或者10％氢氧化钠。最终制剂的活性目标是160,000MWU/g。

Claims

1.液体酶制剂，其包含：

(a)α-淀粉酶；

(b)缓冲剂；

(c)稳定剂；和

(d)防腐剂，

其中酶制剂的pH是大约pH 6.0-8.0。

2.权利要求1的液体酶制剂，其中液体酶制剂的pH是大约pH 6.3-6.7。

3.权利要求1的液体酶制剂，其中稳定剂包括蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、海藻糖、氯化钠、硫酸钠或其任何组合。

4.权利要求1的液体酶制剂，其中缓冲剂包括柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、乙酸钠、乙酸、磷酸钠、磷酸钾或其任何组合。

5.权利要求1的液体酶制剂，其中α-淀粉酶在4-40℃的温度下，保持其至少90％的活性。

6.权利要求1的液体酶制剂，其中α-淀粉酶在25-30℃的温度下，保持其至少90％的活性。

7.权利要求1的液体酶制剂，其中α-淀粉酶保持其至少90％的活性，持续1年。

8.权利要求1的液体酶制剂，其中α-淀粉酶具有至少1年的保存期限。

9.权利要求8的液体酶制剂，其中α-淀粉酶在25℃下具有至少1年的保存期限。

10.权利要求1的液体酶制剂，其中防腐剂包括：山梨酸钾、山梨酸钠、山梨酸、苯甲酸钠、苯甲酸、尼泊金甲酯、丙酸钙、丙酸钠、丙酸铵、丙酸或其任何组合。

11.权利要求1的液体酶制剂，其还包含至少两种防腐剂。

12.权利要求1的液体酶制剂，其中α-淀粉酶包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14中所述氨基酸序列之一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

13.权利要求1的液体酶制剂，其还包含第二种酶。

14.权利要求13的液体酶制剂，其中第二种酶选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖聚酶及其任何组合。

15.制备液体酶制剂的方法，其包含：

(a)提供包含α-淀粉酶的组合物，其中所述组合物具有大约8.0至大约10.5的pH值；

(b)向所述含有α-淀粉酶的组合物中加入稳定剂，以得到液体酶制剂；和

(c)将液体酶制剂的pH滴定至pH 6.0-8.0的范围。

16.液体酶制剂的用途，其包括：

(a)提供包含α-淀粉酶、缓冲剂、稳定剂和防腐剂的液体酶制剂，其中所述液体酶制剂的pH值是pH 6.0-8.0；

(b)提供淀粉；和

(c)使液体酶制剂与淀粉接触，由此水解淀粉。

17.权利要求16的用途，其用于生产食品成分、食品产品、燃料、醇/酒精、清洁产品、个人护理产品、动物饲料、纸、纸浆、纸产品或基于淀粉的产品。

18.油气井作业中的权利要求16的用途。

19.液体酶制剂，其包含：

(a)α-淀粉酶；

(b)缓冲剂；

(c)稳定剂；和

其中酶制剂的pH是大约pH 6.0-8.0。

20.权利要求19的液体酶制剂，其中α-淀粉酶包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14中所述的氨基酸序列之一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

21.权利要求19的液体酶制剂，其中缓冲剂包括柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、乙酸钠、乙酸、磷酸钠、磷酸钾或其任何组合。

22.权利要求19的液体酶制剂，其中稳定剂包括蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、海藻糖、氯化钠、硫酸钠或其任何组合。

23.权利要求1的液体酶制剂，其中液体酶制剂的pH是大约pH 6.3-6.7。

24.液体酶制剂，其含有：

(a)α-淀粉酶；其中α-淀粉酶包含这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中所述的氨基酸序列之一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；

(b)缓冲剂；其中缓冲剂包括柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、乙酸钠、乙酸、磷酸钠、磷酸钾或其任何组合；

(c)稳定剂；其中稳定剂包括蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、海藻糖、氯化钠、硫酸钠或其任何组合；和

其中酶制剂的pH是大约pH 6.0-8.0。