CN112384616A

CN112384616A - 淀粉酶

Info

Publication number: CN112384616A
Application number: CN201980043954.1A
Authority: CN
Inventors: H·乌尔维纳; A·库雷希; A·休斯顿达文波特; X·谭; J·库切尔; A·丰克; M·赛特; S·黑夫纳; A-H·黎
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2021-02-19
Also published as: EP3802813A1; WO2019229101A1; US20210198643A1

Abstract

本发明涉及与亲本α‑淀粉酶相比具有增加的外淀粉酶活性的α‑淀粉酶变体。本发明还涉及制备所述变体α‑淀粉酶的方法以及所述变体α‑淀粉酶在烘焙、洗涤剂、个人护理产品、在纺织品的加工、在纸浆和纸加工、在生产乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆以及在油田和采矿业中用作减粘剂的用途。

Description

淀粉酶

序列表

此申请包括以根据“专利合作条约(PCT)下的国际专利申请中核苷酸和氨基酸序列表的表示标准”ST.25的ASC II文本(.txt)文件的计算机可读形式(CRF)的核苷酸和氨基酸序列表。序列表下文识别并且因此通过引用以其整体并入本申请说明书并且用于所有目的。

文件名	创建日期	大小
			161160-SequenceListing_ST25.txt	2018年5月22日	5.65KB(5,786字节)

发明领域

本发明涉及α-淀粉酶的变体，其与亲本α-淀粉酶相比具有增加的外淀粉酶活性。本发明还涉及制备变体α-淀粉酶的方法以及所述变体α-淀粉酶在烘焙、洗涤剂、个人护理产品、在纺织品的加工、在纸浆和纸加工、在生产乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆以及在油田和采矿业中用作减粘剂(viscosity breaker)的用途。

发明背景

面包数千年来是人类营养的主要内容。面包通常是通过将面粉、水、盐、酵母和/或其他食物添加剂混合以制成面团或糊状物而制成的；然后将面团烘焙以制成面包。已知酶可用于烘焙，因为酶对烘焙过程的作用可以与化学替代品的作用相似或比之更好。几种不同的酶可用于制作面包，例如已知淀粉酶有助于随着时间保持新鲜度(抗老化或硬度)并随着时间保持弹性。面包老化是由支链淀粉的结晶引起的，其在烘焙后在淀粉颗粒中发生。面包老化时，其失去面包屑的柔软性和水分，从而失去弹性。

因此，依然需要一种淀粉酶，其可以在比目前可得的更长的时间内提供新鲜的面包，或者需要一种淀粉酶，其可以随时间提供比新鲜的更好的面包。

所述问题的一种解决方案是具有满足或超过这些工业要求的α-淀粉酶活性的变体多肽。此外，α-淀粉酶变体还可用于动物饲料，洗涤剂，个人护理产品，纺织品的加工、纸浆和纸加工，生产乙醇，生产木质纤维素乙醇，生产糖浆，或在油田和采矿业中用作减粘剂。

发明内容

本发明人惊奇地发现，与亲本酶的活性相比，在α-淀粉酶的氨基酸序列中引入氨基酸修饰增加了变体的外淀粉酶活性。

因此，本发明涉及根据SEQ ID No.1的α-淀粉酶的变体多肽，其包含与根据SEQ IDNo.1的序列至少80％相同的氨基酸序列并且具有α-淀粉酶活性，其中与根据SEQ ID No.1的α-淀粉酶相比，所述变体多肽具有增加的外淀粉酶活性。

在一个实施方案中，与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列相比，所述变体包含至少一个氨基酸修饰，其可以是氨基酸取代。

在一个实施方案中，所述至少一个氨基酸修饰是在选自以下的氨基酸残基位置编号：SEQ ID No.1编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、35、45、53、59、68、76、82、88、90、91、96、105、117、126、128、134、141、152、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、270、292、311、380、416、423、433和435。

在一个实施方案中，所述至少一个氨基酸修饰是选自以下的氨基酸取代：SEQ IDNo.1编号中的K2H、Y3R、S4T、P21E、P21W、G22Q、I25W、W26G、T29G、Q32R、P35K、I45M、G53A、S59P、F68P、K76R、R82N、E88Y、V90G、V90M、N91T、A96T、A105W、L117R、Y126V、W128Y、V134A、A141T、K152M、G160E、G160V、W175N、F197A、F197K、V200S、W234C、Y236H、F243A、F243K、F243T、D256A、N257R、T258C、P261C、P261F、V264R、G270Y、I292A、I292E、V311L、N380L、G416Q、G423M、A433W和V435S。

在一个实施方案中，与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列相比，所述变体多肽包含氨基酸修饰的组合。

所述氨基酸修饰的组合是可选自以下的氨基酸取代的组合：SEQ ID No.1编号中的

(a)G22Q、P35K、S59P、W128Y、D256A；

(b)G22Q、W128Y、W175N、V200S、A433W；

(c)G22Q、P35K、S59P、D256A；

(d)G22Q、W175N、V200S、D256A、A433W；

(e)W128Y、W175N、D256A；

(f)G22Q、S59P、V200S、D256A、A433W；

(g)G22Q、W175N、V200S、D256A；

(h)G22Q、S59P；

(i)G22Q、P35K、W128Y、W175N、V200S、D256A、A433W；

(j)G22Q、P35K、S59P、W128Y、A433W；

(k)G22Q、W128Y、W175N、D256A；

(l)P35K、W128Y、V200S、D256A；

(m)G22Q、S59P、W175N、V200S、A433W；

(n)G22Q、S59P、W128Y、V200S、A433W；

(o)G22Q、S59P、W175N、V200S、D256A、A433W；

(p)G22Q、S59P、W128Y、D256A；

(q)S59P、V200S、D256A、A433W；

(r)P35K、S59P、W128Y、W175N、V200S、D256A、A433W；

(s)G22Q、S59P、W128Y、D256A、A433W；

(t)G22Q、S59P、W128Y、W175N、V200S、433W；

(u)G22Q、W128Y、W175N、A433W；

(v)S59P、W128Y、V200S；

(w)P35K、S59P、V200S、A433W；

(x)S59P、W128Y、V200S、D256A；

(y)S59P、W128Y、V200S、A433W；和

(z)W128Y、V200S、A433W。

在一个实施方案中，所述变体多肽是全长氨基酸序列的片段。

在一个实施方案中，所述变体多肽包含所述至少一个变体多肽和具有淀粉酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有α-淀粉酶活性。

本发明还涉及一种包含所述变体多肽的组合物。

所述组合物还可以包含第二酶并且所述第二酶可选自：第二α-淀粉酶、脂肪酶、β-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。

本发明还涉及一种制备变体多肽的方法，其包含：提供编码所述多肽变体的模板核酸序列，将所述模板核酸序列转化进表达宿主，培养所述表达宿主以产生所述变体多肽，并纯化所述变体多肽。

在一个实施方案中，所述模板核酸是SEQ ID NO.2所示核酸序列的变体核苷酸，其中所述变体核苷酸是与SEQ ID No.2所示核酸序列至少80％相同的核酸序列，其中所述变体核苷酸编码具有α-淀粉酶活性及具有与由根据SEQ ID No.2的核酸序列编码的α-淀粉酶相比增加的外淀粉酶活性的多肽。

在一个实施方案中，所述表达宿主选自：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成表达系统。

所述细菌表达系统可选自大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。

所述酵母表达系统可选自念珠菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

所述真菌表达系统可选自青霉属(Penicillium)、曲霉菌属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、Thermothelomyces、根毛霉菌属(Rhizomucor)、根霉菌属(Rhizopus)、Thermomyces和木霉属(Trichoderma)。

本发明还涉及一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将本文所述的变体多肽添加至所述面团并最终烘焙所述面团。

本发明还涉及所述变体多肽在加工淀粉、清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具、制备乙醇、处理油井、加工纸浆或纸、喂养动物或制备糖浆中的用途。

在一个实施方案中，所述用途是用于加工淀粉的方法，其包括：提供淀粉，提供所述变体多肽，使所述淀粉与所述变体多肽接触，其中所述多肽水解所述淀粉。在一个实施方案中，所述用途是用于加工淀粉的方法，其包括：提供淀粉，提供所述变体多肽，使所述淀粉与所述变体多肽接触，其中所述多肽水解所述淀粉。

附图说明

图1：显示PAHBAH和碘测定值之间线性关系的样品图。所述线是基于样品点计算的线。黑色圆圈表示沿着线性回归线并落在90％置信带(阈值)内的样品。黑色菱形表示破坏线性关系并被识别为“上击(up hit)”的突变体。

图2：通过四种不同变体酶(酶71、72、76和78)以及亲本α-淀粉酶(SEQ ID NO：1/2)的PAHBAH和碘测定测量的对支链淀粉的剂量应答，以及阴性对照。

图3：质构分析(texture profile analysis，TPA)–在室温(RT)储存1天后，阴性对照(无酶)、Novamyl 3D、SEQ ID NO：1/2和酶78的硬度和弹性。

发明详述

尽管将针对特定实施方案描述本发明，但是所述描述不应以限制性意义解释。

在详细描述本发明的示例性实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。除非另有陈述或所述定义性质明显，否则这些定义适用于本文所述的所有方法和用途。

如在本说明书和在所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”和“一种”也包括相应的复数，除非上下文另外明确指出。在本发明的上下文中，术语“大约”和“约”表示本领域技术普通人员将理解为仍确保所讨论特征的技术效果的精度范围。所述术语通常指明与所指示数值的偏差为±20％，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％。

应当理解，术语“包含”不是限制性的。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果下文中将组定义为包含至少一定数量的实施方案，则这意味着还包括优选地仅由这些实施方案组成的组。

此外，说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等用于区分相似元素，而不一定用于描述顺序或时间次序。应当理解，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且本文所述的本发明的实施方案能够以不同于本文所述或所示的其他顺序来操作。在与方法或用途或测定的步骤有关的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”、“i”、“ii”等的情况中，步骤之间没有时间或时间间隔连贯性，即步骤可以同时执行或在这些步骤之间可以有若干秒、若干分钟、若干小时、若干天、若干周、若干月甚至若干年的时间间隔，除非在本文上文或下文所述的申请中另有指出。

应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法论、方案、试剂等，因为这些可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且无意限制仅由所附权利要求书限制的本发明的范围。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如上所述，本发明基于以下发现：与亲本α-淀粉酶相比，α-淀粉酶的变体具有增加的外淀粉酶活性。在烘焙应用中，外淀粉酶活性是优选的，因为其可以完成淀粉的降解，其导致抗老化作用，但不会对最终烘焙产品的质量产生负面影响。相反，内淀粉酶活性可以对最终烘焙产品的质量产生负面影响，因为其会导致支链糊精类积聚，其例如导致粘性或胶状面包屑的产生。

“变体多肽”是指其氨基酸序列不同于其亲本多肽的酶。“变体α-淀粉酶”是指其氨基酸序列不同于其亲本α-淀粉酶并且具有α-淀粉酶活性的α-淀粉酶。根据IUPAC关于单字母或三字母氨基酸缩写的建议，使用单氨基酸分子的命名法和缩写来描述变体多肽。

“亲本”多肽氨基酸序列是用于向序列中引入氨基酸修饰(例如引入一个或多个氨基酸取代、插入、缺失或其组合)以获得亲本多肽氨基酸序列的“变体”的起始序列。亲本多肽既包括野生型多肽氨基酸序列，也包括合成产生的多肽氨基酸序列，其用作引入(进一步)变化的起始序列。在本发明中，亲本多肽优选是具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽。可替代地，亲本多肽可以是包含与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的多肽，并且与根据SEQ ID No.1的序列相比，在以下任意氨基酸残基上不具有氨基酸修饰：2、3、4、21、22、25、26、29、32、35、45、53、59、68、76、82、88、90、91、96、105、117、126、128、134、141、152、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、270、292、311、380、416、423、433和435。

α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)是水解含有三个或更多个(1->4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖(诸如淀粉、支链淀粉和直链淀粉聚合物)中的(1->4)-α-D-糖苷键的酶。由于支链淀粉侧链的长度减少，通过α-淀粉酶水解淀粉可以减少结晶，并增加烘焙过程中的抗老化性。α-淀粉酶广泛用于淀粉加工的初始阶段、湿玉米研磨、酒精生产、作为洗涤剂基质的清洁剂、纺织工业、烘焙应用、饮料工业、油田钻井过程以及动物饲料。

已经从植物、动物和微生物来源分离出α-淀粉酶，其中来自细菌的α-淀粉酶被最广泛地使用。这样的细菌α-淀粉酶包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶。另外，在以下专利申请中公开了淀粉酶：WO02/068589、WO02/068597、WO03/083054、WO04/042006、WO08/080093、WO2013/116175和WO2017/106633。

用于食品加工和烘焙的商业淀粉酶包括：从AB Enzymes获得的

从DSM获得的

和

从DuPont获得的

Max-LIFE^TM、

和

以及从Novozymes获得的

和

通过本领域技术人员已知的各种测定来确定α-淀粉酶活性，包括BCA还原端测定(Smith,P.K.(1985)Anal.Biochem.150(1):76–85)、PAHBAH测定(Lever M.(1972)Anal.Biochem.47:273-279)、碘测定(Fuwa(1954)J.Biochem.41:583-603)、Phadebas测定(例如从Magic Life Sciences可获得)和淀粉板测定。

本发明的变体多肽的特征在于，与亲本多肽相比，优选与具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽相比，他们具有增加的外淀粉酶活性。术语“外淀粉酶活性”是指从底物的非还原端切割淀粉分子。相反，“内淀粉酶活性”是指淀粉分子内的α-D-(1->4)-O-糖苷键以随机方式被切割。

优选地，通过使用不同浓度的变体多肽以及亲本多肽来测量支链淀粉的降解并通过碘及PAHBAH测定针对每种不同浓度的变体和亲本多肽来确定支链淀粉的降解来确定增加的外淀粉酶活性。然后通过使用每种浓度的测试的α-淀粉酶的PAHBAH和碘值建立曲线。如果对于给定的PAHBAH值，碘值高于亲本多肽，则认为变体多肽显示出增加的外淀粉酶活性。在本文的实施例部分中提供了这种确定的示例。

“序列相同性”、“％序列相同性”、“％相同性”、“％相同”或“序列比对”是指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的比较，或第一核酸序列与第二核酸序列的比较，并基于比较计算为百分比。所述计算的结果可以描述为“百分比相同”或“百分比ID”。

通常，序列比对可用于通过两种不同方法之一计算序列相同性。在第一种方法中，在最终序列相同性计算中，将在单个位置的错配和在单个位置的缺口都计为不相同位置。在第二种方法方式中，在最终序列相同性计算中，将在单个位置的错配计为不相同位置；但是，在最终序列相同性计算中，在单个位置的缺口不计为(忽略)不相同位置。换句话说，在第二种方法中，在最终序列相同性计算中忽略了缺口。这两种方法的差异(即，将缺口计为不相同位置和忽略缺口)可导致两个序列间的序列相同性值的差异性。

序列相同性由程序确定，其产生比对，并且在最终序列相同性计算中将在单个位置的错配和在单个位置的缺口都计为不相同位置来计算相同性。例如，程序Needle(EMBOS)，其已使用Needleman和Wunsch的算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，并通过首先产生第一序列和第二序列间的比对、然后计数比对长度上相同位置的数目、然后将相同残基的数目除以比对长度、然后将该数乘以100以生成％序列相同性[％序列相同性＝(相同残基的#/比对长度)×100)]来根据默认设置计算序列相同性。

可从成对比对计算序列相同性，所述成对比对在全长上显示两个序列，因而在其全长中显示第一序列和第二序列(“全局序列相同性”)。例如，程序Needle(EMBOSS)产生这种比对；％序列相同性＝(相同残基的#/比对长度)×100)]。

可从仅显示第一序列或第二序列的局部区域的成对比对计算序列同一性(“局部相同性”)。例如，程序Blast(NCBI)产生这种比对；％序列相同性＝(相同残基的#/比对长度)×100)]。

优选地，通过使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)产生序列比对。优选地，以程序默认参数(缺口开放＝10.0、缺口延伸＝0.5及对于蛋白质，矩阵＝EBLOSUM62及对于核苷酸，矩阵＝EDNAFULL)使用程序“NEEDLE”(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))。然后，可从比对计算序列相同性，所述比对在全长上显示两个序列，因而在其全长中显示第一序列和第二序列(“全局序列相同性”)。例如：％序列相同性＝(相同残基的#/比对长度)x100)]。

通过参考与各个亲本酶的氨基酸序列至少n％相同的氨基酸序列来描述变体多肽，其中“n”是80至100之间的整数。变体多肽包括与根据SEQ ID No.1的亲本α-淀粉酶的全长氨基酸序列比较时，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的酶，其中所述酶变体具有α-淀粉酶活性和与根据SEQ ID No.1的亲本多肽相比增加的外淀粉酶活性。

与亲本多肽，优选与根据SEQ ID No.1的多肽相比，变体多肽包含至少一个氨基酸修饰。术语“氨基酸修饰”是指与亲本多肽的氨基酸序列，优选与根据SEQ ID No.1的多肽相比，变体多肽的氨基酸序列被修饰。术语“氨基酸修饰”不试图包括对氨基酸残基本身的修饰，例如但不限于磷酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊烯化、乙酰化、烷基化、酰胺化、γ-羧化或糖基化。术语“氨基酸修饰”包括氨基酸取代、氨基酸插入和氨基酸缺失。因此，与亲本多肽，优选与根据SEQ ID No.1的多肽相比，本发明的变体多肽包含至少一个氨基酸取代、氨基酸插入和/或氨基酸缺失。优选地，所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸取代。

通过提供亲本多肽中的原始氨基酸残基，然后提供这个氨基酸残基在氨基酸序列内的位置编号，来描述“氨基酸取代”。例如，氨基酸残基22的取代是指在位置22的亲本氨基酸可以被19个其他氨基酸残基中的任一个取代并被称为G22。此外，可以通过提供亲本多肽中原始氨基酸残基，然后提供这个氨基酸残基在氨基酸序列中的位置编号，然后是变体多肽内特异性取代的氨基酸来描述取代。例如，在位置22的甘氨酸被谷氨酰胺取代被称为“Gly22Gln”或“G22Q”。通过在氨基酸残基之间插入逗号来描述取代的组合，例如：g22Q，P35K，S59P，W128Y，D256A；当与亲本多肽相比时，代表五个不同氨基酸残基的取代的组合。在氨基酸水平上具有取代的变体由至少在编码所述取代的氨基酸残基的位置与编码亲本多肽的亲本核酸序列不同的核酸序列编码。

变体多肽中的氨基酸取代可以是保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”或“用相关氨基酸取代”是指与亲本氨基酸序列相比，氨基酸序列中的一个氨基酸残基被在相同位置具有相似性质的不同氨基酸残基置换。保守氨基酸取代的一些实例包括但不限于用不同的带正电荷氨基酸残基置换带正电荷氨基酸残基；用不同的极性氨基酸残基置换极性氨基酸残基；用不同的非极性氨基酸残基置换非极性氨基酸残基，用不同的碱性氨基酸残基置换碱性氨基酸残基，或用不同的芳族氨基酸残基置换芳族氨基酸残基。

下表中提供了保守氨基酸取代的清单(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman和Company(Eds))。

残基	保守取代	残基	保守取代
				Ala	Ser	Leu	Ile,Val
Arg	Lys	Lys	Arg,gln
				Asn	Gln,His	Met	Leu,Ile
Asp	Glu	Phe	Met,Leu,Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr,gly
Cys	Ser	Thr	Ser,Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp,Phe
				His	Asn,gln	Val	Ile,Leu
Ile	Leu,Val

通过提供氨基酸序列中在其后插入氨基酸的位置编号，接着是撇号和特定插入的氨基酸残基来描述“氨基酸插入”。例如，在位置84之后丝氨酸的插入被指定为“84'S”。在氨基酸水平上有插入的变体由至少在编码插入的氨基酸残基的位置与编码亲本多肽的亲本核酸序列不同的核酸序列编码。

通过提供氨基酸序列中氨基酸残基被缺失的位置编号，接着是Δ和特定缺失的氨基酸残基来描述“氨基酸缺失”。例如，在位置10的甘氨酸的缺失被指定为“10ΔG”。在氨基酸水平上有缺失的变体由至少在编码缺失的氨基酸残基的位置与编码亲本多肽的亲本核酸序列不同的核酸序列编码。

在一个实施方案中，变体多肽在选自以下的氨基酸残基位置编号上包含至少一个氨基酸修饰：SEQ ID No.1的编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、35、45、53、59、68、76、82、88、90、91、96、105、117、126、128、134、141、152、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、270、292、311、380、416、423、433和435。

优选地，变体多肽在选自以下的氨基酸残基位置编号上包含至少一个氨基酸取代：SEQ ID No.1的编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、35、45、53、59、68、76、82、88、90、91、96、105、117、126、128、134、141、152、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、270、292、311、380、416、423、433和435。

在一个实施方案中，变体多肽在选自以下的氨基酸残基位置编号上包含至少一个氨基酸修饰：SEQ ID No.1的编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、45、68、76、82、88、91、96、117、126、128、134、141、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、292、311、380、416、423、433和435。

优选地，变体多肽在选自以下的氨基酸残基位置编号上包含至少一个氨基酸取代：SEQ ID No.1的编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、45、68、76、82、88、91、96、117、126、128、134、141、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、292、311、380、416、423、433和435。

在一个实施方案中，变体多肽在选自以下的氨基酸残基位置编号上包含至少一个氨基酸修饰：35、59、128、175、200、256和433。

优选地，变体多肽在选自以下的氨基酸残基位置编号上包含至少一个氨基酸取代：35、59、128、175、200、256和433。

还优选地，所述至少一个氨基酸取代选自：SEQ ID No.1的编号中的K2H、Y3R、S4T、P21E、P21W、G22Q、I25W、W26G、T29G、Q32R、P35K、I45M、G53A、S59P、F68P、K76R、R82N、E88Y、V90G、V90M、N91T、A96T、A105W、L117R、Y126V、W128Y、V134A、A141T、K152M、G160E、G160V、W175N、F197A、F197K、V200S、W234C、Y236H、F243A、F243K、F243T、D256A、N257R、T258C、P261C、P261F、V264R、G270Y、I292A、I292E、V311L、N380L、G416Q、G423M、A433W和V435S。

还优选地，所述至少一个氨基酸取代选自：SEQ ID No.1的编号中的K2H、Y3R、S4T、P21E、P21W、G22Q、I25W、W26G、T29G、Q32R、I45M、F68P、K76R、R82N、E88Y、N91T、A96T、L117R、W128Y、V134A、A141T、G160E、G160V、W175N、F197A、F197K、V200S、W234C、Y236H、F243A、F243K、F243T、D256A、N257R、T258C、P261C、P261F、V264R、I292E、V311L、N380L、G416Q、G423M、A433W和V435S。

更优选地，所述至少一个氨基酸取代选自：SEQ ID No.1的编号中的P35K、S59P、W128Y、W175N、V200S、D256A和A433W。

与亲本多肽的氨基酸序列，优选地与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列相比，所述变体多肽可以包含氨基酸修饰的组合。与亲本多肽的氨基酸序列，优选地与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列相比，所述变体多肽可以包含氨基酸取代的组合。

优选地，氨基酸修饰的组合包含在选自以下的氨基酸残基位置编号上的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸修饰：SEQ ID No.1的编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、35、45、53、59、68、76、82、88、90、91、96、105、117、126、128、134、141、152、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、270、292、311、380、416、423、433和435。

还优选地，氨基酸修饰的组合包含在选自由以下组成的组的氨基酸残基位置编号上的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸取代：SEQ ID No.1的编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、35、45、53、59、68、76、82、88、90、91、96、105、117、126、128、134、141、152、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、270、292、311、380、416、423、433和435。

更优选地，氨基酸修饰的组合包含在选自以下的氨基酸残基位置编号上的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸修饰：SEQ ID No.1的编号中的35、59、128、175、200、256和433。还更优选地，氨基酸取代的组合包含在选自以下的氨基酸残基位置编号上的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸取代：SEQ ID No.1的编号中的35、59、128、175、200、256和433。

甚至更优选地，氨基酸取代的组合包含选自以下的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸取代：SEQ ID No.1的编号中的P35K、S59P、W128Y、W175N、V200S、D256A和A433W。

特别优选地，氨基酸取代的组合选自：SEQ ID No.1的编号中的

(a)G22Q、P35K、S59P、W128Y、D256A；

(b)G22Q、W128Y、W175N、V200S、A433W；

(c)G22Q、P35K、S59P、D256A；

(d)G22Q、W175N、V200S、D256A、A433W；

(e)W128Y、W175N、D256A；

(f)G22Q、S59P、V200S、D256A、A433W；

(g)G22Q、W175N、V200S、D256A；

(h)G22Q、S59P；

(i)G22Q、P35K、W128Y、W175N、V200S、D256A、A433W；

(j)G22Q、P35K、S59P、W128Y、A433W；

(k)G22Q、W128Y、W175N、D256A；

(l)P35K、W128Y、V200S、D256A；

(m)G22Q、S59P、W175N、V200S、A433W；

(n)G22Q、S59P、W128Y、V200S、A433W；

(o)G22Q、S59P、W175N、V200S、D256A、A433W；

(p)G22Q、S59P、W128Y、D256A；

(q)S59P、V200S、D256A、A433W；

(r)P35K、S59P、W128Y、W175N、V200S、D256A、A433W；

(s)G22Q、S59P、W128Y、D256A、A433W；

(t)G22Q、S59P、W128Y、W175N、V200S、433W；

(u)G22Q、W128Y、W175N、A433W；

(v)S59P、W128Y、V200S；

(w)P35K、S59P、V200S、A433W；

(x)S59P、W128Y、V200S、D256A；

(y)S59P、W128Y、V200S、A433W；和

(z)W128Y、V200S、A433W。

最优选地，氨基酸取代的组合选自：SEQ ID No.1的编号中的

(a)S59P、V200S、D256A、A433W；

(b)P35K、S59P、W128Y、W175N、V200S、D256A、A433W；

(c)S59P、W128Y、V200S；和

(d)S59P、W128Y、V200S、D256A。

α-淀粉酶的“片段”应理解为是指α-淀粉酶的较小部分，其由在α-淀粉酶的氨基酸序列中发现的连续氨基酸序列组成并且其具有α-淀粉酶活性。技术人员知道，为了使片段具有酶活性，所述片段必须包含至少存在于α-淀粉酶催化中心的氨基酸。这些氨基酸对于给定的α-淀粉酶是已知的，或者可以由技术人员(例如通过同源性筛选或诱变)容易地鉴定。优选地，与根据SEQ ID No.1的全长多肽相比，α-淀粉酶的片段具有增加的外淀粉酶活性。优选地，所述片段包含至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的根据SEQ ID No.1的全长多肽的核苷酸。

具有α-淀粉酶活性的变体多肽可以是多于一个的α-淀粉酶的杂合体。“杂合体”或“嵌合体”或“融合蛋白”是指第一变体多肽α-淀粉酶的结构域与第二α-淀粉酶的结构域组合以形成杂合体淀粉酶，并且杂合体具有α-淀粉酶活性。优选地，与根据SEQ ID No.1的多肽相比，杂合体α-淀粉酶具有增加的外淀粉酶活性。可以将具有α-淀粉酶活性的变体多肽的结构域与市售淀粉酶(如从AB Enzymes获得的

、从DSM获得的

和

；从DuPont获得的

、Max-LIFE^TM、

和

；以及从Novozymes获得的

和

)的结构域组合。另外，来自各种淀粉酶的结构域可以重组为单个酶，其中所述酶具有α-淀粉酶活性。优选地，与根据SEQ ID No.1的多肽相比，包含来自各种淀粉酶的结构域的杂合体α-淀粉酶具有增加的外淀粉酶活性。

具有α-淀粉酶活性的变体多肽可以是“成熟多肽”。成熟多肽是指其最终形式的酶，所述最终形式包括任何翻译后修饰、糖基化、磷酸化、截短、N-末端修饰、C-末端修饰或信号序列缺失。成熟多肽可以根据表达系统、载体、启动子和/或生产过程而变化。

“酶活性”是指由酶发挥的至少一种催化作用。酶活性表示为单位/毫克酶(比活性)或每分子酶每分钟转化的底物分子(分子活性)。酶活性可以通过酶的实际功能来指定，并且在本发明中是指如上所述的α-淀粉酶活性。

在酶的存储或操作使用中酶活性发生变化。术语“酶稳定性”涉及在存储或操作中酶活性随时间的保留。

为了确定和量化在某些条件下存储或使用的酶催化活性随时间的变化，在限定的条件下零时(100％)和稍后某个时间点(x％)测量“初始酶活性”。通过比较所测量的值，可以确定其范围内酶活性的潜在损失。酶活性损失的范围决定酶的稳定性或非稳定性。

影响酶的酶活性和/或储存稳定性和/或操作稳定性的参数例如是pH、温度和氧化性物质的存在。

“pH稳定性”是指蛋白质在特定pH范围内起作用的能力。通常，大多数酶在相当高的pH范围或相当低的pH范围的条件下有效。

变体多肽可以在约pH 4.0至约pH 12.0范围内的任何单个点的宽pH上具有活性。具有α-淀粉酶活性的变体多肽在pH 4.0至pH 11.0、pH 4.0至pH 10.0、pH 4.0至pH 9.0、pH4.0至pH 8.0、pH 4.0至pH 7.0、pH 4.0至pH 6.0、或pH 4.0至pH 5.0的范围具有活性。具有α-淀粉酶活性的变体多肽在pH 4.0、pH 4.1、pH4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0、pH9.1、pH 9.2、pH 9.3、pH 9.4、pH 9.5、pH 9.6、pH 9.7、pH 9.8、pH 9.9、pH 10.0、pH 10.1、pH 10.2、pH 10.3、pH 10.4、pH 10.5、pH 10.6、pH 10.7、pH 10.8、pH 10.9、pH 11.0、pH11.1、pH 11.2、pH 11.3、pH 11.4、pH 11.5、pH 11.6、pH 11.7、pH 11.8、pH 11.9、pH 12.0、pH 12.1、pH 12.2、pH 12.3、pH 12.4和pH 12.5、pH 12.6、pH 12.7、pH 12.8、pH 12.9以及更高的pH有活性。

术语“热稳定性”和“热稳性”是指蛋白质在一定温度范围内起作用的能力。通常，大多数酶在有限温度范围内起作用。除可以在中等温度(例如室温)工作的酶之外，还有可以在非常高或非常低的温度工作的酶。热稳性的特征为所谓的T₅₀值(也称为半衰期，请参见上文)。T₅₀表示与未进行热处理的参考样品相比，热灭活一定时间后仍存在50％残留活性的温度。

术语“热耐受性”和“耐热性”是指蛋白质在暴露于特定温度(如非常高或非常低的温度)后起作用的能力。耐热蛋白在暴露温度可不起作用，但一旦恢复到适宜温度将起作用。

变体多肽可以在烘焙过程中的任何时间所使用的宽温度内具有活性，其中温度为约20℃至约60℃范围内的任何点。具有α-淀粉酶活性的变体多肽在20℃至55℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、或20℃至25℃的温度范围内具有活性。具有α-淀粉酶活性的变体多肽在至少19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃的温度或更高温度具有活性。

优选地，根据本发明的变体α-淀粉酶是使用细菌、真菌或酵母表达系统产生的重组蛋白。“表达系统”还指宿主微生物、表达宿主、宿主细胞、生产生物体或生产菌株，并且每个这些术语可以可互换使用。表达系统的实例包括但不限于：黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、Thermomyces lanuginosus、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、异孢镰刀菌(Fusariumheterosporum)、大肠杆菌、芽孢杆菌属，优选枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌、假单胞菌属，优选荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(也称为Komagataella phaffii)、Thermothelomyces thermophila(以前称为Myceliopthorathermophila(C1))、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、木霉属，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)和酵母菌属，优选酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。

术语“异源”(或外源或外来或重组)多肽包括：

(a)对宿主细胞不是天然的多肽。这种异源多肽的蛋白质序列是合成的、非天然存在的“人造”蛋白质序列；

(b)对宿主细胞是天然的多肽，其中已经进行了结构修饰例如缺失、取代和/或插入以改变所述天然多肽；或

(c)对宿主细胞是天然的多肽，其表达例如通过使用更强的启动子被定量地改变，或其表达由于通过重组DNA技术操作宿主细胞DNA由从不同于天然宿主细胞的基因组位置所指导。

术语“异源”(或外源或外来或重组)多核苷酸是指：

(a)对宿主细胞不是天然的多核苷酸；

(b)对宿主细胞是天然的多核苷酸，其中已经进行了结构修饰例如缺失、取代和/或插入以改变天然多核苷酸；

(c)对宿主细胞是天然的多核苷酸，其表达通过重组DNA技术例如通过使用更强的启动子操纵多核苷酸的调节元件而被定量改变；或

(d)对宿主细胞是天然的多核苷酸，但是由于通过重组DNA技术的遗传操作而整合在其天然基因组基因座以外的基因组基因座上。

关于两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列，术语“异源”用于表征所述两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个氨基酸序列不是天然地以彼此特异性组合的方式存在。

“载体”是指适于携带外来多核苷酸序列用于转移至另一细胞或在给定细胞内稳定或瞬时表达的的任何类型的构建体。术语“载体”涵盖任何种类的克隆载体，如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如噬菌体)、细菌噬菌体、杆状病毒、粘粒、fosmids、人工染色体或任何其他特异于特定感兴趣宿主的载体。还包括低拷贝数或高拷贝数载体。外来多核苷酸序列通常包含编码序列，其可以被称为“感兴趣基因”。感兴趣基因可以包含内含子和外显子，其取决于宿主细胞的来源或目的。

本发明还包括SEQ ID No.2所示核酸序列的变体，其中所述变体核酸序列是与SEQID No.2所示核酸序列至少80％相同的核酸序列，以及其中变体核酸序列编码具有α-淀粉酶活性的变体多肽，其与亲本多肽、优选与由根据SEQ ID No.2的核酸序列编码的多肽和/或具有根据SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽相比，具有增加的外淀粉酶活性。

制备本发明的变体多肽的方法包括：

(a)提供编码具有α-淀粉酶活性的变体多肽的模板核酸序列；

(b)将所述模板核酸序列转化进表达宿主；及

(c)培养所述表达宿主以产生所述变体多肽，并纯化所述变体多肽。

所述模板核酸序列是SEQ ID No.2所示核酸序列的变体，其中所述变体核酸序列与SEQ ID No.2所示核酸序列至少80％相同，以及其中所述变体核酸序列编码具有α-淀粉酶活性以及与亲本多肽、优选地根据SEQ ID No.1的多肽相比具有增加的外淀粉酶活性的多肽。

具有α-淀粉酶活性的多肽变体可以单独或作为酶的混合物来使用或配制。

含有本发明的变体多肽的制剂可以是固体形式如粉末、冻干制剂、颗粒、片剂、条、晶体、胶囊、丸剂、小丸剂或以液体形式如水性溶液、气雾剂、凝胶、糊剂、膏剂、水性/油性乳剂、乳膏、胶囊或囊泡或胶束悬浮液。

本发明的变体多肽可以与至少一种其他酶组合使用。所述其他酶可以来自相同类别的酶，例如可以是第二α-淀粉酶。所述其他酶也可以来自不同类别的酶，例如可以是脂肪酶。与至少一种其他酶的组合可以是包含至少三种酶的组合物。所述三种酶可以来自相同类别的酶，例如所述组合可以包含本发明的变体多肽、第二淀粉酶和第三淀粉酶；或所述酶可以来自不同类别的酶，例如所述组合可以包含本发明的变体多肽、脂肪酶和木聚糖酶。

所述第二酶可以选自：第二α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(也称为外麦芽四糖水解酶)、G4-淀粉酶；葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(也称为麦芽糖α-淀粉酶)、环糊精葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶；内切-1,4-β-木聚糖酶；木聚糖酶、纤维素酶、氧化还原酶；磷脂酶A1；磷脂酶A2；磷脂酶C；磷脂酶D；半乳糖脂酶、三酰基甘油脂酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、转谷氨酰胺酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、蛋白酶或其任意组合。酶组合可以包含本发明的变体多肽和脂肪酶，或者酶组合可以包含本发明的变体多肽、脂肪酶和木聚糖酶。

本发明还涉及包含本发明的变体多肽的组合物。

包含本发明的变体多肽的组合物还可包含第二酶。

优选地，所述第二酶选自：第二α-淀粉酶、脂肪酶、β-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。

本发明的组合物可以用于烘焙产品的制备中。

本发明还涉及制备面团的方法，所述方法包括将本发明的变体多肽添加至面团中。

“面团”被定义为面粉、盐、酵母和水的混合物，可以在烘焙之前将其揉合、模制、塑形或制卷。另外，也可以使用其他成分诸如糖、人造黄油、鸡蛋、牛奶等。所述术语包括用于制备烘焙食物(诸如面包、面包卷、三明治面包、法式长棍、夏巴塔(ciabatta)、牛角面包、甜酵母面团等)的面团。

本发明还涉及制备由面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将本发明的变体多肽添加至面团中并烘焙面团，从而制备烘焙产品。

术语“烘焙产品”包括但不限于诸如面包、脆皮面包卷(crispy rolls)、三明治面包、圆面包(buns)、法式长棍、夏巴塔、牛角面包、面条以及精焙烤制品如甜甜圈、奶油糕点、果肉面包、蛋糕、松饼等的烘焙产品。

烘焙产品包括但不限于：面包、面包卷、圆面包、面粉糕饼、蛋糕、扁面包、比萨面包、皮塔面包、威化饼、馅饼皮、馕、lavish、皮塔(pitta)、佛卡恰面包、酸面团、面条、饼干、甜甜圈、深-炸玉米饼、薄烤饼(pancakes)、薄饼(crepes)、油煎碎面包片和糕饼。烘焙产品也可以是可食用的容器如杯或锥筒。

烘焙面包通常涉及将成分混合以形成面团、捏合、发起(rising)、成形、烘焙、冷却和储存。用于制作面团的成分通常包括面粉、水、盐、酵母和其他食物添加剂。在本发明的方法中，本发明的变体多肽是用于制备面团的成分之一。

面粉通常由小麦制成并可以被研磨用以不同目的(诸如制作面包、面粉糕饼、蛋糕、饼干面食和面条)。小麦粉的替代品包括但不限于：杏仁粉、椰子粉、奇亚粉(chiaflour)、玉米粉、大麦粉、斯佩耳特粉、大豆粉、大麻粉、马铃薯粉、奎藜籽(quinoa)、teff粉、黑麦粉、苋菜粉、葛粉、鹰嘴豆(埃及豆)粉、腰果粉、亚麻粉、澳洲坚果粉、粟粉、高粱粉、米粉、木薯粉及其任意组合。众所周知，面粉类型在全球不同地区和不同国家之间不同。

面粉或面团的处理可包括添加无机物质、有机物质如脂肪酸、碳水化合物、氨基酸、蛋白质和坚果。面粉或面团可以在烘焙之前通过冷却、加热、辐照、团聚或冷冻干燥进行预处理。另外，面粉或面团可以在烘焙之前通过添加酶(如本发明的变体多肽)或微生物(如酵母)进行预处理。

酵母将糖分解为二氧化碳和水。通常源自酿酒酵母菌的多种贝克酵母(Baker’syeast)是本领域技术人员已知的，包括但不限于：奶油酵母、压缩酵母、压块酵母、活性干酵母、速溶酵母、耐渗透酵母、快速酵母(rapid-rise yeast)、失活酵母。其他酵母包括营养酵母、啤酒酵母、蒸馏酒和葡萄酒酵母。

可以添加到面团中的甜味剂包括但不限于：液态糖、糖浆、白(颗粒)糖、棕(粗)糖、蜂蜜、果糖、右旋糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、蜜叶糖和人造甜味剂。

可以添加到面团中的乳化剂包括但不限于甘油单酯的二乙酰酒石酸酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(sodium stearoyl lactylate，SSL)、硬脂酰乳酸钙(calcium stearoyllactylate，CSL)、乙氧基化的甘油单酯和甘油二酯(EMG)、聚山梨醇酯(PS)和琥珀酸单甘油酯(SMG)。

可用于烘焙方法的其他食物添加剂包括：脂质、油类、黄油、人造黄油、起酥油、乳脂、甘油、鸡蛋、奶制品(diary)、非奶制品替代品、增稠剂、防腐剂、色素和酶。

用于烘焙的成分或添加剂可在烘焙过程中单独添加到面团中。所述成分或添加剂也可以与多于一个的成分或添加剂组合以形成预混合物，然后在烘焙过程中将预混合物添加到面团中。面粉或面团混合物可以在烘焙之前制备，包括即烤面团(ready-for ovendoughs)、包装面团或包装面糊。

可以对烘焙产品进行改性以满足特殊的饮食要求，如无糖饮食、无麸质饮食、低脂饮食或其任何组合。酶可以延长基于面团的产品的保质期或提供抗菌(无霉菌)作用。

“面包体积”是通过使用激光扫描仪(例如Volscan Profiler ex Micro StableSystem)测量体积和比体积所确定的烘焙商品的体积。所述术语还包括通过测量某些烘焙商品的长度、宽度和高度所确定的体积。

本发明的变体多肽在制备面团的方法中的使用增加了由面团制备的烘焙产品的弹性。在确定弹性之前，可以将烘焙产品存储5天、10天、15天或20天。可以通过使用质构分析(TPA)的质地分析仪(texture analyzer)测试来确定弹性。TPA是一个两周期压缩测试并且弹性是通过完成的可恢复功除以质地分析仪完成的硬度功来计算的。使用本发明的变体多肽的由面团制备的烘焙产品的弹性增加至少5％或8％，优选至少10％或12％，更优选至少15％或20％以及最优选至少25％或30％。

本发明的变体多肽在制备面团的方法中的使用降低了储存后的由面团制备的烘焙产品的硬度。通常，在确定硬度之前，将烘焙产品在室温保存10天、15天或20天。可以根据AACC 74-09测试例如使用35mm样品和5kg负载单元来确定硬度。在测试中可以使用以下参数：测试前速度：1mm/sec，测试速度：5mm/sec，测试后速度：5mm/sec，目标模式：距离，距离：10mm，时间5秒，触发类型：自动(Force)，触发力：5g。使用本发明的变体多肽由面团制备的烘焙产品的硬度降低至少5％或8％，优选至少10％或12％，更优选至少15％或20％以及最优选至少25％或30％。

本发明的变体多肽可用于其他工业应用。具有α-淀粉酶活性的变体多肽可用于洗涤剂、个人护理产品、纺织品的加工、纸浆和纸加工、生产乙醇、木质纤维素乙醇或糖浆；或在油田和采矿业中用作减粘剂。

提供以下实例用于说明目的。因此应当理解这些实例不应解释为限制性的。技术人员将明显能够设想对本文所提出的原理的进一步修改。

实施例

实施例1：产生变体α-淀粉酶的酶

根据SEQ ID No.1的亲本酶，其由SEQ ID No.：2的核酸序列编码。在实验室中对亲本酶进行工程改造，以产生与亲本酶相比具有增加的外淀粉酶活性的非天然存在的α-淀粉酶变体酶。使用亲本酶的基因位点饱和诱变(GSSM)(如至少US 6,562,594,US6,171,820,和US 6,764,835中所述)；易错PCR；和/或Tailored Multi-Site-Combinatorial Assembly(TMSCA)(美国专利9,476,078中所述)，从亲本酶起始并使其进化来产生变体多肽酶。

产生与根据SEQ ID No.1的亲本多肽相比具有一个氨基酸取代的变体多肽，并使用PAHBAH和碘测定测试其α-淀粉酶活性。通过从所有样品数据点中减去板背景将所有数据点归一化。

在检测淀粉量的碘测定与检测还原端的PAHBAH测定之间观察到负线性趋势或相关性。换句话说，测定结束时当可用的淀粉更少时，还原端更显著。为了对描述负相关性的线进行预测，对样品数据点进行了线性回归。为了发现与亲本酶相比具有增加的外淀粉酶活性的改良突变体，对违背这个线性趋势的突变进行了鉴定。在数学上，通过围绕线性回归线构建90％置信带来选择这些突变，并选用高于90％置信带(阈值)上限的突变。在图1中显示了证明线性回归的示例性图。下表1显示了不同的单突变体，其与上阈值(即90％置信带)具有正距离，以及其因此被认为是具有增加的外淀粉酶活性的突变体。鉴于二级标记诸如质谱分析的结果，手动选择了其他突变体。

表1

产生以下与根据SEQ ID No.1的亲本多肽相比具有氨基酸取代组合的变体多肽，并使用PAHBAH和碘测定测试α-淀粉酶活性。

表2

实施例2：变体α-淀粉酶的表达

通过构建包含编码多核苷酸序列的表达质粒、将所述质粒转化进巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)中并以以下方式生长所得表达菌株来获得具有α-淀粉酶活性的变体多肽。

新鲜的表达株巴斯德毕赤酵母细胞通过将序列确认菌株的甘油原液散布到含有Zeocin的酵母提取蛋白胨右旋糖(YPD)琼脂板上获得。2天后，使用来自这些平板的细胞将生产菌株的起始种子培养物接种到100mL缓冲甘油复合培养基(BMGY)中，并在30℃和225-250rpm生长20-24小时。通过将合适的量转移进装有挡板的发酵罐中2-4L的BMMY培养基来扩大种子培养物。在30℃和1100rpm搅拌(通过平叶轮提供)下进行发酵48-72小时。在发酵的初始分批阶段之后，当培养物中的溶解氧水平降至30％以下时，添加无菌过滤的甲醇作为饲料。或者，每3小时以起始分批培养物的0.5％v/v添加饲料。将最终的发酵液在4℃以7000xg离心30分钟以获得无细胞上清液。

通过用SDS-PAGE或毛细管电泳测定上清中感兴趣蛋白表达来检测具有α-淀粉酶活性的变体多肽。

实施例3：PAHBAH测定

使用如Lever M.(1972)Anal.Biochem.47,273–279中所述的具有如下修改的4-羟基苯肼法测量α-淀粉酶和变体酶的淀粉水解的定量。在65℃使112μL的1％马铃薯支链淀粉与12.5μL的稀释酶反应并在60分钟时取样。然后通过混合进100μl的1％PAHBAH试剂中淬灭反应。将反应加热至95℃6分钟，冷却至室温，并在BioTek酶标仪中于410nm读取溶液吸光度。

实施例4：碘测定

通过用Lugol试剂染色支链淀粉来评估支链淀粉降解的程度。将酶样品与1％支链淀粉在65℃孵育1小时后，在室温用Lugol溶液将样品稀释至10％。在BioTek酶标仪中于550nm读取吸光度。

例5：碘和PAHBAH值

每个酶反应的碘值用作支链淀粉降解的测量。因此，基于高碘值和/或通过PAHBAH值测量的高水解活性来选择突变体。基于这些参数的α淀粉酶的进化产生了一种酶，其活性从急剧的内淀粉酶活性转变为更多的外淀粉酶活性。其通过与亲本酶相比对给定的PAHBAH值的更高碘值指示(见图1)。

实施例6：BCA测定

使用BCA还原端测定测量α-淀粉酶和变体酶淀粉水解的定量。简要地，在开始测定之前，将1份硫酸铜(II)溶液与49份双金鸡宁酸溶液混合。1％马铃薯支链淀粉用作底物并在添加酶之前在测定温度保持10分钟。

在50℃至80℃的温度，使112μL的1％马铃薯支链淀粉与12.5μL的稀释酶反应，并在10分钟内以相等时间间隔取10μL样品。通过将其混合入100ul的BCA试剂中立即淬灭反应样品并加热至80℃ 30分钟，冷却至室温，并在BioTek酶标仪中于560nm读取溶液吸光度。将实验斜率与葡萄糖标准相关联以产生比活。下表3显示了在表1中所示的突变体在不同温度以μmol/min/mg酶(PI)所示的BCA测定中的活性。

表3：

实施例7：变体α-淀粉酶的烘焙性能

具有α-淀粉酶活性的变体多肽的烘焙性能在直接加工的小麦模制面包中测试。如下制备面包面团：将1000g的550型面粉(Vogtmühlen Illertissen)、30g压缩酵母、20g盐、20g糖、20g人造黄油、60pp抗坏血酸、150ppm

CS30(真菌木聚糖酶、纤维素酶、真菌α-淀粉酶)、8g

(蒸馏的甘油单酯)和600g水在Kemper SP15螺旋混合器中以速度1混合4.5分钟和以速度2混合2.5分钟至最终面团温度为28℃。静置15分钟后，将面团分成500g的块，切圆并发醒(proofed)15分钟。之后，将面团块模制成型，放入烘焙器皿中并在35℃、85％相对湿度发醒80分钟。发醒的面团块在255℃/240℃的上下加热温度在台式烤箱中烘焙25分钟，使用15秒蒸汽注入。

将变体多肽酶样品以27ppm至325ppm的剂量添加到面粉中。将其对面团特性和最终烘焙商品的作用与阴性对照(不含酶)以及

进行比较。测量结果的硬度和弹性，如图3所示。

体积效应通过激光扫描仪(Stable Micro Systems VolScan Profiler,VolScan600)测量面包片来确定。阴性对照定义为0％。

面团特性由熟练的面包师进行触觉评估，并与阴性对照比较进行描述。

将准备好的烘焙面包包装并密封在塑料袋中。另外，将他们部分地在85℃巴氏灭菌90分钟。面包屑特性是在新鲜烘焙的面包上并且在定义的存储时间后确定的，通常是在1、10、20天后，使用质地分析仪((Stable Micro Systems,TA.XTplus Texture Analyzer)通过质构分析来确定。因此，在测量之前，从面包片的中间切出25-毫米-厚的切片。

序列表

<110> 巴斯夫欧洲公司

<120> 淀粉酶

<130> 161160

<150> US 62/677451

<151> 2018-05-29

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 436

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic Generated

<400> 1

Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala Phe

1 5 10 15

Tyr Trp Asp Val Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Gln

20 25 30

Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro

35 40 45

Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro

50 55 60

Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Lys Gly Thr Val Glu

65 70 75 80

Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu Val Asn Met Ile Asn Thr Ala

85 90 95

His Ser Tyr Gly Ile Lys Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg

100 105 110

Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Asn Asn Tyr Thr Trp

115 120 125

Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu

130 135 140

Asp Phe His Pro Asn Glu Val Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly

145 150 155 160

Asp Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gln Tyr Trp Leu

165 170 175

Trp Ala Ser Asn Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile

180 185 190

Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val Val

195 200 205

Asn Asp Trp Leu Ser Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr Trp

210 215 220

Asp Thr Asn Val Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Asp Ser Gly Ala

225 230 235 240

Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp

245 250 255

Asn Thr Asn Ile Pro Ala Leu Val Tyr Ala Leu Gln Asn Gly Gly Thr

260 265 270

Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn His

275 280 285

Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

290 295 300

Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Val Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp

305 310 315 320

Leu Asn Lys Asp Lys Leu Asn Asn Leu Ile Trp Ile His Glu His Leu

325 330 335

Ala Gly Gly Ser Thr Lys Ile Leu Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile

340 345 350

Phe Met Arg Glu Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile

355 360 365

Asn Leu Gly Asn Asp Trp Ala Glu Arg Trp Val Asn Val Gly Ser Lys

370 375 380

Phe Ala Gly Tyr Thr Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp

385 390 395 400

Val Asp Arg Trp Val Gln Tyr Asp Gly Trp Val Lys Leu Thr Ala Pro

405 410 415

Pro His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr

420 425 430

Ala Gly Val Gly

435

<210> 2

<211> 1311

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> Synthetic Generated

<400> 2

gcaaagtact ccgaattgga ggaaggtggt gtaattatgc aagcctttta ctgggacgtt 60

cctggaggtg gaatttggtg ggataccatt agacagaaga tcccagaatg gtatgacgcc 120

ggtatttccg ctatctggat acctcctgcc tctaagggta tgggtggtgg ttactctatg 180

ggttatgacc catacgattt cttcgatttg ggagaatatt accagaaggg taccgtagaa 240

acaagatttg gttctaagga ggagcttgtt aacatgatta acactgctca ttcttacgga 300

attaaggtga ttgcagacat agtgatcaac catcgtgctg gtggagacct tgagtggaat 360

ccatttgtga ataactacac atggactgat ttttcaaagg ttgcctccgg taaatatacc 420

gccaattacc ttgactttca cccaaatgag gtgaagtgtt gtgatgaagg tactttcggt 480

gattttcctg acatcgctca tgagaagtca tgggaccaat attggctgtg ggcatccaac 540

gaatcatacg ccgcttacct tagatcaatt ggtatcgatg cctggagatt tgattatgtg 600

aagggatatg gtgcatgggt tgttaatgat tggctgtctt ggtggggtgg ttgggccgtt 660

ggtgagtact gggacacaaa cgtggatgcc cttttgaact gggcatatga ttctggagct 720

aaagtgtttg acttcccctt gtactataag atggacgagg cttttgataa tactaacata 780

cccgctcttg tgtacgctct tcagaacgga ggtactgttg tttctagaga cccatttaag 840

gctgtgactt ttgttgcaaa ccatgacact gatatcatat ggaacaagta cccagcttat 900

gcattcattt tgacatacga gggacaacct gttattttct atagagacta tgaagaatgg 960

ttgaacaaag acaaattgaa taacctgatt tggattcatg aacatctggc tggtggttct 1020

accaaaattc tttactacga caatgacgaa ctgatattca tgcgtgaagg ttacggatcc 1080

aagcccggat tgattactta tatcaatctt ggaaacgact gggcagagag atgggtgaat 1140

gttggttcca agttcgccgg ttatacaatt cacgaataca ccggaaattt gggtggttgg 1200

gtagataggt gggtccaata tgacggttgg gttaagctta ctgctcctcc tcacgatccc 1260

gctaatggtt actatggata ctctgtgtgg tcttacgcag gtgtaggtta a 1311

Claims

1.根据SEQ ID No.1的α-淀粉酶的变体多肽，其包含与根据SEQ ID No.1的序列至少80％相同的氨基酸序列并且具有α-淀粉酶活性，其中与根据SEQ ID No.1的α-淀粉酶相比，所述变体多肽具有增加的外淀粉酶活性。

2.权利要求1的变体多肽，其中与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列相比，所述变体包含至少一个氨基酸修饰。

3.权利要求2的变体多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰是氨基酸取代。

4.权利要求2或3的变体多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰在选自以下的氨基酸残基位置编号：SEQ ID No.1编号中的2、3、4、21、22、25、26、29、32、35、45、53、59、68、76、82、88、90、91、96、105、117、126、128、134、141、152、160、175、197、200、234、236、243、256、257、258、261、264、270、292、311、380、416、423、433和435。

5.权利要求2或3的变体多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰是选自以下的氨基酸取代：SEQ ID No.1编号中的K2H、Y3R、S4T、P21E、P21W、G22Q、I25W、W26G、T29G、Q32R、P35K、I45M、G53A、S59P、F68P、K76R、R82N、E88Y、V90G、V90M、N91T、A96T、A105W、L117R、Y126V、W128Y、V134A、A141T、K152M、G160E、G160V、W175N、F197A、F197K、V200S、W234C、Y236H、F243A、F243K、F243T、D256A、N257R、T258C、P261C、P261F、V264R、G270Y、I292A、I292E、V311L、N380L、G416Q、G423M、A433W和V435S。

6.权利要求1的变体多肽，其中与根据SEQ ID No.1的氨基酸序列相比，所述变体多肽包含氨基酸修饰的组合。

7.权利要求6的变体多肽，其中所述氨基酸修饰的组合是选自以下的氨基酸取代的组合：SEQ ID No.1编号中的

(a)G22Q、P35K、S59P、W128Y、D256A；

(b)G22Q、W128Y、W175N、V200S、A433W；

(c)G22Q、P35K、S59P、D256A；

(d)G22Q、W175N、V200S、D256A、A433W；

(e)W128Y、W175N、D256A；

(f)G22Q、S59P、V200S、D256A、A433W；

(g)G22Q、W175N、V200S、D256A；

(h)G22Q、S59P；

(i)G22Q、P35K、W128Y、W175N、V200S、D256A、A433W；

(j)G22Q、P35K、S59P、W128Y、A433W；

(k)G22Q、W128Y、W175N、D256A；

(l)P35K、W128Y、V200S、D256A；

(m)G22Q、S59P、W175N、V200S、A433W；

(n)G22Q、S59P、W128Y、V200S、A433W；

(o)G22Q、S59P、W175N、V200S、D256A、A433W；

(p)G22Q、S59P、W128Y、D256A；

(q)S59P、V200S、D256A、A433W；

(r)P35K、S59P、W128Y、W175N、V200S、D256A、A433W；

(s)G22Q、S59P、W128Y、D256A、A433W；

(t)G22Q、S59P、W128Y、W175N、V200S、433W；

(u)G22Q、W128Y、W175N、A433W；

(v)S59P、W128Y、V200S；

(w)P35K、S59P、V200S、A433W；

(x)S59P、W128Y、V200S、D256A；

(y)S59P、W128Y、V200S、A433W；和

(z)W128Y、V200S、A433W。

8.权利要求1-7任一项的变体多肽，其中所述变体多肽是根据SEQ ID No.1的全长氨基酸序列的片段。

9.一种变体多肽，其包含权利要求1-8任一项的至少一种变体多肽和具有淀粉酶活性的第二多肽的杂合体，其中所述杂合体具有α-淀粉酶活性。

10.一种组合物，其包含权利要求1-9任一项的变体多肽。

11.权利要求10的组合物，其还包含第二酶。

12.权利要求11的组合物，其中所述第二酶选自：第二α-淀粉酶、脂肪酶、β-淀粉酶、G4-淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、葡糖淀粉酶、氧化还原酶、磷脂酶和环糊精葡聚糖转移酶。

13.一种制备变体多肽的方法，其包含：提供编码权利要求1-9任一项的多肽变体的模板核酸序列，将所述模板核酸序列转化进表达宿主，培养所述表达宿主以产生所述变体多肽，并纯化所述变体多肽。

14.权利要求13的方法，其中所述模板核酸是SEQ ID NO.2所示核酸序列的变体核酸序列，其中所述变体核酸序列是与SEQ ID No.2所示核酸序列至少80％相同的核酸序列，其中所述变体核酸序列编码具有α-淀粉酶活性及与由根据SEQ ID No.2的核酸序列编码的α-淀粉酶相比具有增加的外淀粉酶活性的多肽。

15.权利要求13或14的方法，其中所述表达宿主选自：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成表达系统。

16.权利要求15的方法，其中所述细菌表达系统选自大肠杆菌、芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属。

17.权利要求15的方法，其中所述酵母表达系统选自念珠菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属。

18.权利要求15的方法，其中所述真菌表达系统选自青霉属、曲霉菌属、镰刀菌属、Thermothelomyces、根毛霉菌属、根霉菌属、Thermomyces和木霉属。

19.一种制备面团或由所述面团制备的烘焙产品的方法，所述方法包含将权利要求1-9任一项的变体多肽添加至所述面团，并最终烘焙所述面团。

20.权利要求1-9任一项的变体多肽或权利要求10-12任一项的组合物在加工淀粉中的用途。

21.权利要求1-9任一项的变体多肽或权利要求10-12任一项的组合物在清洁或洗涤纺织品、硬表面或餐具中的用途。

22.权利要求1-9任一项的变体多肽或权利要求10-12任一项的组合物在制备乙醇中的用途。

23.权利要求1-9任一项的变体多肽或权利要求10-12任一项的组合物在处理油井中的用途。

24.权利要求1-9任一项的变体多肽或权利要求10-12任一项的组合物在加工纸浆或纸中的用途。

25.权利要求1-9任一项的变体多肽或权利要求10-12任一项的组合物在饲喂动物中的用途。

26.权利要求1-9任一项的变体多肽或权利要求10-12任一项的组合物在制备糖浆中的用途。