CN104531660A - 用于重组布氏白僵菌蛋白酶k常温保存的缓冲液及其应用 - Google Patents

用于重组布氏白僵菌蛋白酶k常温保存的缓冲液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用，所述缓冲液的组分包括：三羟甲基氨基甲烷Tris，可溶性纳盐，可溶性钙盐，甘油， pH值至7.5～8.4；余量为水；本发明相比于现有技术，能够显著增强重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的时间且不降解其催化效率，同时，采用本发明的缓冲液保存的重组布氏白僵菌蛋白酶K可无需处理，直接应用，如用于核酸抽提等，显著降低了布氏白僵菌蛋白酶K的运输、保存和使用成本，具有广泛的应用前景。

Description

用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶K缓冲液，尤其涉及的是用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用。
背景技术
蛋白酶K（Proteinase K）, 又名肽链内切酶K、腐生真菌碱性蛋白酶、白色念球菌丝氨酸蛋白酶、白色念球菌蛋白酶K，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。该蛋白可通过切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键降解天然角蛋白，并因此而得名。由于蛋白酶K在盐酸胍（3M）、尿素（4M）和SDS（0.5-1%）中均可以稳定存在并具有降解蛋白质的能力，因而被广泛应用于脉冲电泳用染色体DNA制备、蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制品中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50～100μg/ml，且在较广的pH范围内（pH4～12）均有活性。
蛋白酶K有两个Ca2+结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去Ca2+，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染核酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶K消化过程中通常加入EDTA（以抑制依赖于Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶K具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l的Ca2+而不含EDTA的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入EDTA（pH8.0）至终浓度为2mmol/l，以鳌合Ca2+。
蛋白酶K最早于1974年从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。但一直以来天然菌株培养困难、产量过低的问题严重阻碍了蛋白酶K的实际应用。1985年测定其天然氨基酸序列后，多个国家的研究者及相关公司投入了很大精力尝试实现该蛋白的大规模重组表达，于2000年前后实现该蛋白在大肠杆菌系统中的重组表达，但此方法只能得到包涵体蛋白，变复性过程导致生产成本增高、产量损失严重；直到2008年左右才实现了该蛋白的毕赤酵母系统分泌表达，至此，林伯氏白色念球菌蛋白酶K的生产和应用进入了一个快速发展的时期。与此同时，林伯氏白色念球菌蛋白酶K野生型及各种突变体的表达纯化专利在很短时间内被各大国际制药公司垄断（Patent No.: WO 02/072634 A2，US 7368274 B2），做为后入者的中国企业很难绕开相关专利保护加入到该酶的研发、生产和销售过程中去。
重组布氏白僵菌蛋白酶K来源于布氏白僵菌的重组表达，现已在我国实现了工业化生产，其催化活力显著优于现有林伯氏白色念球菌蛋白酶K。重组布氏白僵菌蛋白酶K产品作为一种蛋白质，其活性和稳定性受到温度、pH值、保存时间等因素的影响，为维持其正常活性，该产品通常需要以干粉形式低温保存（0～4℃），或者溶液状态下冷冻保存（-20℃），且保存时间均不超过一年。这给重组布氏白僵菌蛋白酶K的运输和应用带来了很大不便，研究如何降低其保存条件并延长其保存时间非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用，以解决重组布氏白僵菌蛋白酶K无法常温保存，且保存时间短的技术问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，所述缓冲液的组分包括：
三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为10～500mmol/L；
可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：20mmol/L～500mmol/L；
可溶性钙盐，所述钙盐中Ca2+的摩尔浓度为：2mmol/L～50mmol/L；
用HCl调节pH值至7.5～8.4；
甘油，其30％～60％的体积百分比；
余量为水。
优选地，所述缓冲液的组分包括：
三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为25mmol/L；
可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：200mmol/L；
可溶性钙盐，所述钙盐中Ca2+的摩尔浓度为：10mmol/L；
用HCl调节pH值至7.8；
甘油，其体积百分比为50%；
余量为水。
优选地，所述可溶性钠盐为NaCl。
优选地，所述可溶性钙盐为CaCl2或CaSO4。
本发明进一步提供了上述用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的制备方法，包括下列步骤：
（1）按照配比，将Tris、可溶性钠盐、可溶性钙盐加入水中溶解，并用HCl调节pH值至7.5～8.4，获得混合液；
（2）将甘油按照30％～60％的体积百分比加入步骤（1）的混合液中混匀，即为所述缓冲液。
本发明还进一步提供了上述用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的应用，将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于所述缓冲液中，其溶解浓度为2～10mg/mL，然后置于常温中保存即可，保存时间在一年以上无明显降解。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液及其应用，该缓冲液能够显著增强重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的时间且不降解其催化效率，在该缓冲液中，重组布氏白僵菌蛋白酶K可以在常温运输和存放超过一年时间而活性不受显著影响；同时，采用本发明的方法保存的重组布氏白僵菌蛋白酶K可无需处理，直接应用，如用于核酸抽提等；本发明相比于现有技术，显著降低了布氏白僵菌蛋白酶K的运输、保存和使用成本，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是重组布氏白僵菌蛋白酶K的BSA消化电泳检测图；
图2是利用重组布氏白僵菌蛋白酶K抽提所得的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别准确称取0.303g三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、0.147g二水合氯化钙CaCl2和1.17g氯化钠NaCl，然后加入40ml纯水，充分混匀后用盐酸将其pH调至7.8，用量筒定容至50ml，获得混合液。
（2）准确量取50mL甘油，加入上述混合液中混匀，即获得所述缓冲液。
将上述缓冲液用于重组布氏白僵菌蛋白酶K的常温保存，并测定其保护效果，具体如下：
A、BSA消化试验
a、反应底物BSA的预处理
将5mg的牛血清白蛋白BSA溶于6mol/L的盐酸胍、50mmol/L的Tris-Cl（pH8.0）、5mmol/L的二硫苏糖醇DTT，终体积为1mL；95℃水浴20min；降至室温后，加入50mmol/L的Tris-Cl（pH 7.5）及5mmol/L的CaCl2，使盐酸胍的终浓度降至2mol/L以下，获得BSA溶液。
b、不同缓冲液条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K的BSA消化实验
将重组布氏白僵菌蛋白酶K用本实施例制备获得的缓冲液配制成10mg/ml的酶溶液，分别选取新鲜配制的该酶溶液，室温保存半年的酶溶液，以及室温保存一年的酶溶液作为测定组，并用普通缓冲液溶解重组布氏白僵菌蛋白酶K的酶溶液作为对照组，进行后续的BSA消化反应。
所述BSA消化反应的反应体系（10μL）为由4μL的BSA溶液和6μL的酶溶液组成。
混合反应液在37℃反应15min后金属浴高温加热停止反应，获得消化后的酶解液。
c、SDS-PAGE检测
对酶解液进行SDS-PAGE检测，步骤包括：
步骤一：制备质量比为12%的分离胶和质量比为5%的浓缩胶，其配方为：
步骤二：在小烧杯中依次加入12%分离胶，灌入预先装配好的双层玻璃板的间隙中，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全；再在小烧杯中依次加入5%浓缩胶，灌入双层玻璃板间己凝聚的分离胶上方的间隙，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全，获得凝胶。
步骤三：2×SDS蛋白上样buffer的配制：取10ml的1.5mol/L的Tris-HCl（pH6.8），4g的SDS、0.2g的溴酚蓝，40ml的甘油40ml，加双蒸水定容至100ml。
步骤四：取10μl上述消化后的酶解液，混合等体积的2×SDS蛋白上样buffer，然后在沸水浴中处理10min，再在12000转下离心1min，吸取上清加入到上述制备的凝胶的点样孔中，上样量为10μL；同时加入蛋白质分子量标准Marker（Unstained Protein Molecular Weight Marker，Fermentas），在200V恒压下电泳1.5h；最后卸下凝胶，对凝胶进行考马斯亮蓝染色，观察样品中的目的蛋白条带。
结果获得如图1所示的SDS-PAGE凝胶电泳图，图1中从左向右各泳道分别为：
第1道：蛋白Maker，其中，5条可见的蛋白条带从上向下依次表示45kD、35kD、25kD、18.4kD及14.4kD的蛋白大小；
第2道：经步骤a预处理的BSA溶液；
第3道：普通缓冲液条件下新鲜重组布氏白僵菌蛋白酶K降解BSA样品15分钟后的电泳结果；
第4道：本实施例制备的缓冲液条件下新鲜重组布氏白僵菌蛋白酶K降解BSA样品15分钟后的电泳结果；
第5道：本实施例制备的缓冲液条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K保存半年后降解BSA样品15分钟后的电泳结果；
第6道：本实施例制备的缓冲液条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K保存一年后降解BSA样品15分钟后的电泳结果。
由图1可见，本实施例的缓冲液在常温保存重组布氏白僵菌蛋白酶K一年后蛋白酶K 的活性不受影响。
B、重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液在核酸抽提中的应用
a、提取酿酒酵母基因组DNA：
分别使用普通缓冲液保存的新鲜重组布氏白僵菌蛋白酶K、本实施例制备的缓冲液保存的新鲜重组布氏白僵菌蛋白酶K、本实施例制备的缓冲液保存半年及一年的重组布氏白僵菌蛋白酶K，共四组试验组，用于酿酒酵母样品基因组DNA抽提实验，具体步骤包括：
步骤一：YPD 培养基的配制：15gYPD粉末（Clontech公司）溶于300ml纯水中，6分钟121℃高压灭菌后，加入4.5 ml的Adenine溶液（Adenine，Sigma公司，200ug溶于10ml的0.5M HCl中）；
步骤二：取YPD培养液3ml到15ml 离心管中，挑酿酒酵母单克隆到培养液中，30℃，200rpm下培养4小时；
步骤三：在3ml酵母初级培养液中加入10ml的YPD培养液进行次级培养，30℃，200rpm下培养过夜；
步骤四：取5ml的菌液，13000下离心5分钟，弃上清；
步骤五：沉淀中加入600ul的TE Buffer，10ul的蜗牛酶（200mg/ml），30℃，240rpm下放置1小时，消解细胞壁；
步骤六：将破碎液置于13000rpm下离心3分钟，弃上清，沉淀中加入1 ml消化缓冲液（包括：100mmol/L的NaCl；10mmol/L的Tris-HCl； 25mmol/L的EDTA；0.5% W/V的SDS）及5ul重组布氏白僵菌蛋白酶K（20 mg/ml），65℃水浴使充分消化12～24小时，直至消化液变清亮为止；
步骤七：在上一步所得消化液中加400ul酚/氯仿（1：1体积比）高速震荡3分钟，13000rpm下高速离心5分钟，取上清的水层，并粗略估计体积；
步骤八：在上步所得水溶液中加0.2倍体积 10mol/L （NH3）Ac 及两倍体积无水乙醇，颠倒混匀，室温下13000rpm下离心3分钟，冰上用70%乙醇洗涤，弃上清。
步骤九：鼓风干燥上步所得沉淀后，加入30ul灭菌纯水溶解，获得四组酿酒酵母基因组DNA，用于下一步检测。
b、紫外分光光度法检测上述DNA的浓度和纯度
用紫外分光光度计检测抽提所得基因组DNA在260nm和280nm下的吸光值，计算OD260与OD280的比值，获得的基因组DNA的OD260/OD280均在1.8左右，说明基因组中的核小体蛋白及其他杂蛋白已被去除干净，四组试验组样品均表现出足够的催化活性。
c、琼脂糖凝胶电泳检测所抽提得到的DNA质量：
配制0.7％琼脂糖凝胶，DNA的上样量为5μl，在130V电压下电泳约20 分钟，取出凝胶，紫外成像仪中检测拍照，获得如图2所示的琼脂糖凝胶电泳图，其中，从左向右各泳道的样品分别为：
第1道：普通缓冲液条件下新鲜重组布氏白僵菌蛋白酶K用于抽提酿酒酵母基因组DNA的电泳结果；
第2道：本实施例制备的缓冲液条件下新鲜重组布氏白僵菌蛋白酶K用于抽提酿酒酵母基因组DNA的电泳结果；
第3道：本实施例制备的缓冲液条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K保存半年后用于抽提酿酒酵母基因组DNA的电泳结果；
第4道：本实施例制备的缓冲液条件下重组布氏白僵菌蛋白酶K保存一年后用于抽提酿酒酵母基因组DNA的电泳结果。
第5道：DNA分子量标准（DL5000 DNA Marker，TAKARA）的9条可见的DNA条带从上向下分别表示5,000 bp、3,000 bp、2,000 bp、1,500 bp、1,000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp的双链DNA大小。
从图2中可看出，采用本发明的缓冲液所保存的蛋白酶K 溶液在室温下放置一年后仍然可以用于基因组抽提等实验，蛋白酶K 活性与效果不受影响。
实施例2
本实施例提供的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其制备方法包括以下步骤：
（1）将摩尔浓度为10mmol/L的Tris-base、摩尔浓度为20mmol/L的NaCl、摩尔浓度为2mmol/L的CaSO4加入水中溶解，并用HCl调节pH值至7.5，获得混合液；
（2）将甘油按照60％的体积百分比加入步骤（1）的混合液中混匀，即为所述缓冲液。
将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于上述缓冲液中，溶解浓度为10mg/mL，再置于常温保存，其保存时间为一年以上，溶解于该缓冲液中的布氏白僵菌蛋白酶K可直接应用于核酸抽提等领域。
实施例3
本实施例提供的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其制备方法包括以下步骤：
（1）将摩尔浓度为500mmol/L的Tris-base、摩尔浓度为500mmol/L的NaCl、摩尔浓度为50mmol/L的CaSO4加入水中溶解，并用HCl调节pH值至8.4，获得混合液；
（2）将甘油按照30％的体积百分比加入步骤（1）的混合液中混匀，即为所述缓冲液。
将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于上述缓冲液中，溶解浓度为2mg/mL，再置于常温保存，其保存时间为一年以上，溶解于该缓冲液中的布氏白僵菌蛋白酶K可直接应用于核酸抽提等领域。
实施例4
本实施例提供的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其制备方法包括以下步骤：
（1）将摩尔浓度为100mmol/L的Tris-base、摩尔浓度为100mmol/L的NaCl、摩尔浓度为10mmol/L的CaSO4加入水中溶解，并用HCl调节pH值至8.0，获得混合液；
（2）将甘油按照40％的体积百分比加入步骤（1）的混合液中混匀，即为所述缓冲液。
将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于上述缓冲液中，溶解浓度为5mg/mL，再置于常温保存，其保存时间为一年以上，溶解于该缓冲液中的布氏白僵菌蛋白酶K可直接应用于核酸抽提等领域。
实施例5
本实施例提供的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其制备方法包括以下步骤：
（1）将摩尔浓度为250mmol/L的Tris-base、摩尔浓度为250mmol/L的NaCl、摩尔浓度为25mmol/L的CaSO4加入水中溶解，并用HCl调节pH值至7.8，获得混合液；
（2）将甘油按照50％的体积百分比加入步骤（1）的混合液中混匀，即为所述缓冲液。
将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于上述缓冲液中，溶解浓度为8mg/mL，再置于常温保存，其保存时间为一年以上，溶解于该缓冲液中的布氏白僵菌蛋白酶K可直接应用于核酸抽提等领域。
实施例6
本实施例提供的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其制备方法包括以下步骤：
（1）将摩尔浓度为300mmol/L的Tris-base、摩尔浓度为400mmol/L的NaCl、摩尔浓度为30mmol/L的CaSO4加入水中溶解，并用HCl调节pH值至8.2，获得混合液；
（2）将甘油按照50％的体积百分比加入步骤（1）的混合液中混匀，即为所述缓冲液。
将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于上述缓冲液中，溶解浓度为4mg/mL，再置于常温保存，其保存时间为一年以上，溶解于该缓冲液中的布氏白僵菌蛋白酶K可直接应用于核酸抽提等领域。

Claims (7)

1.一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液的组分包括：
三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为10～500mmol/L；
可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：20mmol/L～500mmol/L；
可溶性钙盐，所述钙盐中Ca2+的摩尔浓度为：2mmol/L～50mmol/L；
甘油，其30％～60％的体积百分比；
用HCl调节pH值至7.5～8.4；
余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液的组分包括：
三羟甲基氨基甲烷Tris，其摩尔浓度为25mmol/L；
可溶性纳盐，所述纳盐中Na+的摩尔浓度为：200mmol/L；
可溶性钙盐，所述钙盐中Ca2+的摩尔浓度为：10mmol/L；
甘油，其体积百分比为50%；
用HCl调节pH值至7.8；
余量为水。
3.根据权利要求1、2任一所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其特征在于，所述可溶性钠盐为NaCl。
4.根据权利要求1、2任一所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液，其特征在于，所述可溶性钙盐为CaCl2或CaSO4。
5.一种如权利要求1所述的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的制备方法，包括下列步骤：
（1）按照配比，将Tris、可溶性钠盐、可溶性钙盐加入水中溶解，并用HCl调节pH值至7.5～8.4，获得混合液；
（2）将甘油按照30％～60％的体积百分比加入步骤（1）的混合液中混匀，即为所述缓冲液。
6.一种如权利要求1所述的用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的应用。
7.根据权利要求6所述的一种用于重组布氏白僵菌蛋白酶K常温保存的缓冲液的应用，其特征在于，将重组布氏白僵菌蛋白酶K溶解于所述缓冲液中，其溶解浓度为2～10mg/mL，然后置于常温中保存。
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