HU220093B - Elhízottságért felelős (ob) rekombináns fehérjék - Google Patents
Elhízottságért felelős (ob) rekombináns fehérjék Download PDFInfo
- Publication number
- HU220093B HU220093B HU9601120A HUP9601120A HU220093B HU 220093 B HU220093 B HU 220093B HU 9601120 A HU9601120 A HU 9601120A HU P9601120 A HUP9601120 A HU P9601120A HU 220093 B HU220093 B HU 220093B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- human
- mouse
- seq
- sequence
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 105
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 107
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 43
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims abstract description 36
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 171
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 95
- 101001063991 Homo sapiens Leptin Proteins 0.000 claims description 90
- 102000049953 human LEP Human genes 0.000 claims description 90
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims description 65
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 claims description 65
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 41
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 37
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 claims description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 32
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 claims description 25
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 claims description 25
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 22
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 20
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 20
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 19
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 16
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 6
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 119
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 93
- 101100181592 Mus musculus Lep gene Proteins 0.000 description 92
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 71
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 43
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 41
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 41
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 39
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 36
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 23
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 23
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 21
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 18
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 17
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 16
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 12
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 11
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 9
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 7
- 101001072192 Rattus norvegicus Protein disulfide-isomerase Proteins 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- -1 diethyl (2-hydroxypropyl) aminoethyl Chemical group 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 235000021316 daily nutritional intake Nutrition 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 5
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 4
- MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N Gly-Cys Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C([O-])=O MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N Thr-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O FLPZMPOZGYPBEN-PPCPHDFISA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFOYULZBKYOKAN-OLHMAJIHSA-N Asp-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BFOYULZBKYOKAN-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 OCYROESYHWUPBP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N Pro-Ile-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USLVEJAHTBLSIL-CYDGBPFRSA-N Val-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)C(C)C USLVEJAHTBLSIL-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 235000018823 dietary intake Nutrition 0.000 description 3
- 235000005686 eating Nutrition 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 235000020925 non fasting Nutrition 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- DYWCIVBBDWZOCL-UHFFFAOYSA-M 4-ethenyl-1-methylpyridin-1-ium;iodide Chemical compound [I-].C[N+]1=CC=C(C=C)C=C1 DYWCIVBBDWZOCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 206010052804 Drug tolerance Diseases 0.000 description 2
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 2
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N Glu-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YQAQQKPWFOBSMU-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YTSVAIMKVLZUDU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N Ile-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JODPUDMBQBIWCK-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 description 2
- ONORAGIFHNAADN-LLLHUVSDSA-N Phe-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N ONORAGIFHNAADN-LLLHUVSDSA-N 0.000 description 2
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- IPFXYNKCXYGSSV-KKUMJFAQSA-N Phe-Ser-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N IPFXYNKCXYGSSV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Tyr Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- KKKVOZNCLALMPV-XKBZYTNZSA-N Ser-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KKKVOZNCLALMPV-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 2
- SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N Thr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000003579 anti-obesity Effects 0.000 description 2
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 230000026781 habituation Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000013116 obese mouse model Methods 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SADPCIINLASURY-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;sodium Chemical compound [Na].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 SADPCIINLASURY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000220479 Acacia Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FRMQITGHXMUNDF-GMOBBJLQSA-N Arg-Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FRMQITGHXMUNDF-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N Arg-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N Arg-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QLSRIZIDQXDQHK-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- ZWASIOHRQWRWAS-UGYAYLCHSA-N Asn-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ZWASIOHRQWRWAS-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KLYPOCBLKMPBIQ-GHCJXIJMSA-N Asp-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N KLYPOCBLKMPBIQ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- PCJOFZYFFMBZKC-PCBIJLKTSA-N Asp-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O PCJOFZYFFMBZKC-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- 101100235626 Caenorhabditis elegans hlb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289888 Caenorhabditis elegans lys-5 gene Proteins 0.000 description 1
- JTNKVWLMDHIUOG-IHRRRGAJSA-N Cys-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JTNKVWLMDHIUOG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000030814 Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 208000019454 Feeding and Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PABVKUJVLNMOJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SUIAHERNFYRBDZ-GVXVVHGQSA-N Glu-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SUIAHERNFYRBDZ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N Gly-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 JPVGHHQGKPQYIL-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N Ile-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O HZYHBDVRCBDJJV-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- HZMLFETXHFHGBB-UGYAYLCHSA-N Ile-Asn-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HZMLFETXHFHGBB-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N Ile-Leu-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N Ile-Pro-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O KCTIFOCXAIUQQK-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SHVFUCSSACPBTF-VGDYDELISA-N Ile-Ser-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N SHVFUCSSACPBTF-VGDYDELISA-N 0.000 description 1
- APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N Ile-Val-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- 208000015580 Increased body weight Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O REPPKAMYTOJTFC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MVVSHHJKJRZVNY-ACRUOGEOSA-N Leu-Phe-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MVVSHHJKJRZVNY-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N Leu-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N Leu-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N Lys-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N Lys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- RTJPUVZZCBWXSZ-BPUTZDHNSA-N Met-Cys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 RTJPUVZZCBWXSZ-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- HAQLBBVZAGMESV-IHRRRGAJSA-N Met-Lys-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O HAQLBBVZAGMESV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NHXXGBXJTLRGJI-GUBZILKMSA-N Met-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NHXXGBXJTLRGJI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101000874159 Mus musculus Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N Pro-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)[O-])C(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 UEKYKRQIAQHOOZ-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N Ser-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- BSXKBOUZDAZXHE-CIUDSAMLSA-N Ser-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BSXKBOUZDAZXHE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HAYADTTXNZFUDM-IHRRRGAJSA-N Ser-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAYADTTXNZFUDM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- MQBTXMPQNCGSSZ-OSUNSFLBSA-N Thr-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)CCCN=C(N)N MQBTXMPQNCGSSZ-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- OGXQLUCMJZSJPW-LYSGOOTNSA-N Trp-Gly-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O OGXQLUCMJZSJPW-LYSGOOTNSA-N 0.000 description 1
- YTZYHKOSHOXTHA-TUSQITKMSA-N Trp-Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 YTZYHKOSHOXTHA-TUSQITKMSA-N 0.000 description 1
- ABRICLFKFRFDKS-IHPCNDPISA-N Trp-Ser-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ABRICLFKFRFDKS-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N MNSSBIHFEUUXNW-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010640 amide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 208000012696 congenital leptin deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000021051 daily weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003479 dental cement Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 235000014632 disordered eating Nutrition 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000010437 gem Substances 0.000 description 1
- 229910001751 gemstone Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001127 hyperphagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002806 hypometabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N leu-asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O DVCSNHXRZUVYAM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001022 morbid obesity Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 235000018770 reduced food intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002618 waking effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Obesity (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
A találmány az ember és állatok testtömegét szabályozó fehérjékre,valamint a fent említett biológiailag aktív fehérjék tisztított éshomogén formában történő rekombináns kifejezésére vonatkozik. Atalálmány tárgya SEQ ID NO: 6-ot tartalmazó, homogén, biológiailagaktív, humán elhízottságért felelős fehérje vagy annak afehérjebiológiai aktivitásával rendelkező fragmense. ŕ
Description
Ismeretes, hogy a nyugati társadalmakban a leggyakoribb táplálkozási rendellenességnek az elhízottság tekinthető [Zhang Y. et al.: Natúré, 372, 425 -432 (1994)]. Tíz felnőtt amerikaiból több mint három testtömege a legkedvezőbb értéket több mint 20%-kal haladja meg (Zhang Y. et al.: supra). A megnövekedett testtömeg közegészségügyi probléma, minthogy fontos gyógyászati halálozási okokkal jár együtt, mint például II típusú diabetes mellitus (azaz nem inzulinfüggő diabetes mellitus), magas vérnyomás és hiperlipidémia [Grundy S. M. és Barnett: Disease-a-Moth, 36, 645-696 (1990)]. Bizonyítékok igazolják, hogy a szervezet a testtömeget fiziológiailag szabályozza, és az elhízást (valamint az ezzel összefüggő állapotokat vagy betegségeket) részben az e szabályozásban fellépő rendellenességek okozzák (Zhang Y. et al.: supra).
Rágcsálókban elhízottsági fenotípust eredményező 7 egyedi génmutációt írtak le; ezek közül 5 egérben van jelen. A fenti 7 rágcsálómodell közül legbehatóbban az 1950-ben azonosított, az egér elhízottsági (ob) génmutációt tanulmányozták [Ingalls A. M. et al.: J. Hered., 41, 317-318 (1950)]. A fenti ob-génmutáció egér homozigótái teljesen elhízottak, II típusú diabetes mellitust fejlesztenek ki, valamint hiperfágok és hipometabolikusak, a humán morbid elhízottsághoz hasonló szindróma részeként [Friedman J. M. et al.: Genomics, 11, 1054-1062 (1991)]. Ez az ob-gén az egér proximális 6 kromoszómához kapcsolódik, és zsíros szövetben kifejezve egy fehérjét (azaz ob-fehéije) kódol (Zhang Y. et al.: supra). Az ob-génmutáció egér homozigótái a fenti ob-fehéijét egyáltalán nem vagy csak kis mértékben termelik, és ennek megfelelően a testtömeget hiányos mértékben szabályozzák, ami elhízottsághoz vezet.
Az egérszerű vagy humán ob-fehérjék az elhízottságért felelős (ob) génjeik terén hiányosságokban vagy mutációkban szenvedő betegeknek adhatók be. Ezek a hiányosságok vagy mutációk a testtömeget szabályozó ob-fehérjék termelését és/vagy működését megakadályozzák, vagy e folyamatokba beavatkoznak. A fent említett fehérjék ezért hormonszerű anyagként az elhízottság és ezzel összefüggő betegségek és állapotok kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatók a humán- és állatgyógyászatban.
Az egérszerű vagy humán ob-fehérjék fenti felhasználása során a fehérjék injekció formájában többféle úton (például intraperitoneálisan, intramuszkulárisan vagy szubkutáns módon) gyakori dózisokban adagolhatok. Minthogy az adagolás gyakran injekció formájában történik, az egérszerű vagy humán ob-fehérjék tisztítása (előnyösen homogenitásig) a szennyező fehérjeanyagok teljes eltávolítása, valamint a fehérjék oldható és biológiailag aktív formában történő rekombináns kifejezése nagyon fontos. Az e szakterületen járatos szakemberek által ismert, hogy a befecskendezendő közegben levő szennyezések gyakran toxikus mellékhatásokhoz vagy kedvezőtlen immunológiai válaszokhoz vezetnek.
Bár a patkány és egér ob-génszekvenciát Zhang Y. et al. (supra) leírta, a patkány és egér ob-fehérje vagy humán megfelelője kifejezésére szolgáló módszereket nem ismertették. E fehérjék biológiailag aktív és oldható, a homogenitásig történő tisztításra alkalmas formában történő előállítására még csak utalás sem történt. Komoly igény jelentkezett patkány és egér, vagy humán ob-fehérjék homogén, oldható és biológiailag aktív formában történő kifejezésére és előállítására. Találmányunk célkitűzése ezen igény kielégítése.
Azt találtuk, hogy rekombináns humán és patkány, illetve egér ob-fehérjék biológiailag aktív és oldható formában kifejezhetők, majd elhízottság és azzal összefüggő állapotok vagy betegségek (például II típusú diabetes mellitus, magas vérnyomás, hiperlipidémia stb.) kezelésére vagy megelőzésére szolgáló injekciók céljainak megfelelő homogenitásig tisztíthatok.
Találmányunk szerint humán és patkány, valamint egér ob-fehérjék rekombináns úton biológiailag aktív formában termelhetők és homogenitásig tisztíthatok oly módon, hogy előbb Escherichia coli (E. coli) számára alkalmas új kifejező vektorokat állítunk elő.
Ezek a kifejező vektorok egy promotert és egy DNS-szekvenciát tartalmaznak. A DNS-szekvencia fúziós fehérjét kódol, amely két részt tartalmaz: E. coli külső A membránfehérje szignálpeptidjét (sOmpA) és a humán, vagy patkány és egér ob-fehérjét. Találmányunk szerint a patkány és egér, valamint humán ob-fehérjék biológiailag aktív rekombináns formája termelésének következő lépése során a fenti kifejező vektort egy E. coli gazdaszervezetbe illesztjük be; ennek során a periplazmikus térben (azaz az E. coli mikroorganizmus belső és külső sejtmembránjai között) a fúziós fehérje hatékony kifejezését és transzvokációját kapjuk, ezen a ponton a szignálpeptidet az ob-fehérjéből kivágjuk, és ezáltal az ob-fehérjét oldható és biológiailag aktív formában nyerjük. Ezután a gazda E. coli sejteket hideg ozmotikus sokknak vetjük alá, és az ob-fehérjéket sejtmentes közegben oldható és biológiailag aktív formában hatékonyan kiválasztjuk, majd az ob-fehérjéket anioncserélő kromatográfia, hidrofób oszlopkromatográfia és gélszűrés szekvenciális alkalmazásával homogenitásig tisztítjuk; ezeket a műveleteket a megadott sorrendben végezzük el.
Találmányunk továbbá
1) egy sOmpA szignálpeptidet és humán, vagy patkány és egér ob-fehérjét tartalmazó fúziós fehérjét kódoló DNS-t magában foglaló kifejező vektorra;
2) a fenti kifejező vektorral transzvektált vagy transzformáit gazdaszervezetre;
3) a humán ob-fehérjét kódoló DNS-szekvenciára; és
4) az ob-fehérje polietilénglikollal vagy polipropilénglikollal képezett konjugátumaira vonatkozik. Találmányunk tárgya továbbá eljárás rekombináns humán, valamint patkány és egér ob-fehérjék biológiailag aktív és oldható formában történő kifejezésére, továbbá e fehérjéknek a humán- és állatgyógyászatban való felhasználásra alkalmas tisztított homogén formában történő előállítására.
A patkány és egér ob-protein kifejezését és termelését találmányunk értelmében a Zhang Y. et al. (supra) által leírtak szerint, patkány és egér ob-gén felhasználásával végezzük el; e gén szekvenciája egy 702 bázispár
HU 220 093 Β (bp), amelynek a nukleotidszekvenciáját mint SEQ ID NO: 1 azonosítottuk. Ez a patkány és egér ob-génszekvencia egy 501 bp kódoló szekvenciát vagy nyitott leolvasó keretet (ORF) tartalmaz, amely a 36. nukleotidnál egy startkodonnal kezdődik és az 537. nukleotidnál egy stopkodonnal végződik, és mindkét végződésen a 3’- és 5’-végződésen - le nem fordított szekvenciákat tartalmaz. Az ORF a 36. és 98. nukleotid között egy 63 bp szignálszekvenciát tartalmaz.
Ez a patkány és egér ob-génszekvencia (SEQ ID NO: 1) a patkány és egér ob-fehéijét és ennek szignálszekvenciáját kódolja; e fehérje aminosavszekvenciája 167 aminosav hosszúságú, és mint SEQ ID NO: 2 azonosítottuk. A SEQ ID NO: 2 jelzésű fehérje első 21 aminosava képezi a patkány és egér ob-fehérje szignálszekvenciáját. Az érett patkány és egér ob-fehérje (a szignálszekvencia nélkül) a 22. aminosavtól (Val) a 167. aminosavig (Cys) terjed, és jelölése SEQ ID NO: 3.
Találmányunk szerint a humán ob-fehérje kifejezéséhez és termeléséhez humán ob-gént alkalmazunk, amelynek a szekvenciája egy 690 bp nukleotidszekvencia. Ezt a szekvenciát mint SEQ ID NO: 4 azonosítottuk.
Zhang Y. et al. (supra) közleménye szerint a humán ob-gén a patkány és egér ob-génnel nagymértékben homológ. A fenti szerzők oligonukleotid-minták felhasználásával patkány és egér ob-génre irányuló hagyományos módszert ismertetnek. E módszer segítségével
1) humán zsíros szövetből származó kiónok cDNSkönyvtára screenelhető;
2) a humán ob-gént tartalmazó kiónok azonosíthatók; és
3) a humán ob-génszekvencia izolálható és szekvenciálható.
A humán ob-génszekvencia hagyományos módszerekkel végzett szekvenciálás alapján a SEQ ID NO: 4 nukleotidszekvenciát tartalmazza.
A humán ob-gén - a patkány és egér ob-génhez hasonlóan - egy 501 bp kódoló szekvenciát vagy nyitott leolvasó keretet (ORF) tartalmaz, amely a 37. nukleotidnál egy startkodonnal kezdődik és az 538. nukleotidnál egy stopkodonnal végződik, és a 3’-végződésen, valamint az 5’-végződésen egyaránt le nem fordított szekvenciákat tartalmaz. Az ORF a 37. és 99. nukleotid között egy 63 bp szignálszekvenciát tartalmaz.
Ez a humán ob-génszekvencia (SEQ ID NO: 4) a humán ob-fehérjét és annak szignálszekvenciáját kódolja; e fehérje aminosavszekvenciája 167 aminosav hosszúságú, és mint SEQ ID NO: 5 azonosítottuk. A 167 aminosav hosszúságú fehérje első 21 aminosava képezi a szignálszekvenciát. Az érett humán ob-fehérje (szignálszekvencia nélkül) a 22. aminosavtól (Val) a 167. aminosavig (Cys) terjed, és jelölése SEQ ID NO: 6.
Zhang Y. és társai (supra) szerint a patkány és egér ob-fehéije, valamint a humán ob-fehéije között 84%-os azonosság áll fenn. Zhang Y. és társai (supra) szerint továbbá a patkány és egér, valamint humán fehérjék variánsai is léteznek; egy ilyen variánst mindkét speciesben a 49. glutamin törlésével jellemeztek. Az egér zsíros sejtekből és humán zsíros sejtekből származó könyvtárakban levő cDNS-klónok körülbelül 30%-ában a 49.
kodon hiányzik (Zhang Y. és társai, supra).
A leírásban szereplő kifejezések definícióját az alábbiakban ismertetjük:
A patkány és egér ob-fehérje (mob) kifejezés a SEQ ID NO: 3 fehérjére vonatkozik. Ez a fehérje biológiai tulajdonságai alapján elhízottság vagy azzal összefüggő állapotok és betegségek kezelésére, szabályozására vagy megelőzésére alkalmas. Specifikusan a „patkány és egér ob-fehéije” kifejezés bármely olyan fehérjét vagy polipeptidet magában foglal, amelynek az aminosavszekvenciája a SEQ ID NO: 3 aminosavszekvenciával lényegében homológ, és az alábbi biológiai aktivitásokkal rendelkezik:
1) Amennyiben a fehéijét vagy polipeptidet intracerebroventrikuláris (ICV) injekció formájában legalább 30 g testtömegű 16-18 órán át éheztetett, érett, elhízott ob/ob egereknek 20 pg vagy ennél kisebb dózisban Haley és McCormick módszerével [Brit. J. Pharmacol., 12, 12-15 (1957)] beadjuk, a fehéqe vagy polipeptid (a) 5 órás etetési teszt során a táplálékfelvételt a hordozó injekcióval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva 50%-kal csökkenti (táplálékfelvétel-csökkentés ED50); és (b) ICV befecskendezést követő 24 óra alatt a testtömeg-gyarapodást a hordozóinjekcióval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva legalább 50%-kal csökkenti (testtömeggyarapodás-csökkentés ED50).
2) Amennyiben a fehéijét vagy polipeptidet intraperitoneálisan (IP) legalább 30 g testtömegű, nem éheztetett, érett ob/ob egereknek naponta kétszer, a nap világos szakaszának megkezdődésekor, majd a sötétedés beálltától 3 órával, egy héten át, napi 20 pg vagy ennél kisebb összdózisban adagoljuk, a fehérje vagy polipeptid (a) az 5 és 24 órás táplálékfelvételt a hordozóval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva legalább 20%-kal csökkenti (táplálékfelvétel-csökkentés ED20); és (b) a testtömeg-gyarapodást az első IP injekció beadását követő 24 óra alatt a hordozóinjekcióval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva legalább 20%-kal csökkenti (testtömeggyarapodás-csökkentés ED20).
A leírásban használt „patkány és egér ob-fehérje” kifejezés a szándékosan (például helyre irányított mutagenézis) vagy véletlenszerűen (mutációk) módosított fehérjéket egyaránt magában foglalja.
A „humán ob-fehérje (hob)” kifejezés a SEQ ID NO: 6 fehérjére vonatkozik. Ez a fehérje biológiai tulajdonságai alapján elhízottság vagy azzal összefüggő állapotok és betegségek kezelésére, szabályozására vagy megelőzésére alkalmas. Specifikusan a „humán ob-fehérje” kifejezés bármely olyan fehéijét vagy polipeptidet magában foglal, amelynek az aminosavszekvenciája a SEQ ID NO: 6 aminosavszekvenciával lényegében homológ, és az alábbi biológiai aktivitásokkal rendelkezik:
1) Amennyiben a fehéijét egy polipeptidet intracerebroventrikuláris (ICV) injekció formájában leg3
HU 220 093 Β alább 30 g testtömegű, 16-18 órán át éheztetett, érett, elhízott ob/ob egereknek 20 pg vagy ennél kisebb dózisban Haley és McCormick módszerével [Brit. J. Pharmacol., 12, 12-15 (1957)] beadjuk, a fehéije vagy polipeptid (a) 5 órás etetési teszt során a táplálékfelvételt a hordozó injekcióval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva 50%-kal csökkenti (táplálékfelvétel-csökkentés ED50); és (b) ICV befecskendezést követően 24 óra alatt a testtömeg-gyarapodást a hordozóinjekcióval kezelt kontroliegerekhez viszonyítva legalább 50%-kal csökkenti (testtömeggyarapodás-csökkentés ED50).
2) Amennyiben a fehérjét vagy polipeptidet intraperitoneálisan (IP) legalább 30 g testtömegű, nem éheztetett, érett ob/ob egereknek naponta kétszer, a nap világos szakaszának megkezdődésekor, majd a sötétedés beálltától 3 órával, egy héten át, napi 20 pg vagy ennél kisebb összdózisban adagoljuk, a fehéije vagy polipeptid (a) az 5 és 24 órás táplálékfelvételt a hordozóval kezelt kontroliegerekhez viszonyítva legalább 20%-kal csökkenti (táplálékfelvétel-csökkentés ED20); és (b) a testtömeg-gyarapodást az első IP injekció beadását követően 24 óra alatt a hordozóinjekcióval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva legalább 20%-kal csökkenti (testtömeggyarapodáscsökkentés ED20).
A leírásban használt „humán ob-fehérje” kifejezés a szándékosan (például helyreirányított mutagenézis) vagy véletlenszerűen (mutációk) által módosított fehérjéket egyaránt magában foglalja.
A „lényegében homológ kifejezés nukleinsav- és aminosavszekvenciákra egyaránt vonatkozik. Ez a kifejezés azt jelenti, hogy egy adott szekvencia (például mutáns szekvencia) a referenciaszekvenciától egy vagy több helyettesítés, törlés vagy addíció útján különbözik, és a módosítás a referenciaszekvencia és megváltoztatott szekvencia között káros funkcionális eltérést nem okoz. Találmányunk szempontjából a 95%-nál nagyobb homológiát, egyenértékű biológiai tulajdonságokat és egyenértékű kifejezési jellemzőket mutató szekvenciákat lényegében homológnak tekintjük. A homológia meghatározása szempontjából az érett szekvenciák csonkítását nem vesszük figyelembe. A kisebb mértékű homológiát, összehasonlítható bioaktivitást és egyenértékű kifejezési jellemzőket mutató szekvenciákat lényegében ekvivalensnek tekintjük. A homológ DNS-szekvenciákat kereszthibridizáció segítségével, mérsékelten szoros standard hibridizációs körülmények között azonosítjuk.
A patkány és egér, vagy humán ob-fehérje fragmensén a patkány és egér, vagy humán ob-fehéije egy részletének vagy ffagmensének aminosavszekvenciáját tartalmazó, a patkány és egér, illetve humán ob-fehérje biológiai aktivitásával rendelkező bármely fehérje vagy polipeptid értendő. A „ffagmensek” a patkány és egér, vagy humán ob-fehéije proteolitikus lebontása útján vagy a szakirodalomból ismert rutinmódszerekkel végrehajtott kémiai szintézissel termelt fehéijék vagy polipeptidek lehetnek.
Egy ob-fehéije vagy fragmens akkor biológiailag aktív, ha emlősöknek (beleértve az embert) beadagolva a táplálékfelvételt és a testtömeg-növekedést csökkenti. A humán, vagy patkány és egér ob-fehéijék biológiai aktivitását a szakirodalomból ismert szokásos módszerekkel határozzuk meg, egy vagy több emlős speciesen, különösen elhízott ob/ob egéren. A szabadalmi leírásban néhány, a biológiai aktivitás meghatározására szolgáló tesztet részletesen ismertetünk. A biológiai aktivitás meghatározására szolgáló, ob/ob egéren végzett ICV teszt szerint a találmányunk szerinti humán, vagy patkány és egér ob-fehérjék ED50-értéke a táplálékfelvétel csökkentésénél előnyösen 20 pg vagy ennél kisebb érték, míg a testtömeg-gyarapodás csökkentése terén előnyösen 20 pg vagy ennél kisebb érték. A találmányunk szerinti humán, vagy patkány és egér ob-fehéijék biológiai aktivitásának meghatározására szolgáló, ob/ob egéren végzett IP-teszt szerint az ED20-érték a táplálékfelvétel-csökkentésnél előnyösen 20 pg vagy ennél kisebb, és a testtömeg-gyarapodás csökkentése terén előnyösen 20 pg vagy ennél kisebb érték. Általában a fenti biológiai aktivitást kifejtő ffagmensek előnyösek.
A „replikon kifejezésen bármely olyan genetikus elem (például plazmid, kromoszóma, vírus) értendő, amely in vivő egy DNS-replikáció autonóm egységeként működik, azaz saját ellenőrzése alatt replikációra képes.
A „kifejező vektor” kifejezés olyan replikonra (például plazmid, fág vagy kozmid) vonatkozik, amelyhez egy másik DNS-szekvencia kapcsolható, a hozzácsatlakoztatott szegmens replikációját előidézve. Ez valamely transzkripciós egységet tartalmaz, amely (1) a génkifejezésben szabályozó szerepet játszó genetikus elemet vagy elemeket (például promoterek vagy enhancerek);
(2) mRNS-be beírt és a fehéijébe lefordított szerkezeti vagy kódoló szekvenciát; és (3) megfelelő transzkripciós kezdeti és befejező szekvenciákat tartalmaz.
A „klón” egy eredeti DNS-szekvenciahosszból leszármaztatott és valamely baktérium vagy vírus által génsebészeti módszerekkel - gyakran plazmidok alkalmazásával - termelt DNS-molekulák csoportját jelenti.
A „szignálszekvencia” a kifejezendő fehérje kódoló szekvenciájának elején (5’-végződés) elhelyezkedő nukleinsavszekvencia. Ez a szignálszekvencia egy szignálpeptidet, az újonnan szintetizált fehérje N-terminálisát kódolja, amely a gazdasejtben a fehérjének a gazdasejtmembrán irányába vagy azon keresztül történő transzlokációját irányítja. A szignálpeptidet az ilyen transzvokáció során általában kivágjuk.
A „startkodon ” a fehéije kódoló szekvenciájában általában az 5’-végződésen - elhelyezkedő kodon (általában ATG), és a fehéijeszekvenciában levő első aminosavat jelzi.
A „stopkodon általában a fehérje kódoló szekvenciája 3’-végződésén elhelyezkedő, nem érzékelő kodon, és a növekvő polipeptidlánc végét jelzi.
HU 220 093 Β
A „nyitott leolvasó keret (ORF) ” kodontriplettek lineáris elrendezése kettős szálú DNS-ben, amely megfelelő szabályozó szekvenciák ellenőrzése alá helyezve egy sejtben in vitro vagy in vivő egy aminosavszekvenciát kódol. Az ORF határait az 5'-végállásban egy startkodon és a 3'-végállásban egy stopkodon határozza meg. A nyitott leolvasó keretre továbbá mint „kódoló szekvencia” is hivatkozunk.
A „promotorszekvencia” olyan DNS-szabályozó tartomány, amely RNS-polimeráznak egy sejtben történő megkötésére és egy vagy több szerkezeti gén áramlásirányban lefelé mutató (3’-irány) nyitott leolvasó keretének kezdeti transzkripciójára képes. A promotorszekvencia általában a szignálszekvencia vagy nyitott leolvasó keret 5’-végén helyezkedik el, és áramlásirányban felfelé az 5'-irányban teljed ki abból a célból, hogy a polipeptidnek a háttér felett kimutatható szinten történő transzkripciójához szükséges minimális számú bázist vagy elemet magában foglalja.
Valamely kódoló szekvencia vagy ORF akkor van egy promoterszekvencia ellenőrzése alatt, ha az RNSpolimeráz a kódoló szekvenciát mRNS-sé úja át.
Valamely „A’’-anyagot tartalmazó kompozíció (ahol „A” jelentése valamely egyetlen polipeptid) akkor homogén az „A” polipeptidre vonatkozóan, ha szennyező fehérjék vagy más endogén anyagok szokásos módszerekkel (például poliakrilamidgél-színezés) kimutatható mennyiségben nincsenek jelen. Találmányunk szempontjából a „homogén” kifejezés azt jelenti, hogy a kompozíció az egyetlen fehéijét vagy polipeptidet legalább 95 tömeg% mennyiségben tartalmazza.
A humán, valamint patkány és egér ob-fehérjék biológiailag aktív és oldható, sejtmentes, más emlős fehérjéket nem tartalmazó, homogenitásig történő tisztításra felhasználható formában történő rekombináns előállítási eljárása az alábbi lépésekből áll. A lépéseket részletesen a példákban ismertetjük.
1. Egér és humán ob-gének előállítása
A patkány és egér ob-fehéijét és természetes szignálszekvenciáját kódoló cDNS-t (SEQ ID NO: 1) Zhang Y. és társai (supra) írták le. Ezt a patkány és egér cDNS-t szokásos módszerekkel, oligodeoxinukleotid DNS-primerek felhasználásával, PCR-módszerrel izoláljuk és amplifikáljuk. Ezeket a DNS-primereket és előállítási eljárásukat Zhang Y. és társai (supra) írták le.
A humán ob-fehéijét és természetes szignálszekvenciáját kódoló cDNS-t (SEQ ID NO: 4) a Zhang Y. et al. (supra) által patkány és egér ob-gén kinyerésére felhasznált oligodeoxinukleotid DNS-primerek alkalmazásával kapjuk. Ezt a humán cDNS-t hagyományos módszerek alkalmazásával humán zsíros sejtből nyert RNS-ből készített lambda fág cDNS-könyvtárból izoláljuk.
A humán vagy egér ob cDNS-t nem csak cDNSkönyvtárakból nyerhetjük, hanem más, hagyományos módszerekkel is elkészíthetjük, például kémiai szintézissel vagy a kívánt sejtből tisztított genom DNS vagy fragmensei klónozása útján. Ezek a módszerek az alábbi irodalmi helyeken kerültek ismertetésre: Sambrook et al.: „DNA Cloning: A Practical Approach”, Vol. I és II, D. N. Glover ed. (1985), MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.; Benton és Davis, Science, 196, 180-182 (1977); és Grunstein és Hogness, Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 3961-3965 (1975). A humán vagy egér cDNS-t oly módon kapjuk cDNS-könyvtárakból, hogy a cDNSkönyvtárakat hagyományos DNS-hibridizációs módszerekkel vagy Benton és Davis (supra) vagy Grunstein és Hogness (supra) módszerével screeneljük patkány és egér ob-gént tartalmazó patkány és egér zsíros sejtekből izolált poliadenilezett RNS fordított transzkripciójával készített primerek felhasználásával. A primerekké hibridizálódó kiónokat restrikciós endonukleáz-hasítás, agaróz gélelektroforézis és további hibridizációs kísérletek („Southern biot”) segítségével, elektroforézissel kezelt primerek felhasználásával analizáljuk. Patkány és egér cDNS-mintákká hibridizálódó néhány klón izolálása után az egyik klón hibridizáló szegmensét alklónozzuk, és ismert módszerekkel szekvenciáljuk.
A genom DNS-ből származó kiónok a kódoló tartományokon kívül szabályozó és intron DNS-tartományokat tartalmazhatnak; a cDNS-ből származó kiónok intronszekvenciákat nem tartalmaznak. A genom DNSgénjének molekuláris klónozásakor DNS-ffagmensek képződnek, amelyek közül néhány a kívánt gént kódolja. A DNS specifikus helyeken különböző restrikciós enzimek felhasználásával hasítható. Alternatív módon a DNS ffagmentálása céljából mangán jelenlétében DNS-áz alkalmazható, vagy a DNS fizikai úton hasítható (például ultrahangos besugárzással). A lineáris DNS-ffagmensek ezután nagyságuk alapján standard módszerekkel szétválaszthatok. E módszerek közül példálódzó, nem korlátozó jelleggel - az agaróz és poliakrilamidgél-elektroforézist és az oszlopkromatografálást említjük meg.
A humán, vagy patkány és egér ob-gént - a kinyerésére felhasznált forrástól függetlenül - a gén szaporítása céljából az irodalomból ismert módszerekkel molekulárisán megfelelő vektorba klónozhatjuk. Bármely kereskedelmi forgalomban beszerezhető vektort felhasználhatunk. így például az egér cDNS-t egy pCDNS3 vektorba, és a humán cDNS-t egy pBluescriptSK- vektorba illeszthetjük be. Baktérium gazdaszervezetekben felhasználható vektorokat például az alábbi irodalmi helyen írtak le: Pouwels et al.: „Cloning Vectors: A Laboratory Manual” (1985), Elsevier, N.Y. A baktériumokban történő felhasználásra alkalmas klónozó vektorok példálódzó, nem korlátozó jelleggel jólismert klónozó vektorból leszármaztatott, kereskedelmi forgalomban levő plazmidokból (pBR322; ATCC 37017) nyert szelektálható markért és bakteriális eredetű replikációt tartalmazhatnak, így például az alábbi kereskedelmi forgalomban levő vektorok jöhetnek tekintetbe: pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) és pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisc., USA).
A kereskedelmi forgalomban levő vektorokba beillesztett humán, vagy patkány és egér ob-gén nukleotidszekvenciáját az irodalomból ismert módszerekkel, standard nukleotidszekvencia-meghatározó eljárásokkal határozhatjuk meg.
Az embertől, patkánytól és egértől eltérő fajok obfehérjéit kódoló más nukleinsavak is felhasználhatók.
HU 220 093 Β
Ennek megfelelően bár a humán és egér ob-gén termelése céljából specifikus DNS-t klónoztunk és szekvenciáltunk, ob-fehérje termelésére nukleinsav forrásaként potenciálisan bármely állati adipocita felhasználható.
2) A humán és patkány és egér ob-fehérje termelésére szolgáló kifejező vektor felépítése
A fenti módszerekkel klónozott humán, vagy patkány és egér ob-gént használjuk fel humán, illetve patkány és egér ob-fehéqék kódolására alkalmas kifejező vektorok felépítésére.
A biológiailag aktív humán, valamint patkány és egér ob-fehérjének transzfektált vagy transzformált E. coli gazdasejt által történő kifejezésére, és az ob-fehérjének a periplazmába történő kiválasztására egy új kifejező vektort alkalmazunk. Ez a kifejező vektor egy promotert és egy fúziós fehéijét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A fúziós fehéqe két részből áll: az első rész az E. coli külső „A” membránfehéqe szignálpeptidje (sOmpA), és a második rész a humán, vagy patkány és egér ob-fehéije (mínusz saját természetes szignálszekvenciáik). A fúziós fehéijét kódoló DNS-szekvencia szintén két részből áll: az sOmpA-peptidet kódoló első rész, és a patkány és egér, vagy humán ob-fehéijét kódoló második rész (mínusz saját természetes szignálszekvenciáik). A DNS-szekvenciának az sOmpA-peptidet kódoló első része a De Sutter K. et al. [Gene, 141, 163-170 (1994)] által leírt szignálszekvencia, amely a SEQ ID NO: 7 nukleotidszekvenciával rendelkezik. A kétrészes DNS-szekvencia második része a patkány és egér, vagy humán ob-fehéijét kódolja, és a SEQ ID NO: 1, illetve SEQ ID NO: 4 nukleotidszekvenciával rendelkezik (mínusz a megfelelő természetes szignálszekvenciákat kódoló nukleotidszekvencia részek).
A SEQ ID NO: 7 sOmpA szignálszekvencia által kódolt szignálpeptid a SEQ ID NO: 8 aminosavszekvenciával rendelkezik (lásd De Sutter, K. et al., supra).
A találmányunk szerinti új kifejező vektort oly módon alakítjuk ki, hogy a fúziós fehérjét kódoló promotert és DNS-szekvenciát a rekombináns fehérjéknek E. coli gazdasejtekben történő kifejezésére alkalmas hagyományos kifejező vektorba illesztjük be.
A találmányunk szerinti új kifejező vektor felépítéséhez bármely olyan promoter felhasználható, amely az sOmpA-peptidet és ob-fehéijét tartalmazó fúziós fehérje E. coli gazdasejtben történő transzkripciójának szabályozására képes. Ha szignálpeptidként sOmpA-t használunk, előnyösen mind a lac-operator promotert (Polac) és a lipoprotein promotert (Plpp) alkalmazzuk. Az E. coliban történő kifejezésre továbbá az alábbi promoterek alkalmazhatók: T7 RNS-polimeráz promoter [Studier et al.: J. Mól. Bioi., 189, 113-130 (1986)], lac promoter [Lauer, J. Mól. Appl. Génét., 1,139-147 (1981), ATCC 37121], tac promoter [Maniatis: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor (1982), ATCC 37138], alkálikus foszfatáz- (phoA) promoter és trp promoter [Goeddel et al.: Nucleic Acids Research, 8, 4057-4075 (1980)]. Más, az E. coliban használt promoterek, valamint nukleotidszekvenciáik az irodalomból ismertek, és ennek alapján a szakember e promotereknek a találmányunk szerinti kifejező vektorral történő funkcionális ligálásra képes [Siebenlist et al.: Cell, 20,269-281 (1980)].
A találmányunk szerinti kifejező vektor specifikusan
a) valamely promoterszekvenciát, és
b) valamely fúziós fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz; ami mellett a fúziós fehéqe a SEQ ID NO: 3 patkány és egér ob-fehérjét vagy a SEQ ID NO: 6 humán ob-fehérjét és az E. coli külső „A” membránfehérje szignálpeptidjét tartalmazza.
A továbbiakban az új kifejező vektor kialakítását ismertetjük. Az eljárást részletesebben a példákban közöljük és a 2. és 3. ábrán tüntetjük fel. Az eljárás első lépésében a humán vagy egér ob-gént (mínusz a természetes szignálszekvenciáját) az sOmpA szignálszekvenciát tartalmazó valamely plazmidba (például a pTlOsOmpArPDI plazmid) illesztjük be. Ezt a pTlOsOmpArPDI plazmidot és szerkezetét, valamint előállítását De Sutter K. et al. (supra) írta le. A plazmidba történő beillesztés után a humán vagy egér obgént ezzel az sOmpA-génnel fúzionáljuk, és ily módon a plazmidban „hibrid génszekvenciát” hozunk létre. Az sOmpA-génnek az ob-gén kódoló szekvencia 5'-tartományától felfelé irányuló áramban kell elhelyezkednie. Ezután a hibrid génszekvenciát tartalmazó plazmidba a fentiekben felsorolt valamely promotert - előnyösen lipoprotein promotert (Pipp) és lac promoter operátort (Polac) - építünk be, és ily módon a találmányunk szerinti kifejező vektorokat hozzuk létre. A találmányunk szerinti kifejező vektorok két kiviteli alakját mint pLPPsOmpA mob és pLPPsOmpA hobl azonosítjuk és a 2., illetve 3. ábrán tüntetjük fel.
A plazmid felépítéséhez az irodalomból ismert bármely módszert alkalmazhatunk. Megemlítjük, hogy az sOmpA- és ob-génszerkezetek fuzionálásának, a génszekvenciáknak a megfelelő plazmidba történő beillesztésének, és a promotemek a találmányunk szerinti kifejező vektort eredményező beépítésének a sorrendje nem döntő jelentőségű tényező. Eljárhatunk például oly módon, hogy előbb az sOmpA-gént fúzionáljuk a patkány és egér, vagy humán ob-génszekvenciával, majd az ily módon közvetlenül kialakított hibrid génszekvenciát a megfelelő promotereket már magában foglaló plazmidba illesztjük be. Fontos azonban, hogy az sOmpA-génszekvencia a patkány és egér, vagy humán ob-génszekvencia 5'-végződésén az áramlás irányában felfelé helyezkedjék el.
Azt találtuk, hogy a találmányunk szerinti új kifejező vektor - különösen az sOmpA-t kódoló szignálszekvencia - felhasználásával a patkány és egér, vagy humán ob-fehérjék a periplazmás térhez transzlokálhatók, ahol a szignálpeptid megfelelő hasításával a humán, vagy patkány és egér ob-fehérjék oldható és biológiailag aktív formában érintetlenül maradnak. A periplazmás térbe került ob-fehérjék a sejtmentes és más emlős fehéijéket nem tartalmazó sejtbe hatékonyan választhatók ki oly módon, hogy a gazdasejteket hideg ozmotikus sokk hatásának vetjük alá. Az ob-fehérjék biológiailag aktív formában homogenitásig tisztíthatok.
HU 220 093 Β
3. Humán, vagy patkány és egér ob-fehérjék kifejezése transzformált E. coli sejtekben
A fentiekben leírt módon kialakított kifejező vektorokat ezután valamely gazda E. coli sejtbe illesztjük be az E. coli sejt transzformálása céljából. Találmányunk értelmében bármely E. coli törzs felhasználható, például E. coli K-12 294 törzs (2 055 382 A számú brit közrebocsátási irat; ATCC 31446). Találmányunk szerint más törzsek is felhasználhatók, például E. coli MCI061 [Casadaban és Cohen: J. Mól. Bioi., 138, 179-207 (1980)], E. coli Β, E. coli X 1776 (ATCC 31537) és E. coli W 3110 (ATCC 27325). Ezenkívül további törzsek is alkalmazhatók, amelyek nagy részét letétbe helyezték, és e törzsek elismert mikroorganizmus-deponáló intézményekből beszerezhetők.
A transzformált E. coli sejteket standard módszerekkel megfelelő sejtsűrűség eléréséig tenyésztjük. A transzformáit E. coli gazdaszervezetek tenyésztése során a találmányunk szerinti kifejező vektorok hatására a patkány és egér, vagy humán ob-fehérjék hatékonyan kifejeződnek, és e fehérjék az E. coli gazdasejtek periplazmájában oldható és biológiailag aktív formában transzlokálódnak.
Az sOmpA szignálpeptid (azaz a fúziós peptid 1. része) a fúziós peptid transzlokációja alatt a periplazmában más emlős fehérjéktől vagy polipeptidektől mentes, biológiailag aktív ob-fehérje keletkezése közben hasad.
Találmányunk szerint más emlős fehérjéktől mentes, biológiailag aktív rekombináns humán, vagy patkány és egér ob-fehérjék oly módon állíthatók elő, hogy
a) valamely promoterszekvenciát és valamely fúziós fehéijét kódoló DNS-szekvenciát magában foglaló kifejező vektort építünk fel; ami mellett a fúziós fehérje SEQ ID NO: 3-t vagy SEQ ID NO: 6-ot és az E. coli külső „A” membránfehérje szignálpeptidet tartalmaz;
b) a kifejező vektort valamely E. coli gazdasejtbe illesztjük be, és ily módon az E. coli gazdasejtet transzformáljuk;
c) a fúziós fehérjét az E. coli gazdasejtben kifejezzük; és
d) az E. coli gazdasejtet hideg ozmotikus sokkpufferrel kezelve a más emlős fehérjéktől és a szignálpeptidtől mentes patkány és egér, vagy humán ob-fehérjét felszabadítjuk.
A rekombináns úton termelt, a transzformált E. coli sejtek periplazmájában oldható, biológiailag aktív formában jelen levő humán, vagy patkány és egér ob-fehérjéket ezután homogenitásig tisztítjuk.
A sejtperiplazmában a fentiekben leírt eljárással transzlokálódott rekombináns humán, vagy patkány és egér ob-fehérjéket hatékonyan választhatjuk ki a sejten kívülre oly módon, hogy a gazdasejteket az irodalomban leírt módon hideg ozmotikus sokknak vetjük alá [Koshland D. és Botstein D.: Cell, 20, 749-760 (1980)]. A hideg ozmotikus sokk hatására az ob-fehérjék az E. coli gazdasejtekből más, emlős fehérjéktől vagy polipeptidektől mentes, biológiailag aktív formában szabadulnak fel.
A transzformált E. coli sejtek hideg ozmotikus sokkja után az ozmotikus folyadékban levő humán, vagy patkány és egér ob-fehérjék biológiailag aktívak, és anioncserélő oszlopkromatográfia, hidrofób kölcsönhatásoszlopkromatográfia és gélszűrés kombinálásával homogenitásig tisztíthatok. Az anioncserélő és hidrofób kölcsönhatás kromatografálást tetszés szerinti sorrendben végezhetjük el, azonban ezeket a lépéseket a gélszűrés előtt kell végrehajtani.
Az anioncserélő kromatografálást szokásos módszerekkel végezhetjük el. Előnyösen Q Sepharose gyors átfolyású oszlopokat alkalmazhatunk. Az anioncserélő kromatografálásnál közegként dietil-amino-etil (DEAE) vagy dietil-(2-hidroxi-propil)-amino-etil- (QEA) csoportokat tartalmazó különböző oldhatatlan mátrixokat alkalmazhatunk. E célra a fehéqék tisztításánál általánosan használt akrilamid, agaróz, dextán, cellulóz vagy más típusú mátrixokat alkalmazhatunk. Az anioncserélő kromatografálásnál különösen előnyösnek bizonyult a DEAE-Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Svédország). DEAE-csoportokat tartalmazó közegek felhasználása esetén a patkány és egér, humán vagy ob-fehérjéket tartalmazó extraktumokat gyengén bázikus pH-értéken (például 8,1) visszük fel. A megkötött patkány és egér, vagy humán ob-fehérjéket megfelelő pufferben (például trisz-HCl) sógradiens alkalmazásával nagyobb mértékben tisztított formában eluálhatjuk. A gradiens jellemzőit kis mennyiségű rekombináns fehérjével végzett eluáló előkísérletekkel határozhatjuk meg.
A tisztítás első lépésében anioncserélő kromatografálással nyert, humán, vagy patkány és egér ob-fehérjét tartalmazó anyagot ezután hidrofób kölcsönhatás-kromatografálásnak vetjük alá. A hidrofób kölcsönhatáskromatográfra olyan elválasztó módszer, amelynek során az anyagokat hidrofób csoportokat tartalmazó töltetlen ágyanyaggal szemben mutatott eltérő hidrofób kölcsönhatás-erősség alapján választjuk el. Általában oly módon járunk el, hogy a hidrofób kölcsönhatás-oszlopot előbb a hidrofób kötődés számára kedvező körülmények között (például magas ionerősség) egyensúlyba hozzuk. A minta eluálásához csökkenő sógradienst alkalmazhatunk.
Az eljárásnál bármely hidrofób kölcsönhatásoszlopot felhasználhatunk. A fenil-Sepharose hidrofób oszlop előnyösnek bizonyult, azonban butil-Sepharose is felhasználható. Találmányunk szerint az anionos oszlopról eluált, a rekombináns patkány és egér, vagy humán ob-fehérjét tartalmazó anyagot viszonylag erős hidrofób gélt (fenil-Sepharose) tartalmazó oszlopra visszük fel. A hidrofób géllel szembeni hidrofób kölcsönhatás elősegítése céljából 0,4 mól vagy ennél nagyobb koncentrációjú ammónium-szulfátot tartalmazó oldószert alkalmazunk; az előnyös koncentráció 0,4 mól. Ennek során az oszlopot és a mintát 50 mM trisz-pufferben 0,4 mól ammónium-szulfát-koncentrációra állítjuk be, és a mintát az oszlopra felvisszük. Az oszlopot 0,4 molos ammónium-szulfát-pufferrel mossuk. Az ob fehérjét ezután a hidrofób kölcsönhatásokat gyengítő oldószerekkel eluáljuk (például csökkenő sógradiens, etilénglikol, propilénglikol vagy karbamid). Eljárásunk előnyös kiviteli alakja szerint az oszlopot szekvenciálisán trisz-pufferrel és 20% etilénglikolt tar7
HU 220 093 Β talmazó triszpufferrel mossuk. Az ob-fehéijét az oszlopról csökkenő ammónium-szulfát-koncentráció gradiens szerint és növekvő etilénglikol-tartalmú triszpufferekkel eluáljuk. Az anioncserélő kromatografálást és a hidrofób kölcsönhatás-oszlopkromatografálást szekvenciálisán tetszés szerinti sorrendben alkalmazva 90% tisztaságú humán, vagy patkány és egér ob-fehérjét nyerünk.
A fent ismertetett anioncserélő kromatografálás és hidrofób kölcsönhatás-oszlopkromatografálás után gélszűrést hajtunk végre. Az eljárást bármely szokásos gélszűrési módszerrel elvégezhetjük. Az utolsóként alkalmazott hidrofób kölcsönhatásoszlopról vagy anioncserélő-oszlopról eluált ob-fehérjét 10 000 molekulatömeg levágású membrán (AMICON-YM10 membrán) felhasználásával kis térfogatra betöményíthetjük és dializálhatjuk. A betöményített anyagot ezután gélszűrő közeget (például GlOO-Sephadex, Pharmacia Uppsala, Svédország) tartalmazó oszlopra vihetjük fel. Az ob-fehérjét az egyéb szennyezésektől a molekulatömeg alapján SDS-PAGE felhasználásával standard módszerekkel választhatjuk el.
Az anioncserélő oszlopkromatografálás, hidrofób kölcsönhatás-oszlopkromatografálás és gélszűrés szekvenciális alkalmazásával 95% tisztaságú humán, vagy patkány és egér ob-fehérjét nyerünk.
A tisztított patkány és egér, vagy humán ob-fehérje N-terminális aminosavszekvenciálását az irodalomból ismert módszerekkel elektrotranszfer útján végezhetjük el [Laemli, U. K., Natúré, 227, 680-685 (1970) vagy Matsudaira, P.: J. Bioi. Chem., 262, 10 035-10 038 (1987)]. A belső szekvenciálást szintén az irodalomból ismert módszerekkel hajthatjuk végre. így például a peptidffagmenseket oly módon képezhetjük, hogy az M-sávot (nitrocellulózon) endoproteináz lizin C-vel emésztjük, majd HPLC-rendszeren szétválasztjuk.
A találmányunk szerinti tisztított humán, patkány és egér fehéijék biológiai aktivitásuk révén embernek vagy egérnek befecskendezve a kezeletlen kontrollcsoporthoz viszonyítva táplálékfelvétel-csökkenést és tömeggyarapodás-csökkenést idéznek elő.
A találmányunk szerint előállított és tisztított humán, patkány és egér ob-fehéijék és ffagmenseik biológiai aktivitása rutinmódszerekkel határozható meg, például ob/ob egereken ismételt vagy egyszeri intracerebroventrikuláris (ICV) injekció befecskendezése útján. Az eljárást a Haley T. J. et al. (supra) által leírt és a 13. és 16. példában részletesen ismertetett módon végezzük el. A fenti ICV-teszt alapján a táplálékfelvétel-csökkenés és testtömeggyarapodás-csökkenés ED50-értékét meghatározzuk. A találmányunk szerinti tisztított humán és patkány és egér ob-fehéijék vagy ffagmenseik biológiai aktivitását továbbá ob/ob egéren ismételt (IP) injekció befecskendezésével, a 15. példában leírt módon is meghatározhatjuk. Az IP-teszt alapján a táplálékfelvétel-csökkenés és a testtömeggyarapodás-csökkenés ED20-értékét meghatározzuk.
A találmányunk szerint előállított és tisztított humán, patkány és egér ob-fehérjék biológiai aktivitását továbbá emberen önmagukban ismert módszerekkel is meghatározhatjuk. Ennek során az ob-fehéijét elhízott embereknek IV beadjuk, majd a táplálékfelvétel-csökkenést méijük, és az eredményeket a konyhasóoldattal IV kezelt kontrollokkal összehasonlítjuk [Muurahainen N. E. et al.: Am. J. Physiol., 260, 672-680 (1991)]; a tesztet a 14. és 17. példában részletesen ismertetjük. Alternatív módszer szerint az ob-fehéijéket elhízott embereknek ismételt IV injekciókkal beadjuk, és méijük a testtömeg-gyarapodás csökkentő (azaz súlycsökkenést előidéző) hatást [Drent M. L. et al.: Int. J. Obesity, 19, 221-226 (1995)]; a módszert a 18. példában részletesen ismertetjük.
A találmányunk szerinti eljárással tisztított találmányunk szerinti patkány és egér, valamint humán ob-fehérjék biológiai aktivitását az alábbiakkal jellemezzük:
1) Amennyiben a fehéijét vagy polipeptidet intracerebroventrikuláris (ICV) injekció formájában legalább 30 g testtömegű, 16-18 órán át éheztetett, érett elhízott ob/ob egereknek 20 pg vagy ennél kisebb dózisban Haley és McCormick módszerével [Brit. J. Pharmacol., 12, 12-15 (1957)] beadjuk, a fehérje vagy polipeptid (a) 5 órás etetési teszt során a táplálékfelvételt a hordozóinjekcióval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva 50%-kal csökkenti (táplálékfelvétel-csökkentés ED50); és (b) ICV-befecskendezést követő 24 óra alatt a testtömeg-gyarapodást a hordozóinjekcióval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva legalább 50%-kal csökkenti (testtömeggyarapodás-csökkentés ED50).
2) Amennyiben a fehéijét vagy polipeptidet intraperitoneálisan (IP) legalább 30 g testtömegű, nem éheztetett, érett ob/ob egereknek naponta kétszer, a nap világos szakaszának megkezdődésekor, majd a sötétedés beálltától 3 órával, egy héten át, napi 20 pg vagy ennél kisebb összdózisban adagoljuk, a fehéije vagy polipeptid (a) az 5 és 24 órás táplálékfelvételt a hordozóval kezelt kontrollegerekhez viszonyítva legalább 20%-kal csökkenti (táplálékfelvételcsökkentés ED20); és (b) a testtömeg-gyarapodást az első IP injekció beadását követő 24 óra alatt a hordozó injekcióval kezelt kontroliegerekhez viszonyítva legalább 20%-kal csökkenti (testtömeggyarapodás-csökkentés ED20).
A találmányunk szerinti, homogenitásig tisztított fehérjék a fenti testtömeg-csökkentő és táplálékfelvétel-csökkentő hatást 20 pg vagy kisebb dózisban, illetve ICV adagolás esetén 1 pg vagy kisebb dózisban is kifejtik.
A találmányunk szerinti humán és/vagy patkány és egér ob-fehérjék biológiai aktivitásának meghatározására szolgáló, a fentiekben leírt és a példákban részletesen ismertetésre kerülő biológiai vizsgálatok segítségével az ob-fehérjék proteolitikus lebontásával, kémiai szintézissel, az ob-fehérjék DNS-szekvenciarészletének rekombináns fehérjekifejezésével vagy a szakem8
HU 220 093 Β bér által ismert bármely más módszerrel kapott fragmensek biológiai aktivitása is meghatározható.
Találmányunk további kiviteli alakja szerint a találmányunk szerinti patkány és egér, valamint humán obfehérjék polietilénglikol vagy polipropilénglikol homopolimerekkel konjugálhatók; a homopolimerek helyettesítetlenek vagy az egyik végállású hidroxilcsoporton kis szénatomszámú alkilcsoporttal történő éterezés révén helyettesítve lehetnek. A találmányunk szerinti konjugátumok a fehéijék stabil formái, és a fehérjék felezési idejét javítják. Ezenkívül a polietilénglikol vagy polipropilénglikol homopolimerekkel képezett konjugátumok felhasználása révén az ob-fehétje aktivitásának felezési ideje a szervezetben növelhető. A konjugátumok további előnye, hogy a gyógyászati hatású ob-fehérje stabilitását és keringési idejét a szervezetben fokozzák, ugyanakkor az ob-protein immunogenicitását csökkentik. A pegilezett ob-fehérjék az emberi szervezetben könnyen szívódnak fel, és fokozzák a véráramba történő felvételt.
Az ob-fehérjékkel konjugálható polietilénglikol vagy polipropilénglikol homopolimerek molekulatömege előnyösen körülbelül 15-60 kDa. A kapott konjugátum polietilénglikollal vagy polipropilénglikollal mono- vagy polipegilezett fehérje. Az ob-fehérje előnyösen mono- vagy dipegilezett, és a polietilénglikol vagy polipropilénglikol egységekkel képezett konjugátum teljes molekulatömege 15-60 kDa, előnyösen 35-45 kDa. A konjugátumok általában polietilénglikol és polipropilénglikol konjugátumok keverékei formájában képződnek, minthogy a kiindulási anyagként felhasznált polietilénglikol és polipropilénglikol a kereskedelemben különböző molekulatömegű homopolimerek keveréke formájában kerül forgalomba. A fentiekben megadott molekulatömegek a keletkezett ob-konjugátumok keveréke átlagos molekulatömegének felel meg. A keverékek kívánt esetben szokásos módszerekkel (például oszlopkromatografálás, beleértve HPLC) az egyes konjugátumokra szétválaszthatok. A kezelésekhez azonban a konjugátum keverék formájában is felhasználható.
A polietilénglikol vagy polipropilénglikol polimerek (PEG) az ob-fehérjéhez a fehérje szabad N-terminális aminosaván keresztül bármely szokásos módszerrel kapcsolhatók konjugátum képződése közben. Az ob-fehérjének a polietilénglikollal vagy polipropilénglikollal képezett konjugátumai bármely ismert módszerrel előállíthatok. A polietilénglikol vagy polipropilénglikol a fehérje N-terminális aminosaván keresztül kovalens kötéssel vagy az ob-fehérjén levő különböző lizinmaradékokon keresztül kapcsolódhat.
A polietilénglikol vagy polipropilénglikol homopolimerek továbbá bi- vagy polifunkcionális összekötő csoportokon (linker) keresztül konjugálhatók az ob-fehérjéhez. Monopolietilén- vagy polipropilénglikol homopolimer konjugátumok képzéséhez difunkciós linkereket alkalmazunk, és a homopolimert a linker egyik funkcionális csoportjával konjugáljuk, illetve az N-terminális aminosav és az ob-fehérje lizincsoportja a linker másik funkcionális csoportjához konjugálható.
A tri- vagy poli(polietilén- vagy polipropilénglikol) polimerek, az ob-fehéqével képezett konjugátumok trifunkciós vagy polifunkciós linkerek segítségével képezhetők. A homopolimer az említett funkcionális csoportok közül kettőhöz vagy többhöz konjugálható, míg a linker maradék funkcionális csoportja az ob-fehéqéhez kapcsolódik. Funkcionális amino- és karboxicsoportokat tartalmazó polifunkcionális linkerek alkalmazhatók. Az aminocsoportok a polietilénglikol vagy polipropilénglikol funkcionális hidroxilcsoportjával amidkötés képzése közben konjugálódnak. A karboxilcsoportok az ob-fehérjén levő aminocsoportokkal amidkötés, és a glikolon levő funkcionális hidroxilcsoportokkal észter képzése közben konjugálódnak. Az ob-fehérje és a PEG között lejátszódó konjugátumképződésnél sokfajta összekötő csoport használható fel, ezek közül példálódzó jelleggel a 4 902 502, 5 034 514, 4 609 546, 5 122 614 és 4 847 325 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban említett csoportokat soroljuk fel.
Találmányunk különösen előnyös kiviteli alakját képezik az I-A és I-B általános képletű konjugátumok (mely képletben
P jelentése a jelen szabadalmi leírásban ismertetett patkány és egér, vagy humán ob-fehérjék;
n és n’ jelentése egész szám, amelyek összege
300-1200, azzal a feltétellel, hogy az összes PEGegység átlagos molekulatömege 15-60 kDa és a konjugátum teljes molekulatömege 30-80 kDa;
R és R’ jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport).
Az I-A és I-B általános képletű vegyületek oly módon állíthatók elő, hogy valamely Π-A vagy II—B általános képletű ismert polimer vegyületet a találmányunk szerinti patkány és egér, vagy humán feltétjével kondenzálunk. Az aktivált észter és az amin amidképződéssel lejátszódó reakcióját bármely ismert módszerrel elvégezhetjük.
A fentiekben példálódzó jelleggel bemutatott reakcióban kilépő csoportként szukcinimidil-észter szerepel. A II-B általános képletű kiindulási anyagnak az I-B általános képletű vegyülethez vezető alkalmazása esetén a találmányunk szerinti patkány és egér, vagy humán ob-fehéqével történő reagáltatást a II-A általános képletű kiindulási anyagnak az I-A általános képletű vegyületté történő átalakításával analóg módon végezzük el. A kiindulási anyagként felhasznált szukcinimidil-észterek (például a II-A általános képletű vegyületek) a Monfardini et al.: Bioconjugate Chem., 6, 62-69 (1995) közleményben kerültek ismertetésre.
Az n+n’=300-1500 értéknek megfelelő I-A általános képletű vegyület esetében olyan konjugátumot nyerünk, amelyben a PEG-egységek teljes átlagos molekulatömege 15-60 kDa, előnyösen 35-45 kDa. Találmányunk előnyös kiviteli alakja szerint olyan I-A általános képletű vegyületeket állítunk elő, amelyekben n és n’ átlagos összege körülbelül 800-1200, előnyösen 850-1000. Az I-A és II-A általános képletű vegyületekben n és n’ aránya előnyösen 0,5-1,5, különösen előnyösen 0,8-1,2. Az I-B általános képletű vegyületek esetében n értéke előnyösen 300-1500, a kapott vegyü9
HU 220 093 Β let 300-1500 PEG-egységet tartalmaz és teljes molekulatömege 15-60 kDa, előnyösen 35-45 kDa. N értéke előnyösen 850-1000.
A találmányunk szerinti humán, vagy patkány és egér ob-fehéijéket megfelelő kompatibilis, gyógyászatilag alkalmas hordozó- vagy vivőanyagok felhasználásával önmagukban ismert módszerekkel injekciós célokra alkalmas gyógyászati készítményekké alakíthatjuk. E célra bármely szokásos hordozó- vagy vivőanyag felhasználható. A gyógyászati készítmények előállításánál enterális, perkutáns vagy parenterális adagolásra alkalmas, szerves vagy szervetlen hordozóanyagokat alkalmazhatunk (például víz, zselatin, gumiarábikum, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, talkum, növényi olajok, polialkilénglikolok, vazelin stb.). A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények további gyógyászati hatóanyagokat is tartalmazhatnak. A gyógyászati készítményekhez további adalékanyagokat (például ízesítő-, tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószerek, pufferek stb.) is adhatunk. E célra a gyógyszergyártásban használatos adalékanyagokat alkalmazhatunk. A találmányunk szerinti homogén ob-fehéqéket tartalmazó gyógyászati készítmények hordozóanyagként előnyösen humán szérumalbumint, humán plazmafehéqéket stb. is tartalmazhatnak.
A találmányunk szerinti rekombináns homogén humán, vagy patkány és egér ob-fehéqék vagy kombinációik elhízott emberen és állaton táplálékfelvétel-csökkenést és súlycsökkenést idéznek elő. Az ob-fehérje adagolása a testtömeg-szabályozás szempontjából fontos fehérjét a szükséges szintre feltölti. A találmányunk szerinti humán, vagy patkány és egér ob-fehérjéket tartalmazó gyógyászati készítmények hatóanyag-tartalmát oly módon választjuk meg, hogy a készítmény a rendellenes testtömeg-változást, illetve az azzal összefüggő rendellenes gyógyászati állapotot vagy betegséget (például II típusú diabetes mellitus) emberen vagy állaton hatékonyan kezelje. Az injekciós készítmények befecskendezésére számos módszer alkalmazható (például szubkutáns, intravénás és intraperitoneális adagolás). A felhasznált ob-fehérje átlagos mennyisége változhat, és mindenkor az orvos vagy állatorvos ajánlásaitól és előírásaitól függ.
A találmányunk szerint előállított humán, vagy patkány és egér ob-fehérjéket az ob-fehéijereceptor(ok) azonosítására szolgáló screenelési módszereknél is alkalmazhatjuk.
Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.
A rajzok rövid ismertetése:
Az 1. ábrán a humán ob-fehérje két kiónját - hob cll és hob cl2 - sematikusan ábrázoljuk. A rajzon a humán ob cDNS-szekvencia 5’- és 3’-végződésén levő restrikciós helyek elhelyezkedését és típusát vázlatosan tüntetjük fel.
A 2. ábrán a pLPPsOmpA mob kifejező vektor szerkezetét sematikusan ábrázoljuk.
A 3. ábrán a pLPPsOmpA hobl kifejező vektor szerkezetét sematikusan ábrázoljuk.
1. példa
Humán ob cDNS kinyerése
A humán ob cDNS-t humán zsíros szövetekből származó RNS-ből készített, kereskedelmi forgalomban levő lambda fág cDNS-könyvtár („Clontech”) screenelésével nyeljük. Ebből a könyvtárból a humán ob cDNS-szekvenciának megfelelő, egyenként körülbelül 2,5 kilobázis fragmenst tartalmazó két lambda fágot a lambda fág könyvtár hibridizációjával nyerünk. E módszer segítségével két kiónt azonosítunk, azaz hobl cDNS és hob2 cDNS. A humán ob-gént a Stratagene által forgalmazott DNS pBluescriptSk plazmidvektorba klónozzuk. A fenti humán ob-gént tartalmazó, ily módon kapott vektorok jelölése pBluescriptSk hobl és pBluescriptSk hob2.
A fenti pBluescriptSk”hobl és pBluescriptSk hob2 vektorokban levő humán ob-génszekvenciát nukleotidszekvenciálással határozzuk meg. A nukleotidszekvenciából következtetett fehétje-aminosav-szekvenciák a SEQ ID NO: 4 által kódolt humán ob-fehéijének felelnek meg (lásd Zhang Y. et al.: supra). A pBluescriptSk~hobl a hobl cDNS stopkodonja után T-C mutációt tartalmaz. E mutáció a hobl nukleotidszekvenciájában egyébként várható és előrelátható Stul restrikciós hely elvesztése útján keletkezik, az alábbiaknak megfelelően.
hobl
.. .GGG.TGC.TGA GGCCT TGA...
Gly Cys stop pBluescriptSk hobl .. .GGG.TGC.TGA GGCCC TGA...
Gly Cys stop pBluescriptSk hob2 .. .GGG.TGC.TGA GGCCT TGA Gly Cys stop
Minthogy ez a mutáció a pBluescriptSk_hobl-ben a humán ob cDNS-szekvencia stopkodonja után helyezkedik el, nem vezet a humán ob-fehérje aminosavszekvenciájának megváltozásához (Zhang Y. et al., supra).
A pBluescriptSk hob2-ben levő cDNS nukleotidszekvenciát illetően restrikciós enzimanalízis segítségével kimutatták, hogy ez a plazmid a humán ob cDNSszekvencia stopkodonja után elhelyezkedő Stul restrikciós helyet tartalmaz.
Azon a tényen túlmenően, hogy a pBluescriptSk hobl a stopkodon után a Stul restrikciós helyben egy mutációt tartalmaz, a pBluescriptSk~~hobl a hobl cDNS-ben az ORF után EcoRI restrikciós helyet tartalmaz, amely a hob2 cDNS-ben nincs jelen (lásd 1. ábra).
2. példa
Plazmid felépítése patkány és egér ob-protein (mob) számára
A Zhang Y. et al. (supra) által leírt eljárással nyert patkány és egér ob cDNS-t (SEQ ID NO: 1) az Invitrogen (San Diego, Califomia, USA) által forgalomba hozott pCDNS3 vektorba illesztjük be. Az ily módon kapott patkány és egér ob-gént használjuk fel a pat10
HU 220 093 Β kány és egér ob-fehéije (mob) kifejezésére szolgáló pLPPsOmpA-mob kifejező vektor felépítéséhez. Ezt a kifejező vektort és szerkezetét a 2. ábrán részletesen feltüntetjük.
A plazmid felépítésének első lépése során az sOmpA-gén szignálkódoló szekvenciáját a patkány és egér ob-gén érett kódoló tartományához fuzionáljuk (azaz a természetes szignálszekvencia nélkül). A pCDNS3 vektorba illesztett, érett patkány és egér ob-fehérjét kódoló 501 bp DNS-fragmenst a vektorból polimeráz láncreakció (PCR) segítségével amplifikáljuk. E célra Vént DNS-polimerázt (New England Biolabs), valint (az érett mob-ban levő első aminosav) kódoló kodon első nukleotidjával kezdődő elülső prímért (primer 1) (Zhang Y. et al., supra) és a mob stopkodonját tartalmazó mob-tartománynak megfelelő fordított prímért (primer 2) alkalmazunk. A primer 2 a HindlII restrikciós helynek megfelelő szekvenciát is tartalmaz.
Primer 1:5’ GTG CCT ATC CAG AAA GTC 3’ Val Pro Ile Glu Lys Val
Primer 2:
5’ TCCC44GC7TTC4GCATTCAGGGCTAAC 3’ HindlII stop
Az amplifikált 501 bp DNS-fragmenst agaróz gélelektroforézissel tisztítjuk, T-4 polinukleotid-kináz (Boehringer) felhasználásával foszforilezzük, majd a HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, és ily módon a primer 2 helyzetében egy 5’ kiugró végződést alakítunk ki. A kapott fragmens az érett mob-ot kódoló cDNS első nukleotidjának megfelelő tompa végződést, és a hasított HindlII helynek megfelelő 5’ kiugró végződést tartalmaz.
A következő lépésben a De Sutter K. et al. (supra) által leírt módszerrel kapott pTlOsOmpArPDI sOmpA plazmidot a mob-génnel fuzionáljuk a pTlOsOmpAmob plazmid kialakítása közben. Ezt a műveletet oly módon végezzük el, hogy a mob-fragmenst T4 ligáz (New England Biolabs) felhasználásával a pTlOsOmpArPDI DNS-vektorba klónozzuk ligálással; ezt a vektort az irodalomból ismert módszerekkel Nael és HindlII restrikciós enzimekkel előzetesen emésztettük [Sambrook J. et al.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]. Ezt a pTlOsOmpArPDI plazmidot a p714 plazmidból származtattuk le [Parker and Wiley, Gene, 83,117-134 (1989)]. Ez a plazmid az sOmpA-szekvenciához fuzionált, érett patkány fehérje diszulfid-izomerázt (rPDI) kódoló cDNS-t tartalmaz.
Az sOmpA-ban (alanin) levő utolsó kodonnak az érett rPDI (glicin) cDNS-ében levő első kodonhoz történő fuzionálása egy Nael restrikciós helyet hoz létre, amely Nael által történő hasítás után tompa végződésként az sOmpA-szekvenciában az utolsó kodont és az rPDI-szekvenciát kódoló cDNS-ben az első kodont szabadítja fel.
Nael
5’...GCC/GGC...3’
Alá Gly sOmpA cDNS/mature rPDI cDNS
Az rPDI-t kódoló cDNS-végződésén egy HindlII hely van jelen. Ezért a plazmid HindlII által történő további emésztése során az rPDI cDNS fő része felszabadul, és a CR-fragmens egyik végződésével kompatibilis 5’ kiugró végződést hoz létre. A kapott plazmidot, amelyben az rPDI-t kódoló cDNS-t az érett egér ob-t kódoló cDNS helyettesíti, pTlOsOmpAmob-nak nevezzük és a 2. ábrán tüntetjük fel.
A ligáit DNS-t standard elektroforézissel E. coli MCI061 törzsbe illesztjük be, és a kapott telepeket restrikciós enzimanalízis segítségével patkány és egér ob DNS-fragmens jelenlétére screeneljük. A pTlOsOmpAmob klón az sOmpA-t kódoló szekvenciához fuzionált, az érett patkány és egér ob-fehéqét kódoló szekvenciát tartalmaz.
A következő lépésben az E. coliban történő mob kifejezést ebben a pTlOsOmpAmob-ben mind a lipoprotein promoter (Pipp), mind a lac promoter operátor (POiac) ellenőrzése alá helyezzük. Ezt oly módon végezzük el, hogy az sOmpA-mob hibrid génszekvenciát a pTlOsOmpAmob plazmidból De Sutter et al. (supra) által leírt standard módszerekkel a pLPPsOmpArPDI plazmidvektorba visszük át. A pLPPsOmpArPDI plazmidot - mint már említettük - a p714 plazmidból származtatjuk le [Parker and Wiley, Gene, 83, 117-134 (1989)]. Ennél a lépésnél a pTlOsOmpAmob DNSplazmidot az Xbal és HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk. Az sOmpAmob-ot kódoló DNS-t tartalmazó fragmenst ezután a pLPPsOmpArPDI plazmidba ligáljuk, amelyből az sOmpA-rPDI-t kódoló DNS-t előzetesen Xbal és HindlII restrikciós enzimmel történő hasítással eltávolítottuk. A kapott plazmid elnevezése: pLPPsOmpAmob.
3. példa
Patkány és egér ob-fehérje kifejezése E. coli törzsben (MC1061)
A patkány és egér ob-fehérje kifejezését E. coliban a következőképpen végezzük el. A 2. példa szerint felépített pLPPsOmpAmob plazmidot elektroforézissel E. coli MC1061 törzsbe illesztjük be. A pLPPsOmpAmob plazmidot tartalmazó E. coli sejteket (MC1061) 28 °C-on egy éjjelen át karbenicillin antibiotikummal (100 pg/ml, Beecham) kiegészített Luria-Bertania (Difco Laboratories) táptalajban tenyésztjük. Ezt a tenyészetet használjuk fel inokulumként (100-szoros hígítás) 30 ml egyéjszakás tenyészet számára, 28 °C-on, ugyanebben a táptalajban. Ezt a tenyészetet 3 liter (például 6x0,5 liter, 1 literes Erlenmeyer-lombikokban) fenti táptalajjal 100-szorosra hígítjuk, és 28 °C-on New Brunswick légrázatóban (percenként 300 fordulat) körülbelül 4 órán át A600 0,3-0,5 sűrűség eléréséig rázatjuk. Ekkor a lac promotert izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid (IPTG, Boehringer) 2 mM végső koncentrációban történő hozzáadásával indukáljuk (lásd De Sutter et al., supra). A sejteket 28 °C-on körülbelül 5 órán át A600 1,3-1,5 sejtsűrűség eléréséig tovább inkubáljuk. Ezután a sejteket JA10 rotorral (Beckman J2-21 vagy J2-21M centrifugamodell) 6 percen át percenkénti 6750 fordulat mellett (8000xg) 4 °C-on vég11
HU 220 093 Β zett centrifugálással összegyűjtjük. A felülúszót eltávolítjuk, és a sejtpelletet 250 ml jéghideg ozmotikus sokkpufferben (100 mM Trisz-HCl, pH 7,4,20% szacharózt és 10 mM EDTA-t tartalmaz) gyorsan újraszuszpendáljuk, és jégen 10-20 percen át inkubáljuk (lásd Koshland és Botstein, supra).
A szuszpenziót ezután műanyag centrifúgacsövekbe visszük át, és JA20 rotorban percenkénti 8200 fordulattal (8000 xg) 5 percen át 4 °C-on végzett centrifúgálással összegyűjtjük. A felülúszót eltávolítjuk, és a sejtpelletet erőteljes rázatás közben 120 ml jéghideg vízben gyorsan újraszuszpendáljuk, és jégen további 10 percen át inkubáljuk. A szuszpenziót JA20 rotorban percenként 11 500 fordulattal (16 000 χ g) 4 °C-on 6 percen át centrifugáljuk, majd a periplazmatikus frakciónak (ozmotikus sokkfolyadék) megfelelő felülúszót összegyűjtjük (körülbelül 120 ml). Ezután nátrium-azidot és Trisz-HCl-t (pH 7,5) adunk hozzá, 0,05%, illetve 50 mM végső koncentrációban. A patkány és egér ob-fehéijét tartalmazó ozmotikus sokkfolyadékot -20 °C-on további felhasználásig tároljuk.
4. példa
Patkány és egér ob-fehérje kifejezése E. coli törzsben (MC1061)
A patkány és egér ob-fehéije kifejezését a 3. példában leírt módon végezzük el, azzal a változtatással, hogy a Luria-Bertaria táptalaj kiegészítésénél antibiotikumként karbenicillin helyett triacillint (100 pg/ml) alkalmazunk.
5. példa
Patkány és egér ob-fehérje tisztítása E. coli ozmotikus folyadékból
A 120 ml fagyasztott ozmotikus sokkfolyadékban levő, a 4. példa szerint előállított patkány és egér ob-fehérjét a következőképpen tisztítjuk. A patkány és egér ob-fehérjét tartalmazó ozmotikus sokkfolyadékot (120 ml) felengedjük, és az oldhatatlan maradékok eltávolítása céljából JA20 rotorban percenkénti 16 000 fordulat mellett 4 °C-on 20 percen át centrifugáljuk. A felülúszót előzetesen 50 mM Tris-HCl-lel (pH 7,5) egyensúlyba hozott, 30 ml ágytérfogat Q-Sepharose-t (gyors átfolyás; Pharmacia) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 50 mM Tris-HCl-lel (pH 7,5) pufferrel mossuk, majd a mob-fehéijét 0,1 M nátrium-kloridot tartalmazó 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) pufferrel eluáljuk.
Ezután a gyorsátfolyású Q-Sepharose-t tartalmazó oszlopról eluált anyaghoz szilárd ammónium-szulfátot adunk 1,0 M végső koncentrációban. A kapott elegyet 1,0 M ammónium-szulfátot tartalmazó 50 mM TrisHCl-lel (pH 7,5) előzetesen egyensúlyba hozott, 7,5 ml ágy térfogat gyorsátfolyású butil-Sepharose-t (Pharmacia) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 1,0 M ammónium-szulfátot tartalmazó Tris-HCl-pufferrel (pH 7,5) mossuk, majd a mob-fehérjét 1,0 M ammónium-szulfát 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) pufferben és 20% etilénglikol vízben közötti gradiens mellett eluáljuk. A mob-fehérjét a gyorsátfolyású butil-Sepharose oszlopról a gradiens végén eluáljuk, míg a legtöbb szennyezést sokkal korábban eluáljuk. A mob-fehéije tisztítása ezüsttel festett poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) szerint 90%.
A gyorsátfolyású butil-Sepharose-t tartalmazó oszlopról eluált mob-fehérjét ezután gélszűréses kromatografálással tovább tisztítjuk. Ennek során egér ob-fehérjét 4 °C-on 8 MC töményítőegység (Amicon) felhasználásával YM10 (Amicon) membránon 1 ml térfogatra betöményítünk, és foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal előzetesen egyensúlyba hozott, 39 ml GlOO-Sephadex-et (Pharmacia) tartalmazó oszlopra (1,0x50 cm) visszük fel. A mob-fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és a fehérjét YM10 membránon betöményítjük. A mob-fehéije koncentrációja 95%-nál magasabb (PAGE és ezüst színezés szerint). SDS-PAGE segítségével 15 000 molekulatömeg mellett egyetlen fehérjesávot mutattunk ki.
6. példa
Patkány és egér ob-fehérje szekvenciaanalízise
A 2-5. példában leírt eljárásokkal nyert és tisztított patkány és egér ob-fehéije N-terminális aminosavszekvenciáját Laemli, U. K., supra által leírt eljárással határozzuk meg. Az elektroforézissel kezelt fehérjéket elektrotranszferrel poli(4-vinil-N-metil-piridínium-jodiddal) bevont üvegszállemezekre visszük át [Bauw G. et a.: J. Bioi. Chem., 7, 194-196 (1988)], majd a 15 000 molekulatömegű fehérjesávot a membránból kivágjuk, és az N-terminális aminosavszekvenciát Edman-lebontással 120A on-line fenil-tiohidantoin aminosavanalizátorral (Applied Biosystems) felszerelt 470A gázfázisú szekvenátoron meghatározzuk. A patkány és egér ob-fehéije N-terminális aminosavszekvenciája a fenti eljárások szerint Val-Pro-Ile-Gin, amely az érett patkány és egér ob-fehérjének (SEQ ID NO: 3) felel meg.
7. példa
Kifejező vektor felépítése humán ob-fehérje (hob) számára
A humán ob-fehérje kifejezésére szolgáló pLPPsOmpAhobl kifejező vektor felépítésére az 1. példában leírt eljárás szerint kapott humán ob-gént használjuk fel. Ennek szerkezete a 2. példában leírt pLPPsOmpAmob felépítéséhez hasonló (lásd részletesen a 3. ábrán). A teljes érett humán ob-kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-ffagmens kiegészítéséhez három fragmensligálásra van szükség.
A kifejező vektor felépítésének első lépésében az érett humán ob-fehérje első aminosavát (valin) kódoló kodon első nukleotidjával kezdődő hob nukleotidszekvenciát az OmpA szignál kódoló szekvenciájához (sOmpA) fuzionáljuk oly módon, hogy az sOmpA-szekvencia a hob nukleotidkódoló szekvencia 5'-végződésében az áramlás irányával felfelé helyezkedjék el. Ezt a DNS-fragmenst pBluescriptSk_hobl plazmidot, Vént DNS-polimerázt és két prímért tartalmazó PCRkeverékben végzett amplifikálással nyerjük. Az elülső primer (primer 1) az érett humán ob-fehérje első aminosavát kódoló kodon első nukleotidjával kezdődik, míg a fordított primer (primer 2) a stopkodont tartalmazó hu12
HU 220 093 Β mán cDNS szekvenciáját tartalmazza. Az amplifíkációs reakció az érett humán ob-fehérjét kódoló szekvenciát tartalmazó 501 bp DNS-fragmenst eredményezi. Ennek a DNS-fragmensnek az 5’-végződését ezután T-4 polinukleotid-kinázzal foszforilezzük, és HindlII restrikciós enzimmel emésztjük; ily módon az érett hob-ot kódoló cDNS első nukleotidjának megfelelő tompa végződést (a primer 1-nek megfelelő helyzet) és a hasított HindlII helynek megfelelő 5’ kiugró végződést tartalmazó 353 bp DNS-fragmenst nyerünk. Ezt a 353 bp DNS-fragmenst agaróz gélelektroforézissel tisztítjuk, és Nael és HindlII restrikciós enzimmel előzetesen emésztett pTlOsOmpArPDI plazmidba klónozzuk. A kapott pTlOsOmpAhobl plazmid (részleges) az érett humán ob-fehérje egy részét (amino-terminális rész) kódoló, az sOmpA-t kódoló szekvenciához fuzionált DNS-fragmenst tartalmaz.
Primer 1: 5’ GTGCCCATCCAAAAAGTC 3’
Primer 2:
5’ TCCCAAGCTT7CAGCACCCAGGGCTGAG 3’ stop
A 2. lépésben a humán ob-fehéije karboxi-terminális részét (fragmens 2) kódoló DNS-szekvenciát az érett hob amino-terminális részét kódoló DNS-fragmenshez Egáljuk, és az sOmpA-hoz fuzionált teljes érett hobszekvenciát kódoló kapott fragmenst a pLPPsOmpArPDI plazmidhoz fuzionáljuk, és ily módon a lipoprotein promoter és a lac promoter operátor ellenőrzése alatt E. coli-ban érett humán ob-fehéije kifejezését hozzuk létre. Ezt oly módon végezzük el, hogy pTlOsOmpAhobl plazmidot (részleges) Xbal és HindlII segítségével emésztjük, és a hob 400 bp DNS 1. ffagmensét agaróz gélelektroforézissel izoláljuk (fragmens 1). Ezután a pBluescriptSk hobl plazmidot HindlII és EcoRI segítségével hasítjuk, és a 450 bp fragmenst agaróz gélelektroforézissel izoláljuk (fragmens 2). Végül a pLPPsOmpArPDI plazmidot XBal és EcoRI segítségével hasítjuk, és a vektorfragmenst agaróz gélelektroforézissel izoláljuk (fragmens 3). Az 1,2 és 3 DNS-fragmenseket egymáshoz Egáljuk, és a ligációs keveréket E. coli MC1061 törzsbe illesztjük be. A pLPPsOmpAhobl végző plazmidot használjuk fel az érett humán ob-fehérje kifejezésére és kiválasztására.
8. példa
Humán ob-fehérje kifejezése E. coli MCI 061 törzsben
A 7. példa szerint felépített pLPPsOmpAhobl-t használjuk fel az E. coli MC1061 törzs transzformálására, humán ob-fehéije oldható biológiailag aktív formában történő kifejezése céljából az E. coli gazdasejtek periplazmájában. Ezt a plazmidot elektroforézissel illesztjük be az E. coli sejtekbe. A pLPPsOmpAhobl plazmidot tartalmazó E. coli MC1061 sejteket karbenicillin antibiotikummal (100 pg/ml, Beecham) kiegészített Luria-Bertania (Difco Laboratories) táptalajban 28 °C-on megfelelő sűrűség eléréséig tenyésztjük, majd a lac promotert izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid 2 mM végső koncentrációban történő hozzáadásával (IPTG, Boehringer) indukáljuk (Du Sutter et al., supra). A sejteket 1,3 A600 sejtsűrűség eléréséig továbbtenyészjük. Ezután a sejteket centrifugálással (8000 xg, °C) összegyűjtjük, és a sejtpelletet 20% szacharózt és 10 mM EDTA-t tartalmazó jéghideg ozmotikus sokkpufferben (100 mM trisz-HCl, pH 7,4) gyorsan újraszuszpendáljuk, és jégen 10 percen át inkubáljuk (Koshland és Botstein módszerével, supra).
A sejteket ezután centrifugálással a fentiekben leírt módon összegyűjtjük, jéghideg vízben újraszuszpendáljuk és jégen 10 percen át inkubáljuk. A szuszpenziót percen át 16 000xg mellett centrifugáljuk, és a felülúszót (ozmotikus sokkfolyadék) összegyűjtjük. Ezután 0,05%, illetve 50 mM végső koncentrációban nátriumazidot, illetve Tris-HCl-t (pH 7,5) adunk hozzá. A humán ob-fehérjét tartalmazó ozmotikus sokkfolyadékot -20 °C-on további felhasználásig tároljuk.
9. példa
Humán ob-fehérje kifejezése E. coliban (MC1061)
A humán ob-fehéije kifejezését a 8. példában leírt módon végezzük el, azzal a változtatással, hogy a LuriaBertaria táptalaj kiegészítéséhez antibiotikumként karbenicillin helyett triacillint (100 pg/ml) alkalmazunk.
10. példa
Humán ob-fehérje tisztítása E. coli ozmotikus folyadékból
A 9. példa szerint nyert ozmotikus sokkfolyadékban levő humán ob-fehéije tisztítása céljából a folyadékhoz 0,1 M végső koncentrációban nátrium-kloridot adunk, és a folyadékot közvetlenül 50 mM Trisz-HCl-pufferrel (pH 7,5) előzetesen egyensúlyba hozott, 30 ml ágytérfogat gyorsátfolyású Q-Sepharose-t (Pharmacia) tartalmazó oszlopra visszük fel.
A gyorsátfolyású Q-Sepharose-t tartalmazó oszlopról eluált anyaghoz 1,0 M végső koncentrációban szilárd ammónium-szulfátot adunk, és az elegyet 1,0 M ammónium-szulfátot tartalmazó 50 mM Trisz-HCl-pufferrel (pH 7,5) előzetesen egyensúlyba hozott, 7,5 ml ágytérfogat gyorsátfolyású butil-Sepharose-t (Pharmacia) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 1,0 M ammónium-szulfátot tartalmazó Tris-HCl-pufferrel (pH 7,5) mossuk, majd a hob-fehérjét 1,0 M ammónium-szulfát 50 mM Tris-HCl-pufferben (pH 7,5) és 20% etilénglikol vízben közötti gradiens szerint eluáljuk. A hob-fehérjét a gyorsátfolyású butil-Sepharose oszlopról a gradiens legvégén, míg a legtöbb szennyezést sokkal korábban eluáljuk. A hob-fehérje tisztasága ennél a lépésnél 90%, ezüstszínezett poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) szerint.
A gyorsátfolyású butil-Sepharose-t tartalmazó oszlopról eluált hob-fehérjét gélszűrés kromatografálással tovább tisztítjuk. E célból a humán ob-fehérjét 4 °C-on 8MC betöményítő egység (Amicon) felhasználásával YM10 (Amicon) oszlopon 1 ml térfogatra betöményítjük, majd foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal előzetesen egyensúlyba hozott, 39 ml GlOO-Sephadexet (Pharmacia) tartalmazó oszlopra (1,0x50 cm) visszük fel. A hob-fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és a fehérjét YM10 membránon betöményítjük. A hob13
HU 220 093 Β fehérje ennél a lépésnél 95%-nál nagyobb tisztaságú, PAGE és ezüstszínezés segítségével meghatározva. Az eluátum SDS-PAGE-analízise 15 000 molekulatömeg mellett egyetlen fehéijesávot mutat.
11. példa
Humán ob-fehérje tisztítása E. coli ozmotikus folyadékból
A 9. példa szerint nyert ozmotikus sokkfolyadékben levő humán fehérje tisztítását a 10. példában leírtak szerint végezzük el az alábbi változtatásokkal. A szilárd ammónium-szulfátnak az eluált anyaghoz történő hozzáadása előtt a 9. példa szerinti ozmotikus sokkfolyadékkal a következő lépéseket végezzük el.
A 9. példa szerinti ozmotikus sokkfolyadékban levő humán ob-fehérjét közvetlenül 50 mM Tris-HCl-pufferrel (pH 7,5) előzetesen egyensúlyba hozott, 30 agytérfogat gyorsátfolyású Q-Sepharose-t (Pharmacia) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 50 mM TrisHCl-pufferrel (pH 7,5) mossuk, majd a hob-fehérjét 0,1 M nátrium-kloridot tartalmazó 50 mM Tris-HClpufferrel (pH 7,5) eluáljuk.
12. példa
Humán ob-fehérje szekvenciaanalízise
A 7-11. példában leírt módon nyert és tisztított humán ob-fehérje N-terminális aminosav-szekvenciáját Laemli, U. K. (supra) által leírt módon határozzuk meg. Az elektroforézisnek alávetett fehéqéket elektrotranszfer segítségével Bauw et al. (supra) által leírt módon poli(4-vinil-N-metil-piridínium-jodiddal) bevont üvegszállemezre visszük fel, majd a 15 000 molekulatömegű fehéijesávot a membránból kivágjuk, és az N-terminális aminosavszekvenciát Edman-lebontással 120A on-line fenil-hidantoin-aminosav-analizátorral (Applied-Biosystems) felszerelt 470A gázfázisú szekvenátoron meghatározzuk. A fenti eljárások segítségével azt találtuk, hogy a hob-fehérje N-terminális aminosav-szekvenciája Val-Pro-Ile-Gln, amely az érett humán ob-fehéije SEQ ID NO: 6 szekvenciájának felel meg.
13. példa
Patkány és egér ob-fehérje biológiai aktivitása; intracerebroventrikuláris (ICV) injekció ob/ob egéren
Az 5. példa szerint tisztított érett patkány és egér ob-fehéije biológiai aktivitását ICV módszerrel a következőképpen határozzuk meg. Érzéstelenített nőstény, 6-13 hetes ob/ob egerek oldalsó agykamrájába az alábbi koordináták mellett (2 mm a középvonaltól oldalra, 0,6 mm a koponyatetőhöz vonatkoztatva, 2 mm lefelé) infúziós tűket illesztünk be, Haley és McCormick (supra) módszere alapján. A tűk végét ékszerészcsavar és fogászati cement segítségével rögzítjük a koponyához. Az egereket egyenként műanyag ketrecekbe helyezzük; az állatok korlátlanul kapnak táplálékot (kivéve az ICV injekció beadása előtti éjszakát) és vizet. A sebészeti beavatkozásból való felépülés után (a napi táplálékfelvétel és testtömeg-gyarapodás értékelése alapján) az egerekbe 1 μΐ intracerebroventrikuláris (ICV) injekcióval az alábbi tesztoldatokat fecskendezzük:
1) mesterséges CSF;
2) bakteriális kontrolloldat;
3) ob-fehéije (0,6-1 pg/egér); vagy
4) infúziót nem adunk be.
A fenti tesztoldatok (ICV) befecskendezése után a patkányok a tű megtisztítása céljából 1 μΐ mesterséges CSF-t kapnak. A kísérlet során a bakteriális kontrolloldatot a 2-4. példában ismertetett eljárással azonos módon készítjük el, azzal az eltéréssel, hogy az E. coli baktériumba beillesztett plazmid patkány és egér obgént nem tartalmaz.
Az egereket az ICV injekció beadása előtt 18 órán át (egy éjjelen át) éheztetjük. Az egerek oldalsó agykamrájába illesztett fecskendőbe 1 μΐ tesztoldatot fecskendezünk, egy előre kalibrált polietilén (PE) csődarabba (PE 20) illesztett 10 μΐ Hamilton-fecskendő segítségével. Az egereket azonnal kísérleti ketrecekbe helyezzük, amelyekbe előzőleg előre lemért mennyiségű pelletírozott egértápot tartalmazó tálkát és vizes üveget helyeztünk. Az egereket vizuálisan megfigyeljük, és a táplálékfelvételt a következő 7 órában mérjük. A táplálékfelvételt az ICV injekció beadása után 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 és 7 órával mérjük. Minden állat testtömegét - az ICV injekció beadása előtt, majd 24 órával utána meghatározzuk. A sikeres tűbehelyezést 10 pg neuropeptid Y ICV beadása utáni 2 órás táplálékfelvétel-növekedés jelzi, 2 órán át éheztetett egereken [Morley J. E. et al.: American J. Physiol., 253, 516-522 (1987)].
A fentiekben leírt ICV teszt során az alábbi eredményeket kapjuk:
A) Táplálékfelvétel-csökkentés
Az ICV injekció beadása utáni első 30 percben csaknem valamennyi egér rövid látens idővel evett, és körülbelül 0,5 g tápot fogyasztott. A kezeletlen vagy mesterséges CSF-el kezelt egerek a következő 6,5 órán át folytatták az evést, és a táplálékfelvétel 7 órás kumulatív értéke 3,2 g (1. táblázat). Ezzel szemben az ob-fehéijével ICV kezelt egerek a táplálkozást az első 30 perc után abbahagyták, és több táplálékot nem fogyasztottak. Ennek megfelelően a következő 6,5 órában a kumulatív táplálékfelvétel körülbelül 0,5 g-ra csökkent (1. táblázat). A kontroll ICV oldattal kezelt állatok 30 perc után szintén abbahagyták a táplálkozást, és csak a 6. és 7. óra között kezdték el újra az evést.
B) Testtömeggyarapodás-csökkentés
A hordozó kontrollal kezelt egerek testtömegének 24 órás változása valamivel kisebb a mesterséges CSFel kezelt vagy kezeletlen egereknél tapasztalt értékeknél (1. táblázat). Az ob-fehérjével kezelt egerek testtömegének %-os változása azonban közel 0, és szignifikánsan kisebb a hordozó kontrollal kezelt egerek testtömeg-változásánál (1. táblázat).
C) Végkövetkeztetés
Rekombináns egér ob-fehéije közvetlen adagolásának (1,1 pg/egér, 1 pl térfogatban, az agyba adagolva) eredményeként nőstény ob/ob egéren szignifikáns táplálékfelvétel-csökkenés és testtömeggyarapodás-csökkenés lépett fel. Ez azt mutatja, hogy az ob-fehérje az agyban közvetlenül hatni képes, és ez az intraperitoneálisan befecskendezett fehérje hatásával jó egyezést
HU 220 093 Β mutat. A példában nyert adatok igazolják a találmányunk szerinti bakteriálisán kifejezett rekombináns patkány és egér ob-fehérje biológiai aktivitását nőstény elhízott ob/ob egéren. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze:
1. táblázat
Kezelés | Táplálékfelvétel (0-7 óra) | Testtömeg-gyarapodás (0-24 óra) | ||
g | %** | g | % | |
Mesterséges | 3,2+0,2 | 100 | 3,8+0,3 | 100 |
Hordozó- kontroli | 0,9+0,3 | 28,1 | 2,9+0,2 | 76 |
ob-fehéije (1 pg/egér) | 0,3+0,1* | 15,6 | 0,3+0,5* | 8 |
* = az ob-fehérjével és mesterséges cerebrospinális folyadékkal (CSF) kezelt csoportok közötti szignifikáns különbség, p<0,05, ** = a kontroll %-a.
14. példa
Intravénásán (IV) adagolt patkány és egér ob-fehérje biológiai aktivitása, ob/ob egéren
A 2., 3., 4. és 5. példa szerint nyert és tisztított patkány és egér ob-fehérje biológiai aktivitását elhízott ob/ob egéren intravénás (IV) adagolás mellett a következőképpen határozzuk meg.
6-13 hetes hím és nőstény elhízott ob/ob egerekbe pentobarbital érzéstelenítés mellett (80 mg/kg testtömeg) krónikus juguláris tűket ültetünk be Mokhtarian A. et al. módszerével [Physiol. Behav, 54, 895-898 (1993)]. Az egereket állandó környezeti körülmények között egyenként műanyag ketrecekbe helyezzük; 12 órás sötét időszakot 12 órás megvilágítás követ. A testtömeget naponta mérjük, a tűk nyílását 2 naponként ellenőrizzük, és <0,1 ml steril heparin/konyhasóoldat (50 E/ml 0,9%-os konyhasóoldatban) infúzióval állandó értéken tartjuk. A sebészeti beavatkozás következményeiből való teljes felépülés után (testtömeggyarapodással való értékelés alapján) az egereket 16-18 órán keresztül (1 éjjelen át) éheztetjük. Másnap reggel az állatokat lemérjük, és a kísérlet előtt akklimatizáció céljából 45 percen át a kísérleti ketrecekben tartjuk. Az állatok folyamatosan kapnak vizet. Az állatokba egér ob-fehérjét (3 pg 0,1 ml-ben) vagy azonos térfogatú hordozókontrollt vagy 0,9%-os konyhasóoldatot fecskendezünk intravénásán. Az ébrenlévő egerekbe 0,5 ml-es inzulinfecskendők segítségével 0,1 ml tesztoldatot, majd 0,05 ml heparin/konyhasóoldatot fecskendezünk. Az egyes vizsgálatok között legalább 3 nap szünetet tartunk. Az egereket ezután azonnal egértáplálékpelletet tartalmazó, előre lemért, Petri-csészével felszerelt kísérleti ketrecekbe helyezzük. Az egereket vizuálisan megfigyeljük, és a táplálékfelvételt a következő 7 órán keresztül, az IV injekció beadása utáni 0,5., 1., 2., 3., 4., 6. és 7. órában méljük. A testtömeget az IV injekció előtt, majd 24 óra múlva mérjük. Öt különböző teszt során két külön egércsoportot (11 ob/ob és 12 sovány) alkalmazunk. A legtöbb egér ob-fehérjét és egy vagy két kontrollinjekciót kap, kiegyensúlyozott sorrendben. A kísérlet során két különböző egér ob-fehérjekészítményt alkalmazunk. A közölt eredmények a két külön teszt kombinációjából adódnak.
A) Eredmények
A kísérlet során az alábbi eredményeket kaptuk:
Az IV injekció beadása utáni első 30 percben a legtöbb kövér és sovány egér rövid látens idővel evett, és körülbelül 0,3-0,5 g táplálékot fogyasztott. A kísérlet során a konyhasóoldattal és hordozókontrollal kezelt, elhízott egerek táplálékfelvétele nőtt. A hordozókontrollal kezelt, elhízott ob/ob egerek kumulatív táplálékfelvétele nem különbözött a konyhasóoldattal kezelt, hasonlóképpen éheztetett, elhízott egerek táplálékfelvételétől. Ezzel szemben a rekombináns ob-fehéijével kezelt, elhízott ob/ob egerek táplálékfelvétele szignifikáns mértékben csökkent, és a kontroll mindössze 57%-ának felelt meg (2. táblázat). A hordozókontrollal és az ob-fehérjével kezelt csoportokban a 7 órás megfigyelési időszakban más viselkedésbeli hatást nem észleltünk. A várakozásnak megfelelően az injekció után 24 órával mutatott testtömeg-gyarapodás a kezelt csoportokban nem tért el (2. táblázat). Ennek oka az egér ob-fehérje egyetlen IV bokszának korlátozott hatásidőtartama.
B) Végkövetkeztetés
Az eredmények igazolják, hogy a rekombináns egér ob-fehéije elhízott ob/ob egéren IV beadagolás esetén (3 pg/egér) a kumulatív 7 órás táplálékfelvételt szignifikáns mértékben csökkenti. A rekombináns ob-fehéijének elhízott ob/ob egéren kifejtett táplálékfelvétel-csökkentő hatása az ob/ob egéren ismételt IP adagolás esetén mutatott táplálékfelvétel-eredményekkel összhangban van. A jelen példa során nyert adatok továbbá igazolják a bakteriálisán kifejezett rekombináns egér ob-fehérje biológiai aktivitását nőstény ob/ob egéren.
Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
Patkány és egér ob-fehéije IV adagolása ob/ob egéren
Kezelés | Táplálékfelvétel (0-7 óra) | Testtömeg-gyarapodás (0-24 óra) | ||
g | %** | g | % | |
Konyhasóoldat (n=4) | 1,8+0,2 | 2,9+0,3 | ||
Hordozókontroll (n=7) | 1,4+0,3 | 100 | 2,2+0,6 | 100 |
ob-fehérje (1 pg/egér) (n=8) | 0,8+0,2* | 57 | 1,4+0,6 | 64 |
Az adatok jelentése:
átlag+szórás;
n = az egerek száma;
* = az ob-fehérjével és mesterséges CSF-el kezelt csoportok közötti szignifikáns eltérés, p<0,05;
** = a kontroll %-a.
HU 220 093 Β
75. példa
Patkány és egér ob-fehérje biológiai aktivitása; ismételt IP befecskendezés ob/ob egéren
A 2-5. példa szerint kapott és tisztított patkány és egér ob-fehérje biológiai aktivitását ismételt intraperitoneális (IP) befecskendezés mellett elhízott ob/ob egéren a következőképpen határozzuk meg:
A kísérlethez 3 csoportot használunk; minden csoport 6 nőstény elhízott ob/ob egérből áll. Az egereket állandó környezeti körülmények mellett, 12 órás sötét és 12 órás megvilágított időszakokkal egyenként műanyag ketrecekbe helyezzük. A 24 órás táplálékfelvételt és testtömeget naponta mérjük. A kísérleti körülményekhez, napi kezeléshez és befecskendezéshez való hozzászoktatási időszak után az állatokat 3 csoportra osztjuk (3 különböző kezelés). Minden egér minden kezelési napon két 0,1 ml-es intraperitoneális (IP) injekciót kap. A 3 csoport állataiba az alábbi oldatokat fecskendezzük:
1) konyhasóoldat (0,9%);
2) bakteriális kontrolloldat; vagy
3) patkány és egér ob-fehérje (3 pg/0,1 ml).
Bakteriális kontrolloldatként a 2-4. példában a patkány és egér ob-fehéije kinyerésére és tisztítására megadott módon előállított és feldolgozott mintát alkalmazunk, azzal a változtatással, hogy az E. coli baktériumba beillesztett plazmid patkány és egér ob-gént nem tartalmaz. Az egereket 5 napon át naponta kétszer kezeljük, majd 2 napon át nem végzünk kezelést. A táplálékfelvételt minden ketrecben az első IP injekció beadása után 2, 3, 5 és 24 órával minden kezelési napon méljük.
A) Eredmények
Táplálékfelvétel-csökkentés
A konyhasóoldattal és baktériumos kontrollal befecskendezett egércsoportokban az 1 hetes kísérleti időszakban a kezeléses és nem kezeléses napokon a táplálékfelvétel nem tért el (3. táblázat). A kísérlet során a kezeléses napokon azonban a 6 pg ob-fehéijével befecskendezett kísérleti csoportban (6 egér) a táplálékfelvétel csökkent. A táplálékfelvétel-csökkenést a kezeléses napokon az első injekció befecskendezése után 2, 3, 5 és 24 órával figyeltük meg; az ob-fehéijével kezelt csoportnál kapott eredményeket a baktériumos kontrollcsoport és konyhasóval kezelt csoport esetében kapott eredményekkel hasonlítottuk össze.
B) Testtömeggyarapodás-csökkenés
Az ob-fehérjével 5 napon át kezelt csoport esetében a kumulatív testtömeg-gyarapodás -3,3+/-0,7 g, míg a fenti érték a konyhasóoldattal kezelt csoport esetében -0,9+/-0,2 g, és a baktériumos kontrollcsoport esetében -0,7+/-0,4 g (3. táblázat).
C) Végkövetkeztetés
A jelen példa adatai igazolják, hogy bakteriálisán kifejezett rekombináns patkány és egér ob-fehérje (6 pg/egér/nap) napi két IP befecskendezése a kezelt nőstény ob/ob egércsoportban a konyhasóoldattal, illetve bakteriális kontrollal kezelt ob/ob egércsoporthoz viszonyítva szignifikáns elhúzódó táplálékfelvétel-csökkenést és szignifikáns testtömeggyarapodás-csökkenést eredményez. Az eredmények bizonyítják, hogy a bakteriálisán kifejezett patkány és egér ob-fehéqe biológiailag aktív és találmányunk értelmében genetikusán elhízott ob/ob egereken a várt elhízásellenes hatásokat fejti ki. A 3. táblázatban a 2 órás és 5 órás eredmények, az átlagos napi táplálékfelvétel-értékek, míg a 24 órás eredmények 5 napos kumulatív táplálékfelvételt fejeznek ki. A kapott eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze.
3. táblázat
Patkány és egér ob-fehérje ismételt IP adagolása ob/ob egéren
Kezelés | Táplálékfelvétel (g/3 egér) | Testtömeg- gyarapodás | |||||
2 óra | 5 óra | 24 óra | |||||
g | kontroll %-a | g | kontroll %-a | g | kontroll %-a | g | |
Nem adtunk be injekciót | 5,5+0,5 | 14,5+0,5 | 44,3+3,5 | -0,9+0,2 | |||
Kontroll | 7,0+0,3 | 100 | 16,5+1,5 | 100 | 49,5+6,1 | 100 | -0,7+0,4 |
ob-fehérje | 3,5+0,5* | 50 | 5,5+1,0* | 33 | 25,5+4,6* | 52 | -3,3+0,7* |
Az adatok a 6 ob/ob egérből álló csoportokban mért átlag± szórásértékeknek felelnek meg. A táplálékfelvételt ketrecenként 3 egéren 5 napos kezelési időszakban, az első IP injekció befecskendezése után 2,5 és 24 órával mért átlagos kumulatív táplálékfelvételként adjuk meg. A testtömeg-gyarapodás az 5 napos kezelési időszakban mért kumulatív tcsttömegváltozásnak felel meg.
*=az ob-fehérjével és hordozóval kezelt csoportokban mért eredmények közötti szignifikáns eltérés, p<0,05.
16. példa
Humán ob-fehérje biológiai aktivitása; intracerebroventrikuláris (ICV) injekció ob/ob egéren
A humán intracerebroventrikuláris, ICV injekció formájában befecskendezett humán ob-fehéqe biológiai akti- 60 vitását a 13. példában leírt módon határozzuk meg, azzal az eltéréssel, hogy az alábbi tesztoldatokat alkalmazzuk: - all. példa szerint termelt rekombináns humán ob-fehérje (0,05 pg), 0,1% egér szérumalbumint tartalmazó foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban (PBS); és
HU 220 093 Β
- 0,1 tömeg/térfogat% egér szérumalbumint (albuminkontroll) tartalmazó PBS mint hordozó kontrolloldat.
A) Táplálékfelvétel-csökkentés
Az ICV injekció befecskendezése utáni első 30 percben csaknem valamennyi egér rövid lappangási idővel evett, és körülbelül 0,5 g táplálékot fogyasztott. Az injekcióval nem kezelt egerek az evést a következő 6,5 órán át folytatták, és a kumulatív 7 órás táplálékfelvétel 1,8 g (4. táblázat). Az albumin-kontrolloldattal ICV kezelt egerek az evést 30 perc után abbahagyták, majd a táplálkozást a 3. és 7. óra között kezdték meg újra. Ezzel szemben a humán ob-fehétje ICV injekcióval kezelt egerek az első 30 percben szignifikánsan kevesebbet fogyasztottak (0,2 g), és a következő 6,5 órában is nagyon keveset ettek. Ennek megfelelően a kumulatív táplálékfelvétel a következő 6,5 órában jelentősen visszaszorult, körülbelül 0,4 g értékre (4. táblázat).
B) Testtömeggyarapodás-csökkentés
A hordozókontrollal kezelt állatok testtömeg-változása 24 órás időszakban a mesterséges CSF-injekcióval kezelt és kezeletlen egerekhez viszonyítva kis mértékben csökkent (4. táblázat). Ezzel szemben a humán ob-fehéije injekcióval kezelt egerek százalékos testtömeg-változása közel 0 (4. táblázat).
C) Végkövetkeztetések
Rekombináns humán ob-fehérjének (0,05 pg/egér, 1 μΐ-ben) az agyba történő közvetlen beadagolása nőstény ob/ob egéren a táplálékfelvétel, valamint testtömeg-gyarapodás hosszan tartó és szignifikáns csökkenéséhez vezet, és ez azt mutatja, hogy az ob-fehérje hatását közvetlenül az agyban fejti ki; a kapott eredmények az IP befecskendezett ob-fehérje hatásával összhangban vannak. A jelen példa továbbá igazolja bakteriálisán kifejezett rekombináns humán ob-fehérje biológiai aktivitását nőstény elhízott ob/ob egéren. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze.
4. táblázat
Humán ob-fehérje ICV adagolása ob/ob egéren
Kezelés | Táplálékfelvétel (0-7 óra) | T esttömeg-gyarapodás (0-24 óra) | ||
g | %** | g | %** | |
Nem adtunk be injekciót (n=3) | l,8±0,2 | 3,l±0,4 | ||
Albuminkont- roll(n=3) | l,0±0,4 | 100 | l,7±0,6 | 100 |
Humán obfehérje (1 pg/egér) (n=5) | 0,4±0,2* | 40 | 0±0,8 | 0 |
Az adatok jelentése;
átlagit szórás;
n = az egerek száma;
* = a humán ob-fehérjével és mesterséges CSF-el kezelt csoportok közötti szignifikáns különbség, p<0,05;
** = a kontroll százaléka.
17. példa
Ob-fehérje biológiai aktivitása elhízott emberen; kísérleti táplálékfelvétel csökkentése IV adagolás után
A 7-11. példa szerint kapott és tisztított humán, valamint patkány és egér ob-fehérjék biológiai aktivitását emberen IV adagolás után a táplálékfelvétel mérése útján a következőképpen határozzuk meg:
Sovány és elhízott önkéntesek étkezési laboratóriumban két alkalommal Muurahainen Ν. E. et al., supra módszerével rögzített kalóriatartalmú táplálékot kapnak. A táplálékfelvétel előtt legalább 1 órával a könyökhajlati vagy alkari vénába beültetett IV katétert helyezünk, és heparinzárral nyitva tartunk. Vizuális-analóg éhezésbeosztást a táplálék beadása előtt 15 perccel, utána 15 perccel és a táplálékfelvétel befejezésekor kapunk. A táplálék beadása előtt 20 perccel IV infúzió útján patkány és egér vagy humán ob-fehéijét vagy konyhasóoldatot adagolunk be. Utasítás szerint minden kísérleti személy jóllakásig fogyaszt táplálékot. Az egyes kísérleti személyek által elfogyasztott kísérleti táplálék mennyiségét mérjük. Ezután minden kísérleti személybe humán obfehérjét (0,05 mg/kg testtömeg), patkány és egér ob-fehéijét (0,5 mg/kg testtömeg) vagy konyhasóoldatot fecskendezünk infúzió útján, és a fenti körülmények között felvett táplálékkülönbséget kiszámítjuk. A humán, vagy patkány és egér ob-fehérjével kezelt csoport tagjai legalább 20%-kal kevesebb táplálékot fogyasztottak.
18. példa
Ob-fehérje biológiai aktivitása elhízott emberen; testtömeg-csökkenés előidézése ismételt IV adagolással
A 7-11. példa szerint nyert és tisztított patkány és egér, vagy humán ob-fehérjék biológiai aktivitását az ob-fehérje ismételt IV adagolásakor fellépő testtömegcsökkenés mérésével, a következő módszerrel határozzuk meg.
Placebo-ellenőrzött kettős vak testtömeg-csökkenés meghatározást Drent M. L. et al., supra módszerével végzünk el. Elhízott, 27-nél nagyobb testtömegindexű (BMI) kísérleti egyéneket lemérünk, és 2-4 héten át 1500 Kcal diétán tartunk. E bevezető periódus végére legalább 1 kg testtömeg-csökkenést mutató valamennyi elhízott kísérleti személyt véletlen elrendezésben két csoportba sorolunk. A kísérleti egyének legalább 6 héten át naponta IV adagolással humán, vagy patkány és egér ob-fehérjét (0,5 mg/kg/nap) vagy placebót (konyhasóoldat) kapnak. A testtömeget hetente feljegyezzük. A humán, vagy patkány és egér ob-fehérjével kezelt kísérleti személyek a 6 hetes kezelés után a placebo-csoporttal összehasonlítva szignifikáns mértékben nagyobb testtömeg-csökkenést mutatnak.
19. példa
A) Polietilénglikollal konjugált ob-fehérje készítése E. coli sejtekből g, a 8. példa szerint előállított E. coli sejtpelletet újraszuszpendálás előtt 5 mM EDTA-t tartalmazó 1 liter 50 mM Tris-HCl-pufferben (pH 8,5) szuszpendálunk. A szuszpenziót 37 °C-on 15 percen át inkubáljuk, majd további, 5 mM EDTA-t tartalmazó 1 liter 50 mM
HU 220 093 Β
Tris-HCl-pufferrel (pH 8,5) hígítjuk. A kapott szuszpenziót 15 percen át homogenizátor felhasználásával 50%-os porülepedésig homogenizáljuk. A szuszpenziót 1 órán át percenkénti 8000 fordulat mellett 4 °C-on végzett centrifugálással derítjük. A pelletet elöntjük. A felülúszót vízzel 1,8 mS vezetőképességig hígítjuk, és közvetlenül 200 ml, 50 mM Tris-HCl-pufferrel (pH 8,5) előzetesen egyensúlyba hozott gyorsátfolyású QSepharose-val (erősen anionos ioncserélő gyanta) töltött oszlopra visszük fel. Az oszlopot az egyensúlyba hozáshoz felhasznált pufferrel mossuk, majd a fehérjét 100 mM nátrium-kloridot tartalmazó fenti kiegyensúlyozó pufferrel eluáljuk. A nátrium-kloridot tartalmazó kiegyensúlyozó pufferrel nyert eluátum jelölése: QSepharose eluátum.
A Q-Sepharose eluátumhoz 82 mS végső vezetőképesség eléréséig szilárd nátrium-kloridot adunk. Az eluátumot ezután 1 M nátrium-kloridot tartalmazó, 50 mM Tris-HCl-pufferrel (pH 8,5) előzetesen egyensúlyba hozott, 200 ml gyorsátfolyású butil-Sepharose-val töltött hidrofób kölcsönhatásoszlopra (HIC) visszük fel. A nem adszorbeálódott anyagokat a fenti kiegyensúlyozó pufferrel kimossuk, és az adszorbeálódott ob-fehéijét 50 mM ammónium-acetáttal (pH 6,9) eluáljuk. A kapott eluátum jelölése: HlC-eluátum. A HlC-eluátumban levő ob-fehérje fordított fázisú HPLC segítségével végzett meghatározás szerint 95%-os tisztaságú. A tisztított ob-fehérjét membrán felhasználásával (YM-10) 3,7 mg/ml értékre betöményítjük. A felhasznált membrán a 10 000 dalton vagy ennél nagyobb molekulákat visszatartja. A membrán felhasználásán alapuló fenti betöményítő lépés után az ob-fehéijét 100 mM borátpufferbe (pH 8,0) diaszűtjük, és a kapott oldatot használjuk fel ob-törzsoldatként.
B) Humán ob-fehérje pegilezése
A pegilezési reakció során olyan II-A általános képletű PEG2-NHS reagenst alkalmazunk, amelyben R jelentése metilcsoport, n és n’ összege 820-1040, átlagos összegük 930, és az átlagos molekulatömeg 40 kDa (forgalmazó cég: Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama). A felhasznált PEG2-NHS reagens olyan II-A általános képletű vegyületek keveréke, amelyekben n és n’ aránya körülbelül 1,0, a keverékben n és n’ összege 820-1040 egység, a PEG-lánc átlagos molekulatömege a keverékben körülbelül 20 kDa, és a reagens átlagos molekulatömege körülbelül 40 kDa, ami mellett a keverékben n és n’ átlagos összege körülbelül 930.
mg vagy 0,54 ml, az A) bekezdés szerint előállított, tisztított humán ob-törzsoldathoz (3,7 mg/ml; 125 nmol ob-fehétje) 250 nmol fent említett PEG2-NHS reagensoldatot adunk. Az oldat 10 mg vagy 0,1 ml 100 mg/ml PEG2-NHS törzsoldatból áll 1 mM sósavban. A teljes reakcióelegyet 100 mM borátpuffer (pH 5,0) hozzáadásával 0,67 ml-re töltjük fel. A fehéije:reagens végső mólarány 1:2. A kapott elegyet 4 órán át 4 °C-on keverjük, majd a reakciót 1,1 μΐ jégecet hozzáadásával leállítjuk; a végső pH 4,5. A kapott reakcióelegyet (0,67 ml) vízzel 27 ml-re hígítjuk, majd a kapott oldatot 1,7 ml karboxi-metilezett kationos ioncserélő gyantát (Perseptives, Framingham, Massachusetts) tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot 3,3 μΜ HEPES/MES nátriumacetát-puffer (pH 5,0) hozzáadásával egyensúlyba hozzuk. A hígított reakcióelegyet az oszlopra felvisszük, és a meg nem kötött PEG2-NHS reagenst az oszlopról lemossuk. Az adszorbeálódott, pegilezett és módosítatlan ob-fehéijéket 80, 150 és 500 mM nátrium-klorid-gradiens szerint eluáljuk (minden lépésnél 15 oszloptérfogat). A kapott eluátumok 2 ml-es mennyiségét különkülön szekvenciában összegyűjtjük, és az egyes frakciók mintáit SDS-PAGE-analízisnek vetjük alá. Az analízis segítségével magasan pegilezett konjugátumokat, kívánt elágazó mono-PEG-ob (PEG2-ob) fehérjét és módosítatlan ob-fehéijét választunk szét. Az egyes frakciókat a fenti minősítés szerint összegyűjtjük; a kívánt elágazó mono-PEG2-ob-fehéqét a második gyűjtőedény tartalmazza. E kívánt fehéije olyan I-A általános képletű vegyületnek felel meg, amelyben n és n’ összege körülbelül 820-1040, n és n’ átlagos összege 930, R és R’ jelentése metilcsoport, és minden PEG-lánc átlagos molekulatömege körülbelül 20 kDa. A pegilezett termék átlagos molekulatömege körülbelül 56 kDa. Az összegyűjtött PEG2-ob-fehéijetartalmú frakciókat YM 10 membrán segítségével 3,7 mg/ml-re töményítjük be. Az YM 10 membrán a 10 000 dalton vagy nagyobb molekulatömegű molekulákat tartja vissza. Ezután a betöményített anyagot PBS-pufferben (pH 7,3) diaszűtjük és -20 °Con tároljuk. A tárolt termék olyan I-A általános képletű pegilezett ob-fehéije, amelyben n és n’ összege körülbelül 820-1040, és minden ob-fehéijelánc átlagos molekulatömege körülbelül 20 kDa. A fenti ob-fehéijekonjugátum-keverékben a PEG fehérje átlagos molekulatömege 56 kDa.
20. példa
Pegilezett humán ob-fehérje biológiai meghatározása; egyetlen IP injekció, ob/ob egérben
Módszerek
Két, egyenként 6-6 nőstény elhízott ob/ob egérből álló csoportot vizsgálunk. Az egereket állandó környezeti körülmények között 12 órás sötét és 12 órás megvilágításos ciklusok mellett hármasával műanyag ketrecekben tartjuk. A 24 órás táplálékfelvételt és a testtömeget naponta méijük. A környezeti körülményekhez, napi kezeléshez és befecskendezéshez való hozzászoktatási időszak után az egereket két kezeléscsoportba soroljuk. Minden egér a kísérlet első napján (közvetlenül a sötét/megvilágítás ciklus sötét fázisának megkezdése előtt) egy intraperitoneális (IP) injekció formájában alábbi kezelést kap:
- konyhasóoldat (0,9%-os);
- a 19. példa A) része szerint előállított humán ob-fehétje törzsoldat (30 pg/0,1 ml);
- pegilezett kontrolloldat (azonos módon előállított és tisztított minta, azonban humán ob-fehéije nélkül);
- a 19. példa szerint előállított pegilezett ob-fehérje (30 pg/0,1 ml).
A napi táplálékfelvételt a ketrecben, és az egyes egerek testtömegét a következő 3 napon, majd a 6. napon méijük.
HU 220 093 Β
Eredmények:
Táplálékfelvétel csökkentése
Az egyetlen kezelés során, és a két azt követő napon a konyhasóoldattal és pegilezett kontrollal befecskendezett egerek napi táplálékfelvétele egymástól nem tért el (5. táblázat). A 30 pg humán ob-fehéijével és pegilezett humán ob-fehérjével kezelt 6 egér napi táplálékfelvétele azonban a kezelés napján a konyhasóoldattal és pegilezett kontrolloldattal befecskendezett egerekhez viszonyítva csökkent (5,2 g és 8,2 g, illetve 11,9 g és 11,4 g). A humán ob-fehérjével kezelt egerek táplálékfelvétele a kontrollértékre visszatért, míg a pegilezett humán ob-fehéijével befecskendezett egerek táplálékfelvétele a kísérlet további napjai alatt is csökkent. A táplálékfelvétel-csökkenést a pegilezett humán ob-fehérje egyetlen befecskendezése után 48 órán át figyeltük meg. A pegilezett humán ob-fehétje befecskendezése esetén a kumulatív 24 órás táplálékfelvétel a kísérlet három napján keresztül a konyhasóoldattal és pegilezett kontrollal kezelt csoportokhoz viszonyítva szignifikánsan 49%-ra csökkent.
B) Testtömeg-gyarapodás csökkentése A konyhasóoldattal és pegilezett kontrollal befecskendezett egércsoportokban az egyetlen kezelés során, és a következő 2 napon a testtömeg-változás nem mutatott eltérést (6. táblázat). A 30 pg humán ob-fehéijével és pegilezett ob-fehérjével befecskendezett csoportok esetében azonban a testtömeg a kezelés napján a konyhasóoldattal és pegilezett kontrolloldattal kezelt csoportokhoz viszonyítva csökkent (-0,9 g és -0,7 g, illetve 0,1 és 0,3 g). A humán ob-fehéijével befecskendezett csoportok esetében az egerek testtömege a kontrollértékre visszatért, míg a pegilezett humán ob-fehérjével kezelt csoportok esetében az egerek testtömege a kezelést követő napokon tovább csökkent. A testtömeg csökkenése a pegilezett humán ob-fehérje befecskendezése után 48 órán át folytatódott. A kísérlet 6 napja során mért kumulatív testtömeg-változás -1,6 g, szemben az ob-fehérjecsoportban mért 0,4 g, a konyhasóoldattal kezelt csoportban mért 0,7 g és a pegilezett kontrollcsoportban kapott 1,1 ±0,2 g értékkel (6. táblázat).
C) Végkövetkeztetés
A jelen példa során kapott adatok igazolják, hogy a pegilezett humán ob-fehétje egyetlen IP befecskendezése (30 pg/egér) 3 napos mérés szerint a konyhasóoldattal és pegilezett kontrollal kezelt nőstény ob/ob egerekkel összehasonlítva szignifikáns és hosszan tartó táplálékfelvétel-csökkenést és szignifikáns testtömeg-csökkenést eredményez. A kapott eredmények bizonyítják, hogy a pegilezett humán ob-fehéije hosszan tartó potens biológiai hatást fejt ki, és genetikusán elhízott ob/ob egéren a várt elhízásellenes hatásokat mutatja.
5. táblázat
Pegilezett humán ob-fehéije egyetlen IP beadásának hatása ob/ob egerek napi táplálékfelvételére
Kezelés | Táplálékfelvétel (3 egér/nap) | |||||
1. nap | 2. nap | 3. nap | ||||
g | kontroll %-a | g | kontroll %-a | g | kontroll %-a | |
Konyhasóoldat | 11,9 | 100 | 13,7 | 100 | 13,6 | 100 |
Ob-fehérje | 5,2 | 43,7 | 11,7 | 85,4 | 12,5 | 92 |
Pegilezett kontroll | 11,4 | 95,8 | 4,5 | 106 | 13,4 | 99 |
Pegilezett ob-fehéije | 8,2 | 68,9 | 6,0 | 43,8 | 4,9 | 36 |
A feltüntetett adatok az egyes csoportokban 6 ob/ob egéren végzett mérések átlagértékei. A táplálékfelvételt a ketrecekben levő három egérnek az egyetlen IP injek- 45 ció beadása után naponként mutatott átlagos napi táplálékfelvétele formájában adjuk meg. Megjegyezzük, hogy a napi táplálékfelvétel tartós csökkenése csak a pegilezett ob-fehérjecsoportban lép fel.
6. táblázat
Pegilezett humán ob-fehétje egyetlen IP beadásának hatása ob/ob egerek testtömeg-változására
Kezelés | Testtömeg-változás (g) | |||
1. nap | 2. nap | 3. nap | 6. nap | |
Konyhasóoldat | 0,1 | 0,6 | 0,01 | -0,01 |
Ob-fehétje | -0,9 | 1,1 | 0,2 | ND |
Kezelés | Testtömeg-változás (g) | |||
1. nap | 2. nap | 3. nap | 6. nap | |
Pegilezett kontroll | 0,3 | 0,4 | 0,6 | -0,2 |
Pegilezett ob-fehéije | -0,7 | -0,6 | -0,9 | 0,6 |
A megadott értékek minden csoportban 6 ob/ob egér átlagértékei. Az egerek az egyetlen IP injekciót az
1. napon kapják. A testtömeg-változást a kísérlet minden napján fellépő testtömeg-változás formájában adjuk meg. Megjegyezzük, hogy tartós testtömeg-csökkenést csak a pegilezett ob-fehérjével kezelt csoportban mértünk. ND=nem végeztünk meghatározást.
HU 220 093 Β
Szekvenciák felsorolása (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ (i) BEJELENTŐ:
(A) NÉV: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) UTCA: Grenzacherstrasse 124 (C) VÁROS: Bázel (D) ÁLLAM: BS (E) ORSZÁG: Svájc (F) POSTAI KÓD: (ZIP): CH-4070 (G) TELEFON: 061-688 42 56 (H) TELEFAX: 061-688 13 95 (I) TELEX : 962292/965542 hír eh (ii) TALÁLMÁNY CÍME: Rekombináns elhízásért felelős (ob) fehérjék (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 8 (iv) COMPUTER ÁLTAL LEOLVASHATÓ FORMA (A) TÍPUS: Floppy disk (B) COMPUTER: Apple Macintosh (C) MŰKÖDŐ RENDSZER: System 7.1 (Macintosh) (D) SOFTWARE: Word 5.0 (2) SEQ ID NO: 1-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 702bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQIDNO: 1:
CAAGGTGCAA GAAGAAGAAG ATCCCAGGGA GGAAAATGTG CTGGAGACCC CTGTGTCGGT 60 TCCTGTGGCT TTGGTCCTAT CTGTCTTATG TTCAAGCAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 120 ATGACACCAA AACCCTCATC AAGACCATTG TCACCAGGAT CAATGACATT TCACACACGC 180 AGTCGGTATC CGCCAAGCAG AGGGTCACTG GCTTGGACTT CATTCCTGGG CTTCACCCCA 240 TTCTGAGTTT GTCCAAGATG GACCAGACTC TGGCAGTCTA TCAACAGGTC CTCACCAGCC 300 TGCCTTCCCA AAATGTGCTG CAGATAGCCA ATGACCTGGA GAATCTCCGA GACCTCCTCC 360 ATCTGCTGGC CTTCTCCAAG AGCTGCTCCC TGCCTCAGAC CAGTGGCCTG CAGAAGCCAG 420 AGAGCCTGGA TGGCGTCCTG GAAGCCTCAC TCTACTCCAC AGAGGTGGTG GCTTTGAGCA 480 GGCTGCAGGG CTCTCTGCAG GACATTCTTC AACAGTTGGA TGTTAGCCCT GAATGCTGAA 540 GTTTCAAAGG CCACCAGGCT CCCAAGAATC ATGTAGAGGG AAGAAACCTT GGCTTCCAGG 600 GGTCTTCAGG AGAAGAGAGC CATGTGCACA CATCCATCAT TCATTTCTCT CCCTCCTGTA 660 GACCACCCAT CCAAAGGCAT GACTCCACAA TGCTTGACTC AA 702 (2) SEQ ID NO: 2-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 167 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: nem releváns (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 2:
Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu
10 15
Ser Tyr Val Gin Alá Val Pro Ile Gin Lys Val Gin Asp Asp Thr Lys
25 30
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr 35 40 45
Gin Ser Val Ser Alá Lys Gin Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro 50 55 60
HU 220 093 Β
Gly 65 | Leu | Hi s | Pro | Ile | Leu 70 | Se r | Leu | Ser | Lys | Me t 75 | As p | Gin | Thr | Leu | Al a 80 |
Val | Tyr | Gin | Gin | Val | Leu | Thr | Ser | Leu | Pro | Ser | Gl n | Asn | Val | Leu | Gin |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ile | Alá | Asn | As p | Leu | Glu | Asn | Leu | Arg | Asp | Leu | Leu | Hi s | Leu | Leu | Al a |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Phe | Ser | Lys | Ser | Cy s | Ser | Leu | Pro | Gin | Thr | Ser | Gly | Leu | Gin | Lys | Pro |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
Glu | Ser | Leu | Asp | Gly | Val | Leu | Glu | Al a | Se r | Leu | Tyr | Ser | Thr | Glu | Val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Va 1 | Al a | Leu | Ser | Arg | Leu | Gin | Gly | Ser | Leu | Gin | As p | Ile | Leu | Gin | Gin |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Asp | Val | Ser | Pro | Glu | Cy s |
165 (2) SEQ ID NO: 3-RA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK: (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: nem releváns (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen
(ii)MOLEKULATÍPUS: peptid | |||||||||||||||
(iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: | SEQ IDNO | : 3: | |||||||||||||
Va 1 1 | Pro | Ile | Gin | Lys 5 | Va 1 | Gin | Asp | Asp | Thr 10 | Ly s | Thr | Leu | Ile | Lys 15 | Thr |
Ile | Val | Thr | Arg 20 | Ile | Asn | As p | Ile | Ser 25 | Hi s | Thr | Gin | Ser | Val 30 | Ser | Al a |
Ly s | Gin | Arg 35 | Va 1 | Thr | Gly | Leu | Asp 40 | Phe | Ile | Pro | Gly | Leu 45 | Hi s | Pro | Ile |
Leu | Ser 50 | Leu | Ser | Lys | Me t | Asp 55 | Gin | Thr | Leu | Al a | Va 1 60 | Tyr | Gin | Gin | Va 1 |
Leu 65 | Thr | Ser | Leu | Pro | Ser 70 | Gin | Asn | Val | Leu | Gin 75 | Ile | Al a | Asn | As p | Leu 80 |
Glu | Asn | Leu | Arg | As p 85 | Leu | Leu | Hi s | Leu | Leu 90 | Al a | Phe | Ser | Ly s | Ser 95 | Cys |
Ser | Leu | Pro | Gin 100 | Thr | Ser | Gly | Leu | Gin 105 | Ly s | Pro | Gl u | Ser | Leu 110 | Asp | Gly |
Va 1 | Leu | Glu 115 | Al a | Ser | Leu | Tyr | Ser 120 | Thr | Glu | Val | Val | Al a 125 | Leu | Ser | Arg |
Leu | Gin 130 | Gly | Ser | Leu | Gin | Asp 135 | Ile | Leu | Gin | Gin | Le u 140 | As p | Val | Ser | Pro |
Glu Cys 145 (2) SEQ ID NO: 4-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK: (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 690bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyetlen (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTTGCAAGGC CCAAGAAGCC TTCTTGTGGC TTTGGCCCTA GATGACACCA AAACCCTCAT CAGTCAGTCT CCTCCAAACA ATCCTGACCT TATCCAAGAT ATGCCTTCCA GAAACGTGAT
SEQIDNO: 4:
CATCCTGGGA AGGAAAATGC TCTTTTCTAT GTCCAAGCTG CAAGACAATT GTCACCAGGA GAAAGTCACC GGTTTGGACT GGACCAGACA CTGGCAGTCT CCAAATATCC AACGACCTGG
ATTGGGGAAC CCTGTGCGGA TGCCCATCCA AAAAGTCCAA TCAATGACAT TTCACACACG TCATTCCTGG GCTCCACCCC ACCAACAGAT CCTCACCAGT AGAACCTCCG GGATCTTCTT
120
180
240
300
360
HU 220 093 Β
CACGTGCTGG CCTTCTCTAA GAGCTGCCAC TTGCCCTGGG CCAGTGGCCT GGAGACCTTG 420 GACAGCCTGG GGGGTGTCCT GGAAGCTTCA GGCTACTCCA CAGAGGTGGT GGCCCTGAGC 480 AGGCTGCAGG GGTCTCTGCA GGACATGCTG TGGCAGCTGG ACCTCAGCCC TGGGTGCTGA 540 GGCCTTGAAG GTCACTCTTC CTGCAAGGAC TACGTTAAGG GAAGGAACTC TGGCTTCCAG 600 GTATCTCCAG GATTGAAGAG CATTGCATGG ACACCCCTTA TCCAGGACTC TGTCAATTTC 660 CCTGACTCCT CTAAGCCACT CTTCCAAAGG 690 (2) SEQ ID NO: 5-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 167 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: nem releváns (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 5:
Me t 1 | Hi s | Trp | Gly | Thr 5 | Leu | Cy s | Gly | Phe | Leu 10 | Trp | Leu | Trp | Pro | Tyr 15 | Leu |
Phe | Tyr | Val | Gin | Al a | Val | Pro | Ile | Gin | Ly s | Val | Gin | As p | As p | Thr | Ly s |
20 | 25 | 30 | |||||||||||||
Thr | Leu | Ile | Ly s | Thr | Ile | Val | Thr | Arg | Ile | Asn | Asp | Ile | Ser | Hi s | Thr |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Gin | Ser | Val | Se r | Ser | Lys | Gin | Lys | Val | Thr | Gly | Leu | Asp | Phe | Ile | Pro |
50 | 55 | 60 | |||||||||||||
Gly | Leu | Hi s | Pro | Ile | Leu | Thr | Leu | Ser | Ly s | Me t | Asp | Gin | Thr | Leu | Al a |
65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
Va 1 | Tyr | Gin | Gin | Ile | Leu | Thr | Ser | Me t | Pro | Ser | Arg | Asn | Va 1 | Ile | Gin |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Ile | Ser | Asn | As p | Leu | Glu | Asn | Leu | Arg | As p | Leu | Leu | Hi s | Val | Leu | Al a |
100 | 105 | 110 | |||||||||||||
Phe | Ser | Lys | Ser | Cy s | Hi s | Le u | Pro | Trp | Al a | Ser | Gly | Leu | Glu | Thr | Leu |
115 | 120 | 125 | |||||||||||||
As p | Ser | Leu | Gly | Gly | Va 1 | Leu | Glu | Al a | Ser | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Val |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Val | Al a | Leu | Ser | Arg | Leu | Gin | Gly | Ser | Leu | Gl n | Asp | Me t | Leu | Trp | Gin |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Leu | Asp | Leu | Se r | Pro | Gly | Cy s |
165 (2) SEQ ID NO: 6-RA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK: (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: nem releváns (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen
(ii) MOLEKULATÍPUS: peptid | ||||||||||||
(iii) HIPOTETIKUS: NEM | ||||||||||||
(iv) ANTI-ÉRZÉKELES: | : NEM | |||||||||||
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: | SEQIDNO | : 6: | ||||||||||
Val Pro Ile Gin | Lys | Val | Gin | Asp | Asp | Thr | Ly s | Thr | Leu | Ile | Lys | Thr |
1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
Ile Val Thr Arg | Ile | Asn | Asp | Ile | Ser | Hi s | Thr | Gin | Ser | Val | Ser | Se r |
20 | 25 | 30 | ||||||||||
Lys Gin Lys Val | Thr | Gly | Leu | Asp | Phe | Ile | Pro | Gly | Leu | Hi s | Pro | Ile |
35 | 40 | 45 | ||||||||||
Leu Thr Leu Ser | Lys | Me t | Asp | Gin | Thr | Leu | Alá | Val | Tyr | Gin | Gin | Ile |
50 | 55 | 60 | ||||||||||
Leu Thr Ser Met | Pro | Ser | Arg | Asn | Val | Ile | Gin | Ile | Ser | Asn | Asp | Le u |
65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||
Glu Asn Leu Arg | Asp | Leu | Leu | Hi s | Val | Leu | Al a | Phe | Ser | Lys | Ser | Cys |
85 | 90 | 95 |
HU 220 093 Β
Hi s | Leu | Pro | Trp | Al a | Ser | Gly | Leu | Glu | Thr | Leu | As p | Ser | Leu | Gly | Gl | y |
100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
Va 1 | Leu | Glu | Al a | Ser | Gly | Tyr | Ser | Thr | Glu | Val | Va 1 | Al a | Leu | Ser | Ar | g |
115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
Leu | Gin | Gly | Ser | Leu | Gin | As p | Me t | Leu | Trp | Gin | Leu | Asp | Leu | Ser | Pr | 0 |
130 | 135 | 140 |
Gly Cys 145 (2) SEQ ID NO: 7-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 63 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: kettős (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 7:
ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG 60 GCC 63 (2) SEQ ID NO: 8-RA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZ: 21 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: nem releváns (D) TOPOLÓGIA: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 8:
Met Lys Lys Thr Alá Ile Alá Ile Alá Val Alá Leu Alá Gly Phe Alá
10 15
Thr Val Alá Gin Alá
Claims (37)
1. SEQ ID NO: 6-t tartalmazó, homogén, biológiailag aktív humán elhízottságért felelős fehérje, vagy annak a fehérjebiológiai aktivitásával rendelkező fragmense.
2. Az 1. igénypont szerinti fehéije vagy fragmens, amelynek a biológiai aktivitását emlősökön a táplálékfelvétel csökkentése és a testtömeg-gyarapodás csökkentése jellemzi.
3. Más emlős fehérjéktől mentes, rekombináns, biológiailag aktív humán elhízottságért felelős fehérje, vagy annak a fehéijebiológiai aktivitásával rendelkező fragmense.
4. A 3. igénypont szerinti fehéije vagy fragmens, amelynek a biológiai aktivitását emlősökön a táplálékfelvétel csökkentése és a testtömeg-gyarapodás csökkentése jellemzi.
5. A 3. igénypont szerinti fehéije, amely SEQ ID NO: 6-ttartalmaz.
6. Homogén, biológiailag aktív egérszerű elhízottságért felelős fehéije, vagy annak a fehéijebiológiai aktivitásával rendelkező fragmense.
7. A 6. igénypont szerinti fehérje vagy fragmens, amelynek a biológiai aktivitását emlősökön a táplálékfelvétel csökkentése és a testtömeg-gyarapodás csökkentése jellemzi.
8. A 6. igénypont szerinti fehérje, amely SEQ ID NO: 3-ttartalmaz.
9. Más emlős fehérjéktől mentes, rekombináns, biológiailag aktív egérszerű elhízottságért felelős fehérje, vagy annak a fehéijebiológiai aktivitásával rendelkező fragmense.
10. A 9. igénypont szerinti fehéije, amelynek a biológiai aktivitását emlősökön a táplálékfelvétel csökkentése és a testtömeg-gyarapodás csökkentése jellemzi.
11. A 9. igénypont szerinti fehérje, azzal jellemezve, hogy SEQ ID NO: 3-t tartalmaz.
12. Kifejező vektor, amely
a) valamely promoterszekvenciát; és
HU 220 093 Β
b) valamely fúziós fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, amely fúziós fehérje a SEQ ID NO: 3 egérszerű ob-fehéqét vagy a SEQ ID NO: 6 humán ob-fehéijét és az E. coli külső A membránfehérje szignálpeptidjét tartalmazza; és amely kifejező vektor Escherichia coli gazdasejtekben a fúziós fehérje kifejezésére képes.
13. A 12. igénypont szerinti kifejező vektor, amelynek a promoterszekvenciája lac promoter operátorból és valamely lipoprotein promoterből áll.
14. Fúziós fehéije, amely az egérszerű elhízottságért felelős fehéijét vagy a humán elhízottságért felelős fehéijét és az Escherichia coli külső A membránfehéije szignálpeptidjét tartalmazza.
15. A 14. igénypont szerinti fúziós fehérje, amelyben az egérszerű elhízottságért felelős fehéije a SEQ ID NO: 3 szekvenciát, és a humán elhízottságért felelős fehérje a SEQ ID NO: 6 szekvenciát tartalmazza.
16. Egy első és egy második részt tartalmazó DNSszekvencia, amelyben
a) az első rész az sOmpA-peptidet kódoló, SEQ ID
NO: 7 sOmpA génszekvencia; és
b) a második rész az egérszerű ob-fehérjét kódoló nukleotidszekvencia vagy a humán ob-fehéijét kódoló nukleotidszekvencia.
17. A 16. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amelynél az egérszerű ob-fehéije a SEQ ID NO: 3 szekvenciát tartalmazza.
18. A 16. igénypont szerinti DNS-szekvencia, amelynél a humán ob-fehérje a SEQ ID NO: 6 szekvenciát tartalmazza.
19. A 12. igénypont szerinti kifejező vektorral transzformált Escherichia coli gazdaszervezet.
20. Eljárás más emlős fehérjéktől mentes, biológiailag aktív, rekombináns humán vagy egérszerű elhízottságért felelős fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) valamely promoterszekvenciát és valamely fúziós fehéijét kódoló DNS-szekvenciát magában foglaló kifejező vektort építünk fel; ami mellett a fúziós fehéije SEQ ID NO: 3-t vagy SEQ ID NO: 6-t és E. coli külső „A” membránfehéije szignálpeptidet tartalmaz;
b) a kifejező vektort valamely E. coli gazdasejtbe illesztjük be, és ily módon az E. coli gazdasejtet transzformáljuk;
c) a fúziós fehérjét az E. coli gazdasejtben kifejezzük; és
d) az E. coli gazdasejtet hideg ozmotikus sokkpufferrel kezelve a más emlős fehérjéktől és a szignálpeptidtől mentes egérszerű vagy humán ob-fehéijét felszabadítjuk.
21. SEQ ID NO: 4-t tartalmazó humán ob-génszekvencia.
22. Eljárás homogén, biológiailag aktív, rekombináns humán vagy egérszerű elhízottságért felelős fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a humán vagy egérszerű elhízottságért felelős fehéijét tartalmazó ozmotikus folyadékot anioncserélő oszlopkromatográfia, hidrofób kölcsönhatás-kromatográfia és gélszűrés kombinációjának vetjük alá.
23. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű ob-fehérjéhez kapcsolt egy vagy több polietilénglikol- és/vagy polipropilénglikol-konjugátumot tartalmazó készítmény, amelyben a konjugátumban levő polietilénglikol- vagy polipropilénglikolegységek átlagos molekulatömege 15 kDa és 60 kDa közötti érték.
24. Egy vagy több (I-A) általános képletű konjugátumot tartalmazó készítmény, mely képletben
P jelentése az 1-11. igénypontok bármelyikében igényelt humán vagy egérszerű ob-fehérje;
n és n’ összege 300 és 1500 közötti egész szám; a készítményben levő konjugátumokban a polietilénglikol-egységek átlagos molekulatömege 15 kDa és 60 kDa közötti érték; és
R és R’ jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport.
25. A 24. igénypont szerinti készítmény, amelyben n és n’ összege 800-1200, és a készítményben levő konjugátumban a polietilénglikol-egységek átlagos molekulatömege 35-45 kDa.
26. Egy vagy több (I-B) általános képletű vegyületet tartalmazó készítmény, mely képletben
P jelentése valamely, az 1—11. igénypontok bármelyikében igényelt humán vagy egérszerű ob-fehérje;
n értéke 300-1500;
a készítményben levő konjugátumokban a polietilénglikol-egységek átlagos molekulatömege 15 kDa és 60 kDa közötti érték; és
R jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport.
27. A 26. igénypont szerinti kompozíció, amelyben n értéke 850-1000, és a készítményben levő konjugátumokban a polietilénglikol-egységek átlagos molekulatömege 35-45 kDa.
28. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű ob-fehéije vagy a 23-27. igénypontok bármelyike szerinti készítmény mint gyógyászati hatóanyag.
29. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű ob-fehéije vagy a 23-27. igénypontok bármelyike szerinti készítmény mint gyógyászati hatóanyag elhízás, és azzal összefüggő betegségek kezelésére, megelőzésére és ellenőrzésére.
30. Gyógyászati készítmény, amely az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű obfehéijét vagy a 23-27. igénypontok bármelyike szerinti készítményt és kompatibilis gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.
31. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű ob-fehéije vagy a 23-27. igénypontok bármelyike szerinti készítmény felhasználása gyógyászati készítmények előállítására.
32. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű ob-fehéije vagy a 23-27. igénypontok bármelyike szerinti készítmény felhasználása elhízás, és azzal összefüggő betegségek kezelésére, megelőzésére és ellenőrzésére szolgáló gyógyászati készítmények előállítására.
HU 220 093 Β
33. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű ob-fehérje felhasználása ob-fehérjereceptor(ok) azonosítására.
34. A 12. vagy 13. igénypont szerinti kifejező vektor felhasználása az 1 -11. igénypontok bármelyike sze- 5 rinti humán vagy egérszerű ob-fehéije termelésére.
35. A 16-18. igénypontok szerinti DNS-szekvencia felhasználása az 1-11. igénypontok szerinti humán vagy egérszerű ob-fehérje termelésére.
36. Escherichia coli gazdaszervezet felhasználása az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti humán vagy egérszerű ob-fehérje termelésére.
37. Homogén, biológiailag aktív, rekombináns humán vagy egérszerű elhízottságért felelős fehéije, amelyet a 20. vagy 22. igénypont szerinti eljárással állítunk elő.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US43577795A | 1995-05-05 | 1995-05-05 | |
US48462995A | 1995-06-07 | 1995-06-07 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9601120D0 HU9601120D0 (en) | 1996-06-28 |
HUP9601120A2 HUP9601120A2 (en) | 1996-11-28 |
HUP9601120A3 HUP9601120A3 (en) | 1999-07-28 |
HU220093B true HU220093B (hu) | 2001-10-28 |
Family
ID=27030682
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9601120A HU220093B (hu) | 1995-05-05 | 1996-04-29 | Elhízottságért felelős (ob) rekombináns fehérjék |
Country Status (35)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6025325A (hu) |
EP (1) | EP0741187A2 (hu) |
JP (1) | JP3244627B2 (hu) |
KR (1) | KR100219970B1 (hu) |
CN (1) | CN1157290A (hu) |
AR (1) | AR003087A1 (hu) |
AU (1) | AU688210B2 (hu) |
BG (1) | BG62975B1 (hu) |
BR (1) | BR9602166A (hu) |
CA (1) | CA2175298A1 (hu) |
CZ (1) | CZ129796A3 (hu) |
DE (1) | DE741187T1 (hu) |
ES (1) | ES2093593T1 (hu) |
GR (1) | GR960300075T1 (hu) |
HR (1) | HRP960213A2 (hu) |
HU (1) | HU220093B (hu) |
IL (1) | IL118059A0 (hu) |
IS (1) | IS4343A (hu) |
MA (1) | MA23856A1 (hu) |
MY (1) | MY132189A (hu) |
NO (1) | NO961796L (hu) |
NZ (1) | NZ286466A (hu) |
OA (1) | OA10362A (hu) |
PE (1) | PE50897A1 (hu) |
PL (1) | PL186568B1 (hu) |
RO (1) | RO117177B1 (hu) |
RU (1) | RU96109211A (hu) |
SG (1) | SG49337A1 (hu) |
SK (1) | SK56996A3 (hu) |
SV (1) | SV1996000030A (hu) |
TN (1) | TNSN96066A1 (hu) |
TR (1) | TR199600357A2 (hu) |
TW (1) | TW464655B (hu) |
UY (1) | UY24219A1 (hu) |
YU (1) | YU26596A (hu) |
Families Citing this family (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993009229A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | Genetics Institute, Inc. | Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use |
US6479055B1 (en) * | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
US6471956B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-10-29 | The Rockefeller University | Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto |
US6429290B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-08-06 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and derivatives |
US6048837A (en) * | 1994-08-17 | 2000-04-11 | The Rockefeller University | OB polypeptides as modulators of body weight |
US6350730B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-02-26 | The Rockefeller University | OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight |
US6124448A (en) * | 1994-08-17 | 2000-09-26 | The Rockfeller University | Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene |
US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
US20030040467A1 (en) * | 1998-06-15 | 2003-02-27 | Mary Ann Pelleymounter | Ig/ob fusions and uses thereof. |
US6936439B2 (en) * | 1995-11-22 | 2005-08-30 | Amgen Inc. | OB fusion protein compositions and methods |
AU769250B2 (en) * | 1995-12-27 | 2004-01-22 | Genentech Inc. | OB protein derivatives having prolonged half-life |
CA2238307A1 (en) * | 1995-12-27 | 1997-07-10 | Genentech, Inc. | Ob protein derivatives having prolonged half-life |
US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
US7074397B1 (en) | 1996-01-08 | 2006-07-11 | Genentech, Inc. | Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein |
US6541604B1 (en) | 1996-01-08 | 2003-04-01 | Genentech, Inc. | Leptin receptor having a WSX motif |
US20050019325A1 (en) | 1996-01-08 | 2005-01-27 | Carter Paul J. | WSX receptor agonist antibodies |
JP2000505791A (ja) * | 1996-01-25 | 2000-05-16 | イーライ・リリー・アンド・カンパニー | 肥満症タンパク質類似体化合物およびその製剤 |
US7067472B1 (en) * | 1996-06-04 | 2006-06-27 | The Scripps Research Institute | Diagnostic and therapeutic methods related to regulating energy mobilization with OB protein and OB antibodies |
US20060205660A1 (en) * | 1996-06-20 | 2006-09-14 | Sauvage Frederic D | OB protein-immunoglobulin chimeras |
US6001816A (en) * | 1996-06-20 | 1999-12-14 | Merck & Co., Inc. | Gene therapy for leptin deficiency |
US20030036629A1 (en) * | 1997-12-12 | 2003-02-20 | Barry Foster | Novel tgf-beta protein purification methods |
US6656906B1 (en) * | 1998-05-20 | 2003-12-02 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
US6420339B1 (en) * | 1998-10-14 | 2002-07-16 | Amgen Inc. | Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility |
US7169889B1 (en) * | 1999-06-19 | 2007-01-30 | Biocon Limited | Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin |
PE20010288A1 (es) | 1999-07-02 | 2001-03-07 | Hoffmann La Roche | Derivados de eritropoyetina |
CZ299516B6 (cs) | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
US7446183B2 (en) | 2000-06-16 | 2008-11-04 | Asterion Limited | Fusion protein comprising growth hormone and growth hormone receptor |
US20030054015A1 (en) * | 2000-12-25 | 2003-03-20 | Shinichiro Haze | Sympathetic-activating perfume composition |
US6867183B2 (en) * | 2001-02-15 | 2005-03-15 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US7060675B2 (en) * | 2001-02-15 | 2006-06-13 | Nobex Corporation | Methods of treating diabetes mellitus |
EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
US6828305B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6828297B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6713452B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-03-30 | Nobex Corporation | Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
US6835802B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-28 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties |
US7713932B2 (en) * | 2001-06-04 | 2010-05-11 | Biocon Limited | Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof |
US7196059B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-03-27 | Biocon Limited | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US7166571B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-01-23 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US7030082B2 (en) * | 2001-09-07 | 2006-04-18 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith |
US7312192B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
US6770625B2 (en) | 2001-09-07 | 2004-08-03 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
US6913903B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-07-05 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
DK2219031T3 (da) | 2001-10-22 | 2013-06-17 | Amgen Inc | Anvendelse af leptin til behandling af human lipoatrofi og fremgangsmåde til bestemmelse af prædisposition for behandlinngen |
US20040018959A1 (en) * | 2002-05-02 | 2004-01-29 | Randall S. Hickle | System and methods of lipid removal from the body |
ES2282904T3 (es) | 2003-09-12 | 2007-10-16 | Wyeth | Barras solidas de fosfato calcico inyectables para el suministro de proteinas osteogenicas. |
CN101027318B (zh) | 2004-07-19 | 2016-05-25 | 比奥孔有限公司 | 胰岛素-低聚物共轭物,制剂及其用途 |
US8227408B2 (en) * | 2005-09-07 | 2012-07-24 | Neurotez, Inc. | Leptin as an anti-amyloidogenic biologic and methods for delaying the onset and reducing Alzheimer's disease-like pathology |
WO2009050738A2 (en) * | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Biocon Limited | An orally administerable solid pharmaceutical composition and a process thereof |
KR20110028457A (ko) * | 2008-05-21 | 2011-03-18 | 뉴로테즈 인코포레이티드 | 신경섬유 매듭과 연관된 신경변성 장애를 치료하는 방법 |
CA2742600A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Nikolaos Tezapsidis | Leptin compositions and methods for treating progressive cognitive function disorders resulting from accumulation of neurofibrillary tangles and amlyoid beta |
WO2010118384A2 (en) | 2009-04-10 | 2010-10-14 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Amylin agonist compounds for estrogen-deficient mammals |
PT2621519T (pt) | 2010-09-28 | 2017-10-04 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Polipéptido de fusão de leptina-abd com duração de ação melhorada |
US20140018290A1 (en) | 2011-01-26 | 2014-01-16 | Novo Nordisk A/S | Leptin derivatives |
US20230002447A1 (en) * | 2019-12-03 | 2023-01-05 | Rodan & Fields, Llc | Peptides and compositions for inhibiting hair growth |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4199337A (en) * | 1978-10-06 | 1980-04-22 | International Telephone And Telegraph Corporation | Method of fabricating high strength optical preforms |
US4666836A (en) * | 1981-01-02 | 1987-05-19 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
US4609546A (en) * | 1982-06-24 | 1986-09-02 | Japan Chemical Research Co., Ltd. | Long-acting composition |
US4757013A (en) * | 1983-07-25 | 1988-07-12 | The Research Foundation Of State University Of New York | Cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
US4643969A (en) * | 1983-07-25 | 1987-02-17 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
EP0154316B1 (en) * | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
US5643575A (en) * | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
AU3329895A (en) * | 1994-08-17 | 1996-03-07 | Rockefeller University, The | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
US6309853B1 (en) * | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
US5861485A (en) * | 1994-08-23 | 1999-01-19 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides involved in body weight disorders, including obesity |
US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
US5827734A (en) * | 1995-01-20 | 1998-10-27 | University Of Washington | Materials and methods for determining ob protein in a biological sample |
US5574133A (en) * | 1995-01-31 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5569743A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-29 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5559208A (en) * | 1995-01-31 | 1996-09-24 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5554727A (en) * | 1995-01-31 | 1996-09-10 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
EP0725079A1 (en) * | 1995-01-31 | 1996-08-07 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5567678A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-22 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5563244A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-08 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5567803A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-22 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5594104A (en) * | 1995-01-31 | 1997-01-14 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5563245A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-08 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5569744A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-29 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5580954A (en) * | 1995-01-31 | 1996-12-03 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5563243A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-08 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
WO1996031526A1 (en) * | 1995-04-06 | 1996-10-10 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Anti-obesity agents |
WO1996040912A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Amgen Inc. | Ob protein compositions and method |
WO1997020933A2 (en) * | 1995-12-06 | 1997-06-12 | Schering Corporation | MUTATIONAL VARIANTS OF MAMMALIAN Ob GENE PROTEINS |
CA2238307A1 (en) * | 1995-12-27 | 1997-07-10 | Genentech, Inc. | Ob protein derivatives having prolonged half-life |
-
1996
- 1996-04-24 EP EP96106408A patent/EP0741187A2/en not_active Ceased
- 1996-04-24 DE DE0741187T patent/DE741187T1/de active Pending
- 1996-04-24 ES ES96106408T patent/ES2093593T1/es active Pending
- 1996-04-29 CA CA002175298A patent/CA2175298A1/en not_active Abandoned
- 1996-04-29 NZ NZ286466A patent/NZ286466A/en unknown
- 1996-04-29 IL IL11805996A patent/IL118059A0/xx unknown
- 1996-04-29 HU HU9601120A patent/HU220093B/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-04-30 AU AU51978/96A patent/AU688210B2/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1996-04-30 RU RU96109211/04A patent/RU96109211A/ru not_active Application Discontinuation
- 1996-04-30 PL PL96314051A patent/PL186568B1/pl unknown
- 1996-05-02 AR ARP960102430A patent/AR003087A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-02 HR HR08/484,629A patent/HRP960213A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1996-05-02 SG SG1996009690A patent/SG49337A1/en unknown
- 1996-05-02 MA MA24221A patent/MA23856A1/fr unknown
- 1996-05-02 PE PE1996000300A patent/PE50897A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-03 UY UY24219A patent/UY24219A1/es unknown
- 1996-05-03 TN TNTNSN96066A patent/TNSN96066A1/fr unknown
- 1996-05-03 MY MYPI96001683A patent/MY132189A/en unknown
- 1996-05-03 RO RO96-00920A patent/RO117177B1/ro unknown
- 1996-05-03 TR TR96/00357A patent/TR199600357A2/xx unknown
- 1996-05-03 CZ CZ961297A patent/CZ129796A3/cs unknown
- 1996-05-03 OA OA60824D patent/OA10362A/fr unknown
- 1996-05-03 CN CN96104497A patent/CN1157290A/zh active Pending
- 1996-05-03 SK SK569-96A patent/SK56996A3/sk unknown
- 1996-05-03 IS IS4343A patent/IS4343A/is unknown
- 1996-05-03 SV SV1996000030A patent/SV1996000030A/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-03 BG BG100558A patent/BG62975B1/bg unknown
- 1996-05-03 NO NO961796A patent/NO961796L/no not_active Application Discontinuation
- 1996-05-04 KR KR1019960014570A patent/KR100219970B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-05-04 TW TW085105350A patent/TW464655B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-05-06 YU YU26596A patent/YU26596A/sh unknown
- 1996-05-06 BR BR9602166A patent/BR9602166A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-05-07 JP JP11273996A patent/JP3244627B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-15 US US08/648,263 patent/US6025325A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-31 GR GR960300075T patent/GR960300075T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU220093B (hu) | Elhízottságért felelős (ob) rekombináns fehérjék | |
US7576190B2 (en) | FGF-21 fusion proteins | |
EP0954588B1 (en) | Ob fusion protein compositions and methods | |
JP2662390B2 (ja) | インシユリン類似体 | |
US7112659B2 (en) | OB fusion protein compositions and methods | |
JP4063878B2 (ja) | 成長ホルモンおよび血清アルブミンに対する組換え融合タンパク質 | |
AU740344B2 (en) | Novel insulin derivatives having a rapid onset of action | |
JPH05507420A (ja) | 組換えヒト第8因子誘導体 | |
US6025324A (en) | Pegylated obese (ob) protein compositions | |
JPH08317789A (ja) | ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体及びそれを含む薬剤組成物 | |
JP4402296B2 (ja) | 亜鉛結合性が増大された新規なインスリン同族体 | |
US5968779A (en) | Recombinant obese (ob) proteins | |
AU728834B3 (en) | Recombinant proteins | |
AU5358399A (en) | Proteins | |
NZ314957A (en) | A composition comprising a conjugate(s) of peg and/or ppg linked to an obese protein | |
MXPA96001655A (en) | Proteins (ob) obesas recommend | |
JP3534434B2 (ja) | トロンボモジュリン類発現用シグナルペプチド | |
AU754446B2 (en) | Novel NPY family member | |
WO1992016626A1 (en) | Equine epidermal growth factor | |
AU4866700A (en) | OB protein compositions and method | |
JPH04501064A (ja) | 成長ホルモン融合蛋白質 | |
JPH0795893A (ja) | 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするdna、そのdnaからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポリペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |