JP3244627B2 - 組換え肥満（ｏｂ）蛋白 - Google Patents

組換え肥満（ｏｂ）蛋白

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肥満及び関連疾患
の治療、予防及び制御に有用な組換え肥満（ｏｂ）蛋白
（タンパク質）に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】肥満
は、西洋社会で最も普通の栄養障害であると報告されて
いる〔Zhang, Y.ら, Nature 372, 425-432 (1994)〕。
成人アメリカ人１０人中３人以上は、理想体重より少な
くとも２０％重い〔Zhang, Y. ら, 上記文献〕。体重増
加は、II型糖尿病（即ち、非インスリン依存型糖尿
病）、高血圧及び高脂血症のような重要な医学的疾患に
関連するため、公衆保健上の問題である〔Grundy, S.M.
及びBarnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990)
〕。体重は生理学的に調節されており、肥満（及びそ
の関連症状又は疾患）は部分的にこの調節の混乱によ
る、という証拠がある〔Zhang, Y. ら, 上記文献〕。
【０００３】齧歯類において、肥満表現型をもたらす７
つの単一遺伝子突然変異が記載されており、その内５つ
はマウスに存在する。これら７つの齧歯類モデルの中
で、最も集中して研究されているものの１つは、１９５
０年に同定された、マウスにおける肥満（obese)（ｏ
ｂ）遺伝子突然変異である〔Ingalls, A.M. ら, J. Her
ed. 41, 317-318 (1950)〕。このｏｂ遺伝子突然変異に
ついて同型接合のマウスは、ヒトにおける病的肥満に類
似した症候群の一部としての異常な肥満で、II型糖尿病
を発症し、かつ過食症で低代謝性である〔Friedman J.
M. ら, Genomics 11,1054-1062 (1991) 〕。このｏｂ遺
伝子は、マウス第６染色体の基部に位置し、脂肪組織で
発現される蛋白（即ち、ｏｂ蛋白）をコードする〔Zhan
g, Y. ら, 上記文献〕。ｏｂ遺伝子突然変異について同
型接合のマウスは、このｏｂ蛋白をほとんど又は全然産
生せず、したがって体重の調節が障害されて肥満に至
る。
【０００４】このマウス又はヒトｏｂ蛋白は、対応する
ｏｂ遺伝子に欠陥又は突然変異（これらの欠陥又は突然
変異は、体重を調節するｏｂ蛋白の産生及び／又は機能
を防止し、又はそれに干渉する）のある患者に投与する
ことができる。したがってこれらの蛋白は、ヒト及び動
物における肥満、及びその関連疾患及び症状を制御し、
予防又は治療するためのホルモン様物質として使用する
ことができる。
【０００５】このようにマウス又はヒトｏｂ蛋白を使用
するために、これらの蛋白は、頻繁な投薬で、種々の経
路（例えば、腹腔内、静脈内、筋肉内又は皮下）により
注射で投与することができる。注射で頻繁に投与される
ため、マウス又はヒトｏｂ蛋白が、好適には均質になる
まで、精製されること、夾雑蛋白物質を含まないこと、
及び可溶性で生物学的に活性な形で組換えにより発現さ
れることが重要である。注射用薬剤中に存在する夾雑物
が、しばしば毒性副作用又は有害な免疫応答を引き起こ
しうることは、当業者には広く知られている。
【０００６】マウスｏｂ遺伝子配列は、Zhang, Y. らの
上記文献で開示されているが、マウスｏｂ蛋白又はその
ヒト対応物を発現させる方法は報告されておらず、まし
てこれらの蛋白を、均質になるまで精製することができ
る生物学的に活性で可溶性の状態で製造する方法は報告
されていない。したがって、均質で、可溶性で、かつ生
物学的に活性な状態でマウス又はヒトｏｂ蛋白を発現さ
せ製造することが、重要であり、かつ本発明の目的であ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】組換えヒト及びマウスｏ
ｂ蛋白は、生物学的に活性で可溶性の状態で発現させる
ことができ、そして肥満、並びにII型糖尿病、高血圧、
高脂血症などのようなその関連症状及び疾患を治療、予
防又は制御するために、患者に注射するのに適するよう
に均質になるまで精製することができることが発見され
た。
【０００８】本発明により、ヒト及びマウスｏｂ蛋白
は、最初に大腸菌〔Escherichia coli(E. coli)〕用の
新規な発現ベクターを作成することにより、組換えによ
り生物学的に活性な形で製造し、均質になるまで精製す
ることができる。これらの発現ベクターは、プロモータ
ーとＤＮＡ配列を含有し、このＤＮＡ配列は、２つの部
分、大腸菌の外膜プロテインＡのシグナルペプチド（即
ち、ｓＯｍｐＡ）とヒト又はマウスｏｂ蛋白とを含む融
合蛋白をコードする。本発明により、生物学的に活性な
組換え型のマウス及びヒトｏｂ蛋白を製造するための次
の工程では、この発現ベクターを大腸菌宿主に挿入し、
これにより融合蛋白の効率的な発現と細胞周辺腔（即
ち、大腸菌の内膜と外膜の間）中へ移動させ、ここでシ
グナルペプチドをｏｂ蛋白から切り出させてｏｂ蛋白を
可溶性で生物学的に活性な形にさせる。次に、このｏｂ
蛋白を、宿主大腸菌細胞を冷浸透圧ショック処理に曝す
ことにより、可溶性で生物学的に活性な形で無細胞培地
中に効率的に分泌させ、ここでｏｂ蛋白を、陰イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマト
グラフィー及びゲル濾過をこの順序で逐次実施すること
により、均質になるまで精製する。
【０００９】本発明はまた、１）ｓＯｍｐＡシグナルペ
プチドとヒト又はマウスｏｂ蛋白とを含む融合蛋白をコ
ードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクター；２）この
ような発現ベクターによりトランスフェクション又は形
質転換された宿主生物；３）ヒトｏｂ蛋白をコードする
ＤＮＡ；及び４）ｏｂ蛋白のポリエチレングリコール又
はポリプロピレングリコールコンジュゲートに関する。
【００１０】更に本発明は、生物学的に活性で可溶性の
状態で組換えヒト及びマウスｏｂ蛋白を発現する方法、
及び動物及びヒトへの投与に適している精製された均質
な形でこれらの蛋白を製造する方法に関する。
【００１１】本発明のマウスｏｂ蛋白を発現させ製造す
る方法は、Zhang, Y. らの上記文献により報告されたマ
ウスｏｂ遺伝子〔この遺伝子の配列は、本明細書で配列
番号１として同定される７０２塩基対（bp）のヌクレオ
チド配列である〕を利用して達成される。このマウスｏ
ｂ遺伝子配列は、５０１bpのコード配列、即ちヌクレオ
チド３６の開始コドンから開始してヌクレオチド５３７
の終止コドンで終わる読み取り枠（ＯＲＦ）を含み、
３′及び５′末端の両方に非翻訳配列を有する。このＯ
ＲＦは、ヌクレオチド３６〜９８の６３bpのシグナルペ
プチドを含有する。
【００１２】このマウスｏｂ遺伝子配列（配列番号１）
は、アミノ酸配列が長さ１６７アミノ酸で、配列番号２
として同定されるマウスｏｂ蛋白（加えてそのシグナル
ペプチド）をコードする。配列番号２のこの蛋白におい
て、最初の２１アミノ酸はマウスｏｂ蛋白のシグナル配
列を表す。成熟マウスｏｂ蛋白（そのシグナル配列を含
まない）は、アミノ酸２２（Ｖａｌ）からアミノ酸１６
７（Ｃｙｓ）にわたり、配列番号３で表される。
【００１３】本発明のヒトｏｂ蛋白を発現させ製造する
方法は、ヒトｏｂ遺伝子を利用して達成される。この遺
伝子の配列は、本明細書で配列番号４として同定される
６９０bpのヌクレオチド配列である。
【００１４】Zhang, Y. らの上記文献は、ヒトｏｂ遺伝
子をマウスｏｂ遺伝子と高度に相同な遺伝子として報告
しており、１）ヒト脂肪組織から誘導されたクローンの
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、２）ヒトｏ
ｂ遺伝子を有するクローンを同定し、そして３）ヒトｏ
ｂ遺伝子を単離し、配列決定するために利用可能であ
る、マウスｏｂ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使用する従来法を開示している。従来法により配
列決定すると、このヒトｏｂ遺伝子配列は、配列番号４
のヌクレオチド配列を有するものと決定される。
【００１５】マウスｏｂ遺伝子の場合のように、ヒトｏ
ｂ遺伝子は、５０１bpのコード配列、即ちヌクレオチド
３７の開始コドンから開始してヌクレオチド５３８の終
止コドンで終わる読み取り枠（ＯＲＦ）を含み、３′及
び５′末端の両方に非翻訳配列を有する。このＯＲＦ
は、ヌクレオチド３７〜９９に６３bpのシグナル配列を
有する。
【００１６】このヒトｏｂ遺伝子配列（配列番号４）
は、ヒトｏｂ蛋白とそのシグナル配列とをコードし、そ
のアミノ酸配列は長さ１６７アミノ酸であり、配列番号
５として同定される。長さ１６７アミノ酸のこの蛋白の
最初の２１アミノ酸は、シグナル配列を表す。成熟ヒト
ｏｂ蛋白（そのシグナル配列を含まない）は、アミノ酸
２２（Ｖａｌ）からアミノ酸１６７（Ｃｙｓ）にわた
り、配列番号６で表される。
【００１７】Zhang, Y. らの上記文献は、マウス及びヒ
トｏｂ蛋白が８４％同一であることを報告している。Zh
ang, Y. らの上記文献はまた、マウス及びヒト蛋白の変
異体が存在し、このような変異体の１つは、両方の種で
グルタミン４９の欠失を特徴とすることを報告してい
る。マウス脂肪組織及びヒト脂肪組織から誘導したライ
ブラリー中の約３０％のｃＤＮＡクローンは、コドン４
９を失っている〔Zhang,Y. ら, 上記文献〕。
【００１８】下記の用語は、以下に述べる定義を有す
る： 「マウスｏｂ蛋白（ｍｏｂ）」は、その生物学的性質
が、肥満又はその関連症状及び疾患を治療、制御又は予
防することに関連する、配列番号３の蛋白に関する。具
体的には、マウスｏｂ蛋白は、配列番号３のアミノ酸配
列に実質的に相同なアミノ酸配列を有し、更に下記の生
物学的活性を有する、任意の蛋白又はポリペプチドを含
むものと定義される： １）１６〜１８時間絶食させた、体重が少なくとも３０
グラムの成熟肥満ｏｂ／ｏｂマウスに、Haley 及びMcCo
rmick, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957) の方法
を使用して２０μg 以下の用量で脳室内（ＩＣＶ）注射
によりその蛋白又はポリペプチドを投与するとき、その
蛋白又はポリペプチドが： （ａ）５時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して５０％低下させ（食物摂取
を低下させるＥＤ50）；かつ （ｂ）ＩＣＶ注射から２４時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも５０％低
下させる（体重増加を低下させるＥＤ50）； 又は ２）絶食させていない、体重が少なくとも３０グラムの
成熟ｏｂ／ｏｂマウスに、２０μg 以下の全１日用量
で、１週間、１日に２回、明相の開始時点と暗相の３時
間の時点で、その蛋白又はポリペプチドを腹腔内（Ｉ
Ｐ）投与するとき、その蛋白又はポリペプチドが： （ａ）５及び２４時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも２０％低下させ（食物摂
取を低下させるＥＤ20）；かつ （ｂ）最初のＩＰ注射から２４時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも２０
％低下させる（体重増加を低下させるＥＤ20）。
【００１９】本明細書で使用されるマウスｏｂ蛋白とい
う用語は、例えば部位特異的突然変異誘発により、意図
的に改変された蛋白、又は偶発的に突然変異により改変
された蛋白を含む。
【００２０】「ヒトｏｂ蛋白（ｈｏｂ）」は、その生物
学的性質が、肥満又はその関連症状及び疾患を治療、制
御又は予防することに関連する、配列番号６のアミノ酸
配列の蛋白に関する。具体的には、ヒトｏｂ蛋白は、配
列番号６のアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列
を有し、更に下記の生物学的活性を有する、任意の蛋白
又はポリペプチドを含むものと定義される： １）１６〜１８時間絶食させた、体重が少なくとも３０
グラムの成熟肥満ｏｂ／ｏｂマウスに、Haley 及びMcCo
rmick の上記文献の方法を使用して２０μg 以下の用量
でその蛋白又はポリペプチドをＩＣＶ投与するとき、そ
の蛋白又はポリペプチドが： （ａ）５時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して５０％低下させ（食物摂取
を低下させるＥＤ50）；かつ （ｂ）ＩＣＶ注射から２４時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも５０％低
下させる（体重増加を低下させるＥＤ50）； 又は ２）絶食させていない、体重が少なくとも３０グラムの
成熟ｏｂ／ｏｂマウスに、２０μg 以下の全１日用量
で、１週間、１日に２回、明相の開始時点と暗相の３時
間の時点で、蛋白又はポリペプチドをＩＰ投与すると
き、その蛋白又はポリペプチドが： （ａ）５及び２４時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも２０％低下させ（食物摂
取を低下させるＥＤ20）；かつ （ｂ）最初のＩＰ注射から２４時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも２０
％低下させる（体重増加を低下させるＥＤ20）。
【００２１】本明細書で使用されるヒトｏｂ蛋白という
用語は、例えば部位特異的突然変異誘発により、意図的
に改変された蛋白、又は偶発的に突然変異により改変さ
れた蛋白を含む。
【００２２】核酸及びアミノ酸配列の両方について当て
はまりうる「実質的に相同」とは、特定の対象配列、例
えば突然変異配列が、１つ以上の置換、欠失又は付加に
より基準配列とは異なるが、その正味の効果は基準配列
と対象配列との間の不都合な機能的相違点を引き起こさ
ないことを意味する。本発明の目的のためには、９５％
以上の相同性、同等の生物学的性質、及び同等の発現特
性を有する配列は、実質的に相同であると考えられる。
相同性の決定の目的のためには、成熟配列の端を切り取
った型（truncation）は無視すべきである。相同性の程
度が低く、同等な生物活性、及び同等の発現特性を有す
る配列は、実質的に等価物と考えられる。一般に、相同
なＤＮＡ配列は、中程度のストリンジェンシー（string
ency）の標準的ハイブリダイゼーション条件下で交差ハ
イブリダイゼーションにより同定することができる。
【００２３】マウス又はヒトｏｂ蛋白の「断片（フラグ
メント）」は、マウス又はヒトｏｂ蛋白の部分又は断片
のアミノ酸配列を有する任意の蛋白又はポリペプチドを
意味し、これは各々マウス又はヒトｏｂ蛋白の生物学的
活性を有する。断片は、マウス又はヒトｏｂ蛋白の分解
により製造されるか又は当該分野でごく普通の方法によ
り化学合成により製造される蛋白又はポリペプチドを含
む。
【００２４】ｏｂ蛋白又はその断片は、ヒトを含む哺乳
動物へのこの蛋白又は断片の投与が哺乳動物において食
物摂取を低下させ、かつ体重増加の速度を低下させる場
合、「生物学的に活性」である。ヒト又はマウスｏｂ蛋
白のこのような生物学的活性の測定は、１つ以上の種の
哺乳動物、特にｏｂ／ｏｂマウスで、このような目的の
ために利用される従来法の周知の試験により行うことが
できる。このような生物学的活性を明らかにするために
使用することができるこれらの試験の幾つかを、本明細
書に記載する。本明細書に記載されるようにｏｂ／ｏｂ
マウスにおけるＩＣＶ試験により生物学的活性を測定す
る場合、ヒト又はマウスｏｂ蛋白は、好適には、２０μ
g 以下の、食物摂取を低下させるＥＤ50と、２０μg 以
下の、体重増加を低下させるＥＤ50とを有する。あるい
は、本明細書に記載されるようにｏｂ／ｏｂマウスにお
けるＩＰ試験によりヒト又はマウスｏｂ蛋白の生物学的
活性を測定する場合、ヒト又はマウスｏｂ蛋白は、好適
には、２０μg 以下の、食物摂取を低下させるＥＤ
20と、２０μg 以下の、体重増加を低下させるＥＤ20と
を有する。一般に、上記生物学的活性を示す断片が好ま
しい。
【００２５】「レプリコン」は、インビボ（生体内）で
ＤＮＡ複製の自律性単位として機能する、即ちそれ自体
の制御下で複製可能なあらゆる遺伝要素（例えば、プラ
スミド、染色体、ウイルス）である。
【００２６】「発現ベクター」は、結合したセグメント
の複製が行われるように別のＤＮＡセグメントを結合さ
せてもよい、プラスミド、ファージ又はコスミドのよう
なレプリコンである。これは、（１）遺伝子発現におい
て調節的役割を有する遺伝要素又は要素類（例えば、プ
ロモーター又はエンハンサー）、（２）ｍＲＮＡに転写
されて蛋白に翻訳される構造又はコード配列、及び
（３）適切な転写開始及び終結配列の構築物（アセンブ
リー）を含む転写単位よりなる。
【００２７】「クローン」は、元の長さのＤＮＡから誘
導され、しばしばプラスミドが関与する遺伝子工学技術
を使用して細菌又はウイルスにより産生されるＤＮＡ分
子の群である。
【００２８】「シグナル配列」は、発現されるべき蛋白
のコード配列の開始点（５′末端）に位置する核酸配列
である。このシグナル配列は、新規に合成される蛋白の
Ｎ末端にシグナルペプチドをコードする。このシグナル
ペプチドは、宿主細胞に、この蛋白を宿主細胞膜に向け
て又はこれを通って移動させるよう指示し、そしてこの
シグナルペプチドは、通常このような移動中に切り出さ
れる。
【００２９】「開始コドン」は、蛋白のコード配列中の
通常５′末端に位置する、通常ＡＴＧであるコドンであ
り、蛋白配列の最初のアミノ酸を示す。
【００３０】「終止コドン」は、通常蛋白のコード配列
の３′末端に位置するナンセンスコドンであり、成長す
るポリペプチド鎖の終わりを示す。
【００３１】「読み取り枠（ＯＲＦ）」は、適切な調節
配列の制御下に置かれると、インビトロ（試験管内）又
はインビボ（生体内）で細胞中でアミノ酸配列をコード
する二本鎖ＤＮＡ中の、コドントリプレットの線状配列
である。ＯＲＦの境界は、５′末端の開始コドンと３′
末端の終止コドンとにより決定される。これは「コード
配列」とも呼ばれる。
【００３２】「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡ
ポリメラーゼと結合し、下流（３′方向）の１つ以上の
構造遺伝子の読み取り枠の転写を開始させることのでき
るＤＮＡ調節領域である。このプロモーター配列は、通
常シグナル配列又は読み取り枠の５′末端に位置し、バ
ックグラウンドを上回る検出可能なレベルでポリペプチ
ドの転写を開始するのに必要な最低数の塩基又は要素を
含むように５′方向に上流に伸びている。
【００３３】コード配列又はＯＲＦは、ＲＮＡポリメラ
ーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写する場合、プロモー
ター配列の「制御下」にある。
【００３４】Ａを含む組成物（ここで、Ａは、単一のポ
リペプチドである）は、例えばポリアクリルアミドゲル
の染色のような従来法により検出するとき、検出可能な
量の夾雑蛋白又は他の内因性物質がない場合、Ａについ
て「均質」である。本発明の目的のためには、均質とい
う用語は、組成物の少なくとも９５重量％が単一の蛋白
又はポリペプチドである場合、その単一の蛋白又はポリ
ペプチドを含む組成物のことをいう。
【００３５】下記の工程は、ヒト及びマウスｏｂ蛋白
を、生物学的に活性で可溶性の無細胞状態で、他の哺乳
動物の蛋白を含まず、ここからｏｂ蛋白を均質になるま
で精製することができるように、組換えにより発現させ
る方法を略述している。これらの工程は、実施例で詳細
に例示する。
【００３６】１）マウス及びヒトｏｂ遺伝子の入手：
マウスｏｂ蛋白とその天然のシグナル配列とをコードす
るｃＤＮＡ（配列番号１）は、Zhang, Y. らの上記文献
に発表されている。このマウスｃＤＮＡは、従来法によ
り、単離され、オリゴデオキシヌクレオチドＤＮＡプラ
イマーを使用してＰＣＲ法により増幅された。これらの
ＤＮＡプライマーとこれらを得るための方法は、Zhang,
Y. らの上記文献に記載されている。
【００３７】ヒトｏｂ蛋白とその天然のシグナル配列と
をコードするｃＤＮＡ（配列番号４）は、マウスｏｂ遺
伝子を得るためにZhang, Y. らの上記文献で使用された
ものと同じオリゴデオキシヌクレオチドＤＮＡプライマ
ーを使用して得られる。従来法により、このヒトｃＤＮ
Ａは、ヒト脂肪細胞組織由来ＲＮＡから作成されたラム
ダファージｃＤＮＡライブラリーから単離された。
【００３８】ヒト又はマウスｏｂのｃＤＮＡは、ｃＤＮ
Ａライブラリーから得ることができるだけでなく、他の
従来法、例えば化学合成により、又は目的の細胞から精
製したゲノムＤＮＡ若しくはその断片のクローニングに
より得ることもできる。これらの手順は、Sambrookらの
「ＤＮＡクローニング：実際的アプローチ（DNA Clonin
g: A Practical Approach)」第Ｉ及び第II巻、D.N. Glo
ver 編、1985年、MRLPress, Ltd. 刊、オックスフォー
ド、英国; Benton及びDavis, Science 196, 180-182 (1
977); 及びGrunstein 及びHogness, Proc. Natl. Acad.
Sci. 72, 3961-3965 (1975)に記載されている。ｃＤＮ
Ａライブラリーからヒト又はマウスｏｂのｃＤＮＡを得
るためには、マウスｏｂ遺伝子を含有するマウス脂肪細
胞から単離したポリアデニル化ＲＮＡの逆転写により調
製したプライマーを使用して、Benton及びDavis の上記
文献、又はGrunstein 及びHogness の上記文献の方法に
より、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション法によりこ
のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。プライ
マーにハイブリダイズするクローンを、制限エンドヌク
レアーゼ切断、アガロースゲル電気泳動、及び電気泳動
したプライマーを含む更なるハイブリダイゼーション実
験（「サザンブロット」）により解析する。マウスｃＤ
ＮＡプローブにハイブリダイズした幾つかのクローンの
単離後、１つのクローンのハイブリダイズするセグメン
トをサブクローニングして、従来法により配列決定す
る。
【００３９】ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、コード領
域に加えて調節及びイントロンＤＮＡ領域を含有する可
能性がある。ｃＤＮＡ由来のクローンはイントロン配列
を含有しない。ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クロー
ニングでは、ＤＮＡ断片が生成され、この内の幾つかは
目的の遺伝子をコードする。このＤＮＡを種々の制限酵
素を使用して特異的部位で切断することができる。ある
いは、マンガンの存在下でＤＮＡｓｅを使用してＤＮＡ
を断片化するか、又はＤＮＡを、例えば音波処理のよう
に物理的に剪断することができる。次にこの線状ＤＮＡ
断片を、標準的な方法（アガロース及びポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及びカラムクロマトグラフィーを含む
がこれらに限定されない）により、サイズに応じて分離
することができる。
【００４０】供給源が何であれ、ヒト又はマウスｏｂ遺
伝子は、当該分野で公知の方法により遺伝子を増やすた
めに適切なベクターに分子クローニングすることができ
る。任意の市販のベクターを使用することができる。例
えば、マウスｃＤＮＡは、ｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入
することができ、ヒトｃＤＮＡは、ｐBluescriptＳＫ-
ベクターに挿入することができる。細菌宿主での使用に
適切なベクターは、Pouwels らの「クローニングベクタ
ー：実験室マニュアル（Cloning Vectors: A Laborator
y Manual）」、1985年、Elsevier刊、ニューヨークに記
載されている。代表的なものであるが非限定的な例とし
て、細菌での使用に有用なクローニングベクターは、周
知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７
０１７）から誘導された市販のプラスミドから誘導され
た細菌由来の複製起点と選択マーカーとを含むことがで
きる。このような市販のベクターとしては、例えばｐＫ
Ｋ２２３−３〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ
（Pharmacia Fine Chemicals）、ウプサラ、スウェーデ
ン〕及びｐＧＥＭ１〔プロメガ・バイオテク（Promega
Biotec）、マディソン、ウィスコンシン州、米国〕が挙
げられる。
【００４１】これらの市販のベクターに挿入されたヒト
又はマウスｏｂ遺伝子のヌクレオチド配列は、標準的ヌ
クレオチド配列決定法による当該分野で公知の方法によ
り確認することができる。
【００４２】ヒト又はマウス以外の種のｏｂ蛋白をコー
ドする他の核酸を、本発明で使用することができる。し
たがって、ヒト及びマウスｏｂ遺伝子に関して特異的Ｄ
ＮＡがクローニングされ配列決定されたが、ｏｂ蛋白の
核酸供給源として任意の動物の脂肪細胞が潜在的には使
用可能である。
【００４３】２）ヒト及びマウスｏｂ蛋白のための発現
ベクターの構築： 上記方法によりクローニングしたヒ
ト又はマウスｏｂ遺伝子を、各々ヒト及びマウスｏｂ蛋
白のための発現ベクターを構築するために使用する。
【００４４】トランスフェクションした又は形質転換し
た大腸菌宿主細胞による生物学的に活性なヒト及びマウ
スｏｂ蛋白の発現のために、及び細胞周辺腔へのｏｂ蛋
白の分泌のために、新規な発現ベクターを利用すること
ができる。この発現ベクターは、プロモーターと、融合
蛋白をコードするＤＮＡ配列とを含む。この融合蛋白は
２つの部分よりなる：第一部分は、大腸菌の外膜プロテ
インＡのシグナルペプチド（ｓＯｍｐＡ）であり、融合
蛋白の第二部分は、ヒト又はマウスｏｂ蛋白（これら自
体の天然シグナル配列を差し引いた）である。この融合
蛋白をコードするＤＮＡ配列も２つの部分よりなる：ｓ
ＯｍｐＡペプチドをコードする第一部分と、マウス又は
ヒトｏｂ蛋白（これらの天然のシグナル配列を差し引い
た）をコードする第二部分である。ｓＯｍｐＡペプチド
をコードするＤＮＡ配列の第一部分は、De Sutter, K.
ら, Gene 141, 163-170 (1994)に記載されたシグナル配
列であり、配列番号７のヌクレオチド配列を有する。こ
の２つの部分よりなるＤＮＡ配列の第二部分は、マウス
又はヒトｏｂ蛋白をコードし、各々配列番号１又は配列
番号４から、各天然シグナル配列をコードするヌクレオ
チド配列の部分を差し引いたヌクレオチド配列を有す
る。
【００４５】配列番号７のｓＯｍｐＡシグナル配列によ
りコードされるシグナルペプチドは、De Sutter, K. ら
の上記文献に報告されるように、配列番号８のアミノ酸
配列を有する。
【００４６】本発明の新規な発現ベクターは、大腸菌宿
主細胞での組換え蛋白の発現に適切な従来の発現ベクタ
ー中に、プロモーターと、融合蛋白をコードするＤＮＡ
配列とを挿入することにより達成される。
【００４７】本発明によりこの新規な発現ベクターを構
築する際、大腸菌宿主細胞中でのｓＯｍｐＡペプチドと
ｏｂ蛋白とを含む融合蛋白の転写を制御することが可能
である限り、任意のプロモーターを使用することができ
る。ｓＯｍｐＡがシグナルペプチドとして使用される場
合、ｌａｃ−プロモーター−オペレーター（ＰＯlac)と
リポ蛋白プロモーター（Ｐlpp)の両方を使用することが
好ましい。大腸菌におけるこのような発現のために有用
な他のプロモーターとしては、Studier ら, J.Mol. Bio
l. 189, 113-130 (1986) により記載されたＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼプロモーター、Lauer, J. Mol. Appl. Gen
et. 1, 139-147 (1981) に記載され、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（American Type Cultur
e Collection）（ＡＴＣＣ）からＡＴＣＣ３７１２１と
して利用可能なｌａｃｚプロモーター、Maniatisの「分
子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor 1982
に記載され、ＡＴＣＣ３７１３８として利用可能なｔ
ａｃプロモーター、アルカリホスファターゼ（ｐｈｏ
Ａ）プロモーター、及びGoeddel ら, Nucleic Acids Re
search 8, 4057-4075(1980)に記載されたｔｒｐプロモ
ーターが挙げられる。他のプロモーターも発見され、大
腸菌で利用されている。これらのヌクレオチド配列に関
する詳細は公表されており〔Siebenlistら, Cell 20, 2
69-281 (1980) 〕、当業者は本発明の発現ベクター中に
機能的にこれらを連結することが可能である。
【００４８】具体的には、発現ベクターは： ａ）プロモーター配列、及びｂ）配列番号３のマウスｏ
ｂ蛋白又は配列番号６のヒトｏｂ蛋白と、大腸菌の外膜
プロテインＡのシグナルペプチドとを含む融合蛋白をコ
ードするＤＮＡ配列、を含む。
【００４９】次に、この新規な発現ベクターを構築する
方法を記載する。この方法は、実施例で更に詳述し、図
２及び図３に示す。最初に、ヒト又はマウスｏｂ遺伝子
のコード配列（その天然シグナル配列を差し引いたも
の）を、プラスミドｐＴ１０ｓＯｍｐＡｒＰＤＩのよう
な、ｓＯｍｐＡシグナル配列を有するプラスミド中に組
み込む。このｐＴ１０ｓＯｍｐＡｒＰＤＩプラスミド、
及びその構築と調製は、De Sutter, K. らの上記文献に
記載されている。このプラスミド中に組み込まれると、
ヒト又はマウスｏｂ遺伝子は、このｓＯｍｐＡ遺伝子と
融合して、このプラスミド中に「ハイブリッド遺伝子配
列」を生成する。このｓＯｍｐＡ遺伝子は、ｏｂ遺伝子
コード配列の５′領域の上流に存在しなければならな
い。そして、上に列挙したプロモーター、好適にはリポ
蛋白プロモーター（Ｐlpp)及びｌａｃ−プロモーター−
オペレーター（ＰＯlac)を、ハイブリッド遺伝子配列を
有するこのプラスミド中に組み込んで、本発明の発現ベ
クターを生成する。これらの発現ベクターの２つの実施
態様を、ｐＬＰＰｓＯｍｐＡ−ｍｏｂ及びｐＬＰＰｓＯ
ｍｐＡ−ｈｏｂ１として同定し、各々図２及び図３に示
す。
【００５０】このようなプラスミドを構築するための当
該分野で公知の任意の方法又は手順を使用することがで
きる。更に、ｓＯｍｐＡ配列とｏｂ遺伝子配列を融合さ
せ、適切なプラスミド中にその遺伝子配列を組み込み、
そしてプロモーターを組み込んで、本発明の発現ベクタ
ーに到達する順序は、決定的に重要ではない。例えば、
ｓＯｍｐＡ遺伝子配列を最初にマウス又はヒトｏｂ遺伝
子配列に直接融合させてハイブリッド遺伝子配列を生成
し、次にこのハイブリッド配列を、前もって適切なプロ
モーターを組み込んだプラスミド中に挿入することがで
きる。しかし、ｓＯｍｐＡ遺伝子配列がマウス又はヒト
ｏｂ遺伝子配列の５′末端の上流に位置することは、必
要である。
【００５１】このような新規な発現ベクターを使用する
ことにより、特にｓＯｍｐＡをコードするシグナル配列
を使用することにより、マウス又はヒトｏｂ蛋白が細胞
周辺腔に移動し、そこでシグナルペプチドが適切に切断
されて、完全な（インタクトな）ヒト又はマウスｏｂ蛋
白が、可溶性で生物学的に活性な形で生成しうることが
発見された。一旦この細胞周辺腔に入ると、ｏｂ蛋白
は、宿主細胞を冷浸透圧ショックに曝すことにより、他
の哺乳動物蛋白を含まない無細胞環境中に効率的に分泌
されて、ここでｏｂ蛋白は、生物学的に活性な形で均質
になるまで精製することができる。
【００５２】３）形質転換した大腸菌細胞でのヒト又は
マウスｏｂ蛋白の発現： 次に、上記手順により構築した発現ベクターを宿主大腸
菌細胞中に挿入して、大腸菌細胞を形質転換した。英国
特許公報第２，０５５，３８２−Ａに記載される大腸菌
Ｋ−１２の２９４株（ＡＴＣＣ番号３１４４６）のよう
な、任意の株の大腸菌を使用することができる。本発明
に有用な他の菌株としては、大腸菌ＭＣ１０６１〔Casa
daban 及びCohen, J. Mol. Biol. 138, 179-207 (198
0)〕、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１
５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７３
２５）、又はその多くが寄託され、公認の微生物寄託機
関から利用可能な他の株を含む。
【００５３】形質転換した大腸菌細胞を適切な細胞密度
まで増殖させて、標準的方法により培養する。形質転換
した大腸菌宿主をこのように増殖させ、培養する際に、
本発明の発現ベクターは、マウス又はヒトｏｂ蛋白を効
率的かつ有効に発現させ、これら同蛋白を宿主大腸菌細
胞の細胞周辺腔中に可溶性で生物学的に活性な形で移動
させる。ｓＯｍｐＡシグナルペプチド（即ち、融合蛋白
の第一部分）は、融合蛋白の細胞周辺腔への移動中に切
断されて、他の哺乳動物蛋白又はポリペプチドを含まな
い生物学的に活性なｏｂ蛋白が生成される。具体的に
は、他の哺乳動物蛋白を含まない生物学的に活性な組換
えヒト又はマウスｏｂ蛋白を製造する方法は、以下の工
程： ａ）プロモーター配列、及び融合蛋白（この融合蛋白
は、配列番号３又は配列番号６の蛋白と、大腸菌の外膜
プロテインＡのシグナルペプチドとを含む）をコードす
るＤＮＡ配列を有する発現ベクターを構築し； ｂ）この発現ベクターを大腸菌宿主中に挿入して大腸菌
宿主細胞を形質転換し； ｃ）大腸菌宿主細胞で融合蛋白を発現させ；そしてｄ）
この大腸菌宿主細胞を冷浸透圧ショック緩衝液で処理し
て、他の哺乳動物蛋白を含まず、かつシグナルペプチド
を含まない、マウス又はヒトｏｂ蛋白を遊離させる、工
程を含む。
【００５４】次に、形質転換した大腸菌細胞の細胞周辺
腔に可溶性で生物学的に活性な状態で組換えにより製造
されたヒト又はマウスｏｂ蛋白を、均質になるまで精製
する。
【００５５】本明細書に記載される手順により細胞の細
胞周辺腔に移動した組換えヒト及びマウスｏｂ蛋白は、
当該分野で公知の、Koshland, D.及びBotstein, D., Ce
ll 20, 749-760 (1980) に記載された方法により、宿主
細胞を冷浸透圧ショックに曝すことにより、細胞の外に
効率的に分泌させることができる。冷浸透圧ショックの
使用により、大腸菌からｏｂ蛋白が他の哺乳動物蛋白又
はポリペプチドを含まない生物学的に活性な状態で遊離
する。
【００５６】上記手順により、形質転換した大腸菌細胞
の冷浸透圧ショックにより浸透圧液中に置かれたヒト又
はマウスｏｂ蛋白は、生物学的に活性であり、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラム
クロマトグラフィー及びゲル濾過の組合せを使用して、
均質になるまで精製することができる。陰イオン交換及
び疎水性相互作用クロマトグラフィーは、任意の順に実
施することができるが、どちらも必ずゲル濾過の前に使
用しなければならない。
【００５７】陰イオン交換工程は、従来法により実施す
ることができる。陰イオン交換クロマトグラフィーに好
ましいカラムは、Ｑセファロース・ファスト・フロー
（Q Sepharose Fast Flow)カラムである。適切な陰イオ
ン交換クロマトグラフィー媒体としては、ジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）又はジエチル−（２−ヒドロキシ
プロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）基を含む種々の不溶
性マトリックスが挙げられる。これらのマトリックス
は、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セル
ロース、又は蛋白精製に通常使用される他のタイプのも
のであってよい。陰イオン交換クロマトグラフィーのた
めに特に有用な物質は、ＤＥＡＥ−セファセル〔DEAE-S
ephacel 、ファルマシア（Pharmacia)、ウプサラ、スウ
ェーデン〕である。ＤＥＡＥ基を含む媒体を使用する場
合、マウス又はヒトｏｂ蛋白を含有する抽出物は、弱塩
基性ｐＨ、例えばpH８．１で適用する。結合したマウス
又はヒトｏｂ蛋白は、トリス−ＨＣｌのような適切な緩
衝液中の塩勾配の適用により、より高度に精製された形
で溶出することができる。一般に、この勾配の特性は、
少量の組換え蛋白を含む予備溶出実験により決定するこ
とができる。
【００５８】陰イオン交換クロマトグラフィーの使用に
より得られたヒト又はマウスｏｂ蛋白を含有する物質
を、陰イオン交換クロマトグラフィーを精製の第一工程
として使用する場合、次に疎水性相互作用クロマトグラ
フィーにかける。疎水性相互作用クロマトグラフィー
は、疎水性基を有する荷電していないカラム床物質との
疎水性相互作用の異なる強度に基づいて物質を分離する
分離技術である。典型的には、この疎水性相互作用カラ
ムは、最初に、疎水性結合に適した条件、例えば高イオ
ン強度の条件下で平衡化する。試料を溶出するために下
降する塩勾配を使用することができる。
【００５９】任意の疎水性相互作用カラムを使用するこ
とができる。好適な疎水性カラムは、フェニルセファロ
ースであるが、ブチルセファロースも利用することがで
きる。本発明にしたがうと、陰イオンカラムから溶出さ
れた組換えマウス又はヒトｏｂ蛋白を含有する物質を、
フェニルセファロースのような比較的強疎水性のゲルを
含有するカラムにかける。疎水性ゲルとの疎水性相互作
用を促進するために、例えば、０．４M 以上の硫酸アン
モニウム（０．４M が好適である）を含有する溶媒を使
用する。即ち、カラム及び試料を、５０mMトリス緩衝液
中０．４M 硫酸アンモニウムに調整し、試料をカラムに
適用する。このカラムを、０．４M 硫酸アンモニウム緩
衝液で洗浄する。次にｏｂ蛋白を、例えば、下降する塩
勾配、エチレン若しくはプロピレングリコール、又は尿
素のような疎水性相互作用を減衰させる溶媒で溶出す
る。好適な実施態様は、トリス緩衝液と、２０％エチレ
ングリコールを含有するトリス緩衝液とでカラムを連続
的に洗浄することを含む。続いて、ｏｂ蛋白を、トリス
緩衝液中の低下する硫酸アンモニウム濃度と増加するエ
チレングリコール濃度の勾配でカラムから溶出する。任
意の順序の、陰イオン交換クロマトグラフィーと疎水性
相互作用カラムクロマトグラフィーとの集合的かつ逐次
の使用により、通常操作で概算９０％の純度のヒト又は
マウスｏｂ蛋白が得られる。
【００６０】上に略述した陰イオン交換クロマトグラフ
ィー及び疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー工程
に続いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うが、これ
は従来のあらゆるゲル濾過手順により行うことができ
る。疎水性相互作用カラム、又は陰イオン交換カラム
（どちらのカラムを最後に使用しても）から溶出された
ｏｂ蛋白を、カットオフ分子量１０，０００の膜〔アミ
コン−ＹＭ１０（AMICON-YM10)膜〕を使用することによ
り、濃縮透析して小容量にすることができる。次に、こ
の濃縮した物質を、Ｇ１００−セファデックス〔ファル
マシア（Pharmacia)、ウプサラ、スウェーデン〕のよう
なゲル濾過媒体を含有するカラムにかけることができ
る。次にｏｂ蛋白を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用する標準
的技術により、分子量に基づいて他の夾雑物から分離す
ることができる。
【００６１】陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性
相互作用カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過の集合
的かつ逐次の使用により、通常操作で９５％の純度のヒ
ト又はマウスｏｂ蛋白が得られる。
【００６２】この精製マウス又はヒトｏｂ蛋白のＮ−末
端アミノ酸配列決定は、例えば、Laemli, U.K., Nature
227, 680-685 (1970)の方法による電気的トランスファ
ー（electrotransfer)、又はMatsudaira, P., J. Biol.
Chem. 262, 10035-10038 (1987)により記載された手順
などの、当該分野で公知の方法により実施することがで
きる。内部配列決定も、当該分野で公知の方法により行
うことができる。例えば、エンドプロテイナーゼのリシ
ンＣ（Lysine C）によるＭバンド（ニトロセルロース
上）の消化によりペプチド断片を生成させ、ＨＰＬＣ系
により分離することができる。
【００６３】本発明の精製したヒト及びマウスｏｂ蛋白
の生物学的活性は、このｏｂ蛋白をヒト患者又はマウス
に頻繁に注射により投与すると、注射をしない、即ち対
照群の被験体に比較して、食物摂取が低下し、体重増加
速度が低下するというものである。
【００６４】本発明により得られる精製されたヒト及び
マウスｏｂ蛋白又はその断片の生物学的活性は、日常的
方法、例えば、実施例１３及び１６に詳述されるよう
な、Haley, T.J. らの上記文献の手順による、ｏｂ／ｏ
ｂマウスにおける繰り返し又は単一の脳室内（ＩＣＶ）
注射により、試験することができる。このＩＣＶ試験に
基づき、食物摂取を低下させるＥＤ50と、体重増加を低
下させるＥＤ50とを測定することができる。更に、精製
されたヒト及びマウスｏｂ蛋白又はその断片の生物学的
活性は、実施例１５に詳述されるように、ｏｂ／ｏｂマ
ウスにおける繰り返しＩＰ注射により測定することがで
きる。ＩＰ試験に基づき、食物摂取を低下させるＥＤ20
と、体重増加を低下させるＥＤ20とを測定することがで
きる。
【００６５】本発明により得られる精製されたヒト及び
マウスｏｂ蛋白又はその断片の生物学的活性はまた、ヒ
トで、当該分野で公知の方法により、例えば、Muurahai
nen,N.E. ら, Am. J. Physiol. 260, 672-680 (1991）
の方法により、また実施例１４及び１７に詳述するよう
に、生理食塩水のＩＶ投与対照と比較した、肥満ヒト被
験者へのｏｂ蛋白のＩＶ投与後の試験食摂取の低下を測
定することにより、測定することができる。あるいは、
本発明の精製されたマウス及びヒトｏｂ蛋白の体重増加
速度を低下させる能力（例えば、体重減少を誘導する）
は、実施例１８に詳述するように、Drent, M.L. ら, In
t. J. Obesity 19, 221-226 (1995)の方法により、肥満
ヒト被験者への繰り返しＩＶ投与により測定することが
できる。
【００６６】本発明により精製する場合、本発明のマウ
ス及びヒトｏｂ蛋白は、下記の生物学的活性を有する： １）１６〜１８時間絶食させた、体重が少なくとも３０
グラムの成熟肥満ｏｂ／ｏｂマウスに、Haley 及びMcCo
rmick の上記文献の方法を使用して２０μg 以下の用量
で脳室内（ＩＣＶ）注射によりこれらを投与する場合、
その蛋白又はポリペプチドが： （ａ）５時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注
射した対照マウスに比較して５０％低下させ（食物摂取
を低下させるＥＤ50）；かつ （ｂ）ＩＣＶ注射から２４時間の間の体重増加を、賦形
剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも５０％低
下させる（体重増加を低下させるＥＤ50）； そして ２）絶食させていない、体重が少なくとも３０グラムの
成熟ｏｂ／ｏｂマウスに、２０μg 以下の全１日用量
で、１週間、１日に２回、明相の開始時点と暗相の３時
間の時点とにこれらを腹腔内（ＩＰ）投与する場合、そ
の蛋白又はポリペプチドが： （ａ）５及び２４時間食物摂取を、賦形剤を注射した対
照マウスに比較して少なくとも２０％低下させ（食物摂
取を低下させるＥＤ20）；かつ （ｂ）最初のＩＰ注射から２４時間の間の体重増加を、
賦形剤を注射した対照マウスに比較して少なくとも２０
％低下させる（体重増加を低下させるＥＤ20）。
【００６７】更に、この体重と食物摂取の低下は、２０
μg 未満の用量でさえ起こり、特にこれらの蛋白が均質
になるまで精製されている場合には、１μg 以下のＩＣ
Ｖ投与用量レベルでさえ起こる。
【００６８】ヒト及び／又はマウスｏｂ蛋白の生物学的
活性を測定するための、上記の、実施例で詳述する生物
学的検定は、これらの蛋白の断片（これらの断片が、ｏ
ｂ蛋白の分解、化学合成、ｏｂ蛋白の部分ＤＮＡ配列の
組換え蛋白の発現、又は当業者に公知の任意の他の方法
のいずれにより製造されるものであるかに関わらない）
の生物学的活性を測定するために使用することができ
る。
【００６９】本発明の別の実施態様によれば、本発明の
マウス及びヒトｏｂ蛋白は、ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコールホモポリマーと結合させることができ
る。これらのポリマーは、非置換であるか、又はその一
方の端の１つのヒドロキシ基のエーテル化により低級ア
ルキル基により置換されていてもよい。これらのコンジ
ュゲートは、安定な形のｏｂ蛋白を提供し、これらの蛋
白の半減期を改善する。更に、ポリエチレングリコール
又はポリプロピレングリコールホモポリマーから形成さ
れるこれらのコンジュゲートの使用は、体内におけるｏ
ｂ蛋白の活性の半減期を増大させるための手段を提供す
る。更に、これらのコンジュゲートは、体内における治
療用ｏｂ蛋白の安定性及び循環時間を増加させ、また一
方ではｏｂ蛋白の免疫原性を低下させるというような、
更なる利点を提供することが見い出された。これらのＰ
ＥＧ化ｏｂ蛋白はまた、ヒト体内に容易に吸収されて、
血液系における取り込みの増加を提供することができ
る。
【００７０】ｏｂ蛋白に結合される好適なポリエチレン
又はポリプロピレングリコールホモポリマーは、約１５
〜６０kDa の分子量を有し、ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコール分子によりモノ−又はポリ−ＰＥＧ化
された蛋白を製造する。好適な場合には、ｏｂ蛋白は、
ポリエチレン又はポリプロピレングリコール単位により
モノ−又はジ−ＰＥＧ化されたコンジュゲートを形成す
るが、このコンジュゲート中のこれらの単位は、１５〜
６０kDa 、最も好適には３５〜４５kDa の総分子量を有
する。一般に、ポリエチレン及びポリプロピレングリコ
ール出発物質は、異なる分子量を有する異なるホモポリ
マーの混合物として市販されているため、このコンジュ
ゲートは、ポリエチレン及びポリプロピレングリコール
コンジュゲートの混合物（組成物）として製造される。
上述の分子量は、このように製造されるｏｂコンジュゲ
ートの混合物の平均分子量である。これらの混合物は、
望ましい場合には、ＨＰＬＣを含むカラムクロマトグラ
フィーのような従来法により、個々のコンジュゲートに
分離することができる。しかし、治療のためには、一般
にこのコンジュゲートは混合物として使用される。
【００７１】ポリエチレングリコール又はポリプロピレ
ングリコールポリマー〔ＰＥＧ〕は、任意の従来法によ
り、蛋白の遊離のＮ−末端アミノ酸を介してｏｂ蛋白に
結合してコンジュゲートを形成することができる。ｏｂ
蛋白とのコンジュゲートを形成するためのポリエチレン
又はポリプロピレングリコールの結合方法は、利用可能
な数多くの公知方法の任意の方法であってよい。ポリエ
チレン又はポリプロピレングリコールは、蛋白のＮ−末
端アミノ酸を介して、更にはまたｏｂ蛋白上の種々のリ
シン残基を介して共有結合させてもよい。
【００７２】更に、ポリエチレン又はポリプロピレング
リコールホモポリマーは、二官能性又は多官能性連結基
によりｏｂ蛋白に結合させてもよい。モノ−ポリエチレ
ン又はポリプロピレングリコールホモポリマーコンジュ
ゲートを製造する際、二官能性リンカーが使用され、ホ
モポリマーは、このリンカーの１つの官能基に結合し、
一方、ｏｂ蛋白のＮ−末端アミノ酸及びリシン基は、こ
のリンカーの他の官能基に結合することができる。ｏｂ
蛋白とのトリ−又はポリ−〔ポリエチレン又はポリプロ
ピレングリコール〕ポリマーコンジュゲートは、三官能
性又は多官能性リンカーを使用して形成される。このホ
モポリマーは、２つ以上のこれらの官能基に結合するこ
とができ、リンカーの残りの１つの官能基にｏｂ蛋白が
結合することができる。これらのリンカーには、アミン
及びカルボキシ官能基を有する多官能性リンカーがあ
る。アミン基は、ポリエチレン又はポリプロピレングリ
コールの官能基化されたヒドロキシ基と結合して、アミ
ド結合を形成することができる。カルボキシ基は、ｏｂ
蛋白上のアミン基と結合してアミド結合を形成し、グリ
コール上の官能基化されたヒドロキシ基と結合してエス
テルを形成することができる。ｏｂ蛋白とＰＥＧとのコ
ンジュゲートを形成するために使用することができる多
くのタイプの連結基には、米国特許第４，９０２，５０
２号、５，０３４，５１４号、４，６０９，５４６号、
５，１２２，６１４号及び４，８４７，３２５号に開示
されているものなどがある。
【００７３】本発明の特に好適な実施態様によるコンジ
ュゲートは、式（Ｉ−Ａ）及び（Ｉ−Ｂ）：
【００７４】
【化３】
【００７５】（式中、Ｐは、本明細書記載のマウス又は
ヒトｏｂ蛋白であり；ｎ及びｎ′は、全ＰＥＧ単位の平
均分子量が１５kDa 〜６０kDa で、かつ、このコンジュ
ゲートの総分子量が３０kDa 〜８０kDa になるように、
合計が３００〜１，５００の整数であり；Ｒ及びＲ′
は、低級アルキルである）で示される。
【００７６】式（Ｉ−Ａ）及び（Ｉ−Ｂ）の化合物は、
式（II−Ａ）及び（II−Ｂ）：
【００７７】
【化４】
【００７８】で示される公知のポリマー物質から、これ
らを本発明のマウス又はヒトｏｂ蛋白と縮合させること
により、調製することができる。活性エステルとアミン
とを反応させてアミドを形成する任意の従来法を使用す
ることができる。上で説明した反応において、例示した
スクシンイミジルエステルは、アミド形成を起こす脱離
基である。式（Ｉ−Ｂ）の化合物を製造するために式
（II−Ｂ）の化合物を使用する場合、本発明のマウス又
はヒトｏｂ蛋白との反応は、式（Ｉ−Ａ）の化合物への
式（II−Ａ）の化合物の変換に関連して記載されるのと
同じように実施される。蛋白とのコンジュゲートを製造
するための、式（II−Ａ）の化合物のようなこれらのス
クシンイミジルエステルは、Monfardiniら, Bioconjuga
te Chem., 6,62-69 (1995) に開示されている。
【００７９】式（Ｉ−Ａ）の化合物の場合、ＰＥＧ単位
の総平均分子量が１５〜６０kDa 、好適には３５〜４５
kDa であるコンジュゲートとなるように、ｎとｎ′の合
計は、３００〜１，５００である。式（Ｉ−Ａ）の好適
な実施態様において、ｎとｎ′の合計は約８００〜１，
２００であり、ｎとｎ′の平均合計は８５０〜１，００
０である。一般に、式（Ｉ−Ａ）及び（II−Ａ）の化合
物中のｎ′に対するｎの好適な比は、０．５〜１．５で
あり、０．８〜１．２が好適である。式（Ｉ−Ｂ）の化
合物の場合、総分子量１５〜６０kDa 、好適には３５〜
４５kDa の、３００〜１，５００のＰＥＧ単位を有する
化合物を製造するために、ｎは、好適には３００〜１，
５００の間である。好適な実施態様において、ｎは約８
５０〜１，０００である。
【００８０】本発明により製造されるヒト又はマウスｏ
ｂ蛋白は、当該分野で公知の方法により、薬剤学的に許
容しうる融和性の賦形剤又は賦形剤と共に、注射に適し
た薬剤組成物として調製してもよい。任意の従来の賦形
剤物質を使用することができる。賦形剤物質は、経腸、
経皮又は非経口投与に適した、有機又は無機のものであ
ってよい。適切な賦形剤としては、水、ゼラチン、アラ
ビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネ
シウム、タルク、植物油、ポリアルキレン−グリコー
ル、石油ゼリー（ワセリン）などが挙げられる。更に、
この薬剤調製物は、他の薬剤学的に活性な薬剤を含有し
てもよい。香料、保存料、安定剤、乳化剤、緩衝剤など
のような更なる添加物を、調剤の許容される慣例にした
がって添加することができる。本発明の均質なｏｂ蛋白
を処方するのに好適な賦形剤には、ヒト血清アルブミ
ン、ヒト血漿蛋白などがある。
【００８１】均質な組換えｏｂ蛋白（それがヒト由来又
はマウス由来、あるいはその組み合わせであろうと）の
投与は、肥満のヒト及び動物において食物摂取の低下と
体重減少をもたらす。したがって、ｏｂ蛋白の投与は、
体重の調節において重要であるこの蛋白を補給する。ヒ
ト又はマウスｏｂ蛋白を含有する薬剤組成物は、単独で
又はII型糖尿病のような有害な症状若しくは疾患の一部
として体重が異常に変動するヒト又は動物患者に、種々
の手段により投与するのに有効な濃度で、処方すること
ができる。注射による種々の投与法を使用することがで
き、これらには、皮下、静脈内及び腹腔内注射が含まれ
る。ｏｂ蛋白の平均量は、変化させることができ、特
に、資格を有する医師又は獣医師の推奨と処方に基づく
べきである。
【００８２】本発明により調製されたヒト又はマウスｏ
ｂ蛋白はまた、ｏｂ蛋白受容体（レセプター）を同定す
るためのスクリーニング法において使用することもでき
る。
【００８３】
【実施例】以下に与える実施例は、本発明をなんら限定
しようとするものではない。
【００８４】実施例１ ヒトｏｂのｃＤＮＡの取得 ヒト脂肪細胞組織由来ＲＮＡから作成された、市販のラ
ムダファージｃＤＮＡライブラリー（「クローンテク
（Clontech）」）のスクリーニングにより、ヒトｏｂの
ｃＤＮＡを得た。このライブラリーから、ラムダファー
ジライブラリーのハイブリダイゼーションにより、ヒト
ｏｂのｃＤＮＡ配列に対応する各々約２．５キロベース
の断片を含有する２つのラムダファージを得た。この技
術により、２つのクローン（即ち、ｈｏｂ１−ｃＤＮＡ
及びｈｏｂ２−ｃＤＮＡ）を同定した。このヒトｏｂ遺
伝子を、ストラタジーン（Stratagene）から市販されて
いるプラスミドベクターＤＮＡのｐBluescriptＳｋ- に
サブクローニングした。これらのヒトｏｂ遺伝子配列を
有する得られたベクターを、ｐBluescriptＳｋ- ｈｏｂ
１及びｐBluescriptＳｋ- ｈｏｂ２と呼んだ。
【００８５】このｐBluescriptＳｋ- ｈｏｂ１及びｐBl
uescriptＳｋ- ｈｏｂ２中のヒトｏｂ遺伝子配列を、ヌ
クレオチド配列決定により確認した。ヌクレオチド配列
決定から推測される蛋白のアミノ酸配列は、配列番号４
によりコードされるヒトｏｂ蛋白に対応し、Zhang, Y.
らの上記文献に発表されたとおりであった。ｐBluescri
ptＳｋ- ｈｏｂ１は、ｈｏｂ１のｃＤＮＡの終結コドン
後にＴ−Ｃ突然変異を有していた。この突然変異によ
り、下記のように、これがなければｈｏｂ１のヌクレオ
チド配列中に存在することが予測されたＳｔｕＩ制限部
位が喪失した：
【００８６】ｈｏｂ１ ...GGG.TGC.TGA GGCCT TGA... Gly Cys 終結ｐBluescriptＳｋ - −ｈｏｂ１ ...GGG.TGC.TGA GGCCC TGA... Gly Cys 終結ｐBluescriptＳｋ - −ｈｏｂ２ ...GGG.TGC.TGA GGCCT TGA Gly Cys 終結
【００８７】ｐBluescriptＳｋ- ｈｏｂ１のこの突然変
異は、ヒトｏｂのｃＤＮＡ配列の終結コドンの後に位置
するため、Zhang, Y. らの上記文献により発表されたと
おりの、ヒトｏｂ蛋白のアミノ酸配列に変化を起こさな
かった。
【００８８】ｐBluescriptＳｋ- ｈｏｂ２に存在するｃ
ＤＮＡのヌクレオチド配列に関する限り、制限酵素解析
により、このプラスミドが、ヒトｏｂのｃＤＮＡ配列の
終結コドンの後に位置するＳｔｕＩ制限部位を有するこ
とが明らかになった。
【００８９】ｐBluescriptＳｋ- ｈｏｂ１が終結コドン
に続くＳｔｕＩ制限部位に突然変異を有するという事実
に加えて、ｐBluescriptＳｋ- ｈｏｂ１はまた、ｈｏｂ
１のｃＤＮＡ中のＯＲＦの後にＥｃｏＲＩ制限部位を有
しており、これはｈｏｂ２のｃＤＮＡには存在しない
（図１参照）。
【００９０】実施例２ マウスｏｂ蛋白（ｍｏｂ）のプラスミド構築 配列番号１のマウスｏｂのｃＤＮＡを、Zhang, Y. らの
上記文献の方法により得、これをインビトロジェン（In
vitrogen）（カリフォルニア州サンディエゴ、米国）か
ら市販されているｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入した。次
に、得られたマウスｏｂ遺伝子を使用して、マウスｏｂ
蛋白（ｍｏｂ）の発現のための発現ベクターｐＬＰＰｓ
ＯｍｐＡ−ｍｏｂを構築した。この発現ベクターとその
構築は、図２に詳述する。
【００９１】構築の第一工程は、マウスｏｂ遺伝子の成
熟コード領域（即ち、その天然のシグナル配列を含まな
い）へのｓＯｍｐＡ遺伝子からのシグナルコード配列の
融合を達成することであった。ｐＣＤＮＡ３ベクターに
挿入された成熟マウスｏｂ蛋白をコードする５０１bpの
ＤＮＡ断片を、ベントＤＮＡポリメラーゼ（Vent DNApo
lymerase)〔ニューイングランド・バイオラボ（New Eng
land Biolabs)〕、バリン（これは成熟ｍｏｂ中の最初
のアミノ酸である）をコードするコドンの最初のヌクレ
オチドから開始するフォワードプライマー（プライマー
１）（Zhang, Y. らの上記文献）、及びｍｏｂの終結コ
ドンを含有するｍｏｂの領域に対応するリバースプライ
マー（プライマー２）を使用して、このベクターから、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。プラ
イマー２は、ＨｉｎｄIII 制限部位に対応する配列も含
有していた。
【００９２】 プライマー１： 5' GTG CCT ATC CAG AAA GTC 3' Val Pro Ile Glu Lys Val プライマー２： 5' TCCCAAGCTT TCAGCATTCAGGGCTAAC 3' HindIII 終結
【００９３】増幅した５０１bpのＤＮＡ断片を、アガロ
ースゲル電気泳動により精製して、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（「ベーリンガー（Boehringer）」）を使用
してリン酸化し、次に制限酵素ＨｉｎｄIII で消化して
プライマー２の位置に５′突出末端を作成した。得られ
た断片には、成熟ｍｏｂをコードするｃＤＮＡの最初の
ヌクレオチドに対応する平滑末端と、切断されたＨｉｎ
ｄIII 部位に対応する５′突出末端があった。
【００９４】次に、De Sutter, K. らの上記文献の方法
により得られたｓＯｍｐＡプラスミドｐＴ１０ｓＯｍｐ
ＡｒＰＤＩをｍｏｂに融合させて、ｐＴ１０ｓＯｍｐＡ
ｍｏｂプラスミドを作成した。これを実施するために、
当該分野で公知の方法〔Sambrook, J.らの「分子クロー
ニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual）」、第２版、Cold Spring Harbor Lab
oratory Press 刊、コールド・スプリング・ハーバー、
ニューヨーク、1989年〕により、前もって制限酵素Ｎａ
ｅＩとＨｉｎｄIII で消化したｐＴ１０ｓＯｍｐＡｒＰ
ＤＩベクターＤＮＡへ、Ｔ４リガーゼ〔ニューイングラ
ンド・バイオラボ（New England-Biolabs)〕を使用する
連結により、ｍｏｂ断片をクローニングした。このｐＴ
１０ｓＯｍｐＡｒＰＤＩは、プラスミドｐ７１４〔Park
er及びWiley, Gene 83, 117-134(1989)〕から誘導し
た。このプラスミドは、ｓＯｍｐＡ配列に融合した、成
熟ラット蛋白ジスルフィドイソメラーゼ（ｒＰＤＩ）を
コードするｃＤＮＡを含有していた。
【００９５】成熟ｒＰＤＩのｃＤＮＡ中の最初のコドン
（グリシン）へのｓＯｍｐＡ中の最後のコドン（アラニ
ン）のこの融合により、ＮａｅＩ制限部位を作成し、こ
れをＮａｅＩで切断後、ｓＯｍｐＡ配列中の最後のコド
ンと、ｒＰＤＩ配列をコードするｃＤＮＡ中の最初のコ
ドンとを、平滑末端として放出させた。
【００９６】
【００９７】ｒＰＤＩをコードするｃＤＮＡの末端に、
ＨｉｎｄIII 部位が存在していた。したがって、このプ
ラスミドを更にＨｉｎｄIII で消化して、ｒＰＤＩのｃ
ＤＮＡの主要部分を放出させ、ＰＣＲ断片の１つの末端
と融和性の５′突出末端を作成した。ｒＰＤＩをコード
するｃＤＮＡを成熟マウスｏｂをコードするｃＤＮＡで
置き換えた、得られたプラスミドを、ｐＴ１０ｓＯｍｐ
Ａｍｏｂと呼び、図２に示した。
【００９８】標準的な電気穿孔法により、連結したＤＮ
Ａを大腸菌株ＭＣ１０６１に導入し、得られたコロニー
を、制限酵素解析により、マウスｏｂＤＮＡ断片の存在
に関してスクリーニングした。クローンｐＴ１０ｓＯｍ
ｐＡｍｏｂは、ｓＯｍｐＡをコードする配列に融合した
成熟マウスｏｂ蛋白をコードする配列を有していた。
【００９９】次に、大腸菌でのこのｐＴ１０ｓＯｍｐＡ
ｍｏｂ中のｍｏｂの発現を、リポ蛋白プロモーター（Ｐ
lpp)とｌａｃプロモーター−オペレーター（ＰＯlac)の
両方の制御下に置いた。これを行うために、De Sutter,
K. らの上記文献に記載された標準的手順により、ハイ
ブリッド遺伝子ｓＯｍｐＡ−ｍｏｂ配列を、プラスミド
ｐＴ１０ｓＯｍｐＡｍｏｂからプラスミドベクターｐＬ
ＰＰｓＯｍｐＡｒＰＤＩに移した。このｐＬＰＰｓＯｍ
ｐＡｒＰＤＩプラスミドは、本明細書で既に述べたよう
に、プラスミドｐ７１４から誘導された〔Parker及びWi
ley, Gene 83,117-134 (1989)〕。この工程のため、プ
ラスミドｐＴ１０ｓＯｍｐＡｍｏｂのＤＮＡを、制限酵
素ＸｂａＩとＨｉｎｄIII で切断した。次に、ｓＯｍｐ
Ａ−ｍｏｂをコードするＤＮＡを含有する断片を、プラ
スミドｐＬＰＰｓＯｍｐＡｒＰＤＩ（前もって、制限酵
素ＸｂａＩとＨｉｎｄIII で切断してｓＯｍｐＡ−ｒＰ
ＤＩをコードするＤＮＡを除去したもの）中に連結し
た。生じたプラスミドをｐＬＰＰｓＯｍｐＡｍｏｂと呼
んだ。
【０１００】実施例３ 大腸菌（ＭＣ１０６１）でのマウスｏｂ蛋白の発現 大腸菌中でのマウスｏｂ蛋白の発現を以下のとおり行っ
た。実施例２により構築したｐＬＰＰｓＯｍｐＡｍｏｂ
プラスミドを、電気穿孔法により大腸菌株ＭＣ１０６１
に挿入した。プラスミドｐＬＰＰｓＯｍｐＡｍｏｂを有
する大腸菌細胞（ＭＣ１０６１）を、抗生物質カルベニ
シリン〔１００μg/ml、「ビーチャム（Beecham)」〕を
添加したルリア・バータニア（Luria-Bertania）〔「デ
ィフコ・ラボラトリーズ（Difco Laboratories）」〕培
地中で、２８℃で一晩増殖させた。次に、この培養物を
接種物（１００倍希釈）として使用して、同じ培地中で
２８℃で３０mlの一晩培養物を用意した。次に、この培
養物を上記培地で３リットルに１００倍希釈（例えば、
１リットルの三角フラスコ中、０．５ｌ×６本）して、
ニューブランズウィック・エアーシェイカー（New Brun
swick air shaker）中で３００rpm 、２８℃で約４時
間、Ａ600 が０．３〜０．５の密度に達するまで振盪し
た。この時、De Sutter, K. らの上記文献に記載された
ように、最終濃度２mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド〔ＩＰＴＧ、「ベーリンガー（Boehri
nger）」〕を添加することにより、ｌａｃプロモーター
を誘導した。細胞を、細胞密度がＡ600 ＝１．３〜１．
５に達するまで、更に２８℃で約５時間インキュベート
した。次に、ＪＡ１０ローター〔ベックマン（Beckman)
の遠心分離機モデルＪ２−２１又はＪ２−２１Ｍ〕中で
６，７５０rpm 、６分間（８，０００×ｇ）、４℃で遠
心分離して、細胞を集めた。上澄液を除去して、細胞ペ
レットを氷冷浸透圧ショック緩衝液（２０％ショ糖と１
０mMＥＤＴＡを含有する１００mMトリス−ＨＣｌ、pH
７．４）２５０mlに迅速に再懸濁して、Koshland及びBo
tsteinの上記文献に記載されたように１０〜２０分間氷
上でインキュベートした。
【０１０１】そして、この懸濁液をプラスチックの遠心
分離用チューブに移して、８，２００rpm （８，０００
×ｇ）で５分間、４℃でＪＡ２０ローター中で遠心分離
して、細胞を集めた。上澄液を除去し、激しく振盪しな
がら氷水１２０mlに細胞ペレットを迅速に再懸濁して、
氷上で更に１０分間インキュベートした。次に、この懸
濁液をＪＡ２０ローター中で１１，５００rpm （１６，
０００×ｇ）で６分間、４℃で遠心分離して、細胞周辺
腔画分（浸透圧ショック液）に対応する上澄液を集めた
（約１２０ml）。アジ化ナトリウム及びトリス−ＨＣｌ
（pH７．５）を、各々最終濃度０．０５％及び５０mMに
なるように添加した。マウスｏｂ蛋白を含有する浸透圧
ショック液は、更に使用するまで−２０℃で保存した。
【０１０２】実施例４ 大腸菌（ＭＣ１０６１）でのマウスｏｂ蛋白の発現 ルリア・バータニア（Luria-Bertania）培地に添加する
ための抗生物質として、（カルベニシリンの代わりに）
トリアシリン（triacilline)（１００μg/ml）を使用し
たほかは、実施例３に記載した手順により、マウスｏｂ
蛋白の発現を行った。
【０１０３】実施例５ 大腸菌浸透圧液からのマウスｏｂ蛋白の精製 実施例４による凍結浸透圧ショック液１２０ml中のマウ
スｏｂ蛋白を、以下のとおり精製した。マウスｏｂ蛋白
を含有する浸透圧ショック液１２０mlを解凍し、４℃で
２０分間、１６，０００rpm でＪＡ２０ローター中で遠
心分離して、不溶性の細胞破砕物を除去した。次に、前
もって５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）緩衝液で平衡
化した、カラム床容量３０mlのＱ−セファロース・ファ
スト・フロー（Q-Sepharose Fast Flow)〔「ファルマシ
ア（Pharmacia)」〕を含有するカラムに、上澄液を直接
適用した。５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）緩衝液で
洗浄後、０．１M ＮａＣｌを含有する５０mMトリス−Ｈ
Ｃｌ（pH７．５）緩衝液でｍｏｂ蛋白を溶出した。
【０１０４】次に、Ｑ−セファロース・ファスト・フロ
ー（Q-Sepharose Fast Flow)を含有するカラムから溶出
した物質に、最終濃度１．０M になるように、固体の
（ＮＨ4)2 ＳＯ4 を添加して、１．０M （ＮＨ4)2 ＳＯ
4 を含有する５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）緩衝液
で前もって平衡化した、カラム床容量７．５mlのブチル
−セファロース・ファスト・フロー（Butyl-Sepharose
Fast Flow)〔「ファルマシア（Pharmacia)」〕を含有す
るカラムに、この混合物を適用した。１．０M （ＮＨ4)
2 ＳＯ4 を含有する５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）
緩衝液で洗浄後、５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）緩
衝液中１．０M （ＮＨ4)2 ＳＯ4 から水中２０％エチレ
ングリコールへの勾配を適用することにより、ｍｏｂ蛋
白を溶出した。ｍｏｂ蛋白は、勾配の最後の方でブチル
−セファロース・ファスト・フローカラムから溶出し、
一方、ほとんどの夾雑物ははるかに早く溶出した。この
段階でのｍｏｂ蛋白の純度は、銀染色ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による概算では、９０％で
あった。
【０１０５】次に、ブチル−セファロース・ファスト・
フローを含有するカラムから溶出した物質中のｍｏｂ蛋
白を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し
た。これを行うために、８ＭＣ濃縮ユニット〔「アミコ
ン（Amicon）」〕を使用するＹＭ１０〔「アミコン（Am
icon）」〕膜で、マウスｏｂ蛋白を４℃で容量１mlまで
濃縮して、前もってリン酸緩衝生理食塩水で平衡化した
Ｇ１００−セファデックス〔「ファルマシア（Pharmaci
a)」〕３９mlを含有するカラム（１．０cm×５０cm）に
適用した。次に、ｍｏｂ蛋白を含有する画分をプールし
て、蛋白をＹＭ１０膜で濃縮した。この段階では、ＰＡ
ＧＥと銀染色による概算では、ｍｏｂ蛋白は純度９５％
以上であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１５，
０００の位置に単一蛋白バンドが見られた。
【０１０６】実施例６ マウスｏｂ蛋白の配列解析 上記実施例２、３、４及び５の手順により得られた精製
されたマウスｏｂ蛋白のＮ−末端アミノ酸の配列決定
を、Laemli, U.K.の上記文献の手順により行った。Bau
w, G.ら, J. Biol. Chem. 7, 194-196 (1988)に記載さ
れたように、ポリ（４−ビニルＮ−メチルピリジニウム
ヨウ化物）でコートしたガラス繊維シートに、電気泳動
した蛋白を電気的にトランスファーした後、分子量１
５，０００の蛋白のバンドを膜から切り出し、１２０Ａ
オンライン・フェニルチオヒダントインアミノ酸解析機
〔「アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosyste
ms）」〕を取付けた４７０Ａ気相配列決定装置で、エド
マン分解により、Ｎ−末端のアミノ酸配列を決定した。
上記手順により得られたこのマウスｏｂ蛋白のＮ−末端
アミノ酸配列は、配列番号３の成熟マウスｏｂ蛋白に対
応するＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎであった。
【０１０７】実施例７ ヒトｏｂ蛋白（ｈｏｂ）のための発現ベクターの構築 実施例１の手順により得られたヒトｏｂ遺伝子を使用し
て、ヒトｏｂ蛋白の発現のための発現ベクターｐＬＰＰ
ｓＯｍｐＡｈｏｂ１を構築した。この構築は実施例２に
詳述したｐＬＰＰｓＯｍｐＡｍｏｂの構築に類似してお
り、図３に詳細を示した。全成熟ヒトｏｂコード配列を
含有するＤＮＡ断片を完成するために、３つの断片の連
結が必要であった。
【０１０８】構築の第一段階において、成熟ヒトｏｂ蛋
白の最初のアミノ酸（バリン）をコードするコドンの最
初のヌクレオチドから開始するｈｏｂヌクレオチド配列
を、ＯｍｐＡからのシグナルをコードする配列（ｓＯｍ
ｐＡ）に融合して、ｓＯｍｐＡ配列をｈｏｂヌクレオチ
ドコード配列の５′末端の上流に入れた。プラスミドｐ
BluescriptＳｋ- ｈｏｂ１、ベントＤＮＡポリメラー
ゼ、及び２つのプライマーを含有するＰＣＲ混合物中で
増幅することにより、このＤＮＡ断片を得た。フォワー
ドプライマー（プライマー１）は、成熟ヒトｏｂ蛋白の
最初のアミノ酸をコードするコドンの最初のヌクレオチ
ドで開始し、リバースプライマー（プライマー２）は、
終結コドンを含有するヒトｃＤＮＡの配列を含有した。
増幅反応により、成熟ヒトｏｂ蛋白をコードする配列を
含有する５０１bpのＤＮＡ断片を得た。次に、このＤＮ
Ａ断片の５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで
リン酸化し、制限酵素ＨｉｎｄIII で消化して、成熟ｈ
ｏｂをコードするｃＤＮＡの最初のヌクレオチドに対応
する平滑末端（プライマー１に対応する位置）と、Ｈｉ
ｎｄIII 切断部位に対応する５′突出末端とを有する３
５３bpのＤＮＡ断片を得た。この３５３bpのＤＮＡ断片
を、アガロースゲル電気泳動により精製して、前もって
制限酵素ＮａｅＩとＨｉｎｄIII で消化したｐＴ１０ｓ
ＯｍｐＡｒＰＤＩプラスミドにクローニングした。得ら
れたプラスミドｐＴ１０ｓＯｍｐＡｈｏｂ１（部分）に
は、ｓＯｍｐＡをコードする配列に融合した、成熟ヒト
ｏｂ蛋白の一部分（アミノ末端部分）をコードするＤＮ
Ａ断片が含まれていた。
【０１０９】
【０１１０】第二工程において、ヒトｏｂ蛋白のカルボ
キシ末端部分をコードするＤＮＡ配列（即ち、断片２）
を、成熟ｈｏｂのアミノ末端部分をコードするＤＮＡ断
片に連結し、ｓＯｍｐＡに融合させた全成熟ｈｏｂ配列
をコードする得られた断片を、リポ蛋白プロモーター及
びｌａｃ−プロモーター−オペレーターの制御下で大腸
菌中で成熟ヒトｏｂ蛋白を発現させるために、プラスミ
ドｐＬＰＰｓＯｍｐＡｒＰＤＩに移した。これを行うた
めに、プラスミドｐＴ１０ｓＯｍｐＡｈｏｂ１（部分）
をＸｂａＩとＨｉｎｄIII で消化し、ｈｏｂの４００bp
のＤＮＡ断片１をアガロースゲル電気泳動により単離し
た（断片１）。次に、プラスミドｐBluescriptＳｋ- ｈ
ｏｂ１をＨｉｎｄIII とＥｃｏＲＩで切断し、アガロー
スゲル電気泳動により４５０bpの断片を単離した（断片
２）。最後に、プラスミドｐＬＰＰｓＯｍｐＡｒＰＤＩ
をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりベクター断片を単離した（断片３）。次に、
ＤＮＡ断片１、２及び３を相互に連結して、連結混合物
を大腸菌株ＭＣ１０６１に導入した。最終プラスミド構
築体ｐＬＰＰｓＯｍｐＡｈｏｂ１を含有するコロニー
を、成熟ヒトｏｂ蛋白の発現及び分泌のために使用し
た。
【０１１１】実施例８ 大腸菌（ＭＣ１０６１）でのヒトｏｂ蛋白の発現 実施例７により構築したｐＬＰＰｓＯｍｐＡｈｏｂ１を
使用して、宿主大腸菌細胞の細胞周辺腔において可溶性
の生物学的に活性な形でヒトｏｂ蛋白を発現させるため
に、大腸菌株ＭＣ１０６１を形質転換した。電気穿孔法
により、これらの宿主大腸菌細胞中へのプラスミドの挿
入を行った。プラスミドｐＬＰＰｓＯｍｐＡｈｏｂ１を
有する大腸菌細胞（ＭＣ０１６１）を、抗生物質カルベ
ニシリン〔１００μg/ml、「ビーチャム（Beecham)」〕
を添加したルリア・バータニア〔「ディフコ・ラボラト
リーズ（Difco Laboratories）」〕培地中で、２８℃で
適正な密度まで増殖させて、次に、De Sutter, K. らの
上記文献に記載されたように、最終濃度２mMのイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド〔ＩＰＴＧ、
「ベーリンガー（Boehringer）」〕を添加することによ
り、ｌａｃプロモーターを誘導した。細胞密度がＡ600
＝１．３に達するまで、更に細胞を増殖させた。次に、
遠心分離（８，０００×ｇ、４℃）により細胞を集め
て、氷冷浸透圧ショック緩衝液（２０％ショ糖と１０mM
ＥＤＴＡとを含有する１００mMトリス−ＨＣｌ、pH７．
４）に細胞ペレットを迅速に再懸濁して、Koshland及び
Botsteinの上記文献に記載されたように、１０分間氷上
でインキュベートした。
【０１１２】次に、上記のとおり細胞を再度遠心分離に
より集めて、細胞ペレットを氷冷水に再懸濁し、氷上で
１０分間インキュベートした。次に、この懸濁液を１
６，０００×ｇで５分間遠心分離して、上澄液（浸透圧
ショック液）を集めた。アジ化ナトリウム及びトリス−
ＨＣｌ（pH７．５）を、各々最終濃度０．０５％及び５
０mMになるように添加した。このヒトｏｂ蛋白を含有す
る浸透圧ショック液は、更に使用するまで−２０℃で保
存した。
【０１１３】実施例９ 大腸菌（ＭＣ１０６１）でのヒトｏｂ蛋白の発現 ルリア・バータニア培地に添加するための抗生物質とし
て、カルベニシリンの代わりにトリアシリン（triacill
ine)（１００μg/ml）を使用したほかは、実施例８に記
載された手順により、ヒトｏｂ蛋白の発現を行った。
【０１１４】実施例１０ 大腸菌浸透圧液からのヒトｏｂ蛋白の精製 実施例９の浸透圧ショック液中のヒトｏｂ蛋白を精製す
るために、ＮａＣｌを最終濃度０．１M になるようにこ
の液に添加し、次に、前もって５０mMトリス−ＨＣｌ
（pH７．５）緩衝液で平衡化したカラム床容量３０mlの
Ｑ−セファロース・ファスト・フロー（Q-Sepharose Fa
st Flow)〔「ファルマシア（Pharmacia)」〕を含有する
カラムに、この液を直接適用した。
【０１１５】次に、Ｑ−セファロース・ファスト・フロ
ー（Q-Sepharose Fast Flow)を含有するカラムから溶出
したフロースルー物質に、最終濃度１．０M になるよう
に、固体の（ＮＨ4)2 ＳＯ4 を添加して、１．０M （Ｎ
Ｈ4)2 ＳＯ4 を含有する５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．
５）緩衝液で前もって平衡化した、カラム床容量７．５
mlのブチル−セファロース・ファスト・フロー（Butyl-
Sepharose Fast Flow)〔「ファルマシア（Pharmaci
a)」〕を含有するカラムに、この混合物を適用した。
１．０M （ＮＨ4)2 ＳＯ4 を含有するトリス−ＨＣｌ
（pH７．５）緩衝液で洗浄後、５０mMトリス−ＨＣｌ
（pH７．５）緩衝液中１．０M （ＮＨ4)2 ＳＯ4 から水
中２０％エチレングリコールへの勾配を適用することに
より、ｈｏｂ蛋白を溶出した。ｈｏｂ蛋白は、勾配の最
後の方でブチル−セファロース・ファスト・フローカラ
ムから溶出し、一方、ほとんどの夾雑物ははるかに早く
溶出した。この段階でのｈｏｂ蛋白の純度は、銀染色ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による概算
では、９０％であった。
【０１１６】次に、ブチル−セファロース・ファスト・
フローを含有するカラムから溶出した物質中のｈｏｂ蛋
白を、ゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し
た。これを行うために、８ＭＣ濃縮ユニット〔「アミコ
ン（Amicon）」〕を使用するＹＭ１０〔「アミコン（Am
icon）」〕膜で、ヒトｏｂ蛋白を４℃で容量１mlまで濃
縮して、前もってリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したＧ
１００−セファデックス〔「ファルマシア（Pharmaci
a)」〕３９mlを含有するカラム（１．０cm×５０cm）に
適用した。次に、ｈｏｂ蛋白を含有する画分をプールし
て、蛋白をＹＭ１０膜で濃縮した。この段階では、ＰＡ
ＧＥと銀染色による概算では、ｈｏｂ蛋白は純度９５％
以上であった。溶出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、
分子量１５，０００の位置に単一蛋白バンドが見られ
た。
【０１１７】実施例１１ 大腸菌浸透圧液からのヒトｏｂ蛋白の精製 実施例９の浸透圧ショック液中のヒト蛋白を精製するた
めに、下記の相違点を除いて実施例１０の手順を使用し
た：フロースルー物質に固体の（ＮＨ4)2 ＳＯ4 を添加
する前に、実施例９の浸透圧ショック液に関して下記工
程を行った。
【０１１８】前もって５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．
５）緩衝液で平衡化した、カラム床容量３０mlのＱ−セ
ファロース・ファスト・フロー（Q-Sepharose Fast Flo
w)〔「ファルマシア（Pharmacia)」〕を含有するカラム
に、実施例９の浸透圧ショック液中のヒトｏｂ蛋白を直
接適用した。５０mMトリス−ＨＣｌ（pH７．５）緩衝液
で洗浄後、０．１M ＮａＣｌを含有する５０mMトリス−
ＨＣｌ（pH７．５）緩衝液でｈｏｂ蛋白を溶出した。
【０１１９】実施例１２ ヒトｏｂ蛋白の配列解析 上記実施例７〜１１の手順により得られた精製されたヒ
トｏｂ蛋白のＮ−末端アミノ酸の配列決定を、Laemli,
U.K.の上記文献の手順により行った。Bauw, G.らの上記
文献により記載されたように、ポリ（４−ビニル−Ｎ−
メチルピリジニウムヨウ化物）でコートしたガラス繊維
シートに、電気泳動した蛋白を電気的にトランスファー
した後、分子量１５，０００の蛋白のバンドを膜から切
り出し、１２０Ａオンライン・フェニルチオヒダントイ
ンアミノ酸解析機〔「アプライド・バイオシステムズ
（Applied Biosystems）」〕を取付けた４７０Ａ気相配
列決定装置で、エドマン分解により、Ｎ−末端のアミノ
酸配列を決定した。上記手順により得られたこのｈｏｂ
蛋白のＮ−末端アミノ酸配列は、配列番号６の成熟ヒト
ｏｂ蛋白に対応するＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎで
あった。
【０１２０】実施例１３ マウスｏｂ蛋白の生物学的活性：ｏｂ／ｏｂマウスにお
ける脳室内（ＩＣＶ）注射 下記のとおりに、ＩＣＶ法を使用して、実施例５により
精製した成熟マウスｏｂ蛋白の生物学的活性を測定し
た。Haley 及びMcCormick の上記文献の方法に基づき、
以下の座標（中線の２mm外側；ブレグマに対して０．６
mm；２mm下）を用いて、麻酔をかけたメスの肥満ｏｂ／
ｏｂマウス（６〜１３週齢）の脳の側脳室中に、注入用
カニューレを埋め込んだ。カニューレの末端は、精密ね
じ（jeweler screw)と歯科用セメントを使用して頭蓋骨
に固定した。マウスは、個別に、自由に食物摂取（ＩＣ
Ｖ注射の前の晩を除いて）と水の摂取ができるプラスチ
ックケージに収容した。１日食物摂取量及び体重増加に
より評価して、手術から回復した後、下記の試験液の１
つを１μl 脳室内（ＩＣＶ）注射して、幾つかの場合に
マウスを検討した： １）人工ＣＳＦ； ２）細菌性対照液； ３）ｏｂ蛋白（０．６〜１μg/マウス）；又は４）輸液
なし。 各マウスへの上記試験液の１つのＩＣＶ注射に続いて、
カニューレをきれいにするために人工ＣＳＦ１μl を注
射した。この実験の目的のために、細菌性対照液は、大
腸菌に挿入されたプラスミドにマウスｏｂ遺伝子が含ま
れていなかったことを除いて、実施例２〜４に略述した
手順と同様に処理し調製した試料であった。
【０１２１】ＩＣＶ注射の前に１８時間（一晩）、マウ
スを絶食させた。マウスを軽く拘束して、前もって較正
したポリエチレン（ＰＥ）チューブ（ＰＥ２０）を装着
した１０μl ハミルトン（Hamilton）シリンジを使用し
て、側脳室に取付けたカニューレに試験液１μl を注射
した。次いで、直ちにマウスを、前もって重量を計量し
たペレット化したマウス用の餌を含有する食物皿と水瓶
のついた試験ケージに入れた。マウスを肉眼で観察し、
食物摂取をそれから７時間測定した。食物摂取測定は、
ＩＣＶ注射の０．５、１、２、３、４、６及び７時間後
に行った。ＩＣＶ注射の前と２４時間後に、各マウスの
体重を測定した。カニューレ固定がうまくいっているこ
とは、Morley, J.E.ら, American J. Physiol. 253, 51
6-522 (1987)の、２時間絶食マウスでのニューロペプチ
ドＹ １０μg のＩＣＶ注射後２時間の食物摂取の増加
により示された。
【０１２２】上記ＩＣＶ試験の結果は以下のとおりであ
った：Ａ．食物摂取の低下 ＩＣＶ注射後最初の３０分間、ほとんど全てのマウス
は、短い間隔をおいて食べ、約０．５グラム消費した。
注射をしなかったか、人工ＣＳＦを注射したマウスは、
次の６．５時間中食べ続け、累積７時間摂取量は３．２
グラムに達した（第１表）。対照的に、ｏｂ蛋白のＩＣ
Ｖを行ったマウスは、最初の３０分以降食べるのを停止
し、再び食べることはなかった。即ち、次の６．５時間
にわたって、これらの累積食物摂取量は、約０．５グラ
ムに抑制され続けた（第１表）。賦形剤対照液のＩＣＶ
を行ったマウスも、３０分後に食べるのを停止し、６〜
７時間後になってようやく再び食べ始めた。
【０１２３】Ｂ．体重増加の低下 賦形剤対照液を注射されたマウスの体重の２４時間変化
は、人工ＣＳＦを注射されたか又は注射をされていない
マウスに比べて、わずかに低下した（第１表）。しか
し、ｏｂ蛋白を注射されたマウスの体重の変化パーセン
トは、ゼロに近く、賦形剤対照液を注射されたマウスに
比較して有意に低下した（第１表）。
【０１２４】Ｃ．結論 組換えマウスｏｂ蛋白の直接投与（１μl 中の１．１μ
g/マウスを脳に）の観察された効果は、メスのｏｂ／ｏ
ｂマウスの食物摂取及び体重増加の持続性で有意な低下
であった。これにより、ｏｂ蛋白が、脳で直接に作用す
ることができ、腹腔内に注射された場合のｏｂ蛋白の効
果に一致することが明らかになった。この実施例では、
本発明によりメスの肥満ｏｂ／ｏｂマウスにおける細菌
で発現させた組換えマウスｏｂ蛋白の生物学的活性も確
認された。
【０１２５】
【表１】
【０１２６】＊は、ｏｂ蛋白群と人工脳脊髄液（ＣＳ
Ｆ）群との間の有意（ｐ＜０．０５）な差を示す。 ＊＊は、対照を１００としたパーセントを示す。
【０１２７】実施例１４マウスｏｂ蛋白の生物学的活
性：ｏｂ／ｏｂマウスにおける静脈内（ＩＶ）注射 実施例２、３、４及び５により得られた精製されたマウ
スｏｂ蛋白の生物学的活性を、以下のとおりに肥満ｏｂ
／ｏｂマウスへの静脈（ＩＶ）注射により試験した。
【０１２８】Mokhtarian A. ら, Physiol. Behav. 54,
895-898 (1993)の方法により、オス及びメスの肥満ｏｂ
／ｏｂマウス（６〜１３週齢）にペントバルビタール麻
酔（８０mg/kg 体重）下で長期頚部カニューレを埋め込
んた。１２時間／１２時間の明暗サイクルで一定の環境
条件下のプラスチックケージにマウスを個々に収容し
た。毎日固定して体重を測定し、カニューレの開存は、
１日おきに無菌ヘパリン／生理食塩水（０．９％生理食
塩水中５０U/ml）≦０．１mlの注入により確認して維持
した。手術から完全に回復後、マウスを１６〜１８時間
（一晩）絶食させた。翌朝、マウスの体重を測定し、実
験の前の環境順応のために４５分間試験ケージに入れ
た。水は継続して自由に与えた。マウスｏｂ蛋白（０．
１ml中３μg)又は等容量の賦形剤対照液又は生理食塩水
（０．９％）を静脈内注射した。覚醒しているマウスを
軽く拘束し、０．５mlのインスリンシリンジを使用し
て、試験液０．１ml、続いてヘパリン／生理食塩水０．
０５mlを注射した。試験は少なくとも３日間おいて行っ
た。次いで直ちに、マウスを、前もって重量を測定した
マウス用の餌のペレットを含有するペトリ皿のついた試
験ケージに入れた。マウスを肉眼で観察し、それから７
時間、ＩＶ注射の０．５、１、２、３、４、６及び７時
間後に食物摂取を測定した。ＩＶ注射前と２４時間後に
体重を測定した。２つの別々の群のカニューレを挿入し
たマウス（ｏｂ／ｏｂ１１匹及び痩身１２匹）を５回の
個別の試験で使用した。ほとんどのマウスに、相殺する
順でマウスｏｂ蛋白と１つ又は両方の対照液注射を行っ
た。この実験には、マウスｏｂ蛋白の２つの別の調製物
を使用した。ここに報告したデータは、これら個々の反
復の結果の組合せである。
【０１２９】Ａ．結果 上記実験の結果は以下のとおりであった： ＩＶ注射後最初の３０分間、ほとんどの肥満及び痩身マ
ウスは短い間隔をおいて食べ、約０．３〜０．５グラム
消費した。生理食塩水及び賦形剤対照液を注射した肥満
マウスの食物摂取は、実験を通して上昇した。賦形剤対
照液を注射した肥満ｏｂ／ｏｂマウスの累積食物摂取量
は、同様に絶食させた生理食塩水を注射した肥満マウス
の食物摂取量と差がなかった。対照的に、組換えｏｂ蛋
白を注射した肥満ｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取量は有意
に低下し、対照の５７％に抑制された（第２表）。７時
間の観察期間を通して、賦形剤対照液及びｏｂ蛋白の群
には、他の行動に及ぼす効果は観察されなかった。予想
通り、マウスｏｂ蛋白の単回ＩＶボーラスの限定された
作用時間のために、注射２４時間後の体重増加は、処理
群間に差はなかった。
【０１３０】Ｂ．結論 これらの結果により、組換えマウスｏｂ蛋白が、肥満ｏ
ｂ／ｏｂマウスへのＩＶ投与（３μg/マウス）後の累積
７時間食物摂取量を有意に低下させることが明らかにな
った。肥満ｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取を低下さ
せる組換えマウスｏｂ蛋白の能力は、肥満ｏｂ／ｏｂマ
ウスにおけるｏｂ蛋白の繰り返しＩＰ注射により得られ
る食物摂取の結果に一致した。この実施例では、メスの
肥満ｏｂ／ｏｂマウスにおける細菌で発現させた組換え
マウスｏｂ蛋白の生物学的活性も確認された。
【０１３１】
【表２】
【０１３２】データは、平均値±ｓｅｍである。ｎはマ
ウスの個体数を示し、ｓｅｍは「標準誤差」を意味し、
＊はｏｂ蛋白群と人工ＣＳＦ群との間の有意（ｐ＜０．
０５）な差を示す。 ＊＊は、対照を１００としたパーセントを示す。
【０１３３】実施例１５マウスｏｂ蛋白の生物学的活性：ｏｂ／ｏｂマウスにお
ける繰り返しＩＰ注射 実施例２〜５により得られた精製されたマウスｏｂ蛋白
の生物学的活性を、以下のとおりに肥満ｏｂ／ｏｂマウ
スへの繰り返し腹腔内（ＩＰ）注射により試験した。
【０１３４】３群の６匹のメスの肥満ｏｂ／ｏｂマウス
を検討した。１２時間／１２時間の明暗サイクルで一定
の環境条件下のプラスチックケージにマウスを収容した
（１ケージ当り３匹）。２４時間食物摂取と体重を毎日
測定した。環境条件及び日常の取り扱いと注射に対する
適応期間の後、マウスを３つの処理群に仕分けした。各
マウスに、各処理日に下記の試験液０．１mlの２回（明
暗サイクルの暗相の始まる少し前と暗相に入って３時
間）の腹腔内（ＩＰ）注射を行った： １）生理食塩水（０．９％）； ２）細菌性対照液；又は３）マウスｏｂ蛋白（３μg/
０．１ml）。 細菌性対照液は、大腸菌に挿入されたプラスミドにマウ
スｏｂ遺伝子が含まれていなかったことを除いて、マウ
スｏｂ蛋白を得て精製するための実施例２〜４に略述し
た手順により同様に処理し調製した試料であった。５日
間マウスを１日２回処理し、次に２日間何も処理しなか
った。各ケージの食物摂取量を、各処理日に最初のＩＰ
注射の２、３、５及び２４時間後に測定した。
【０１３５】Ａ．結果 食物摂取の低下 １週間の実験を通して、処理日と非処理日の生理食塩水
及び細菌性対照液を注射したマウスの間で、食物摂取に
差はなかった（第３表）。しかし、実験を通して、処理
日にｏｂ蛋白６μg を注射した６匹のマウスでは食物摂
取が低下した。細菌性対照液及び生理食塩水対照群に比
較して、ｏｂ蛋白を投与した群では、処理日の最初の注
射から２、３、５及び２４時間後に食物摂取の低下が観
察された。
【０１３６】体重増加の低下 ｏｂ蛋白群の５処理日にわたる累積体重増加は、−３．
３±０．７グラムであり、これに対して生理食塩水群で
は−０．９±０．２グラム、細菌性対照液群では−０．
７±０．４グラムであった（第３表）。
【０１３７】結論 この実施例により、細菌で発現させた組換えマウスｏｂ
蛋白（６μg/マウス/日）の１日２回のＩＰ注射が、生
理食塩水及び細菌性対照液処理のｏｂ／ｏｂマウスに比
較して、処理したメスのｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取の
有意で持続的な低下と、体重増加速度の有意な低下をも
たらすことが明らかになった。これらの結果により、本
発明により、細菌で発現させたマウスｏｂ蛋白が生物学
的に活性であり、遺伝的に肥満のｏｂ／ｏｂマウスに対
して期待通りの抗肥満効果を及ぼすことを証明した。第
３表において、２及び５時間の結果は平均１日食物摂取
量であり、一方、２４時間の結果は処理５日間の平均累
積食物摂取量である。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】データは、各群６匹のｏｂ／ｏｂマウスの
平均値±標準誤差である。食物摂取は、処理５日間の、
最初のＩＰ注射の２、５及び２４時間後の、３匹のマウ
スのケージの平均累積摂取量である。体重増加は、処理
５日間の体重の累積変化である。＊はｏｂ蛋白群と賦形
剤群との間の有意（ｐ＜０．０５）な差を示す。
【０１４０】実施例１６ ヒトｏｂ蛋白の生物学的活性：ｏｂ／ｏｂマウスにおけ
る脳室内（ＩＣＶ）注射 ｏｂ ／ｏｂマウスにおける脳室内（ＩＣＶ）注射による
ヒトｏｂ蛋白の生物学的活性を測定するのに使用した方
法は、試験液が下記のとおりである他は、実施例１３と
同じであった： ・０．１％マウス血清アルブミンを含有するリン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）中の、実施例１１で製造された組
換えヒトｏｂ蛋白（０．０５μg)；及び・賦形剤対照液
として、０．１％（w/v)マウス血清アルブミンを含有す
るＰＢＳ（アルブミン対照液）。
【０１４１】Ａ．食物摂取の低下 ＩＣＶ注射後最初の３０分間、ほとんど全てのマウスは
短い間隔をおいて食べ、約０．５グラム消費した。注射
していないマウスは、その後６．５時間食べ続けて、累
積７時間摂取量は１．８グラムに達した（第４表）。ア
ルブミン対照液のＩＣＶを行ったマウスは、３０分後食
べるのを停止し、３〜７時間後になってようやく再び食
べ始めた。対照的に、ヒトｏｂ蛋白ＩＣＶで処理したマ
ウスは、最初の３０分間に食べた量は有意に少なく
（０．２グラム）、その後６．５時間の間非常に少量を
食べた。即ち、次の６．５時間にわたってこれらの累積
食物摂取量は、約０．４グラムで抑制され続けた（第４
表）。
【０１４２】Ｂ．体重増加の低下 賦形剤対照を注射したマウスの体重の２４時間の変化
は、アルブミン対照液を注射したか何も注射していない
マウスに比べてわずかに低下した（第４表）。しかし、
ヒトｏｂ蛋白を注射したマウスの体重の変化パーセント
はゼロに近かった（第４表）。
【０１４３】Ｃ．結論 組換えヒトｏｂ蛋白の脳への直接投与（１μl 中の０．
０５μg/マウス）の観察された効果は、メスのｏｂ／ｏ
ｂマウスの食物摂取及び体重増加の持続的で有意な低下
であった。これにより、ｏｂ蛋白が脳に直接に作用する
ことができ、腹腔内に注射された時のｏｂ蛋白の効果に
一致することが証明された。この実施例では、メスの肥
満ｏｂ／ｏｂマウスにおける細菌で発現させた組換えヒ
トｏｂ蛋白の生物学的活性も確認された。
【０１４４】
【表４】
【０１４５】データは、平均値±標準誤差である。ｎは
マウスの個体数を示す。＊は、ヒトｏｂ蛋白群とアルブ
ミン対照液群との間の有意（ｐ＜０．０５）な差を示
す。＊＊は、対照を１００としたパーセントを示す。
【０１４６】実施例１７ 肥満ヒト被験者におけるｏｂ蛋白の生物学的活性：ＩＶ
投与後の試験食摂取の低下 各々実施例７〜１１により得られた精製されたマウス及
びヒトｏｂ蛋白の生物学的活性を、以下のとおりにヒト
へのＩＶ投与後の試験食摂取量を測定することにより測
定した。
【０１４７】痩身及び肥満のヒト志願者に、Muurahaine
n, N.E. らの上記文献の方法を使用して２つの場合で食
事実験室内で一定カロリー含量の試験食を与えた。食事
提供の少なくとも１時間前に、内在式（indwelling）Ｉ
Ｖカテーテルを肘前又は前腕静脈に入れて、ヘパリンロ
ックで開口を維持した。食事提供の１５分前、１５分
後、及び試験食の終了時に、視覚によるアナログの飢餓
評点を得た。次いで、食事提供の２０分前にマウス又は
ヒトｏｂ蛋白あるいは生理食塩水をＩＶ注入した。各被
験者に、満足するまで好きなだけ試験食を食べるように
指示した。各被験者が摂取した試験食の量を測定した。
次に、各被験者にヒトｏｂ蛋白（０．５mg/kg 体重）、
マウスｏｂ蛋白（０．５mg/kg 体重）又は生理食塩水の
いずれかを注入して、これらの条件下での摂取した試験
食の量の差を計算した。ヒト又はマウスｏｂ蛋白群にお
いて、消費した食事量が少なくとも２０％低下した。
【０１４８】実施例１８ 肥満ヒト被験者におけるｏｂ蛋白の生物学的活性：繰り
返しＩＶ投与による体重減少の誘導 各々実施例７〜１１により得られた精製されたマウス及
びヒトｏｂ蛋白の生物学的活性を、以下の方法により、
ｏｂ蛋白の繰り返しＩＶ投与後の体重減少を測定するこ
とにより測定した。
【０１４９】Drent, M.L. らの上記文献の方法を使用し
て、プラセボ対照を用いた二重盲検体重減少試験を行っ
た。肥満指数（ＢＭＩ）が２７を超える肥満被験者の体
重を測定し、２〜４週間のならし（run-in）期間の間、
１，５００Kcalの規定食を与えた。ならし期間の最後
に、少なくとも１kg体重が減少した全ての肥満被験者
を、ならし相での体重減少に合わせて２つの処理群に無
作為に分けた。被験者に、ヒト又はマウスｏｂ蛋白
（０．５mg/kg/日）あるいはプラセボ（生理食塩水）
を、少なくとも６週間、毎日ＩＶ投与した。毎週体重を
記録した。ヒト又はマウスｏｂ蛋白を投与した被験者
は、６週間の処理後、プラセボ群に比べて有意な体重の
減少があった。
【０１５０】実施例１９ Ａ．大腸菌細胞からのポリエチレングリコール結合ｏｂ
蛋白の調製 実施例８に記載されたように調製した大腸菌細胞ペレッ
ト５０ｇを、再懸濁の前に、５mMＥＤＴＡを含有する５
０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．５）１ｌに懸濁した。この
懸濁液を３７℃で１５分間インキュベートし、５mMＥＤ
ＴＡを含有する５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．５）１ｌ
で更に希釈した。次に、この懸濁液を、ホモジナイザー
を使用して５０％の出力設定で１５分間ホモジナイズし
た。８，０００rpm で１時間４℃で遠心分離することに
より、この懸濁液を清澄化した。ペレットを廃棄した。
伝導率が１．８mSになるまで上澄液を水で希釈して、前
もって５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．５）で平衡化した
Ｑ−セファロース・ファスト・フロー（強陰イオン性イ
オン交換樹脂）２００mlを充填したカラムに直接適用し
た。平衡化緩衝液で洗浄後、１００mMＮａＣｌを更に含
有する同じ平衡化緩衝液で、吸着したｏｂ蛋白をカラム
から溶出した。塩化ナトリウムを含有する平衡化緩衝液
によるカラムの処理後得られた溶出物を、Ｑ−セファロ
ース溶出物と呼んだ。
【０１５１】最終伝導率が８２mSに達するまでＱ−セフ
ァロース溶出物に固体ＮａＣｌを添加した。次に、この
溶出物を、１M ＮａＣｌを含有する５０mMトリス−ＨＣ
ｌ（pH８．５）で前もって平衡化したブチル−セファロ
ース・ファスト・フロー２００mlを充填した疎水性相互
作用カラム（ＨＩＣ）に適用した。吸着していない物質
を平衡化緩衝液で洗い流して、吸着したｏｂ蛋白を５０
mM酢酸アンモニウム（pH６．９）で溶出してＨＩＣ溶出
物を製造した。逆相ＨＰＬＣにより測定したところ、Ｈ
ＩＣ溶出物中のｏｂ蛋白は純度９５％であった。サイジ
ング（sizing）膜（ＹＭ−１０）を使用して、この精製
したｏｂ蛋白を３．７mg/ml まで濃縮した。このサイジ
ング膜は、１０，０００ダルトン以上の分子を保持する
膜であった。サイジング膜を使用するこの濃縮工程後、
ｏｂ蛋白を１００mMホウ酸緩衝液（pH８．０）中に透析
濾過して、これをｏｂ保存溶液として使用した。
【０１５２】Ｂ．ヒトｏｂ蛋白のＰＥＧ化 このＰＥＧ化反応を実施する際、シアーウォーター・ポ
リマーズ（ShearwaterPolymers)、アラバマ州ハンツビ
ル（Huntsville）から購入した式（II−Ａ）のＰＥＧ2
−ＮＨＳ試薬〔式中、ＲはＣＨ3 であり、ｎ及びｎ′の
合計は８２０〜１，０４０の範囲であり、平均合計は約
９３０であり、そして平均分子量４０kDa である〕を使
用した。これは、式（II−Ａ）のＰＥＧ2 −ＮＨＳ試薬
の混合物であり、ｎ′に対するｎの比が約１．０であ
り、この混合物中のｎ及びｎ′の合計が８２０〜１，０
４０ユニットの範囲であり、この混合物中のＰＥＧ鎖の
平均分子量は約２０kDa であって、このため、この試薬
の平均分子量は約４０kDa であり、この混合物中のｎ及
びｎ′の平均合計は約９３０である。上記パートＡで調
製した３．７mg/ml 精製ヒトｏｂ保存溶液０．５４ml
〔ｏｂ蛋白１２５nmol〕又は２mgに、上記ＰＥＧ2 −Ｎ
ＨＳ試薬溶液２５０nmolを添加した。この溶液は、１mM
ＨＣｌ中の１００mg/ml ＰＥＧ2 −ＮＨＳ試薬溶液０．
１ml又は１０mgよりなっていた。１００mMホウ酸塩（pH
５．０）を添加することにより全反応混合物を０．６７
mlに調製した。蛋白対試薬の最終モル比は１：２であっ
た。この混合物を、４℃で４時間撹拌して、氷酢酸１μ
l の添加により最終ｐＨを４．５にして反応を停止し
た。生じた反応混合物（０．６７ml）を水で希釈して溶
液２７mlを形成し、これをカルボキシメチル化陽イオン
交換樹脂〔パーセプティブズ（Perseptives)、マサチュ
ーセッツ州フラミンガム〕１．７mlを含有するカラムに
適用した。このカラムを、３．３μM ＨＥＰＥＳ／ＭＥ
Ｓ／酢酸ナトリウム緩衝液、pH５．０で平衡化した。希
釈した反応混合物をこのカラムに適用して、吸着してい
ないＰＥＧ2 −ＮＨＳ試薬をカラムから洗い流した。吸
着したＰＥＧ化及び非修飾ｏｂ蛋白を、８０、１５０及
び５００mMＮａＣｌの段階塩勾配〔各１５カラム容量〕
で溶出した。これらの溶出物２mlを別々に順に集めて、
各画分の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析にかけた。この解
析により、高度ＰＥＧ化コンジュゲート、目的の分枝状
モノ−ＰＥＧ−ｏｂ（ＰＥＧ2 −ｏｂ）及び非修飾ｏｂ
蛋白として溶出物を分類した。これらの各画分を、上で
設定した分類にプールした。第二のプールが目的の分枝
状モノ−ＰＥＧ2 −ｏｂ蛋白を含有していた。この目的
蛋白は、式（Ｉ−Ａ）〔式中、ｎ及びｎ′の合計は約８
２０〜１，０４０であり、平均合計は約９３０であり、
Ｒ及びＲ′はＣＨ3 であり、そして各ＰＥＧ鎖の平均分
子量は約２０kDa である〕の化合物の構造であった。こ
のＰＥＧ化生成物は、約５６kDa の平均分子量であっ
た。ＹＭ１０膜を使用して、ＰＥＧ2 −ｏｂを含有する
プールを３．７mg/ml まで濃縮した。ＹＭ１０は、１０
kDa 以上の分子量の分子を保持するサイジング膜であ
る。このサイジング工程後、濃縮物質をＰＢＳ緩衝液
（pH７．３）中に透析濾過して、−２０℃で凍結保存し
た。この保存生成物は、式（Ｉ−Ａ）のＰＥＧ化ｏｂ蛋
白であり、ｎ及びｎ′の合計は約８２０〜１，０４０で
あり、各ｏｂ鎖の平均分子量は約２０kDa であった。こ
のｏｂ蛋白コンジュゲート混合物中のＰＥＧ蛋白の平均
分子量は５６kDa であった。
【０１５３】実施例２０ ＰＥＧ化ヒトｏｂ蛋白の生物学的試験：ｏｂ／ｏｂマウ
スにおける単回ＩＰ注射方法 ２群の６匹のメスの肥満ｏｂ／ｏｂマウスを検討した。
１２時間／１２時間の明暗サイクルで一定の環境条件下
のプラスチックケージにマウスを収容した（３匹／ケー
ジ）。２４時間食物摂取と体重を毎日測定した。環境条
件、日常の取り扱い及び注射に対する適応期間の後、マ
ウスを２つの処理群に仕分けした。実験の第１日目に、
１回（明暗サイクルの暗相の始まる直前）の腹腔内（Ｉ
Ｐ）注射で各マウスに下記の試験液０．１mlを与えた：
生理食塩水（０．９％）；実施例１９のパートＡで調製
したヒトｏｂ蛋白保存溶液（３０μg/０．１ml）；ＰＥ
Ｇ化対照溶液（ヒトｏｂ蛋白を含まない、同様に処理し
精製した試料）又は実施例１９に記載されたように調製
したＰＥＧ化ｏｂ蛋白（３０μg/０．１ml）。第１日目
に１回だけマウスに注射した。その後３日間及び第６日
目に再度、ケージの毎日の食物摂取量と各マウスの体重
を測定した。
【０１５４】結果 Ａ）食物摂取の低下 生理食塩水及びＰＥＧ化対照液を注射したマウスには、
単回処理及びそれに続く２日間、１日食物摂取量に差は
なかった（第５表）。しかし、処理日に、３０μg のヒ
トｏｂ蛋白及びＰＥＧ化ヒトｏｂ蛋白を注射した６匹の
マウスでは、生理食塩水及びＰＥＧ化対照液を注射した
マウスに比較して、１日摂取量が低下（５．２、８．２
対１１．９、１１．４ｇ）した。ヒトｏｂ蛋白を注射し
たマウスの食物摂取は対照レベルに戻ったが、一方、Ｐ
ＥＧ化ヒトｏｂ蛋白を注射したマウスの食物摂取は実験
のそれ以降の日も低下したままだった。ＰＥＧ化ヒトｏ
ｂ蛋白群では、食物摂取の低下が単回注射後４８時間観
察された。ＰＥＧ化ヒトｏｂ蛋白では、生理食塩水及び
ＰＥＧ化対照群に比較して、実験から３日間にわたる累
積２４時間食物摂取が対照の４９％と有意に低下した。
【０１５５】Ｂ）体重増加の低下 生理食塩水及びＰＥＧ化対照液を注射したマウスには、
単回処理及びそれに続く２日間、体重の変化に差はなか
った（第６表）。しかし、処理日に、３０μgのヒトｏ
ｂ蛋白及びＰＥＧ化ヒトｏｂ蛋白を注射した６匹のマウ
スでは、生理食塩水及びＰＥＧ化対照液を注射したマウ
スに比較して、体重が低下（−０．９、−０．７対０．
１、０．３ｇ）した。ヒトｏｂ蛋白を注射したマウスの
体重は対照レベルに戻ったが、一方、ＰＥＧ化ヒトｏｂ
蛋白を注射したマウスの体重は実験のそれ以降の日も低
下し続けた。ＰＥＧ化ヒトｏｂ蛋白群では、継続した体
重の低下が単回注射後４８時間観察された。実験の６日
間にわたる体重の累積変化は−１．６グラムであり、こ
れに対してｏｂ蛋白群では０．４グラム、生理食塩水で
は０．７グラム、そしてＰＥＧ化対照群では１．１±
０．２グラムであった（第６表）。
【０１５６】結論 この実施例により、ＰＥＧ化ヒトｏｂ蛋白（３０μg/マ
ウス）の単回ＩＰ注射が、３日間にわたって、生理食塩
水及びＰＥＧ化対照液処理のｏｂ／ｏｂマウスに比較し
て、処理したメスのｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取の有意
で持続的な低下と、体重増加の有意な低下をもたらすこ
とが明らかになった。これらの結果により、ＰＥＧ化ヒ
トｏｂ蛋白が、持続的な強力な生物学的活性を有し、遺
伝的に肥満のｏｂ／ｏｂマウスに対して期待通りの抗肥
満効果を有することが証明された。
【０１５７】
【表５】
【０１５８】データは、各群６匹のｏｂ／ｏｂマウスの
平均値である。食物摂取は、第１日目に単回ＩＰ注射
後、各実験日の３匹のマウスのケージについての平均１
日食物摂取量である。１日食物摂取の持続性の低下は、
ＰＥＧ化ｏｂ蛋白群のみであることに注意されたい。
【０１５９】
【表６】
【０１６０】データは、各群６匹のｏｂ／ｏｂマウスの
平均値である。第１日目のみに単回ＩＰ注射をマウスに
行った。体重の変化は、各実験日の体重の変化である。
持続性の体重減少は、ＰＥＧ化ｏｂ蛋白群のみであるこ
とに注意されたい。表中のＮＤは、測定しなかったこと
を示す。
【０１６１】
【配列表】（１）一般的情報 （ｉ）出願人： （Ａ）名称：エフ・ホフマン・ラ・ロシュ ＡＧ （Ｂ）番地：Grenzacherstrasse １２４ （Ｃ）市：バーゼル （Ｄ）州：ＢＳ （Ｅ）国：スイス （Ｆ）郵便番号：ＣＨ−４０７０ （Ｇ）電話：０６１−６８８ ４２ ５６ （Ｈ）ファックス：０６１−６８８ １３ ９５ （Ｉ）テレックス：９６２２９２／９６５５４２ ｈｌ
ｒ ｃｈ （ii）発明の名称：組換え肥満（ｏｂ）蛋白 （iii)配列の数：８ （iv）コンピュータ可読形態： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：アップル・マッキントッシュ （Ｃ）オペレーティング・システム：システム７．１
（マッキントッシュ） （Ｄ）ソフトウェア：Ｗｏｒｄ ５．０
【０１６２】（２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：７０２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号１：
【０１６３】
【表７】
【０１６４】（２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：該当せず （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号２：
【０１６５】
【表８】
【０１６６】（２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：該当せず （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号３：
【０１６７】
【表９】
【０１６８】（２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６９０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号４：
【０１６９】
【表１０】
【０１７０】（２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：該当せず （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号５：
【０１７１】
【表１１】
【０１７２】（２）配列番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：該当せず （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号６：
【０１７３】
【表１２】
【０１７４】（２）配列番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic) （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号７：
【０１７５】
【表１３】
【０１７６】（２）配列番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：該当せず （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）配列の種類：ペプチド （iii)ハイポセティカル：Ｎｏ （iv）アンチセンス：Ｎｏ （xi）配列番号８：
【０１７７】
【表１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトｏｂ蛋白の２つのクローン（即ちｈｏｂ−
ｃｌ１とｈｏｂ−ｃｌ２）の概略図であり、この概略図
は、ヒトｏｂのｃＤＮＡ配列の５′及び３′末端に位置
する制限部位の位置及び型を図示している。
【図２】ｐＬＰＰｓＯｍｐＡ−ｍｏｂ発現ベクターの構
築の概略図である。
【図３】ｐＬＰＰｓＯｍｐＡ−ｈｏｂ１発現ベクターの
構築の概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ルネ・デボ ベルギー国、ベー−8400 オステンド、 カーイストラート 24 ビュス １ (72)発明者 イーブ・ギーセ ベルギー国、ベー−8200 サント−アン ドリース・ブリュッヘ、ザンドストラー ト 209 (56)参考文献 特表 平９−506264（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ（1994）Ｖｏｌ．372, ｐ．425−432 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/47 C07K 19/00 C12P 21/00- 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号６のアミノ酸配列からなる、均
    質な生物学的に活性なヒトｏｂタンパク質。
  2. 【請求項２】 １６〜１８時間絶食させた、体重が少な
    くとも３０グラムの成熟肥満ｏｂ／ｏｂマウスに、Hale
    y及びMcCormickの方法を使用して２０μg以下の用量で
    脳室内注射により投与するとき、そのタンパク質が５時
    間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注射した対照
    マウスに比較して少なくとも５０％低下させる、他の哺
    乳動物のタンパク質を含まない生物学的に活性な組換え
    ヒトｏｂタンパク質である、請求項１記載のタンパク
    質。
  3. 【請求項３】 哺乳動物の食物摂取を低下させ、かつ哺
    乳動物の体重増加速度を低下させる生物学的活性を有す
    ることを特徴とする、請求項１又は２記載のタンパク
    質。
  4. 【請求項４】 配列番号３のアミノ酸配列からなる、均
    質な生物学的に活性なマウスｏｂタンパク質。
  5. 【請求項５】 １６〜１８時間絶食させた、体重が少な
    くとも３０グラムの成熟肥満ｏｂ／ｏｂマウスに、Hale
    y及びMcCormickの方法を使用して２０μg以下の用量で
    脳室内注射により投与するとき、そのタンパク質が５時
    間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注射した対照
    マウスに比較して少なくとも５０％低下させる、他の哺
    乳動物のタンパク質を含まない生物学的に活性な組換え
    マウスｏｂタンパク質である、請求項４記載のタンパク
    質。
  6. 【請求項６】 哺乳動物の食物摂取を低下させ、かつ哺
    乳動物の体重増加速度を低下させる生物学的活性を有す
    ることを特徴とする、請求項４又は５記載のタンパク
    質。
  7. 【請求項７】 ａ）プロモーター配列、及びｂ）配列番
    号３のマウスｏｂタンパク質又は配列番号６のヒトｏｂ
    タンパク質と、大腸菌の外膜プロテインＡのシグナルペ
    プチドとを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配
    列、 を含む、大腸菌宿主細胞中で該融合タンパク質を発現さ
    せることができる発現ベクター。
  8. 【請求項８】 プロモーターが、ｌａｃ−プロモーター
    −オペレーター及びリポタンパク質プロモーターの両方
    よりなる、請求項７記載の発現ベクター。
  9. 【請求項９】 マウスｏｂタンパク質が配列番号３のア
    ミノ酸配列からなり、ヒトｏｂタンパク質が配列番号６
    のアミノ酸配列からなる融合タンパク質。
  10. 【請求項１０】 次の第一及び第二部分を含むＤＮＡ配
    列からなり、 （ａ）第一部分が、ｓＯｍｐＡペプチドをコードする配
    列番号７のｓＯｍｐＡ遺伝子配列であり；そして （ｂ）第二部分が、請求項４のマウスｏｂタンパク質を
    コードするヌクレオチド配列、又は請求項１のヒトｏｂ
    タンパク質をコードするヌクレオチド配列である、 ＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】 マウスｏｂタンパク質が配列番号３の
    アミノ酸配列を含み、ヒトｏｂタンパク質が配列番号６
    のアミノ酸配列を含む、請求項１０記載のＤＮＡ。
  12. 【請求項１２】 請求項７記載の発現ベクターで形質転
    換された大腸菌宿主生物。
  13. 【請求項１３】 他の哺乳動物のタンパク質を含まない
    生物学的に活性な組換えヒト又はマウスｏｂタンパク質
    を製造する方法であって、以下の工程： ａ）プロモーター配列、及び配列番号３又は配列番号６
    のタンパク質と大腸菌の外膜プロテインＡのシグナルペ
    プチドとを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列
    を有する発現ベクターを構築し； ｂ）この発現ベクターを大腸菌宿主中に挿入して大腸菌
    宿主細胞を形質転換し； ｃ）大腸菌宿主細胞中で融合タンパク質を発現させ；そ
    して ｄ）大腸菌宿主細胞を冷浸透圧ショック緩衝液で処理し
    て、他の哺乳動物タンパク質を含まず、かつシグナルペ
    プチドを含まない、マウス又はヒトｏｂタンパク質を遊
    離させる、 ことを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１のヒトｏｂタンパク質又は請
    求項４のマウスｏｂタンパク質を含有する浸透圧液に、
    陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作
    用カラムクロマトグラフィー及びゲル濾過の組合せを行
    うことを特徴とする、１６〜１８時間絶食させた、体重
    が少なくとも３０グラムの成熟肥満ｏｂ／ｏｂマウス
    に、Haley及びMcCormickの方法を使用して２０μg以下
    の用量で脳室内注射により投与するとき、そのタンパク
    質が５時間の給餌試験の間の食物摂取を、賦形剤を注射
    した対照マウスに比較して少なくとも５０％低下させ
    る、均質な生物学的に活性な組換えヒト又はマウスｏｂ
    タンパク質を製造する方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜６のいずれか１項記載のヒ
    ト又はマウスｏｂタンパク質にポリエチレングリコール
    及び／又はポリプロピレングリコールが結合した１つ以
    上のコンジュゲートを含む組成物であって、この組成物
    中の該コンジュゲートのポリエチレン又はポリプロピレ
    ングリコール単位の平均分子量が１５kDa 〜６０kDa の
    間である組成物。
  16. 【請求項１６】 式（Ｉ−Ａ）： 【化１】 （式中、Ｐは、請求項１〜６のいずれか１項記載のヒト
    又はマウスｏｂタンパク質であり；ｎ及びｎ′は、合計
    が３００〜１，５００の整数であり；この組成物中の該
    コンジュゲート中のポリエチレングリコール単位の平均
    分子量が１５kDa〜６０kDa であり；そしてＲ及びＲ′
    は、低級アルキルである）で示される１つ以上のコンジ
    ュゲートを含む組成物。
  17. 【請求項１７】 式（Ｉ−Ｂ）： 【化２】 （式中、Ｐは、請求項１〜６のいずれか１項記載のヒト
    又はマウスｏｂタンパク質であり；ｎは、３００〜１，
    ５００の整数であり；この組成物中の該コンジュゲート
    中のポリエチレングリコール単位の平均分子量が１５kD
    a 〜６０kDa であり；そしてＲは、低級アルキルであ
    る）で示される１つ以上のコンジュゲートを含む組成
    物。
  18. 【請求項１８】 請求項１〜６のいずれか１項記載のヒ
    ト又はマウスｏｂタンパク質、あるいは請求項１５〜１
    ７のいずれか１項記載の組成物を含有する医薬。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜６のいずれか１項記載のヒ
    ト又はマウスｏｂタンパク質、あるいは請求項１５〜１
    ７のいずれか１項記載の組成物を含有する肥満及び関連
    疾患の治療、予防及び制御のための医薬。
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