CZ129796A3

CZ129796A3 - Recombinant obese (ob) proteins

Info

Publication number: CZ129796A3
Application number: CZ961297A
Authority: CZ
Inventors: Arthur Campfield; Rene Devos; Ives Guisez
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 1997-01-15
Also published as: HUP9601120A2; ES2093593T1; PL186568B1; SV1996000030A; HU220093B; JPH093098A; CA2175298A1; EP0741187A2; DE741187T1; YU26596A; HRP960213A2; GR960300075T1; NO961796D0; UY24219A1; MX9601655A; IL118059A0; KR960041194A; TNSN96066A1; NO961796L; AU688210B2

Description

Obezita se uvádí jako nejběžnější nutriční porucha v západních společnostech /Zhang, Y. a kol., Nátuře 372, 425-432 (1994)/. Více než 3 z 10 dospělých Američanů má hmotnost alespoň o 20 % vyšší, než je jejich ideální hmotnost /Zhang, Y. a kol., viz výše/. Zvýšená tělesná hmotnost je všeobecným zdravotním poblémem, poněvadž je spojena s důležitou lékařskou nemocností jako je diabetes mellitus typ II (to je neinzulinově závislá diabetes mellitus), hypertenze a hyperlipidemie /Grundy, S.M. a Barnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990)/. Existuje důkaz, že tělesná hmotnost je fyziologicky regulována a obezita (a související stavy nebo nemoce) jsou zčásti ovlivněny poruchami v této regulaci /Zhang, Y. a kol., viz výše/.

U hlodavců je popsáno 7 jednotlivých genových mutací, které vedou k obéznímu fenotypu, z nichž 5 je přítomno u myší.

Z těchto 7 rodentních modelů jako jeden z nejintenzivněji studovaných je obézní (ob) genová mutace u myší identifikovaná v roce 1950 /Ingals, A.M. a kol., J. Hered. 41, 317-318 (1950)/. Homozygotní myši pro tuto ob genovou mutaci jsou hluboce obézní, vyvíjejí diabetes mellitus typ II a jsou hyperfagické a hypometabolické jako součást syndromu podobného morbidní obezitě u člověka /Friedman J.M. a kol. Genomics 11, 1054-1062, (1991)/. Tento ob gen je mapován na myším proximálním chromozomu 6 a kóduje protein (to je ob protein expresovaný v adipózní tkáni /Zhang, Y. a kol. viz výše/. Homozygotní myši pro tuto ob genovou mutaci téměř nemají žádnou produkci tohoto ob proteinu a proto mají defektivní regulaci tělesné hmotnosti vedoucí k obezitě.

Myší nebo lidské ob poteiny mohou být podávány pacientům trpícím defekty nebo mutacemi v jejich odpovídajícím obézním (ob) genu, kteréžto defekty nebo mutace brání nebo interferují s produkcí a/nebo funkcí ob proteinů při modulaci tělesné hmotnosti. Tyto proteiny mohou být tudíž použity jako hormonovité substance pro potlačování, prevenci nebo léčení obezity a s ní spojených nemocí a stavů u člověka a zvířat.

K použití myší nebo lidské ob proteiny mohosu být podávány pomocí injekcí různými způsoby jako jsou intraperitoneální, intravenozní, intramuskulární nebo subkutánní, v opakovaných dávkách. Protože se podávání provádí často injekcemi, je důležité, aby myší nebo lidské proteiny byly vyčištěny výhodně do homogenity, byly bez kontaminačních proteinových látek a byly rekombinantně expresovány v rozpustné a biologicky akivní formě. Obecně je praktikům známo, že nečistoty přítomé v in>

jektovatelném léčení mohou často vést k toxickým postranním účinkům nebo nepříznivým imunologickým odezvám.

Zatímco myší ob genová sekvence je zveřejněna v Zhang, Y. a kol., viz výše, žádné způsoby exprese murinového ob proteinu nebo jeho lidského potejšku nejsou uváděny, přičemž se mnohem méně vyrábějí tyto proteiny v biologicky aktivním a rozpustném stavu, z kterého mohou být tyto proteiny vyčištěny k homogenitě. Dále je důležité a je to objektem tohoto vynálezu, expresovat a produkovat vyšší nebo lidské ob proteiny v homogenním rozpustném a biologicky aktivním stavu.

Bylo zjištěno, že rekombinantní lidské a myší ob proteiny mohou být expresovány v biologicky aktivním a rozpustném stavu a pak vyčištěny na homogenitu vhodnou pro injekce pacientům k léčení, prevenci nebo potlačování obezity a s ní spojených stavů a nemocí jako je diabetes mellitus typ II, hypertenze, hyperlipidemie a podobně.

Podstata vynálezu i

Podle tohoto vynálezu lidské a myší ob proteiny mohou být produkovány rekombinantně v biologicky aktivní formě a vyčištěny k homogenitě nejdříve vytvořením nových expresivních vektorů pro Escherichia coli (E. coli). Tyto expresivní vektory obsahují promotor a DNA sekvenci, kterážto DNA sekvence kóduje fúzovaný protein obsahující dvě části: signální peptid vnějšího membránového proteinu A E.coli (to je sOmpA) a lidský nebo myší ob protein.

Podle tohoto vynálezu další stupeň pro produkci biologicky aktivní rekombinantní formy myších a lidských proteinů je zavedení tohoto expresivního' vektoru v E.coli hostiteli, čímž se získá výkonná exprese a translokace fúzovaného proteinu do periplazmického prostoru (to je mezi vnitřní a vnější buněčnou membránu E.coli mikroorganizmu), v kterémžto bodě se signální peptid excizuje z ob proteinu zanechávaje ob protein v rozpustné a biologicky aktivní formě.

-W

Dále jsou ob proteiny účinně sekretovány v rozpustné a biologicky aktivní formě do bezbuněčného media, načež následuje úprava hostitelských E.coli buněk do chladného osmotického šoku, v kterémžto bodě se ob proteiny vyčistí do homogenity postupným použitím aniontoměnné chromatografíe, hydrofobní interakční sloupcové chromatografíe a gelové filtrace, prováděným v tomto pořadí.

Předložený vynález je také zaměřen na

1/ expresivní vektor obsahující DNA kódující fúzovaný protein obsahující sOmpA signální peptid a lidský nebo myší ob protein,

2/ na hostitelský organismus transfektovaný nebo transformovaný takovýmto expresivním vektorem,

3/ na DNA sekvenci kódující lidský ob protein a

4/ polyethylen nebo polypropylenglykol konjugáty ob proteinu.

Předložený vynález je dále zaměřen na způsoby exprese rekombinantních lidských a myších ob proteinů v biologicky aktivním a rozpustném stavu a na produkci těchto proteinů v čisté homogenní formě vhodné pro podání zvířatům nebo lidem.

Způsob pro expresi a produkci myšího Ob proteinu podle tohoto vynálezu se dosáhne využitím myšího ob genu jak je uváděno Zhangem a kol., viz výše, sekvence pro kterýžto gen je 702 párů bází (bp) nukleotidové sekvence identifikované zde jako SEKV ID Č: 1. Tato myší ob genová sekvence obsahuje 501 bp kódující sekvence nebo otevřeného čtecího rámce (ORF) vycházejícího se startovacím kodónem v nukleotidu 36 a končícího s terminačním kodónem v nukleotidu 537 a majícího netranslatované sekvence v jak 3'-, tak 5' koncích. ORF obsahuje 63 bp signální sekvence z nukleotidu 36 až 98.

Tato myší ob genová sekvence (SEKV ID Č : 1) kóduje myší ob protein (plus jeho signální sekvenci) jehož aminokyselinová sekvence je 167 aminokyselin po délce a je identifikován jako SEKV ID Č : 2.

V tomto proteinu SEKV ID Č : 2 prvních 21 aminokyselin předsta vuje signální sekvenci myšího ob proteinu. Úplný myší ob protein (s jeho signální sekvencí) zasahuje od aminokyseliny 22 (Val) k aminokyselině 167 (Cys) a je představen SEKV ID Č : 3.

Způsob pro expresi a produkci lidského ob proteinu podle tohoto vynálezu se získá využitím lidského ob genu, přičemž sekvence pro tento gen je 690 bp nukleotidní sekvence identifikované zde jako SEKV ID Č : 4.

Zhang, Y. a kol. viz výše, uvádí lidský ob gen jako vysoce homologní s vyšším ob genem a zveřejňuje konvenční způsob využití oligonukleotidových zkoušek zaměřených na myší ob gen, které mohou být využity

1/ k roztřídění cDNA banky klonů odvozených z lidské tukové tkáně,

2/ k identifikaci těchto klonů majících lidský ob gen, a

3/ k izolaci a sekvencování lidské ob genové sekvence.

Když se sekvencuje konvenčními prostředky, je tato lidská ob genová sekvence určená, aby měla nukleotidovou sekvenci SEKV ID Č : 4.

Jako u myšího ob genu lidský ob gen obsahuje 501 bp kódující sekvence nebo otevřeného čtecího rámce (ORF) vycházeje s startovacím kodónem u nukleotidu 37 a konče s terminačním kodónem u nukleotidu 538 a maje netranslatovanou sekvenci u jak 3' tak 5' konců. ORF obsahuje 63 bp signální sekvence z nukleotidu 37 až 99.

Tato lidská ob genová sekvence (SEKV ID Č : 4) kóduje lidský ob protein plus jeho signální sekvenci, jejíž aminokyselinová sekvence 167 aminokyselin v délce je identifikována jako SEKV ID Č : 5.

Prvních 21 aminokyselin tohoto proteinu ze 167 aminokyselin v délce představuje signální sekvenci.

6Úplný lidský ob protein (bez jeho signální sekvence) zasahuje od aminokyseliny 22 (Val) k aminokyselině 167 (Cis) a je představen SEKV ID Č : 6.

Zhang, Y. a kol., viz výše, uvádí 84%ní identitu mezi myšími a lidskými ob proteiny. Zhang, Y. a kol., viz výše, také uvádějí, že varianty lidských a myších proteinu existují, přičemž jedna takováto varianta je vyznačena u obou druhů delecí glutaminu 49. Přibližně 30 % cDNA klonů v bankách odvozených z myší adipózní tkáně a lidské adipózní tkáně má chybějící kodón 49 (Zhang, Y. a kol., viz výše).

Následující výrazy mají dále uvedený význam:

myší ob protein (mob) - se týká proteinu SEKV ID Č : 3, jehoi biologické vlastnosti ve vztahu k léčení,’ potlačování nebo prevenci obezity nebo s ní spojených stavů a nemocí. Specificky je myší ob protein definován tak, že zahrnuje jakýkoli protein nebo polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která je v podstatě homologní s aminokyselinovou sekvencí SEKV ID Č : 3 a dále mající následující biologické aktivity:

1) když se protein nebo polypeptid podává intracerebroventrikulární (ICV) injekcí 16 až 18 hodin hladovějícím dospělým obézním ob/ob myším majícím tělesnou hmotnost alespoň 30 g v dávce 20 mikrogramů nebo méně za použití postupů podle Haleyho a McCormicka, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957), pak protein nebo polypeptid:

(a) snižuje příjem potravy během 5 hodinového krmícího testu o 50 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED50 pro snížení příjmu potravy), a (b) snižuje přírůstek tělesné hmotnosti během 24 hodin po ICV injekci o alespoň 50 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED50 pro snížení přírůstku tělesné hmotnosti),

2) když se protein nebo polypeptid podá intraperitoneálně (IP), nevyhladovělým dospělým ob/ob myším o tělesné hmotnosti alespoň 30 g 2 x denně na začátku dne a znovu v 3hodinovém bodu temnotní fáze po dobu 1 dne v celkové denní dávce 20 mikrogra mů nebo méně, protein nebo polypeptid:

(a) snižuje 5 a 24 hodinový příjem potravy o alespoň 20 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED2O pro snížení příjmu potravy), a (b) snižuje přírůstek tělesné hmotnosti během 24 hodin po první IP injekci o aleslpoň 20 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED20 pro snížení přírůstku tělesné hmotnosti.

Jak je zde použit výraz myší ob protein, zahrnuje takové proteiny, které jsou záměrně modifikovány například místně řízenoumutagenesí nebo případně mutacemi.

Lidský ob protein (hob) - se týká proteinu SEKV ID Č : 6, jehož biologické vlastnosti^ve^Uvztahu k léčení, potlačování nebo prevenci obezity nebo s ní spojenými stavy a nemocemi.

Specificky je lidský ob protein definován tak, že zahrnuje jakýkoli protein nebo polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci, která je v podstatě homologní s aminokyselinovou sekvencí SEKV ID Č : 6, a dále mající následující biologické akivity:

1) když se protein nebo polypeptid podává ICV 16 až 18 hodin vyhladovělé dospělé obézní ob/ob myši mající tělesnou·hmotnost alespoň 30 g v dávce 20 mikrogramů nebo méně za použití způsobů Haleyho a McCormicka, viz výše, protein nebo polypeptid:

(a) snižuje příjem potravy během 5hodinového krmného testu o 50 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED 50 pro snížení příjmu potravy), a (b) snižuje přírůstek tělesné hmotnosti během 24 hodin po

ICV injekci o alespoň 50 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED 50 pro snížení přírůstku 4 tělesné hmotnosti),

2) když se protein nebo polypeptid podává IP nevyhladovělým dospělým ob/ob myším majícím tělesnou hmotnost alespoň 30 g 2 x denně na začátku dne a znovu v 3hodinovém bodě temnotní fáze, po dobu 1 týdně v celkové denní dávce 20 mikrogramů nebo méně, protein nebo polypeptid:

(a) snižuje 5 a 24hodinový příjem potravy o alespoň 20 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED20 pro snížení příjmu potravy), a (b) snižuje přírůstek-'tělesné hmotnosti během 24 hodin po první IP injekci o alespoň 20 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED 20 pro snížení přírůstku tělesné hmotnosti).

Jak je zde použit výraz lidský ob protein, zahrnuje takové proteiny, které jsou záměrně modifikovány jako například místně usměrněnou mutagenezí nebo případně mutacemi.

Výraz v podstatě homologní - který se může týkat jak sekvencí nukleových kyselin, tak aminokyselinových sekvencí, znamená, že příslušná sekvence subjektu, například mutantní sekvence se mění z referenční sekvence jednou nebo více substitucemi, delecemi nebo adicemi, jejichž výsledný efekt nemá za následek nepříznivé funkční odlišnosti mezi referenčními a subjektovými sekvencemi.

Pro účely tohoto vynálezu sekvence mající větší než 95% homologii, ekvivalentní biologické vlastnosti a ekvivalentní expresivní vlastnosti se považují za v podstatě homologní.

Pro účely určeni homologie by se zkomolení zralé sekvence nemělo brát na vědomí. Sekvence mající menší stupně homologie, srovnatelnou bioaktivitu a ekvivalentní expresivní vlastnosti se považují za v podstatě ekvivalentní. Obecně mohou být homologní DNA sekvence identifikovány cross-hybridizací za standardních hybridizačních podmínek průměrné přísnosti.

Fragment - myšího nebo lidského ob proteinu znamená jakýkoli protein nebo polypeptidy, mající aminokyselinovou sekvenci části nebo fragmentu myšího nebo lidského ob proteinu, a který má biologickou aktivitu příslušného myšího nebo lidského proteinu. Fragmenty zahrnují proteiny nebo polypeptidy produkované proteolytickou degradací myších nebo lidských ob proteinů nebo produkovaných chemickou syntézou způsoby běžně známými.

Ob protein nebo jeho framgent je - biologicky aktivní - když podání tohoto proteinu nebo jeho fragmentu savci včetně člověka snižuje příjem potravy a snižuje míru hmotnostního přírůstku u tohoto savce. Určení takovéto biologické aktivity lidského nebo myšího proteinu se může provádět konvenčními dobře známými testy užívanými pro takovéto účely na jednom nebo více druzích savců zejména obézní ob/ob myši. Některé z těchto testů, které mohou být použity pro demonstraci této biologické aktivity, jsou zde popsány. Při určování biologické aktivity podle ICV testu u ob/ob myši je zde popsáno, přičemž lidský nebo myší ob protein má výhodně ED50 pro snížení příjmu potravy 20 mikrogramů nebo méně a ED50 pro snížení přírůstku tělesné hmotnosti 20 mikrogramů nebo méně. Alternativně při určeování biologické aktivity lidského nebo myšího proteinu podle OP testu u ob myší jak je zde popsáno má lidský nebo myší ob protein výhodně ED20 pro snížení příjmu potravy 20 mikrogramů nebo méně a ED20 pro snížení přírůstku tělesné hmotnosti 20 mikrogramů nebo méně.

Obecně jsou výhodné fragmenty, které vykazují výše uvedenou biologickou aktivitu.

Replikon - je jakýkoli genetický element (například plazmid, chromozom, virus), který působí jako autonomní jednotka DNA replikace in vivo, to je schopný replikace za svého vlastního řízení.

Expresivní vektor - je replikon jako je plazmid, fág nebo kosmid, ke kterému může být připojen další DNA segment, takže se vyvolá replikace připojeného segmentu. Zahrnuje to transkripční jednotku obsahující soubor (1) genetického elementu nebo elementů majících regulační roli při expresi genů, například promotory nebo zesilovače, (2) strukturální nebo kódovací sekvenci, která se transkribuje do mRNA a převádí do proteinu a (3) příslušných transkripčních, iniciačních a terminačních sekvencí .

Klon - je skupina DNA molekul odvozených z jedné původní délky DNA sekvencí a produkovaná bakterií nebo virem za použití technologií genetického inženýrství, často zahrnující plázmidy.

Signální sekvence - je sekvence nukleové kyseliny uložená na počátku (5' - konec) kódovací sekvence proteinu, jenž má být expresován. Tato signální sekvence kóduje signální peptid, N-terminál k nově syntetizovanému proteinu, který směruje hostitelskou buňku k translokaci proteinu k nebo skrz hostitelskou buněčnou membránu a kterýžto signální peptid je obvykle excizován během této translokace.

Startovací kodón je kodón obvykle ATG uložený v kódovací sekvenci proteinu a obvykle na 5' - konci a signalizuje první aminokyselinu v proteinové sekvenci.

Terminační kodón - je nesmyslný kodón uložený v, a obvykle na 3' - konci, kódovací sekvenci proteinu a signalizuje konec rostoucího polypeptidového řetězce.

Otevřený čtecí rámec (ORF) - je lineární uspořádání kodónových tripletů v dvouřetězcové DNA kódující aminokyselinovou sekvenci v buňce in vitro nebo in vivo,když jsou uloženy pod řízením příslušných regulačních sekvencí. Hranice ORF jsou určeny startovacím kodónem v 5' - konci a terminačním kodónem v 3' - konci. Může být také označen jako kódující sekvence.

Promotorova sekvence - je DNA regulační oblast schopná vázat RNA polymerasu v buňce a iniciující transkripci po směru exprese genu (3'-směr) otevřeného čtecího rámce jednoho nebo více strukturálních genů. Promotorová sekvence je obvykle uložena na 5'-konci signální sekvence nebo otevřeného čtecího rámce a probíhá proti směru exprese v 5'-směru, aby zahrnovala mini mální počet bází nebo elementů nutních k iniciaci transkripce polypeptidu v úrovni zaznamenatelné oproti pozadí.

Kódující sekvence ORF je pod řízením promotorové sekvence, když RNA polymerasa transkribuje kódující sekvenci do mRNA.

Složení obsahující A, (kde A je jeden polypeptid) je homogenní pro A, když tam není žádné zjistitelné množství kontaminujících proteinů nebo jiných endogenních látek, při zjišťování konvenčními prostředky například zbarvením polyakrylamidových gelů. Pro účely tohoto vynálezu výraz homogenní se má vztahovat na složení obsahující jeden protein nebo polypeptid, když alespoň 95 % hmotnostních tohoto složení má tento jeden protein nebo polypeptid.

Následující kroky nastiňují způsoby pro rekombinantní expresi lidských a myších ob proteinů v biologicky aktivním a rozpoustném bezbuněčném stavu, prostých jiných savčích proteinů, z kterých ob proteiny pak mohou být vyčištěny do homogenity.

Tyto kroky jsou příkladně detailně uvedeny v příkladech provedení . .

1) Získání myších a lidských ob genů cDNA (SEKV ID Č:l) kódující myší ob protein plus jeho přirozenou signální sekvenci je..publikován ve výše uvedené publikaci Zhang, Y. a kol. Tato myší cDNA byla izolována a zesílena PCR technologií za použití oligodeoxynuklotidových DNA primerů konvenčními technologiemi. Tyto DNA primery a způsob jejich získání jsou popsány v Zhang, Y. a kol., viz výše.

cDNA (SEKV ID Č:4) kódující lidský ob protein plus jeho přirozenou signální sekvenci se získá za použití týchž oligodeoxynukleotidových DNA primerů, jaké jsou použity v Zhang, Y. a kol., viz výše, k získání myšího ob genu. Při použití konvenčních technologií byla tato cDNA izolována z lambda fágové cDNA banky vyrobené z RNA odvozené z lidské adipocytové tkáně.

Lidská nebo myší ob cDNA může být získána nejen z cDNA bank, ale také jinými konvenčními prostředky, například chemickou syntézou nebo klonováním genomické DNA nebo jejími fragmenty vyčištěnými od požadovaných buněk. Tyto postupy jsou popsány Sambrookem a kol. v DNA Cloning: A Practical Approach, sv. I a II, vydal D.N.Glover, ed. 1985, MRL Press, Ltd., Oxford U.K., Benton a Davis, Scienc 196, 180-182 (1977), a Grunstein a Hogness, Proč. Nat. Acad. Sci. 72, 3961-3965 (1975).

Pro získání lidské nebo myší ob cDNA z cDNA bank se cDNA banky třídí konvenčními DNA hybridizačními technologiemi způsoby Bentona a Davise, viz výše, nebo Grunsteina a Hognesse, viz výše, za použití primerů připravených reveresní transkripcí polyadenylované RNA izolované z myších adipózních buněk obsahujících myší ob gen. Klony, které hybridizují na primery se analyzují restrikčním endonukleasovým štěpením, agarosovou gelovou elektroforézou a dalšími hybridizačnmími experimenty (Sauthernovy přenosy) zahrnujícími elektrofozované prifnery. Po izolaci různých klonů, které hybridizovaly na myších cDNA sondách,se hybri dizující segment jednoho klonu subklonuje a sekvencuje konvenčními technologiemi.

Klony odvozené z genomické DNA mohou obsahovat regulační a intronové DNA oblasti navíc ke kódujícím oblastem: klony odvo zené od cDNA nebudou obsahovat intronové sekvence. Při molekulárním klonování genu z genomické DNA se vytvoří DNA fragmenty, z nichž některé budou kódovat požadovaný gen. DNA může být štěpena na určitých místech pomocí různých restrikčních enzymů.

Alternativně se mohou použít DNA v přítomnosti manganu k dělení DNA nebo DNA může být fyzikálně přerušena, například sonikací. Lineární DNA fragmenty pak mohou být odděleny podle velikosti standardními technologiemi včetně, ale bez omezení, agarosové a polyakrylamidové gelové elektroforézy a sloupcové chromatografie.

Jakýkoli zdroj, lidský nebo myší ob gen může být molekulárně klonován do vhodného vektoru pro propagaci genu známými způsoby. Může být použit jakýkoliů komerčně dostupný vektor. Například myší cDNA může být insertována do pCDNA3 ^a lidská cDNA může být inzertována do pBluescriptSk vektoru

Příslušné vektory pro použití u bakterálních hostitelů jsou popsány Pouwelsem a kol. v Cloning Vectors: A Labortory Manuál, 1985, Elsevier, N.Y. Jako představitel neomezujícího příkladu mohou užitečné klonovací vektory pro bakteriální použití obsahovat selektovaný markér a’ bakteriální originál replikace odvozené z komerčně dostupných plazmidů, které jsou naopak odvozeny z dobře známého klonovacího vektoru pBR322 (ATCC 37017). Takovéto komerční vektory zahrnují například pKK223-3 (Pharmcia Fiůne Chemicals, Uppsala, Švédsko) a pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisc., USA).

>

Nukleotidové sekvence lidského nebo myšího ob genu insertované v těchto komerčně dostupných vektorech mohou být ověřeny známými způsoby, technologiemi standardního nukleotidového sekvencování.

Jiné nukleové kyseliny, které kódují ob proteiny druhů jiných, než jsou lidé nebo myši, zde mohou být použity. Podle toho, zatímco specifická DNA byla klonována a sekvencována ve vzta hu k lidskému a myšímu ob genu, jakýkoli živočišný adipocyt může být potenciální použit jako zdroj nukleové kyseliny ob proteinu.

2) Konstrukce expresivního vektoru pro lidský a myší ob protein

Lidský nebo myší ob gen klonovaný způsoby výše popsanými se použije ke konstrukci expresivních vektorů pro lidské a myší ob proteiny.

Pro expresi biologicky aktivního lidského a myšího ob proteinu tranfektovanou nebo transformovanou E. coli hostitelskou buňkou a pro sekreci ob proteinu do periplazmy se může využít nový expresivní vektor. Tento expresivní vektor zahrnuje promotor a DNA sekvenci kódující a fúzní protein. Fúzní protein sestává ze dvou částí: první část je signální peptid pro vnější membránový protein A z E.coli ((sOmpA) a druhá část fúzního proteinu je lidský nebo myší protein (minus jeho vlastní přirozené signální sekvence).

DNA sekvence kódující tento fúzní protein také sestává ze dvou částí: první část, která kóduje sOmpA peptid a druhá část, která kóduje myší nebo lidský ob protein (minus jejich přirozené signální sekvence). První část DNA sekvence, která kóduje , , .De sOmpA peptid, je signální sekvence popsana Sutterem K. a kol., Gene 141, 163-170 (1994) a má nukleotidovou sekvenci SEKV ID Č:7 Druhá část dvoudílné DNA sekvence kóduje myší nebo lidské ob proteiny a.má nukleotidovou sekvenci SEKV ID Č:1 nebo SEKV ID Č:2, bez té části nukleotidové sekvence, která kóduje příslušné přirozené signální sekvence.

Signální peptid kódovaný sOmpA signální sekvencí SEKV ID Č:7, má aminokyselinovou sekvenci SEKV ID Č:8, jak uvádí De Sutter, K. a kol.,, viz výše.

Nový expresivní vektor tohoto vynálezu se zajistí inzercí promotoru a DNA sekvence kódující fúzní protein do konvenčního expresivního vektoru vhodného pro expresi rekombinantních proteinů v E.coli hostitelských buňkách.

Při konstrukci tohoto nového expresivního vektoru podle tohoto vynálezu může být použit jakýkoli promotor pokud je schop ný řídit transkripci fúzního proteinu obsahujícího sOmpA peptid a ob protein v E.coli hostitelské buňce. Když se použije sOmpA jako signální peptid, je výhodné použít jak lac-operátorového promotoru (^p°j_ac) tak lipoproteinového promotoru (Ρ^^) ·

Jiné užitečné promotory pro takovouto expresi v E.coli zahrnují T7 RNA polymerasový promotor popsaný Studierem a kol.,

J. Mo. Biol. 189, 113-130 (1986), lacz-promotor popsanmý Lauerem, J. Mol. Appl. Genet. 1, 139-147 (1981) a dostupný z American Type Culture Collection (ATCC) jako ATCC 37121, tac-promotor popsaný Maniatisem v Molekular Clonin: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 1982 a dostupný jako ATCC 37138, promotor alkalické fosfatasy (phoA) a trp-promotor popsaný Goeddelem a kol., Nucleic Acids Research 8, 4057-4075 (1980).

Jiné promotory byly zjištěny a využity v E.coli a detaily týkající se jejich nukleotidových sekvencí umožňující odborníkům funkčně je vázat s expresivním vektorem tohoto vynálezu jsou popsány (Siebenlist a kol., Cell 20, 269-281 (1980).

Specificky expresivní vektor obsahuje:

a) promotorovou sekvenci a

b) DNA sekvenci kódující fúzní protein, kterýžto fúzní protein obsahuje myší ob protein SEKV ID Č:3 nebo lidský ob protein SEKV ID Č:6 a signální peptid pro vnější membránový protein A E.coli.

Dále je popsán způsob pro konstrukci tohoto nového expresivního vektoru. Tento způsob je dále detailován v příkladech provedení a zobrazen na obr. 2 a 3.

Nejdříve je kódující sekvence lidského nebo myšího ob genu (bez jeho přirozené signální sekvence) začleněn do plazmidu obsahujícího sOmpA signální sekvenci, jako je plazmid pTlOsOmpArPDI. Tento pTlOsOmpArPDR plazmid a jeho konstrukce a příprava jsou popsány De Sutterem, K. a kol., viz výše. Jak je jednou začleněn do tohoto plasmidu, lidský nebo myší ob gen je fúzován do tohoto sOmpA genu, čímž se vytvoří hybridní genová sekvence v tomto plazmidu.

Tento sOmpA gen musí být proti směru 5'-oblasti ob gen kódující sekvence. Pak promotory jak jsou vyčísleny výše a výhodně lipoproteinový promotor ^a lac-promotor-operátor (PO^_ac) se začlení do tohoto plazmidu obsahujícího hybridní genovou sekvenci, čímž se vytvoří expresivní vektor tohoto vynálezu. Dvě provedení tohoto expresivního vektoru jsou identifikována jako pLPPsOmpA mob a pLPPsOmpA hobl a jsou zobrazeny v obr. 2 a 3.

Jakýkoli způsob nebo postup dosud známý pro konstrukci takovéhoto plazmidu může být použit. Navíc pořádek, jakým se fúzují sOmpA a ob genové sekvence, začleňují genové sekvence do vhodného plazmidu a začleňuje se promotor, aby se dospělo k expresnímu vektoru tohoto vynálezu, není kritický. Například sOmpA genová sekvence může být zpočátku fúzována do myší nebo lidské ob genové sekvence přímo k vytvoření hybridní genové sekvence a pak se tato hybridní sekvence inzertuje do plazmidu majícího již začleněny příslušné promotory. Je však nutné, aby sOmpA genová sekvence byla proti směru exprese v 5'-konci myší nebo ob genové sekvence.

Bylo objeveno, že při použití tohoto nového expresivního vektoru a zejména při použití signální sekvence kódující sOmpA, mohou být myší nebo lidské proteiny translokovány do periplazmického prostoru, kde se signální peptid příslušně štěpí zanechávaje neporušený lidský nebo myší protein v rozpustné a biologicky aktivní formě.

Jakmile jsou v tomto periplazmickém prostoru, jsou ob proteiny účinně sekretovány do buněčného volného prostředí bez jiných savčích proteinů po podrobení hostitelských buněk chladicímu osmotickému šoku, v kteréžto době ob proteiny mohou být čištěny do homogeniny v biologicky aktivní formě.

3) Exprese lidských nebo myších ob proteinů v transformovaných E.coli buňkách

Dále expresivní vektory konstruované podle výše popsaných postupů se inzertují do hostitelské E.coli buňky k transformaci E.coli buňky. Může být použit jakýkoli kmen E.coli, jako je E.coli K-12 kmen 294, jak je popsáno v britském patentovém spisu číslo 2055382 A (ATCC č. 31446). Jiné kmeny užitečné podle tohoto vynálezu zahrnují E.coli MC1061 /Casadaban a Cohen, J.Mol. Biol. 138, 179-207 (1980)/, E.,coli’ Β, E. coli X 1776 (ATTC č. 31537), a E. coli W 3110 (ATCC č. 27325) nebo jiné kmeny, z nichž mnoho je uloženo a jsou dostupné z uznaných uklá dacích zařízení mikroorganismů.

Transformované E. coli buňky jsou vypěstovány na příslušnou buněčnou hustotu a jsou opatrovány standardními postupy.

Při takovémto růstu a pěstování transformovaných E. coli hostitelů exprese vektorů tohoto vynálezu účinně a výkonně umožňuje expresi myších a lidských ob proteinů a translokaci těchto proteinů do periplazmy hostitelských E. coli buněk v rozpustné a biologicky aktivní formě.

Signální peptid sOmpA, (to je část 1 fúzního proteinu) se štěpí během translokace fúzního proteinu do periplazmy, čímž se získá biologicky aktivní ob protein bez jiných savčích proteinů nebo polypeptidů. Speciálně způsob produkce biologicky aktivního rekombinantního lidského nebo myšího obézního proteinu bez jiných savčích proteinů zahrnuje tyto kroky:

(a) konstrukci expresivního vektoru majícího promotorovou sekvenci a DNA sekvenci kódující fúzní protein, kterýžto fúzní protein zahrnuje SEKV ID Č:3 nebo SEKV ID Č:6 a signální peptid pro vnější membránový protein A E. coli, (b) inzerci expresivního vektoru do E. coli hostitelské buňky pro transformaci E. coli hostitelské buňky, (c) expresi fúzního proteinu v E. coli hostitelské buňce, a (d) zpracování E. coli hostitelské buňky chladicím osmotickým šokovým pufrem k uvolnění myšího nebo lidského proteinu bez jiných savčích proteinů a bez signálního peptidů.

Rekombinantně produkované lidské nebo myší ob proteiny v rozpustném biologicky aktivním stavu v periplazmě transformo» váných E. coli buněk se pak vyčistí do homogenity.

Rekombinantní lidské nebo myší ob proteiny translokované do buněčné periplazmy podle postupů zde popsaných, mohou být účinně sekretovány ven z buňky podrobením hostitelských buněk chladicímu osmotickému šoku způsoby, které jsou známé a jsou popsány D. Koshlandem a D. Botsteinem, Cell 20, 749-760 (1980). Použití chladicího osmotického šoku uvolňuje z E. coli ob proteiny v jejich biologicky aktivním stavu bez jiných savčích proteinů nebo polypeptidů.

Lidské nebo myší ob proteiny uložené v osmotické kapalině po chladicím osmotickém šoku transformovaných E. coli buněk podle výše popsaného postupu, jsou biologicky aktivní a mohou být vyčištěny do homogenity pomocí kombinace aniontoměnné sloupcové chromatografie, hydrofobní interakční sloupcové chromatografie a gelové filtrace. Aniontoměnná a hydrofobní interakční chromatografie může být prováděna v jakémkoli pořadí, avšak použití obou musí předcházet gelová filtrace.

Aniontoměnné stadium může být prováděno konvenčními prostředky. Výhodný sloupec pro aniontoměnnou chromatografií je Q Sepharose Fast Flow sloupec. Vhodná aniontoměnná chromatografická media zahrnují různé nerozpustné matrice obsahující diethyl aminomethyl (DEAE) nebo diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethyl (QAE) skupiny. Matrice mohou být akrylamid, agarosa, dextran, celulosa nebo jiné typy obecně používané při čištění proteinů. Zvlášt užitečným materiálem pro aniontoměnnou chromatografií je DEAE-Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Švédsko).

Když se použijí media obsahující DEAE skupiny, pak extrakty, obsahující myší nebo lidské ob proteiny se aplikují při slabě zásaditém pH, například pH 8,1. Vybudované myší nebo lidskék proteiny mohou být eluovány ve výše vyčištěné formě aplikací solného gradientu ve vhodném pufru jako je tris-HCl. Obecně vlastnosti gradaientu mohou být určeny předběžně elučními experimenty zahrnujícími.malá množství rekombinantního proteinu.

Materiál obsahující lidský nebo myší ob protein získaný použitím aniontoměnné chromatografie, když se aniontoměnná chromatografie použije jako první stadium čištění,se dále podrobí hydrofobní interakční chromatografií. Hydrofobní interakční chromatografie je separační technologie, ve které se látky separují na bázi rozličných sil hydrofobní interakce s nenabytým vrstveným materiálem obsahujícím hydrofobní skupiny. Typicky se hydrofobní interakční sloupec nejdříve vyváží za podmínek výhodných pro hydrofobní vazbu, například vysokou iontovou silou.

K eluci vzorku se může použít klesající solný gradient.

Může být použit jakýkoli hydrofobní interakční sloupec. Výhodný hydrofobní sloupec je fenylová Sepharosa, avšak může být také použita butylová Sepharosa.

Podle vynálezu materiál obsahující rekombinantní myší nebo lidský ob protein, který je eluován z aniontového sloupce, se naplní na sloupec obsahující relativně silný hydrofobní gel, jako je fenylsefarosa. Pro povzbuzení hydrofobní interakce s hy drofobním gelem se použije rozpouštědlo, které například obsahuje více než nebo rovnající se 0,4M síranu amonného, přičemž 0,4M se dává přednost. Tak se sloupec a vzorek nastaví na 0,4M síran amonný v 50 mM tris-pufru a vzorek se nanese do sloupce. Sloupec se promyje 0,4M pufrem síranu amonného. Ob protein se pak eluuje rozpouštědly, která zeslabují hydrofobní interakce, jako jsou například klesající solné gradienty, ethylen nebo propylenglykol nebo močovina. Výhodné provedení zahrnuje promytí sloupce postupně tris-pufrem a tris-pufrem obsahujícím 20 % ethylenglkykolu.

Ob protein se postupně eluuje ze sloupce s gradientem klesající koncentrace síranu amonného a zvyšující se koncentrací ethylenglykolu v tris-pufru. Společné a postupné použití aniontoměnné chromatografie a hydrofobní interakční sloupcové chromatografie v jakémkoli pořadí poskytuje lidský nebo myší ob protein rutinně v přibližné čistotě 90 %.

Gelový filtrační chromatografický krok následuje kroky aniontoměnné chromatografie a hydrofobní· interakční sloupcové chromatografie, uvedené výše a může být prováděn jakýmkoli konvenčním postupem gelové filtrace. Ob protein eluovaný z hydrofobního interakčního sloupce nebo z aniontoměnného sloupce, přičemž kterýkoli tento sloupec může být použit jako poslední, může být koncentrován a dialýzován na malý objem použitím membrány s vyhraněnou molekulovou hmotností 10 000 (AMICON YM 10 membrána). Koncentrovaný materiál pak může být naplněn do sloupce obsahujícího gelová filtrační media, jako je G100 Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Ob protein pak může být separován od jiných nečistot na bázi své molekulové hmotnosti standardními postupy užívajícími SDS-PAGE.

Společné a postupné použití aniontoměnné chromatografie, hydrofóbní interakční sloupcové chromatografie a gelové filtrace rutinně poskytuje lidský nebo myší ob protein v 95%ní čistotě .

N-terminálové aminokyselinové sekvencování vyčištěného myšího nebo lidského proteinu se může provádět známými postupy, například elektrotransferem podle způsobů Laemliho, U.K., Nátuře 227, 680-685 (1970) nebo postupy popsanými Matsudairaem, P., J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 (1987). Interní sekvencování může být také prováděno známými způsoby. Například peptidové fragmenty mohou být vytvořeny digerací M pásu (na nitrocelulose) s endoproteinasou Lysině C a pak separovány HPLC systémem.

Biologická účinnost vyčištěných lidských a myších ob proteinů tohoto vynálezu je taková, že časté podávání ob proteinu injekcí lidským pacientům nebo myším vede k sníženému příjmu potravy a k snížené míře hmotnostního přírůstku ve srovnání s injektovanými kontrolními skupinami subjektů. B

Biologická aktivita lidských a myších ob proteinů nebo jejich fragmentů získaných a vyčištěných podle tohoto vynálezu může být testována rutinními způsoby, například opakovanou nebo jedinou intracerebroventrikulární (ICV) injekcí u ob/<?b myší podle postupů Haley, T. J. a kol, viz výše, jak je popsáno detailně v příkladech provedení 13 a 16. Na základě tohoto ICV testu ED50 pro snížení příjmu potravy a ED50 pro snížení tělesného hmotnostního přírůstku mohou být určeny.

Navíc biologická aktivita vyčištěného lidského a myšího ob proteinu nebo jejich fragmentů může být určena opakovanou IP injekcí u ob/ob myší jak je detailně uvedeno v příkl. 15.

Na základě IP testu může být určen ED20 pro snížení příjmu potravy a ED20 pro snížení tělesného hmotnostního přírůstku.

Biologická aktivita lidských a myších ob proteinů nebo jejich fragmentů získaných a vyčištěných podle tohoto vynálezu může být také určena u lidí známými postupy, například redukcí příjmu testovaného jídla po IV podání ob proteinu obézním lidským testovaným subjektům ve srovnání s IV podáním solné kontro>

ly podle postupů Muurahainena, N.E. a kol., Am. J. Physiol.

260, 672-680 (1991) a jak je popsáno detailně v příkladech 14 a 17 .

Alternativně schopnost vyčištěného myšího a lidského ob proteinu tohoto vynálezu snižovat míru hmotnostního přírůstku (například vyvolat hmotnostní ztrátu), může být určena opakovaným IV podáním obézním lidským testovaným subjektům podle způ sobů, které popsal Drent, M.L. a kol., Int. J. Obesity 19, 221226 (1995), jak je popsáno detailně v příkladu 18.

Myší a lidské ob proteiny tohoto vynálezu, když jsou vyčištěny podle tohoto vynálezu mají biologickou aktivitu v tom, že:

1) když se podají intracerebroventrikulárnkí (ICV) injekcí 16 až 18 hodin hladovějícím dospělým obézním ob/ob myším majícím tělesnou hmotnost alespoň 30 g, v dávce 20 raikrogramů nebo méně za použití metod Haleyho a McCormicka, viz výše, protein nebo polypeptid:

(a) redukuje příjem potravy během 5ti hodinového krmného testu o 50 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED50 pro snížení příjmu potravy), (b) redukuje přírůstek tělesné hmotnosti během 24 hodin po ICV injekci alespoň o 50 % ve srovnání k vehikulu injektovanému kontrolním myším (ED50 pro snížení přírůstku tělesné hmotnosti, a

2) když se podají intraperitoneálně nevyhladovělým dospělým ob/ob myším majícím tělesnou hmotnost alespoň 30 g, 2 x denně na začátku denního světla a znovu v tříhodinovém bodě temnotní fáze po dobu 1 týdne v celkové denní dávce 20 mikro’ >

gramů nebo méně, protein nebo polypeptid:

(a) redukuje 5 a 24 hodinový příjem potravy alespoň o 20 % ve srovnání s vehikulenr'injektovaným kontrolním myším (ED20 pro snížení příjmu potravy a (b) redukuje přírůstek tělesné hmotnosti během 24 hodin po první IP injekci o alespoň 20 % ve srovnání s vehikulem injektovaným kontrolním myším (ED 20 pro snížení přírůstku tělesném hmotnosti.

Navíc se tato redukce u tělesné hmotnosti a příjmu potravy dokonce uskutečňuje při dávkách pod 20 mikrogramů nebo méně, dokonce při dávkové úrovni podávané ICV 1 mikrogram neboméně, zejména když se tyto proteiny vyčistí do homogenity.

Výše popsané biologické zkoušky a detailně uvedené v příkladech provedení pro určování biologické aktivity lidských a/nebo myších proteinů mohou být použity k určování biologické aktivity fragmentů těchto proteinů, a£ jsou tyto fragmenty produkovány proteolytickou degradací ob proteinu, chemickou syn tézou rekombinantního proteinu, expresí části DNA sekvence pro ob proteiny, nebo jakýmikoli jinými prostředky známými odborníkům v oboru.

Podle dalšího provedení tohoto vynálezu může být myší a lidský protein tohoto vynálezu konjugován s polyethyle nebo polypropylenglykolovými homopolymery, které mohou být nesubstituo vány nebo substituovány etherifikací jedné z hydroxyskupin na jednom ze svých konců nižší alkylovou skupinou. Tyto konjugáty zajišťují ob protein ve stabilní formě a zlepšují poločas těchto proteinů. Navíc použití těchto konjkugátů vytvořených z póly ethylenglykolových nebo polypropylenglykolových homopolymerů vytváří prostředek pro zvýšení poločasu aktivity ob proteinu v těle.

Dále, jak bylo zjištěno, tyto konjugáty zajišťují další výhody, jako je zvýšení stability a cirkulační doby terapeutického proteinu v těle, přičemž se také sníží imunogennost ob proteinu. Tyto pegylované proteiny mohou být také snadno adsorbovány v lidském těle a zajišťují zvýšené hladiny v krevním systému.

Výhodné polyethylen nebo polypropylenglykolové homopolymery, které jsou konjkugovány k ob proteinu mají molekulové hmotnosti přibližně 15 až 60 kDa, čímž se vytvoří protein, který může být mono- nebo polypegylovaný s polyethylen nebo polypropylenglykolovými molekulami. Ve výhodném případě je ob protein bud mono- nebo dipegylovaný, čímž se vytvoří konjugát s polyethylen nebo polypropylenglykolovými jednotkami, kteréžto jednotky v konjugátu mají celkovou molekulovou hmotnost 15 až 60 kDa, nejvýhodněji 35 až 45 kDa.

Obecně se konjugáty produkují jako směs (kompozice) polyethylen a polypropylenglykolových konjugátů, protože polyethylen a polypropylenglykolové výchozí materiály se prodávají jako směsi různých homopolymerů majících různé molekulové hmotnosti. Molekulová hmotnost uvedená výše je průměrná molekulová hmotnost směsi ob konjgátů takto vytvořených. Tyto směsi mohou být rozděleny na jednotlivé konjugáty, když je třeba, konvenčními prostředky jako je sloupcová chromatografie, která zahrnuje HPLC. Avšak pro léčení se obecně tento konjugát využívá jako směs.

Polyethylenglykolové nebo polypropylenglykolové polymery /PEG/ mohou být připojeny k ob proteinu poijiocí volné N-terminálení aminokyseliny poteinu, čímž se vytvoří konjugát jakýmkoli konvenčními prostředky. Způsob připojení polyethylen nebo polypropylenglykolu k vytvoření konjugátů s ob proteinem může být jakýkoli z mnoha známých dostupných způsobů. Polyethylen nebo polypropylenglykol může být kovalentně vázán přes N-terminální aminokyselinu proteinu stejně jako přes růzuné lysinové zbytky na ob proteinu.

Navíc polyethylen nebo polypropylenglykolové homopolymery mohou být konjugovány k ob proteinu bi- nebo polyfunkčními vazebnými skupinami. Při produkci monopolyethylen nebo polypropy lenglykolových homopolymerových konjugátů se používají difunkční spojovače a homopolymer se konjuguje k jedné funkční skupině tohoto spojovače, zatímco N-terminální aminokyselina stej ně jako lysinová skupina ob proteinu mohou být konjugovány k druhé funkční skupině tohoto spojovače.

Tri- nebo poly-/polyethylen nebo polypropylenglykol/polymerové konjugáty s ob proteinem se vytvoří použitím trifunkčního nebo polyfunkčního spojovače. Homopolymer může být konjugován ke dvěma nebo více těchto funkčních skupin^sjednou zbývající funkční skupinou spojovače připojenou k ob proteinu.

Mezi těmito spojovači jsou polyfunkční spojovače mající aminové a karboxy funkční skupiny. Aminové skupiny mohou konjugovat s funkcionalizovanou hydroxyskupinou polyethylen nebopolypropylenglykolu, čímž se vytvoří amidové spojení. Karboxyskupiny mohou konjugovat s amidovou skupinou na ob proteinu, čímž se vytvoří amidová vazba a s funkcionalizovanou hydroxyskupinou na glykolu, čímž se vytvoří ester. Mezi mnoha typy vazebných skupin, které mohou být použity k vytvoření konjugátu mezi ob proteinem a PEG jsou skupiny zveřejněno v US patentech číslo 4 902 502, 5 034 514, 4 609 546, 5 122 614 a 4 847 325.

Podle zvlášt výhodného provedení tohoto vynálezu mají tyto konjugáty vzorce

O

II

R'0CH_oCH_n(0CH_nCH_) ,— O -C-NH

2 2 2 n

CH

R0CH„CH_o(OCH-CH-) - 0 -C-NH

7» 7, z. n

C-NH-P

II a O

II

RO(CH CH„O) CH_CH„ -C -NH-P (I-B)

2 n 2 2 kde P je myší nebo lidský ob protein zde popsaný, a n a n' jsou celá čísla, jejichž součet je od 300 do 1200, takže průměrná molekulová hmotnost všech PEG jednotek je od 15 do 60 kDa a celková molekulová hmotnost konjugátu je od 30 kDa do 80 kDa, a R a R' jsou nižší alkyly.

Sloučeniny vzorce I-A a I-B mohou být mých polymerních materiálů připraveny ze zná0

II

R'OCH_CH_ (OCH_CH„) ,- O — C —NH

2 2 2 n ^(CH2^: (II-A roch₂ch₂(och₂ch₂) — o —- c o

(II-B jejich kondenzací s myším nebo lidským ob proteinem tohoto vynálezu.

Jakýkoli konvenční způsob reakce aktivovaného esteru s aminem k vytvoření amidu může být použit. Při výše znázorněné reakci příkladný sukcinimidylester je odstupující skupinou vyvolávající tvorbu amidu. Když se použije sloučenina vzorce II-B k produkci sloučeniny vzorce I-B, reakce s myším nebo lidským ob proteinem tohoto vynálezu se provádí stejným způsobem jaký je popsán ve spojení s konverzí sloučeniny vzorce II-A na sloučeninu vzorce I-A. Tyto sukcinimidylestery jako je sloučenina vzorce II-A k produkci konjugátů s proteiny jsou zveřejněny v Monfardini a kol. Bioconjugate Chem., 6, 62-69 (1995).

V případě sloučeniny vzorce I-A součet n a n' je od 300 do 1 500, takže se vytvoří konjugát mající celkovou průměrnou molekulovou hmotnost PEG jednotek od 15 do 6Ó kDa a výhodně od 35 do 45 kDa. Při výhodném provedení vzorce I-A je součet n a n' od asi 800 do 1 200, přičemž průměrný součet n a n' je od 850 do 1 000. Obecně je výhodný poměr n a n' ve sloučeninách vzorce I-A a II-A od 0,5 do 1,5, přičemž 0,8 až 1,2 je přednostní .

V případě sloučeniny vzorce I-B je n výhodně mezi 300 až 1 500, čímž se vytvoří sloučenina mající 300 až 1 500 PEG jednotek s celkovou molekulovou hmotností od 15 do 60 kDa a výhodně od 35 do 45 kDa. Ve výhodném provedení je n od asi 850 do 1 500.

Lidské nebo myší proteiny připravené podle tohoto vynálezu mohou být připraveny ve farmaceutických směsích vhodných pro injektování se slučitelným farmaceuticky přijatelným nosičem nebo vehikulem známými postupy. Může být použit jakýkoli konvenční nosný materiál.

Nosný materiál může být anorganický nebo organický, vhodný pro enterální, perkutánní nebo parenterální podání. Vhodné nosiče zahrnují vodu, želatinu, arabskou pryskyřici, laktosu, škrob, stearan hořečnatý, talek, rostlinné oleje, polyalkylenglykoly, ropné vazelíny a podobně.

Dále farmaceutické přípravky mohou obsahovat jiné farmaceuticky aktivní prostředky. Další aditiva jako jsou aromatizační přísady, ochranné přísady, stabilizátory, emulgátory, pufry a podobně mohou být přidány podle akceptovatelných praktik farmaceutického míšení. Mezi výhodnými nosiči pro formulaci homogenních ob proteinů tohoto vynálezu jsou lidský sérový albumin, lidské plasmové proteiny atd.

Podání rekombinantního homogenního ob proteinu lidského nebo myšího nebo jejich kombinací, má za následek snížený příjem potravy a hmotnostní ztrátu u obézních lidí a zvířat.

Tudíž podání ob proteinu doplňuje tento protein, který je důležitý při regulaci tělesné hmotnosti.

Farmaceutické směsi obsahující lidské nebo myší ob proteiny, mohou být formulovány v síle účinné pro podání různými prostředky lidskému nebo živočišnému pacientu, přičemž se berou v úvahu abnormální fluktuace tělesné hmotnosti, bud samotné nebo jako část nepříznivého léčebného stavu nebo nemoci jako je diabetes mellitus typ II. Mohou být využity různé podávači techniky jako je injekce, mezi nimi subkutánní,'intravenozní a intraperitoneální injekce. Průměrná množství ob proteinu se mohou měnit a zejména by měla být založena na doporučeních a předpisech kvalifikovaných lékařů a veterinářů.

Lidské nebo myší ob proteiny připravené podle tohoto vynálezu mohou být také použity při screeningových metodách pro identifikaci ob proteinového receptorů nebo proteinových receptorů.

Dále uvedené příklady provedení nejsou určeny k jakémukoli omezení vynálezu.

Stručný popis výkresů

Obr. 1 je schéma dvou klonů pro lidský ob protein, to je hob cil a hob cl2, které schematicky znázorňují uložení a typy restrikce míst uložených v 5'- a 3'- koncích lidské ob cDNA sekvence.

Obr. 2 je schéma konstrukce pLPPsOmpA mob expresivního vektoru.

Obr. 3 je schéma konstrukce- pLPPsOmpA hobl expresivního vektoru

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Získání lidského ob cDNA

Lidský ob cDNA byl získán tříděním komerčně dostupného lambda fágu cDNA banky (Clontech) připraveného z RNA odvozené z lidské adipocytní tkáně. Z této banky byly získány dva lambda fágy, z nichž každý obsahoval přibližně 2,5 kilobází fragmentu odpovídajícího lidské ob cDNA sekvenci pomocí hybridizace lambda fagových bank. Při této technologii byly identifikovány dva klony, to je hobl cDNA a hob2 cDNA. Lidský, ob gen byl subklonován do plazmidového vektoru DNA pBluescriptSk komerčně dostupného ze Stratagenu. Výsledné vektory obsahující tyto lidské ob genové sekvence byly nazvány pBluescriptSk

M * hobl a pBluescript hob2.

Lidská ob genová sekvence v tomto ůBluescript Sk hobl a pBluescriptSk hob2 byly ověřeny nukleoticnim sekvencováním. Aminokyselinové sekvence proteinu dedukovaného z nukleotidového sekvencování odpovídají lidskému ob proteinu kódovanému SEKV ID Č:4 a jak je zveřejněno Zhangem, Y. a kol., viz výše. Onen pBluescriptSk hobl měl T-C mutaci za terminačním kodónem hobl cDNA. Tato mutace měla za následek ztrátu Stul restrikčního místa jinak předpokládaného, že je přítomno v nukleotidové sekvenci hobl následovně:

hob 1 . ..GGG.TGC.TGA GGCCT TGA...

Gly Cys stop pBluescriptSk hobl ...GGG.TGC.TGA GGCCC TGA...

Gly Cys stop pBluescriptSk hob2

...GGG.TGC.TGA GGCCT TGA

Gly Cys stop

Protože tato mutace v pBluescriptSk hobl je uložena za terrainačním kodónem lidské ob cDNA sekvence, nevede to ke změně aminokyselinové sekvence lidského ob proteinu jak je publikováno Zhangem, Y. a kol., viz výše.

Pokud jde o nukleotidovou sekvenci cDNA, přítomnou v pBluescriptSk hob2, bylo demonstrováno restrikční enmzymovou analýzou, že tento plazmid má Stul restrikční místo uložené za terminačním kodónem lidské ob cDNA sekvence.

Navíc k faktu, že pBluescriptSk hobl má mutaci v Stul restrikčním místě následujícím terminační kodón, má také pBlues criptSk hobl EcoRI restrikční místo za ORF v hobl cDNA, kteje absentní v hob2 cDNA (viz obr. 1).

Příklad 2

Plazmidová konstrukce pro ob myší protein (mob)

Myší ob cDNA SEKV ID Č:1 byla získána postupem Zhanga,Y.

a kol., viz výše, a pak inzertována do pCDNA3 vektoru komerčně dostupného od firmy Invitrogen (San Diego, Californie, (JSA). Myší ob gen takto získaný byl použit pro konstrukci expresivního vektoru pLPPsOmpA-mob pro expresi myšího ob proteinu (mob). Tento expresivní vektor a jeho konstrukce je detailně zobrazen v obr. 2.

První stadium konstrukce bylo dosáhnout fúzi signální - kódovací sekvence z sOmpA genu do zralé kódovací oblasti myšího ob genu, to je bez jeho přirozené signální sekvence.

DNA fragment 501 bp kódující zralý myší ob protein inzertovaný v pCDNA3 vektoru byl amplifikován z tohoto vektoru polymerasovou řetězcovou reakcí (PCR) za použití Vent DNA polymerasy (New England Biolabs) původního primeru (primer 1), vycházeje s prvním nukleotidem kodónu kódujícího valin (který je první aminokyselinou v zralém mob) (Zhajig, Y. a kol., viz výše) a reverzního primeru (primer 2) odpovídajícího oblasti mob obsahující terminační kodón mob. Primer 2 také obsahoval sekvenci odpovídající Hind III restrikčnímu místu.

Primer 1; 5' GTG CCT ATC CAG AAA GTC 3'

Val Pro Ile Glu Lys Val

Primer 2: 5' TCCCAAGCTT TCAGCATTCAGGGCTAAC 3'

HindlII stop

Amplifikovaný 501 bp DNA fragment byl vyčištěn agarósovou gelovou elektroforézou a fosforylován za použití T4 polynukleotidové kinasy (Boehringer) a pak digerován s restrikčním enzymem HindlII, čímž se vytvořil 5' vyčnívající konec primeru 2.

Získaný fragment měl zarovnaný konec odpovídající prvnímu nukleotidu cDNA kódující zralý mob a 5' vyčnívající konec odpovídající štěpenému Hindlll místu.

Dále sOmpA plasmid pTlOsOmpArPDI získaný postupy De Suttera, K. a kol. viz výše, byl fúzován do mob genu k vytvoření pTlOsOmpAmob plazmidu. K tomuto provedení byl mob fragment klonován ligací za použití T4 ligasy (New England-Biolabs) do pTlOsOmpArPDI vektoru DNA, který byl předtím degerován s restrikčními enmzymy Nael a Hindlll způsoby známými v dosavadním stavu techniky (Sambrook, J. a kol. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual druhé vydání, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

Tento pTlOsOmpArPDI byl odvozen z plazmidu p714 (Parker a Wilex, Gene 83, 117-134 (1989)). Tento plazmid obsahoval cDNA kódující zralou krysí proteinovou disulfidovou isomerasu (rPDI) cDNA fúzovanou do sOmpA sekvence.

posledního .

Tato fúze minuiéhe kodónu v sOmpA (alanin) do prvn-ího kodónu v cDNA zralého rPDI (glycin) vytvořila Nael restrikční místo, které po štěpení Nael uvolnilo poslední kodón v sOmpA sekvenci a první kodón v cDNA kódující rPDI sekvenci jako zarovnané konce.

Nael

5' ........GCC / GGC ........3'

Ala Gly sOmpA cDNA / zralá rPDI cDNA

HindlII místo existuje na konci cDNA kódující rPDI. Tudíž další digerace tohoto plazmidu s HINDIII uvolnila hlavní část rPDI cDNA a vytvořila 5' vyčnívající konec kompatibilní s jedním zkonců PCR fragmentu. Výsledný plazmid, kde cDNA kódující rPDI byla nahražena cDNA kódující zralý myší ob byla označena pTlOsOmpAmob a je znázorněna v obr. 2.

Ligatovaná DNA byla zavedena do E.coli kmene MC1061 za použití sandardní elektroporace a získané kolonie byly prozkoumány na přítomnost myšího ob DNA fragmentu restrikční enzymovou analýzou. Klon pTlOsOmpAmob měl sekvenci kódující zralý myší ob protein fúzovanou do sekvence kódující sOmpA.

Dále exprese mob v E.coli v tomto pTlOsOmpAmob byla uložena pod kontrolou jak lipoproteinového promotoru (^pjpp) tak lac promotoru-operátoru (P0^_ac). ^At)y ^{se to} udělalo, hybridní genová sOmpA-mob sekvence byla převedena z plazmidu pTlOsOmpAmob do plazmidového vektoru pLPPsOmpArPDI standardními postupy popsanými v’De Sutterovi a kol., viz výše.

Tento pLPPsOmpArPDI plazmid byl odvozen, jak již bylo dříve zmíněno, z plazmidu p714 (Parker a Wiley, Gene 83, 117-134 (1989).

Pro tento krok byl plazmid pTlOsOmpAmob DNA rozštěpen restrikčními enzymy Xbal a HindlII. Fragment obsahující sOmpAmob kódující DNA byl pak ligatován do plazmidu pLPPsOmpArPDI z kterého sOmpA-rPDI kódující DNA byla předběžně odstraněna štěpením restriktivními enzymy Xbal a HindlII Výsledný plazmid byl nazván pLPPsOmpAmob.

Příklad 3

Exprese myšího ob proteinu v E.coli (MC1061)

Exprese myšího ob proteinu v E.coli byla dosažena následovně. Onen pLPPsOmpAmob plazmid konstruovaný podle příkladu 2 byl inzertován elektroporací do E.coli kmene MC1061. E.coli buňky (MC1061) chovající plazmid pLPPsOmpAmob byly rozpěstovány přes noc při 28°C v Luria-Bertania (Difco Laboratories) mediu doplněném antibiotickým karbenicillinem (100 mikrogramů na ml, Beecham).Tato kultura pak byla použita jako inokulum v témž mediu. Tato kultura pak byla zředěna stonásobně ve třech litrech (například 6 x 0,5 1 v jedno litrových Erlenmayerových baňkách) ve výše uvedeném mediu a třepána při teplotě 28 °C v New Brunswick air shakeru.

(300 ot/min) po dobu asi 4 hodin, dokud nebylo dosaženo hustoty Αθθθ 0,3 až 0,5. V této době byl lac promotor zaveden přídavkem -2 mM finální koncentrace isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG, Boehringer) jak je popsáno v De Sutter a kol., viz výše'.

Buňky byly dále inkubovány při 28 C po dobu asi 5 hodin, dokud hustota buněk nedosáhla Α^-θθ 1,3 až 1,5.

Pak byly buňky shromážděny odstředěním v JA10 rotoru (Beckmanovy odstředivkové modely J2-21 nebo J2-21M) během 6 minut při 6750 otáčkách za minutu (8000 x g) při 4 °C. Supernatant byl odstraněn a buněčné pelety byly resuspendovány rychle v 250 ml ledově chladném osmotickém šokovém pufru (1000 mM tris-HCl, pH 7,4, obsahující 20 % sacharosy 10 mM EDTA) a inkubovány na ledu po dobu 10 až 20 minut, jak je popsáno Koshlandem a Botsteinem, viz výše.

Pak byla suspenze převedena do plastických odstředivkových trubic a buňky shromážděny odstředěním při 8 200 otáčkách za minutu (8 000 x g) po dobu 5 minut při teplotě 4 °C v JA20 rotoru. Supernatant byl odstraněn a buněčné pelety rychle resuspendovány ve 120 ml ledově chladné vody za živého třepání a inkubovány na ledu po dalších 10 minut.

Suspenze pak byla odstředěna v JA20 rotoru po dobu 6 minut při 4 °C při 11 500 otáčkách za minutu (16 000 x g) a supernatant odpovídající periplazmatické frakci (osmotická šoková tekutina) byl shromážděn (přibližně 120 ml). Azid sodný tris-HCl (pH 7,5) byly přidány do konečné koncentrace 0,5 % a 50 mM, příslušně. Osmotická šoková tekutina obsahující myší ob protein byla uskladněna při -20 °C až do dalšího použití.

Příklad 4

Exprese myšího ob proteinu v E.coli (MC1061)

Exprese myšího ob proteinu byla získána podle postupu popsaného v příkladu 3 kromě toho, že triacillin (100 mikrogramú/ml) byl antibiotikem použitým jako přídavek Luria-Bertaria media (oproti karbenicillinu).

Příklad 5

Čištění myšího ob proteinu z E.coli osmotické tekutiny

Myší ob protein uložený ve 120 ml zmrazené osmotické šokové tekutiny podle příkladu 4 byl vyčištěn následovně:

120 ml osmotické šokové tekutiny obsahující myší ob protein bylo rozmraženo a odstředěno při 4 °C během 20 minut při 16 000 otáčkách za minutu v JA20 rotoru k odstranění nerozpustného odpadu. Supernatant byl pak naplněn přímo na sloupec obsahující 30 ml objemové vrstvy Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) před vyrovnané 50 mM tris-HCl (pH 7,5) pufru.

Po promytí 50 mM tris-HCl (pH 7,5 pufrem) byl mob protein eluován 50 mM tris-HCl (pH 7,5) pufru, obsahujícím 0,1 M NaCl

Dále byl přidán tuhý (NH^^SO^ do materiálu eluovaného z Q-Sepharose Fast Flow obsahujícího sloupce do konečné koncentrace 1,0 M a směs byla naplněna na sloupec obsahující 7,5 ml objemové vrstvy Butyl-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) předvyvážené 50 mM tris-HCl (pH 7,5) pufru obsahujícího 1,0 M-síranu amonného. Po promytí tris-HCl (pH 7,5) pufrem obsahujícím 1,0 M síranu amonného byl mob protein eluován pomocí gradientu od/1,0 M síranu amonného v 50 mM tris-HC1 (pH 7,5) pufru do 20%ního ethylenglykolu ve vodě.

Mob protein eluoval; z Butyl-Sepharose Fast Flow sloupce na samém konci gradientu, zatímco většina nečistot eluovala mnohem dříve. Čistota mob proteinu v tomto stupni byla 90 %, jak bylo zjištěno stříbrem značenou polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE).

Mob protein v materiálu eluovaném z Butyl-Sepharose Fast Flow obsahujícího sloupce byl pak dále vyčištěn gelovou filtrační chromatografií. Aby se to udělalo, byl myší ob protein koncentrován při 4 °C do objemu 1 ml na YM10 (Amicon) membráně za použití 8MC koncentrační jednotky (Amicon) a byl aplikován do sloupce (1,0 cm x 50 cm) obsahujícího 39 ml GlOO-Sephadexu (Pharmacia) předvyváženého ve fosfátem pufrovaném solném roztoku. Frakce obsahující mob protein pak byly sdruženy a protein koncentrován na YM10 membráně.

V tomto stadiu byl mob protein čistší více než 95 %, jak bylo stanoveno PAGE a značením stříbrem. SDS-PAGE vykázal jediný proteinový pás při Mr 15 000.

Příklad 6

Sekvenční analýza myšího ob proteinu

N-terminální aminokyselinová sekvence myšího ob proteinu získaná a vyčištěná postupy z příkladů 2,3,4a 5, výše popsanými, byla vytvořena postupy podle Laemli, U.K., viz výše,

Po elektrotransferu elektroforezovaných proteinů do poly(4-vi nyl-N-methylpyridiniumjodidem) povlečené skleněné vláknité vrstvy jak je popsáno Bauw, G. a kol. J. Biol. Chem. 7, 194-196 (1988). Pás proteinu s Mr 15 000 byl excizován z membrány a N-terminální aminokyselinová sekvence byla určena Ed manovou degradací na 470A plynovém fázovém sekvenátoru vybaveném 120A on line fenylthiohydantoinovým aminokyselinovým analyzátorem (Applied Biosystems). N-terminální aminokyseli nová sekvence myšího ob proteinu získaná výše popsanými postupy byla Val-Pro-Ile-Gln, což odpovídá zralému myšímu ob proteinu SEKV ID Č:3.

Příklad 7

Konstrukce expresivního vektoru pro lidský ob protein (hob)

Lidský ob gen získaný v souhlase s postupy z příkladu 1 byl využit ke konstrukci expresivního vektoru pLPPsOmpAhobl pro expresi lidského ob proteinu. Tato konstrukce byla podobná konstrukcik pLPPsOmpAmob popsané v příkladu 2 a je detailně znázorněna v obr. 3. Třífragmentální ligace byla požadována pro kompletaci DNA fragmentu obsahujícího celou zralou lidskou ob kódující sekvenci.

V prvním stadiu konstrukce byla hob nukleotidové sekvence vycházející s prvním nukleotidem kodónu kódujícího první aminokyselinu zralého lidského ob proteinu (valin), fúzována do signálně kódovací sekvence OmpA (sOmpa), tak, že sOmpa sekvence je proti směru od 5' konce hob nukleotidové kódující sekvence. Tento DNA fragment byl získán amplifikací v PCR směsi obsahující plazmid pBluescriptSK hobl, vent DNA polymerasu a dva primery.

Přední primer (primerl) vycházel s prvním nukleotidem kodónu kódujícího první-’ aminokyselinu zralého lidského proteinu a reverzní primer (primer 2) obsahoval sekvenci lidské;./> cDNA obsahující terminační kodón.

Amplifikační reakce poskytla DNA fragment o 501 bp obsahující sekvenci kódující zralý lidský ob protein. 5' konec tohoto DNA fragmentu byl pak fosforylován T4 polynukleotidovou kydasou a digerován s restrikčním enzymem HindlII, čímž se získalo 353 bp DNA fragmentu majícího zarovnaný konec odpovídající prvnímu nukleotidu cDNA kódující zralý hob (pozice odpovídající primeru 1 a 5' vyčnívající konec odpovídající štěpenému HindlII místu.

Tento 353 bp DNA fragment byl vyčištěn agarosovou gelovou elektroforézou a klonován v pTlOsOmpArPDI plazmidu, který byl předtím digerován s restrikčními enzymy Nae I a HindlII. Výsledný plazmid pTlOsOmpAhobl (parciální) má DNA fragment kódující část zralého lidského ob proteinu (aminoterminální část) fúzovanou do sekvence kódující sOmpA.

Primer 1: 5' GTGCCCATCCAAAAAGTC 3'

Primer 2: 5' TCCCAAGCTTTCAGCACCCAGGGCTGAG 3' stop

V druhém kroku DNA sekvence kódující karboxy terminálovou část lidského ob proteinu, to je fragment 2, byla vázána do DNA fragmentu kódujícího aminoterminální část zralého hob a výsledný fragment kódující celou zralou hob sekvenci fúzovaný do sOmpA byl transferován do plazmidu pLPPsOmpArPDI což vedlo k expresi zralého lidského ob proteinu v E.coli za řízení lipoproteinového promotoru a lacpromotoru-operátoru Aby se to udělalo, byl plazmid pTlOsOmpAhobl (parciální) digerován s Sbal a HindlII a 400 bp DNA fragment 1 hob byl izolován agarosovou gelovou elektroforézou (fragment 1). Dále byl plazmid pBluescriptSK hobl štěpen s HindlII a EcoRI a 450 bp bylo izolováno agarosovou gelovou elektroforézou (fragment 2).

Nakonec byl plazmid pLPPsOmpArPDI štěpen s Xbal a EcoRI a vektorový fragment izolován agarosovou gelovou elektroforézou (fragment 3).

DNA fragmenty 1, 2 a 3 pak byly vázány k sobě a ligační směs zavedena do E.coli kmene MC1061. Kolonie obsahující konečnou plazmidovou konstrukci pLPPsOmpAhobl byla použita pro expresi a sekreci zralého lidského ob proteinu.

Příklad 8

Exprese lidského ob proteinu E.coli (MC1061) pLPPsOmpAhobl konstruovaný v souhlase s příkladem 7 byl použit pro transformaci E.coli kmene MC1061 pro expresi lidského ob proteinu v rozpustné biologicky aktivní formě v periplasmatu hostitelských E.coli buněk. Inzerce plazmidu do těchto hostitelských E.coli buněk byla provedena elektroporací.

>

E. coli buňky (MC1061) nesoucí plazmid pLPPsOmpAhobl byly pěstovány při 28 °C v Luria-Bertania (Difco Laboratories) mediu, doplněném antibiotickým carbencillinem (100 mikrogramů/ml, Beecham) na příslušnou hustotu, načež byl lac promotor indukován přídavkem 2 mM finální koncentrace isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG, Boehringer), jak je popsáno v De Sutterovi a kol, viz výše. Buňky byly dále pěstovány až do buněčné hustoty 1,3 ^Αθθβ· Pak byly buňky shromážděny odstředěním (8000 x g při 4°C) a buněčná peleta byla rychle resuspendována v ledově chladném osmotickém šokovém pufru (100 mM tris-HCl, pH 7,4 obsahujícím 20 % sacharosy a 10 EDTA) a byly inkubovány na ledu po dobu 10 minut, jak je popsáno Koshlandem a Botsteinem, viz výše.

Pak byly buňky znovu kolektovány odstředěním jako výše a buněčná peleta byla resuspendována v ledově studené vodě a inkubována na ledu po dobu 10 minut.

Suspenze pak byla centrifugována po dobu 5 minut při 16 000 x g a supernatant (osmotická šoková tekutina) byla jímána.

Azid sodný a tris-HCl (pH 7,5) byly přidány do finální koncentrace 0,05 %, resp. 55 mM. Osmotická šoková tekutina obsahující lidský ob protein byla uskladněna při -20 °C až do dalšího použití.

Příklad 9

Exprese lidského ob proteinu v E.coli (MC1061)

Exprese lidského ob proteinu byla dosažena použitím postupu z příkladu 8 kromě toho, že triacillin (100 mikrogramů /ml byl použit jako antibiotikum k přídavku Luria-Bertaria media oproti carbenicillinu.

Příklad 10

Čištění lidského ob proteinu z E.coli osmotické tekutiny

K čištění lidského ob proteinu v osmotické šokové tekutině z příkladu 9 byl do tekutiny přidán NaCl na finální koncentraci 0,1 M a tekutina byla naložena přímo na sloupec obsahující 30 ml objemové vrstvy Q-Sepharose Fast Flow (Phar-. macia), předvyvážené 55 mM tris-HCl (pH 7,5) pufrem.

Dále byl přidán tuhý síran amonný do průtokového materiá-) lu eluovaného z Q-Sepharose Fast Flow obsahujícího sloupce do finální koncentrace 1,0 M a směs byla naložena na sloupec obsahující 7,5ml vrstvy butyl-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) předvyvážené 55 mM tris-HCl (ph 7,5) pufrem obsahujícím 1,0 M (NH^^SO^. Po promytí tris-HCl (pH 7,5) pufrem obsahujícími 1,0 M síranu amonného byl hob protein eluován aplikací gradientu od 1,0 M síranu amonného v 50 mM tris-HCl (pH 7,5) pufru do 20%ního ethylenglykolu ve vodě.

Hob protein eluoval z butyl-Sepharose Fast Flow sloupce na samém konci gradientu, zatímco většina nečistot eluovala mnohem dříve. Čistota hob proteinu v tomto stadiu byla 90%ní jak bylo stanoveno stříbrem barvenou polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE).

Hob protein v materiálu eluovaném z butyl-Sepharose Fast Flow obsahujícího sloupce byl pak dále vyčištěn gelovou filtrační chromatografií. Aby se to udělalo, byl lidský ob protein koncentrován při 4 °C na objem 1 ml na YM10 (Amicon) membráně za použití 8MC koncentrační jednotky (Amicon) a byl aplikován na sloupec (1,0 cm x 50 cm) obsahující 39 ml GlOO-Sephadexu (Pharmacia) předvyváženého v fosfátem pufro váném solném roztoku.

Frakce obsahující hob protein pak byly jímány a protein byl koncentrován na YM10 membráně. V tomto stavu byl hob pro tein více než 95%ně čistý jak bylo stanovenou PAGE a stříbrným barvením. SDS PAGE analýza eluátu vykázala jeden proteinový pás při Mr 15 000.

Příklad 11

Čištění lidského ob proteinu z E.coli osmotické tekutiny

Aby se vyčistil lidský protein v osmotické šokové tekutině z příkladu 9, byl použit postup příkladu 10 s následující výjimkou: před přidáním tuhého síranu amonného do proteklého materiálu byly provedeny následující kroky s ohledem na osmotickou šokovou tekutinu z příkladu 9.

Lidský ob protein v osmotické šokové tekutině z příkladu 9 byl nanesen přímo na sloupec obsahující 30 ml vrstvy Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) předvyvážené 50 mM tris-HCl (ph 7,5) pufrem. Po promytí 50 mM tris-HCl (pH 7,5) pufrem byl hob protein eluován 50 mM tris-HCl (pH 7,5) pufrem obsahujícím 0,1 M NaCI.

Příklad 12

Sekvenční analýza lidského ob proteinu

N-terminální aminokyselinová sekvence lidského ob protei nu vyčištěná a získaná postupy z příkladů 7 až 11 výše popsa nými byla provedena podle postupů Laemliho, U.K., viz výše. Po elektrotransferu elektroforézovaných proteinů do vrstvy póly(4-vinyl-N-methylpyridiniumjodidem) povlečeného skleněné ho vlákna jak je popsáno Bauwem a kol., viz výše, byl pás proteinu s Mr 15 000 excizován z membrány a N-terminální aminokyselinová sekvence byla pak určena Edmanovou degradací na 470A plynofázovém sekvenátoru vybaveném 120A on line fenylthiohydantoinovým aminokyselinovým analyzátorem (Applied Biosystems).

N-terminální aminokyselinová sekvence hob proteinu získaného výše popsanými postupy byla Val-Pro-Ile-Gln odpovídající zralému lidskému ob proteinu SEKV ID Č:6.

Příklad 13

Biologická aktivita myšího ob proteinu:

Intracerebroventrikulární (IVC) injekce u ob/ob myší

Biologická aktivita zralého myšího ob proteinu vyčištěného podle příladu 5 byla určena pomocí ICV metody následovně. Infúzní kanyly byly implantovány do. postranní komory mozků anestetizovaných samic obézních ob/ob myší (věk 6 až 13 týdnů) za použití následujících koordinát (2mm stranou od střední čáry, 0,6 mm s ohledem na bregmu, 2 mm dolů) založeno na způsobech Haleyho a McCormicka, viz výše. Konec kanyly byl upevněn na lebce za použití ušlechtilého šroubu a dentálního cementu. Myši byly individuálně umístěny v plastických klecích s volným přístupem k potravě (s výjimkou noci před ICV injekcí) a vodě. Po zotavení z chirurgického zákroku, posouzeno denním příjmem potravy a přírůstkem tělesné hmotnosti, byly myši studovány při různých příležitostech po intracerebro ventrikulární (ICV) injekci 1 mikrolitru jednoho z následujících zkoušených roztoků:

1) umělý mozkomíšní mok (CSF),

2) bakteriální kontrolní roztok

3) ob protein (0,6 až 1 mikrogram/myš, nebo

4) žádná infuze.

Injekce jednoho z výše uvedených zkušebních roztoků ICV do každé myši byla následována jedním mikrolitrem umělého CSF k vyčištění kanyly. Pro účely tohoto experimentu byl bakteriální kontrolní roztok vzorkem identicky zpracovaným a připraveným v souhlase s postupy uvedenými v příkladech 2 až 4 kromě toho, že plazmid inzertovaný v E.coli bakterii neměl myší ob gen.

Myši byly vyhladověny po dobu 18 hodin (přes noc) před ICV injekcí. Myši byly mírné omezeny a 10 mikrolitrová Hamilton injekční stříkačka vybavená kouskem předkalibrované polyethylenové (PE) trubice (PE20) byla použita pro injekci 1 mikrolitru testovaného roztoku do kanyly umístěné v postranní komoře. Myši pak byly ihned umístěny ve zkušební kleci s miskou potravy obsahující předem zvážené množství peletizované myší stravy a s lahví vody.

Myši byly vizuálně zkoumány a příjem potravy byl měřen po dalších 7 hodin. Měření příjmu potravy byla získána v 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 a 7 hodin po ICV injekci. Tělesná hmotnost každého zvířete byla měřena před ICV injekcí a 24 hodin později. Úspěšné uložení kanyly bylo dokumentováno vzrůstem příjmu potravin po 2 hodinách po ICV injekci 10 mikrogramů neuropeptidu Y 2 hodiny hladovějící myši podle Morley, J.E. a kol., American J. Physiol. 253, 516-522 (1987).

Výsledky ICV zkoušky, která je výše popsána, jsou následující:

A. Redukce příjmu potravy

Během prvních 30 minut po ICV injekci téměř všechny myši požívaly s krátkou latencí a konzumovaly přibližné 0,5 g.

Myši, které neobdržely žádnou injekci nebo umělý CSF,pokračovaly v krmení během dalších 6,5 hodiny a dosáhly kumulativního 7hodinového příjmu 3,2 g (tabulka 1). V kontrastu s tím myši ošetřené ob proteinem ICV se přestaly krmit po prvních 30 minutách a pak nic nepožívaly. Tak jejich kumulativní příjem potravy zůstal potlačen během příštích celých 5 hodin.-, na přibližně 0,5 g (tabulka 1). Myši, přijímající vehikulový kontrolní roztok ICV také přestaly žrát po 30 minutách a příjem potravy začal znovu mezi 6 a 7 hodinami.

B. Redukce přírůstku tělesné hmotnosti hodinová změna tělesné hmotnosti myší injektovaných vehikulovou kontrolou byla mírně snížena od těch, které byly injektovány umělým CSF nebo od neinjektovaných myší. (Tabulka 1.) Avšak procentní změna tělesné hmotnosti myši injektované ob proteinem byla téměř nulová a byla významně snížena ve srovnání s vehikulovou kontrolou injektovanou myší (tabulka 1).

C. Závěr

Zjištěný účinek přímého podání rekombinantního myšího ob proteinu (1,1 mikrogramů na myš) v jednom mikrolitru do mozku) byla trvalá a významná redukce příjmu potravy a přírůstku tělesné hmotnosti samic ob/ob myší. To demonstruje, že ob protein může působit přímo na mozek a je konzistentní s účinkem ob proteinu, když je injektován intraperitoneálně. Tento příklad také potvrzuje biologickou účinnost bakteriálně expresovaného rekombinantního myšího ob proteinu u samičího obézních ob/ob myší podle vynálezu.

Tabulka 1

Ošetření	Příjem potravy (0-7 hodin)	Přírůstek tělesné hmotnosti (0-24 h)
	g	% xx/	g	%
umělý CSF	3,2 - 0,2	100	3,8 - 0,3	100
vehikulová kontrola	^0,9 í 0,3	28,1	2,9 + 0,2	76
ob protein (1 mikrogram/myš)	0,5 - 0,1	15,6 »	0,3 - 0,5	8

x/ indikuje významné rozdíly mezi ob protein a ní mok (CSF) skupinami s p menším než 0,05 umělý mozkomíšxx/ indikuje procento kontroly.

Příklad 14

Biologická aktivita myšího proteinu podaného intravenózně (IV) u ob/ob myší

Biologická aktivita myšího ob proteinu získaného a vyčištěného v souhlase s příklady 2, 3, 4 a 5 byla testována intravenózní (IV) injekcí u obézních ob/ob myší jak je dále uvedeno. , >

Samci a samic©⁷' obézních ob/ob myší (6 až 13 týdnů starých) byly implantovány stálými hrdelními kanylami za pentobarbitalové anesteze (80 mg/kg tělesné hmotnosti) podle způsobu Mokhtariana A., a kol., Physiol. Behav. 54, 895-898 (1993). Myši byly individuálně umístěny v plastických klecích za konstantních podmínek prostředí s 12 hodinovým temnotním a 12 hodinovým světelným cyklem. Tělesné hmotnosti byly měřeny při fúzi denně a průchodnost kanyl byla ověřována a udržována každý další den infuzí 0,1 ml heparinu v solném roztoku (50 U/ml v 0,9%ním solném roztoku).

Po úplném zotavení z chirurgického zákroku, projeveném přírůstkem tělesné hmotnosti byly myši vyhladověny po dobu 16 až 18 hodin (přes noc). Příští ráno byly myši zváženy a umístěny do testovacích pecí po dobu 45 minut pro aklimatizaci před experimentem. Voda byla stále dostupná. Myší ob protein (3 mikrogramy v 0,1 ml) nebo stejný objem vehikulové kontroly nebo solného 0,9 %ního roztoku) byly injektovány intravenózně. Vzbuzené myši byly mírně omezeny a 0,5 ml inzulínové stříkačky byly použity pro injekci 0,1 ml testovaného roztoku, načež následovalo 0,05 ml heparinu v solném roztoku. Zkoušky byly odděleny o alespoň 3 dny. Myši pak byly ihned uloženy v testovacích klecích s předem zváženou Petriho miskou obsahující peletu myší stravy. Myši byly vizuálně zkoumány, příjem potravy byl měřen po dalších 7 hodin při 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 a 7 hodinách po IV injkci. Tělesná hmotnost byla měřena před IV injekcí a znovu 24 hodin později.

Dvě oddělené skupiny kanylovaných myší (11 ob/ob a 12 neobézních) byly použity v 5 jednotlivých zkouškách. Většina myší dostala myší ob protein a jednu nebo obě kontrolní injekce ve vyváženém pořadí. Dva oddělené přípravky myšího ob proteinu byly použity při tomto experimentu. Zde uvedená data jsou kombinací výsledků těchto jednotlivých replikací.

A. Výsledky

Výsledky výše uvedeného experimentu jsou následující.

Během prvních 30 minut po IV injekci většina obézních a neóbézních myší přijímala potravu s krátkou latencí a zkonzumovala přibližně 0,3 až 0,5 g. Příjem potravy u solným roztokem a vehikulovou kontrolou injektovaných obézních myší vzrůstal během experimentu. Kumulativní příjem potravy obézních ob/ob myší injektovaných vehikulovou kontrolou nebyl rozdílný od příjmu potravy podobně vyhladovělých obézních myší, které byly injektovány solným roztokem. V kontrastu s tím příjem potravy obézních ob/ob myší injektovaných rekombinantním ob proteinem byl významně snížen a zůstal potlačen na 57 % od kontroly (tabulka 2).

Žádné další účinky nebyly pozorovány u vehikulové kontroly a ob proteinových skupin během 7 hodin pozorovací periody. Jak se očekávalo, 24hodinový postinjekční tělesný přírůstek hmotnosti nebyl rozdílný u ošetřených skupin (tabulka 2) vlivem omezeného trvání akce jedné IV dávky myšího ob proteinu .

B. Závěry

Tyto výsledky demonstrují, že rekombinantní myší ob protein významně snižuje kumulativní 7hodinový příjem potravy po IV podání (3 mikrokgramy na myš) u obézních ob/ob myší. Schopnost rekombinantního myšího ob proteinu snižovat příjem potravy u ob/ob myší je konzistentní s výsledky příjmu potravy získanými následující opakovanou IP injekcí ob proteinu u obéz nich ob/ob myší. Tento příklad také potvrzuje biologickou aktivitu bakteriálně expresovaného rekombinantního myšího ob proteinu u samic obézních ob/ob myší.

Tabulka 2

IV podání myšího ob proteinu u ob/ob myší

Ošetření j	Příjem potravy (0-7 h,<)	Přírůstek tělesné hmotnosti. (0-24 h)
	g	% xx/	g	%
solný roztok (n = 4)	1,8 - 0,2		2,9 - 0,3
vehikulová kontrola (n=7)	1,4 i 0,3	100	2,2 - 0,6	100
ob protein (1 mikrogram /myš) (n .= 8)	0,8 - 0,2^X'	57.	1,4 - 0,6	64

Údaje jsou střední hodnotou - sem. n = označuje počet jednotlivých myší, sem znamená standardní střední chybu, x/ označuje významné rozdíly mezi ob proteinovými a umělý CSF skupinami s p menším než 0,05.

xx/ označují procento kontroly.

Příklad 15

Biologický účinek myšího ob proteinu, opakované IP injekce u ob/ob myší

Biologická aktivita myšího ob proteinu získaného a vyčištěného podle příkladů 2 až 5 byla testována opakovanou intraperitoneální (IP) injekcí u obézních ob/ob myší následovně .

skupiny 6 samic ob/ob myší byly studovány. Myši byly umístěny v plastických klecích (3 na klec) za konstantních podmínek prostředí s 12hodinovým temnotním/12 hodinovým světelným cyklem. Dvacetčtyři (24) hodinový příjem potravy a tělesná hmotnost byly měřeny každý-'den. Pp adaptační periodě na podmínky prostředí a denní manipulaci a injekce byly myši roztříděny do 3 léčebných skupin. Každá myš dostala 2 intraperitoneální (IP) injekce každý léčebný den (krátce před začátkem temnotní fáze temnotně světelného cyklu a 3 hodiny do temnotní fáze) 0,1 ml následujících zkušebních roztoků.

1) solný roztok (0,9%),

2) bakteriální kontrolní roztok, nebo

3) myší ob protein (3 mikrogramy/0,1 ml).

Bakteriální kontrolní roztok byl vzorek identicky zpracovaný a připravený postupy popsanými pro příklady 2 až 4 k získání a čištění myšího ob proteinu, s výjimkou, že plazmid inzertovaný v E.coli bakterii neměl myší ob gen. Myši byly ošetřeny 2 x denně po dobu 5 dnů a pak nedostaly žádné ošetření po dobu 2 dnů. Příjem potravy v každé kleci byl měřen 2,3,5 a 24 hodin po první IP injekci v každém léčebném dnu

A. Výsledky

Snížení příjmu potravy

Příjem potravy nebyl rozdílný u solného roztoku a bakteriální kontroly injektovanými myším v léčebných a neléčebných dnech během jednotýdenního experimentu (tabulka 3). Avšak příjem potravy byl snížen u 6 myší injektovaných 6 mikrogramy ob proteinu v léčebných dnech během experimentu. Snížení příjmu potravy bylo zjištováno ve 2, 3, 5 a 24 hodinách po první injekci v léčebných dnech u myší přijímajících ob protein ve srovnání se skupinami bakteriální kontroly a solné kontroly.

Snížení tělesného hmotnostního přírůstku

Kumulativní přírůstek tělesné hmotnosti po dobu 5 léčebných dnů byl u ob proteinové skupiny minus 3,3 +/- 0,7 g ve srovnání s -0,9 +/- 0,2 gramy u solného rozotoku a -0,7 +/- 0,4 gramy u bakteriální kontrolní skupiny (tabulka 3).

Závěr

Tento příklad demonstruje, že 2 IP injekce denně bakteriálně expresovaného rekombinantního myšího ob proteinu (6 mi krogramů na myš na den) měly za následek významnou podpůrnou redukci příjmu potravy a významný pokles míry přírůstku hmotnosti ošetřených samic ob/ob myší ve srovnání solným a bakteriálním kontrolním roztokem ošetřenými ob/ob myšmi. Tyto výsledky demonstrují, že bakteriálně expresovaný myší ob protein je biologicky aktivní a má očekávané intiobézní účinky na geneticky obézní od/ob myší podle tohoto vynálezu.

V tabulce 3 jsou dvouhodinové a pštihodinové výsledky středními příjmy potravy, zatímco 24hodinové výsledky jsou pětidenními kumulativními příjmy potravy.

Tabulka 3

Opakované IP podání myšího ob proteinu u ob/ob myší

Ošetření	příjem potravy (g/3 myši)	přírůstek tělesné hmotnosti
	2 hodiny	5 hodin	24	hodin	g
	O, g kontr.	c, g kontr.	g	% kontr.
žádná	5,5 t	14,5*	44,3		-0,9 í
injekce	0,5	0,5	3,5		0,2
kontrola	7,0 í 100	16,5Í 100	49,5	í 100	-0,7 ±
	0,5	1,5	5,1		0,4
ob pro-	3,5 í 50	5,5Í 33	25,5	t 52	-3,3 t
tein	0,5^x/	1,0	4,6	x/	0,7^x/

Údaje jsou středem ΐ sem pro 6 ob/ob myší v každé skupině. Příjem potravy je středním kumulativním příjmem pro klece 3 myší bě+hem 5 dnů ošetření 2, 5 a 24 hodin po první IP injekci. Přírůstek tělesné hmotnosti je kumulativní změnou tělesné hmotnosti během 5 dnů ošetření.

x/ označuje významné změny mezi ob proteinovými a vehikulovými skupinami s p menším než 0,05.

Příklad 16

Biologická aktivita lidského ob proteinu: intracerebroventri kulární (ICV) injekce u ob/ob myší

Způsoby použité k určení biologické ativity lidského ob proteinu intracerebroventrikulární ICV injekcí u ob/ob myší byly stejné jako v příkladu 13 s výjimkou toho, že testované roztoky byly:

. rekombinantní lidský ob protein produkovaný v příkladu 11 (0,05 mikrogramů) ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS) obsahujícím 0,1 % myšího sérového albuminu, a . PBS obsahující 0,1% (hm/obj) myšího sérového albuminu (albuminová kontrola) jako vehikulový kontrolní roztok

A. Redukce příjmu potravy

Během prvních 30 minut po ICV injekci téměř všechny myši požívaly s krátkou latencí a zkonzumovaly přibližně 0,5 g. Myši, které nedostaly injekci, pokračovaly v jídle během příštích 6,5 hodiny a dosáhly kumulativního 7 hodinového příjmu 1,8 g (tabulka 4). Myši přijímající albuminový kon59 trolní roztok ICV také přestaly přijímat potravu po 30 minutách a začaly žrát mezi 3 až 7 hodinami. V kontrastu s tím myši ošetřené lidským proteinem ICV přijímaly potravu významně méně v prvních 30 minutách (0,2 g) a žraly velmi malá množství během dalších 6,5 hodin. Tak jejich kumulativní příjem potravy zůstal potlačen dalších 6,5 hodiny na přibližně 0,4 g (tabulka 4).

B. Redukce přírůstku tělesné hmotnosti hodinová změna tělesné hmotnosti myší injektovaných vehikulovou kontrolou byla mírně snížen od přírůstku myší injektovaných umělým CSF nebo neinjektovaných (tabulka 4). Avšak procentní změna tělesné hmotnosti myší injektovaných lidským ob proteinem byla téměř nulová. (Tabulka 4.)

C. Závěr

Zjištěný účinek přímého podání rekombinantního lidského ob proteinu (0,05 mikrogramů/myš v 1 mikrolitru) do mozku vedla k základní a významné redukci příjmu potravy a přírůstku tělesné hmotnosti samic ob/ob myší, což demonstruje, že ob protein může působit přímo na mozek a je konzistentní s účinkem ob proteinu, když je injekován IP. Tento příklad také potvrzuje biologickou aktiitu bakteriálně expersovaného rekombinantního lidského ob proteinu u samic obézních ob/ob myší.

Tabulka 4

ICV podání lidského ob proteinu u ob/ob myší

Ošetření	příjem potravy (0 - 7 h)	přírůstek těles. hmotn.(0 - 24 h)
	g	9. xx/ -	g	= ^xx/ O
žádná injekce (n = 3)	1,8 + 0,2		3,1 í 0,4
albuminová kontrola (n = 3)	1,0 - 0,4	100	1,7 - 0,6	100
lidský ob protein (1 mikrogram/myš) (n = 5)	0,4 - 0,2*	40	0 i 0,8	0

Údaje jsou střední ΐ sem. n = označuje počet jednotlivých myší.

x/ označuje významné rozdíly mezi lidským proteinem a umělým CSF s p < 0,05, xx/ označují procento kontroly.

Příklad 17

Biologická aktivitu, ob proteinu u obézních lidských subjektů: redukce příjmu zkušebního jídla po IV podání

Biologická aktivita myšího a lidského ob proteinu získaného a vyčištěného podle příkladů 7 až 11 je určena měřením příjmu zkušebního jídla po IV podání lidem, jak je dále uvedeno

Neobézní a obézní lidští dobrovolníci mají k dispozici zkušební jídla o fixovaném kalorickém obsahu v jídelní laboratoři pro 2 příležitosti za použití způsobu Muurahainena,

N.E. a kol., viz výše. Alespoň 1 hodinu před podáním jídla je umístěn na delší dobu katetr v předloketní žíle a je udržován otevřený heparinovou aretací. Vizuální analogová míra hladu se získá 15 minut před, 15 minut po podání a na závěr zkušebního jídla. Myší nebo lidský ob protein nebo solný roztok se pak infúzuje IV 20 minut před podáním jídla. Každý subjekt je instruován tak, aby jedl tolik jídla, kolik si přeje, dokud není uspokojen. Množství přijatého jídla každým subjektem se měří. Každý subjekt pak obdrží infuze bud lidského proteinu (0,5 mg/kg tělesné hmotnosti), myšího ob proteinu (0,5 mg/kg tělesné hmotnosti) nebo solného roztoku a rozdíl v množství zkušebního jídla přijatého za těchto pdmínek se spočítá. U lidské nebo myší ob proteinové skupiny je snížené množství spotřebovaného jídla o alespoň 20 %.

Příklad 18

Biologická ativita ob proteinu u obézních lidských subjektů: indukce ztráty hmotnosti opakovaným IV podáním

Biologická aktivita myších a lidských ob proteinů získaných a vyčištěných podle příkladů 7, resp. 11, se určí měřením hmotnostní ztráty po opakovaném IV podání ob proteinu následujícím způsobem.

Placebem kontrolovaná dvojitě slepá studie ztráty hmotnosti za použití způsobů Drenta, M.L. a kol., viz výše, se provádí. Obézní subjekty s tělesným hmotnostním indexem (BMI) větším než 27 se zváží a pak se u nich uplatní dieta s 1500 kcal po dobu 2 až 4 týdenní běhové periody. Na konci tohoto běhu všechny obézní subjekty, které ztratily alespoň 1 kg tělesné hmotnosti se náhodně rozdělí do 2 léčebných skupin vhodných pro hmotnostní ztrátu během fáze dalšího běhu. Subjekty obdrží denně intravenózně podaný bud lidský nebo myší ob protein (0,5 mg/kg/den) nebo placebo (solný roztok) po alesoň 6 týdnů. Tělesná hmotnost se zaznamenává týdně. Subjekty dostávající lidský nebo myší ob protein mají významné snížení tělesné hmotnosti oproti placebové skupině po 6 týdnech ošetření.

Příklad 19

A. Příprava polyethylenglykolem konjugovaného ob proteinu z E. coli buněk g E. coli buněčné pelety připravené jak je popsáno v příkladu 8 před resuspenzí bylo suspendováno s 1 litrem 50 mM tris-HCl (pH 8,5) obsahující 5 mM EDTA. Suspenze byla inkubována po dobu 15 minut při 37 °C, zředěna dalším 1 1 50 mM tris-HCl (pH 8,5) obsahující 5 mM EDTA. Potom byla suspenze homogenizována pomocí homogenizátoru po dobu 15 minut při 50%ním silovém nastavení. Suspenze byla vyčištěna odstře63 děním při 8 000 otáčkách za minutu, 4 °c, po dobu 1 hodiny. Peleta byla odstraněna.

Supernatant byl zředěn vodou na vodivost 1,8 mS a nanesen přímo na sloupec naplnění 200 ml Q-Sepharose Fast Flow (silná aniontoměnná pryskyřice) předvyvážené 50 mM tris-HCl (pH 8,5). Po promytí vyvažovacím pufrem byl adsorbovaný ob protein eluován ze sloupce stejným vyvažovacím pufrem, který navíc obsahoval 100 mM NaCI. Eluát získaný po zpracování sloupce vyvažovacím pufrem obsahujícím chlorid sodný byl nazván Q-Sepharosový eluát.

Tuhý NaCI byl přidán k Q-Sepharosovému eluátu až se dosáhlo konečné vodivosti 82 mS. Potom byl eluát nanesen na hydrofóbní interakční sloupec (HIC) naplněný 200 ml butyl-Sepharose Fast Flow, předvyvážené 5O.-mM tris-HCl (pH 8,5) obsahující 1 M NaCI. Neadsorbované materiály byly vymyty vyvažovacím pufrem a adsorbovaný ob protein byl eluován 50 mM octanu amonného (pH 6,9), čímž se vytvořil HIC eluát.

Ob protein v HIC eluátu byl určen jako 95%ně čistý revers ní fázovou HPLC. Vyčištěný ob protein byl koncentrován na 3,7 mg/ml pomocí třídicí membrány (YM-10). Třídicí membrána byla membrána, která zadržovala molekuly 10 000 daltonů nebo větší. Po tomto koncentračním stupni při použití třídicí membrány byl ob protein diafiltrován do 100 mM borátového pufru (pH 8,0), který byl použit jako zásobní roztok.

B. Pegylace lidského ob proteinu

Při provádění této pegylační reakce byl použit PEG2-NHS raagent vzorce II-Aů, kde R je CH^, součet n a n' v rozmezí 820 až 1 040 s průměrným součtem asi 930 a s průměrnou molekulovou hmotností 40 kDa, který byl zakoupen od firmy Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama.

Byla to směs PEG2-NHS reagentů vzorce II-A, kde poměr n k n' je přibližně 1,0 a součet n a n' v této směsi v rozmezí 820 až 1 040 jednotek, s průměrnou molekulovou hmotností PEG řetězce v této směsi přibližně 20 kDa, takže průměrná molekulová hmotnost tohoto reagentů je přibližně 40 kDa s průměrným součtem n a n' v této směsi jsoucím asi 930.

K 2 mg nebo 0,54 ml 3,7 mg/ml vyčištěného lidského ob zásobního roztoku připraveného výše v části A (125 nmol ob proteinu) bylo přidáno 250 nmol výše uvedeného PEG^-NHS reagenčního roztoku. Tento roztok obsahoval 10 mg nebo 0,1 ml 100 mg/ml PEG2-NHS reagenčního roztoku v 1 mM HCI.

Celková reakční směs byla vytvořena až do 0,67 ml přídavkem 100 mM borátu o pH 5,0. Finální molární poměr proteinu k reagentů byl 1:2. Tato směs byla míchána při 4 °C po dobu 4 hodin a reakce byla zastavena přídavkem 1 mikrolitrů ledové kyseliny octové, čímž se vytvořilo finální pH 4,5. Výsledná reakční směs 0,67 ml byla zředěna vodou, čímž se vytvořilo 27 ml roztoku, který byl uložen na sloupec obsahující 1,7 ml karboxymethylované kationtoměnné pryskyřice (Perseptives, Framingham , Massachusetts). Sloupec byl uveden do rovnováhy 3,3 mikromoly HEPES/MES/acetát sodný pufrem, pH 5,0. Zředěná reakční směs byla nanesena na sloupec a neadsorbovaný PEG2-NHS reagent byl vymyt ze sloupce.

Adsorbované pegylované a nemodifikované ob proteiny byly eluovány stupóvitými solnými gradienty (15 objemů sloupce každý)

80, 150 a 500 mři NaCl.2 ml těchto eluátů byly separátně jímány postupně a tyto vzorky každé frakce byly podrobeny SDS-PAGE analýze.

Z této analýzy byly eluáty klasifikovány jako vysoce pegylované konjugáty požadované rozvětvené mono-PEG-ob (0EG2“Ob) a nemodifikovaný ob protein. Každá z těchto frakcí byla vzata do třídicích zařízení uvedených výše a druhá skupina obsahovala požadovaný rozvětvený mono-PEG2~ob protein. Tento požadovaný protein měl strukturu sloučeniny vzorce I-A, kde součet n a n' byl přibližně 820 až 1040, s průměrným součtem asi 930, R a R' jsou CH^ a průměrná molekulová hmotnost každého PEG řetězce byla asi .20 kDa.₍ Pegylovaný produkt měl průměrnou molekulovou hmotnost 56 kDa. Část obsahující PEG2~ob byla koncentrována na 3,7 mg/ml pomocí YM 10 membrány

YM 10 je třídicí membrána, která zadržuje molekuly o molekulové hmotnosti 10 000 daltonů nebo větší. Po roztřičovacím kroku byl koncentrovaný materiál diafiltrován do PBS pufru (pH 7,3) a uskladněn zmrazený při -20 °C.

Tento uskladněný produkt byl pegylovaný ob protein vzorce I-A, kde součet n a n' byl přibližně 820 až 1040 a průměrná molekulová hmotnost každého ob řetězce byla přibližně 20 kilo daltnů. Průměrná molekulová hmotnost PEG proteinu v této proteinové konjugátové směsi byla 56 kilodaltnů.

Příklad 20

Biologická zkouška pegylovaného lidského proteinu:

IP injekce ob/ob myším

Způsoby

Byly studovány dvě skupiny 6 myších samic obézních ob/ob myší. Myši byly umístěny v plastických klecích (tři/klec) za konstantních podmínek prostředí s 12 hodinami temnotního/12 hodinami světelného cyklu. 24 hodin příjmu potravy a tělesná hmotnost byly měřeny každý den. Po adaptační periodě na podmínky prostředí, denní manipulaci a injekce, byly myši rozdě lény do dvou ošetřovaných skupin. Každá myš dostala 1 intraperitoneální (IP) injekci v den 1 tohoto experimentu (právě před začátkem temnotní fáze temnotního/světelného cyklu)

0,1 ml následujících roztoků: solný roztok (0,9%ní), lidský ob protein ve formě zásobního roztoku připraveného v části A příkladu 19a (30 mikrogramů/0,1 ml), pegylovaný kontrolní roztok (stejně zpracovaný a vyčištěný vzorek bez lidského proteinu) nebo pegylovaný ob protein (30 mikrogramů/0,1 ml) připravený jak je popsáno v příkladu 19.

Myši byly injektovány jen jednou v den 1. Denní příjem potravy na klec a tělesná hmotnost každé myši byly měřeny po příští 3 dny a znovu v den 6.

Výsledky

A. Redukce příjmu potravy

Denní příjem potravy nebyl rozdílný u solného roztoku a pegylační kontroly, které byly myším injektovány v jednom ošetření a ve dvou následných dnech (tabulka 5). Avšak denní příjem byl redukován u 6 myší injektovaných 30 mikrogramy lidského ob proteinu a pegylovaného lidského ob proteinu v den ošetření (5,2, 8,2 oproti 11,9, 11,4 g) ve srovnání se solným roztokem a pegylovanou kontrolní injekcí u myši. Příjem potravy myší injektovaných lidským proteinem se vrátil na kontrolní úrovně, zatímco příjem potravy myší in jektovaných.'. pegylovaným lidským ob proteinem zůstal snížený v následujících dnech experimentu.

Redukce příjmu potravy byla zjišťována 48 hodin po 1 injekci pegylované lidské ob proteinové skupiny. Kumulativní 24hodinový příjem potravy po dobu 3 dnů experimentu byl významně snížen na 49 % kontroly u pegylovaných lidských ob proteinů ve srovnání se solnou a pegylovanou kontrolní skupinou.

t

B. Redukce tělesného hmotnostního přírůstku

Změna tělesné hmotnosti nebyla rozdílná u solných a pegylovaných kontrolně injektovaných myší při jednom ošetření a dvou následných dnech (tabulka 6). Avšak tělesná hmotnost byla snížena u 6 myší injektovaných 30 mikrogramy lidského ob proteinu a pegylovaného lidského proteinu v den ošetření (-0,9,

-0,7 oproti 0,1, 0,3 g) ve srovnání k solným a pegylovaným kontrolně injektovanými myšmi.

Tělesná hmotnost myší injektovaných lidským ob proteinem zůstala na kontrolních hladinách, zatímco tělesná hmotnost myši injektované lidským pegylovaným ob proteinem pokračovala v poklesu v následujících dnech experimentu. Pokračující redukce tělesné hmotnosti byla zjištěna 48 hodin po jednotlivé injekci u pegylované lidské ob proteinové skupiny. Kumulativní změna tělesné hmotnosti po dobu 6 dnů experimentu byla

-1,6 g ve srovnání s 0,4 g u ob proteinové skupiny, 0,7 g u solného roztoku a 1,1 - 0,2 gu pegylované kontrolní skupiny (tabulka 6).

Závěr

Tento příklad demonstruje, že jednotlivá IP injekce pegylovaného lidského ob proteinu (30 mikrogramů/myš) měla za následek významné vytrvalé snížení příjmu potravy a významný pokles tělesné hmotnosti ošetřené samice ob/ob myši po dobu 3 dní ve srovnání se solným roztokem a pegylačním kontrolním roztokem u ošetřených ob/ob myší. Tyto výsledky demonstrují, že pegylované lidské ob proteiny mají trvalý, potentní, biologicky aktivní účinek a mají očekávané antiobézní účinky na geneticky obézních ob/ob myších.

Tabulka 5

Denní příjem potravy jednotlivého IP podání pegylovaného lidského proteinu u ob/ob myší)

Ošetření Příjem potravy (3 myši/den)

	den 1	den 2	den '3
g	% kontroly	g	% kontroly	g	% kontroly
solný roztok	11,9	100	13,7	100	13,6	100
ob protein	5,2	43,7	11,7 ..	85,4	12,5	92
pegylovaná kontrola	11,4	95,8	4,5	106	13,4	99
pegylovaný ob protein	8,2	68,9	6,0	43,8	4,9	36

Údaje jsou střední pro 6 ob/ob myší v každé skupině. Příjem potravy je střední denní příjem potravy na klec tří myší v každý den experimentu po jednotlivé IP injekci v den 1. Všimněte si stálé redukce v denním příjmu potravy jen u pegylované ob proteinové skupiny.

Tabulka 6

Změna tělesné hmotnosti po jednotlivém IP podání pegylovaného lidského ob proteinu u ob/ob myší

Ošetření Změna tělesné hmotnosti (gramy)

	den 1	den 2	den3	den 6
solný roztok	0,1	0,6	0,01	-0,01
ob protein	- 0,9	1,1	0,2	ND
PEGYLovaná kontrola	0,3	0,4	0,6'	-0,2
PROTEIN	- 0,7	- 0,6	- 0,9	0,6

Údaje jsou střední hodnotou pro 6 ob/ob myší v každé skku pině. Myši dostaly jednotlivou IP injekci jen v první den. Změna tělesné hmotnosti je změnou tělesné hmotnosti v každý den experimentu. Zaznamenejte stálou hmotnostní ztrátu jen u pegylované ob proteinové skupiny. ND v tabulce značí neurčeno.

Sekvenční zápis (1) Obecná informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Ulice: Grenzacherstrasse 124 (C) Město: Basilej (D) Stát: BS (E) Země: Švýcarsko (F) Poštovní kód (ZIP): CH-4070 (G) Telefon: 061 - 688 42 56 (H) Telefax: 061 - 688 13 95 (I) Telex: 962292/965542 hlr ch (ii) Název vynálezu: Rekombinantní obézní (ob) proteiny (iii) Počet sekvencí: 8 (iv) Počítačově čitelná forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: Apple Macintosh (C) Operační systém: Systém 7.1 (Macintosh) (D) Software: Word 5.0 (2) Informace pro SEKV ID Č:l:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 702 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA <

(iii) Hypotetický: žádný (iv) Antismyslný: žádný (xi) Sekvenční popis: SEKV ID Č:l:

CAAGGTGCAA	GAAGAAGAAG	ATCCCAGGGA	GGAAAATGTG	CTGGAGACCC	CTGTGTCGGT	60
TCCTGTGGCT	TTGGTCCTAT	CTGTCTTATG	TTCAAGCAGT	GCCTATCCAG	AAAGTCCAGG	120
ATGACACCAA	AACCCTCATC	AAGACCATTG	TCACCAGGAT	CAATGACATT	TCACACACGC	180
AGTCGGTATC	CGCCAAGCAG	AGGGTCACTG	GCTTGGACTT	CATTCCTGGG	CTTCACCCCA	240
TTCTGAGTTT	GTCCAAGATG	GACCAGACTC	TGGCAGTCTA	TCAACAGGTC	CTCACCAGCC	300
TGCCTTCCCA	AAATGTGCTG	CAGATAGCCA	ATGACCTGGA	GAATCTCCGA	GACCTCCTCC	360
ATCTGCTGGC	CTTCTCCAAG	AGCTGCTCCC	TGCCTCAGAC	CAGTGGCCTG	CAGAAGCCAG	420
AGAGCCTGGA	TGGCGTCCTG	GAAGCCTCAC	TCTACTCCAC	AGAGGTGGTG	gctttgagca	480
GGCTGCAGGG	CTCTCTGCAG	GACATTCTTC	AACAGTTGGA	TGTTAGCCCT	GAATGCTGAA	540
GTTTCAAAGG	CCACCAGGCT	CCCAAGAATC	ATGTAGAGGG	AAGAAACCTT	GGCTTCCAGG	600
GGTCTTCAGG	AGAAGAGAGC	CATGTGCACA	CATCCATCAT	TCATTTCTCŤ	CCCTCCTGTA	660
GACCACCCAT	CCAAAGGCAT	GACTCCACAA	TGCTTGACTC	AA		702

(2) Informace pro SEKV ID Č:2:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 167 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: nerelevantní (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetický: žádný (iv) Antismyslný: žádný (xi) Sekvenční popis: SEKV ID Č:2.

Met 1

Cys

Trp Arg Pro Leu Cys Arg 5

Phe

Leu Trp Leu Trp Ser Tyr

Leu

10

15

Ser

Tyr

Val

Gin

Ala

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Thr

Lys

20

25

30*

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

35

40

45

Gin

Ser

Val

Ser

Ala

Lys

Gin

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

50

55

60

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Ser

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

65

70

75

80

Val

Tyr

Gin

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Gin

Asn

Val

Leu

Gin

85

90

95

Ile

Ala

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Leu

Ala

100

105

_f

110

Pne

Ser

Lys

Ser

Cys

Ser

Leu

Pro

Gin

Thr

Ser

Gly

Leu

Gin

Lys

Pro

115

120

125

•

Glu

Ser

Leu

Asp

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

130

135

140

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Ile

Leu

Gin

145

150

155

160

Leu

Asp

Val

Ser

Pro

Glu

Cys

165

(2) Informace pro SEKV ID č:3:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 146 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: nerelevantní (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetický: žádný (iv) Antismyslný: žádný (xi) Popis sekvence: SEKV ID Č: 3:

Val 1

Pro

Ile

Gin

Lys 5

Val

Gin

Asp

Thr 10

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys 15

Thr

Ile

Val

Thr

Arg 20

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser 25

His

Thr

Gin

Ser

Val 30

Ser

Ala

Lys

Gin

Arg 35

Val

Thr

Gly

Leu

Asp 40

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu 45

His

Pro

Ile

Leu

Ser 50

Leu

Ser

Lys

Met

Asp 55

Gin

Thr

Leu

Ala

Val 60

Tyr

Gin

Val

Leu 65

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser 70

Gin

Asn

Val

Leu

Gin 75

Ile

Ala

Asn

Asp

Leu 80

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp 85

Leu

His

Leu

Leu 90

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser 95

Cys

Ser

Leu

Pro

Gin 100

Thr

Ser

Gly

Leu

Gin 105

Lys

Pro

Glu

Ser

Leu 110

Asp

Gly

Val

Leu

Glu 115

Ala

Ser

Leu

Tyr

Ser 120

Thr

Glu

Val

Ala 125

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin 130

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp 135

Ile

Leu

Gin

Leu 140

Asp

Val

Ser

Pro

Glu Cys 145 (2) Informace pro SEKV ID Č:4:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 690 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický: žádný (iv) Antismyslný: žádný (xi) Sekvenční popis: SEKV ID Č:4:

GTTGCAAGGC	CCAAGAAGCC	CATCCTGGGA	AGGAAAATGC	ATTGGGGAAC	CCTGTGCGGA	60
TTCTTGTGGC	TTTGGCCCTA	TCTTTTCTAT	GTCCAAGCTG	TGCCCATCCA	AAAAGTCCAA	120
GATGACACCA	AAACCCTCAT	CAAGACAATT	GTCACCAGGA	TCAATGACAT	TTCACACACG	180
CAGTCAGTCT	CCTCCAAACA	GAAAGTCACC	GGTTTGGACT	TCATTCCTGG	GCTCCACCCC	240
ATCCTGACCT	TATCCAAGAT	GGACCAGACA	CTGGCAGTCT	ACCAACAGAT	CCTCACCAGT	300
atgccttcca	GAAACGTGAT	CCAAATATCC	AACGACCTGG	AGAACCTCCG	GGATCTTCTT	360
CACGTGCTGG	CCTTCTCTAA	GAGCTC-CCAC	TTGCCCTGGG	CCAGTGGCCT	GGAGACCTTG	420
GACAGCCTGG	GGGGTGTCCT	GGAAGCTTCA	GGCTACTCCA	CAGAGGTGGT	GGCCCTGAGC	480
AGGCTGCAGG	GGTCTCTGCA	GGACATGCTG	TGGCAGCTGG	ACCTCAGCCC	TGGGTGCTGA	540
GGCCTTGAAG	GTCACTCTTC	CTGCAAGGAC	TACGTTAAGG	GAAGGAACTC	TGGCTTCCAG	600
GTATCTCCAG	GATTGAAGAG	CATTGCATGG	ACACCCCTTA	TCCAGGACTC	TGTCAATTTC	660
CCTGACTCCT	CTAAGCCACT	CTTCCAAAGG				690

(2) Informace pro SEKV ID Č:5:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 167 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: nerelevantní (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetický: žádný (iv) Antismyslný: žádný

(:

xi)

Sek

verv

ční

POP

is:

SEKV I

D Č

:5:

Met

His

Trp

Gly

Thr

Leu

Cys

Gly

Phe

Leu

Trp

Leu

Trp

Pro

Tyr

Leu

1

5

10

15

Phe

Tyr

Val

Gin

Ala

Val

Pro

Ile

Gin

Lys

Val

Gin

Asp

Thr

Lys

20

25

30

Thr

Leu

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Thr

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser

His

Thr

35

40

45

Gin

Ser

Val

Ser

Lys

Gin

Lys

Val

Thr

Gly

Leu

Asp

Phe

Ile

Pro

50

55

60

Gly

Leu

His

Pro

Ile

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ala

65

70

75

80

Val

Tyr

Gin

Ile

Leu

Thr

Ser

Met

Pro

Ser

Arg

Asn

Val

Ile

Gin

85

⁹⁰

95

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp

Leu

His

Val

Leu

Ala

100

105

110

Phe

Ser

Lys

Ser

Cys

His

Leu

Pro

Trp

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Leu

115

120

125

Asp

Ser

Leu

Gly

Val

Leu

Glu

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser

Thr

Glu

Val

130

135

140

Val

Ala

Leu

Ser

Arg

Leu

Gin

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Met

Leu

Trp

Gin

145

150

155

160

Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165

ΊΊ (2) Informace pro SEKV ID Č:6:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 146 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: nerelevantní (D) Topologie: neznámá (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetický: žádný (iv) Antismyslný: žádný (xi) Sekvenční popis: SEKV ID Č:6:

Val 1

Pro

Ile

Gin

Lys 5

Val

Gin

Asp

Thr 10

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys 15

Thr

Ile

Val

Thr

Arg 20

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser 25

His

Thr

Gin

Ser

Val 30

Ser

Lys

Gin

Lys 35

Val

Thr

Gly

Leu

Asp 40

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu 45

His

Pro

Ile

Leu

Thr 50

Leu

Ser

Lys

Met

Asp 55

Gin

Thr

Leu

Ala

Val 60

Tyr

Gin

Ile

Leu 65

Thr

Ser

Met

Pro

Ser 70

Arg

Asn

Val

Ile

Gin 75

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu 80

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp 85

Leu

His

Val

Leu 90

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser 95

Cys

His

Leu

Pro

Trp 100

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu 105

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu 110

Gly

Val

Leu

Glu 115

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser 120

Thr

Glu

Val

Ala 125

Leu

Ser

Arg

Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Met Leu Trp Gin Leu Asp Leu Ser 130 135 140

Pro Gly Cys 145 (2) Informace pro SEKV ID Č:7:

(i) sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 63 párů bází (B) typ: nukleové kyselina (C) řetězec: dvojitý (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomické) (iii) hypotetický: žádný (iv) antisense: žádný (xi) sekvenční popis: SEKV ID Č:7

ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG GCC (2) Informace pro SEKV ID Č:8:

(i) sekvenční charakteristiky:

(A) délka: 21 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) řetězec: nerelevantní (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetický: žádný (iv) antisense: žádný (xi) sekvenční popis: SEKV ID Č: 8:

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala 15 10

Gly Phe Ala Thr Val Ala Gin Ala

20

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Homogenní biologicky aktivní lidský obézní protein nebo jeho fragment, kterýžto fragment má biologickou aktivitu uvedeného proteinu.
2. Protein nebo fragment podle nároku 1, kde biologická aktivita tohoto proteinu nebo fragmentu je vyznačena redukcí příjmu potravy u savců a redukční mírou hmotnostního přírůstku u savců.
3. Protein podle nároku 1 obsahující SEKV ID Č:6.
4. Rekombinantní biologicky aktivní lidský obézní protein prostý jiných savčích proteinů nebo jejich fragmentů, kterýžto fragment má biologickou aktivitu uvedeného proteinu.
5. Protein nebo fragment podle nároku 4, kde biologická aktivita tohoto proteinu je vyznačena redukcí příjmu potravy u savců a redukční mírou přírůstku hmotnosti u savců.
6. Protein podle nároku 4 zahrnující SEKV ID Č:6.
7. Homogenní biologicky aktivní myší obézní protein nebo jeho fragment, kterýžto fragment má biologickou aktivitu uvedeného proteinu.
8. Protein nebo fragment podle ná.roku 7, kde biologická aktivita tohoto proteinu nebo fragmentu je vyznačena snížením příjmu potravy u savců a snížením míry hmotnostního přírůstku u savců.
9.

Protein podle nároku 7 zahrnující SEKV ID Č:3.

1θ· Rekombinantní biologicky aktivní myší obézní protein prostý jiných savčích proteinů nebo jejich fragmentů, kterýžto fragment má biologickou aktivitu uvedeného proteinu.
11. Protein podle nároku 10, kde biologická aktivita tohoto proteinu je vyznačena snížením příjmu potravy u savců a snížením míry hmotnostního přírůstku u savců.
12. Protein podle nároku 10 zahrnující SEKV ID Č:3.
13. Expresívní vektor zahrnující:

a) promotorovou sekvenci, a

b) DNA sekvenci kódující fúzní protein, kterýžto fúzní pro» tein zahrnuje myší ob protein SEKV ID Č:3 nebo lidský ob protein SEKV ID Č:6, a signální peptid pro vnější membránový protein A E.coli, kterýžto expresívní vektor je schopen expresovat fúzní protein v Escherichia coli hostitelských buňkách.
14. Expresívní vektor podle nároku 13, kde promotorové sekvence sestává z jak lac-promotoru - operátoru, tak lipoproteinového promotoru.
15. Fúzní protein zahrnující myší obézní protein nebo lidský obézní protein a signální peptid pro vnější membránový protein A Escherichia coli.
16. Fúzní protein podle nároku 15, kde myší obézní protein zahrnuje SEKV ID Č:3 a kde lidský obézní protein zahrnuje SEKV ID Č:6.
17. DNA sekvence zahrnující první a druhou část, kde (a) první část je sOmpA genová sekvence SEKV ID Č:7, kódující sOmpA peptid, (b) druhá část je nukleotidová sekvence kódující myší ob protein nebo nukleotidová sekvence kódující lidský ob protein.

18. zahrnuje DNA SEKV sekvence ID Č:3. podle nároku 17, kde myší ob protein 19 . zahrnuje DNA SEKV sekvence ID Č:6. podle nároku 17, kde lidský ob protein
20. Escherichia coli hostitelský organizmus transformovaný expresivním vektorem z nároku 13.
21. Způsob produkce biologicky aktivního rekombinantního lidského nebo myšího obézního proteinu prostého jiných savčích proteinů vyznačený tím, že zahrnuje (a) konstrukci expresivního vektoru majícího promotorovou sekvenci, a DNA sekvenci :kódující fúzní protein, kterýžto fúzní protein zahrnuje SEKV ID Č:3 nebo SEKV ID Č:6, a signální peptid pro vnější membránový protein A E. coli, (b) inzerci expresivního vektoru do E.coli hostitelské buňky k transformaci E.coli hostitelské buňky, (c) expresi fúzního proteinu v E.coli hostitelské buňce a (d) ošetření E. coli hostitelské buňky chladným osmotickým šokovým pufrem k uvolnění myšího nebo lidského ob proteinu prostého jiných savčích proteinů a prostého signálního peptidu.
22. Lidská ob genová sekvence zahrnující SEKV ID Č:4.
23. Způsob produkce homogenního biologicky aktivního rekombinantního lidského nebo myšího obézního proteinu vyznačený tím, že se osmotická tekutina obsahující lidský nebo myší protein podrobí kombinaci aniontoměnné sloupcové chromatografie, hydrofobní interakční sloupcové chromatografie a gelové filtrace.
24. Kompozice zahrnující alespoň jeden konjugát polyethylenglykolu a/nebo polypropylenglykolu vázaný na lidský nebo myší ob protein, jak je nárokováno v nárocích 1 až 12 přičemž průměrná molekulová hmotnost polyethylen nebo polypropylenglykolových jednotek v těchto konjugátech v uvedené kompozici je mezi 15 kDa až 60 kDa.
25. Kompozice zahrnující alespoň jeden konjugát vzorce

ROCH„CH„(OCH_CH„) O-— C

Xt At At At n

O

II

R'OCH CH (0CH_oCH_) , -O-C -NH z z z z n (CK₂)₄ (I-A)

CH /\

NH C-NH--Ρ ll o

II o

kde P je lidský nebo myší ob protein jak je nárokován v nárocích 1 až 12, n a n' jsou celá čísla mající součet od 300 do 1500, přičemž průměrná molekulová hmotnost polyethylenglykolových jednotek v těchto konjugátech v této kompozici je od 15 kDa do 60 kDa a R a R' jsou nižší alkyl.

τ
26. Kompozice podle nároku 25, kde součet n a n' je mezi 800 až 1200 a průměrná molekulová hmotnost polyethylenglykolových jednotek v tomto konjugátu v uvedené kompozici je 35 až 45 kDa.
27. Kompozice zahrnující alespoň jeden konjugát vzorce

O n

RO(CH_CH_O) CH„CH_-C-NH-P . ' (I-B) z z n z z kde P je lidský nebo myší ob protein jak je nárokován v nárocích 1 až 12, n je celé číslo mající součet od 300 do 1500, přičemž průměrná molekulová hmotnost polyethylenglykolových jednotek v uvedených konjugátech v uvedené kompozici je 15 kDa až 60 kDa, a R je nižší alkyl.
28. Kompozice podle nároku 27, kde n je od asi 850 do 1000 a průměrná molekuklová hmotnost polyethylenglykolových jednotek v uvedených konjugátech v této kompozici je od 35 do 45 kDa.
29. Lidský nebo myší ob protein jak je nárokován v nárocích 1 až 12 nebo kompozice jak je nárokována v nárocích 24 až 28, jako terapeuticky aktivní prostředky.
30. Lidský nebo myší ob protein jak je nárokován v nárocích 1 až 12 nebo kompozice jak jsou nárokovány v nárocích 24 až 28, jako terapeuticky aktivní prostředky pro léčení, prevenci a potlačování obezity a přidružených nemocí.
31. Farmaceutická směs obsahující lidský nebo myší ob protein podle nároků 1 až 12 nebo kompozici podle nároků 24 až 28 a kompatibilní farmaceuticky akceptovatelný nosný materiál .
32. Použití lidského nebo myšího ob proteinu nárokovaného v nárocích 1 až 12 nebo kompozice nárokované v nárocích 24 až 28 pro přípravu farmaceutických směsí.
33. Použití lidského nebo myšího ob proteinu nárokovaného v nárocích 1 až 12 nebo kompozice nárokované v nárocích 24 až 28 pro přípravu farmaceutických směsí pro léčení, prevenci a potlačování obezity a přidružených nemocí.
34. Použití lidského nebo myšího ob proteinu nárokovaného v nárocích 1 až 12 pro identifikaci ob proteinového receptoru nebo receptorů.
35. Použití expresivního vektoru nárokovaného v nárocích 13 a 14 pro produkci lidského nebo myšího ob proteinu jak je nárokován v nárocích 1 až 12.
36. Použití DNA sekvence nárokované v nárocích 17 až 19 pro produkci lidského nebo myšího ob proteinu nárokovaného v nárocích 1 až 12.
37. Použití Escherichia coli hostitelského organizmu pro produkci lidského nebo myšího proteinu nárokovaného v nárocích 1 až 12.
38. Homogenní biologicky aktivní rekombinantní lidský nebo myší ob protein kdykoli připravený způsobem nárokovaným v nárocích 21 nebo 23.

SíL, Způsob léčení, prevence a potlačováni—obezity a přidruz^nýek—aemocí vyznačenýtím,že se podá lidský nebo myší ob prQtein náro^óV2tftý_v_^árocích 1 až 12 a 33 nebo komposice nárokovaná v nárocích 24 az^TST ---Produkty, farmaceutické směsi, procesy a způsoby v podstatě jak jsou zde popsány.