BR112013007388B1

BR112013007388B1 - Polipeptídeo tendo domínio de ligação de albumina e leptina, seu uso no tratamento de doenças, bem como composição farmacêutica que o compreende

Info

Publication number: BR112013007388B1
Application number: BR112013007388-8A
Authority: BR
Inventors: Soumitra S. Ghosh; Mary Erickson; David C. Litzinger; Zijian Guo; Jonathan David Roth
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals, Llc; Astrazeneca Pharmaceuticals Lp
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2022-01-04
Also published as: JP2013543497A; EP2621519A2; CN103547590B; CN103403019A; JP6608799B2; JP2020033366A; US20130274182A1; BR112013007388A2; EA201390474A1; MX2013003482A; CN103547590A; US20130203661A1; WO2012050930A3; CY1119498T1; WO2012050925A2; CN103403019B; CA3138758A1; ES2630031T3; JP2014502252A; PT2621515T

Abstract

polipeptídeo tendo domínio de ligação de albumina e leptina, seu uso no tratamento de doenças, bem como composição farmacêutica que o compreende. a presente invenção refere-se aos polipeptídeos construídos que apresentam um domínio de ligação de albumina e um primeiro domínio de hormônio de peptídeo selecionado de uma leptina, um análogo de leptina ou um fragmento ativo do mesmo. a presente invenção fornece ainda uma composição farmacêutica compreendendo os referidos polipeptídeos e ao uso dos mesmos no tratamento de doenças e distúrbios, incluindolipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso, diabetes (incluindo tipo i e tipo ii), esteato-hepatite não alcoólica (nash), doença hepática gordurosa não alcoólica (dhgna), síndrome x metabólica e doença de huntington.

Description

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido US N°61/387.402 depositado em 28 de Setembro de 2010 e no Pedido US N° 61/422.091 depositado em 10 de Dezembro de 2010, as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O presente pedido contém uma listagem de sequência, aqual foi enviada no formato ASCII via EFS-Web e é aqui incorporada por referência na íntegra. A referida cópia em ASCII, criada em 27 de Outubro de 2011, é denominada 1317WO1.txt e tem 159.244 bytes de tamanho.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A invenção proporciona novos compostos que têmatividade biológica demonstrada. Os compostos também demonstram aprimoramento surpreendente e significativo em propriedades físicas, tais como solubilização e estabilidade.

[0004] Os compostos da invenção são baseados em sequênciasde leptina descritas no Pedido U.S. N° 61/387.402 e Pedido US N° 61/422.091. Os compostos são, surpreendentemente, altamente solúveis e não demonstram a propensão de agregar, diferente das leptinas que ocorrem naturalmente. As propriedades físicas dos compostos facilitam o preparo de formulações e composições solúveis farmaceuticamente aceitáveis, também fornecidas pela invenção. Doenças passíveis de tal tratamento incluem lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, peso excessivo, obesidade, amenorréia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso, diabetes (incluindo tipo I e tipo II), esteato-hepatite não alcoólica (Non Alcoholic Steato Hepatitis - NASH), doença do fígado gorduroso não alcoólica (Non Alcoholic Fatty Liver Disease - NAFLD), síndrome X metabólica e Doença de Huntington ou combinações dos mesmos.

[0005] Permanece uma necessidade de desenvolver polipeptídeosúteis nas doenças, condições e distúrbios metabólicos acima descritos. Consequentemente, é um objetivo da presente invenção proporcionar novos polipeptídeos úteis para tratar as condições acima e métodos para produção e uso dos mesmos.

[0006] Cada Patente, Pedido de Patente e Publicação citada aquié incorporada aqui por referência na íntegra e para todos os efeitos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] São fornecidos compostos polipeptídicos quiméricos tendoatividade biológica de leptina, além de propriedades físicas intensificadas. Os compostos são polipeptídeos quiméricos os quais são baseados em um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre em que pelo menos uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre foi substituída por uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina humana madura.

[0008] Em um primeiro aspecto, é proporcionado um polipeptídeoquimérico, conforme descrito aqui.

[0009] Em outro aspecto, é proporcionado um método paratratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo que precisa de tratamento. O método inclui administração de um polipeptídeo quimérico conforme descrito aqui ao indivíduo.

[00010] Em ainda outro aspecto, é proporcionada uma composição farmacêutica a qual inclui um polipeptídeo quimérico descrito aqui em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00011] Em ainda outro aspecto, são proporcionados polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo quimérico e seus intermediários, vetores de expressão trazendo tais polinucleotídeos, células hospedeiras que expressam tais polinucleotídeos e meios para sua expressão, síntese, modificação pós-traducional e isolamento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00012] As Figs. 1A-1C representam os efeitos de uma administração diária dos polipeptídeos quiméricos indicados descritos aqui sobre a ingestão de alimento e alteração de peso corporal (% corrigido para veículo) quando de administração a camundongos C57/B6 fêmeas, conforme descrito no Exemplo 4. Figura 1A: ingestão de alimento. Figura 1B: alteração no peso corporal (% veículo- corrigido). Figura 1C: curva de dose-resposta.

[00013] As Figs. 2A-2C representam os efeitos de uma administração diária dos polipeptídeos quiméricos indicados descritos aqui sobre a ingestão de alimento e alteração de peso corporal (% corrigido para veículo) quando de administração a camundongos C57/B6 fêmeas, conforme descrito no Exemplo 5. Figura 2A: ingestão de alimento. Figura 2B: alteração no peso corporal (% veículo- corrigido). Figura 2C: curva de dose-resposta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[00014] "Obesidade" e "peso excessivo" referem-se a mamíferos tendo um peso maior do que normalmente esperado e podem ser determinados, por exemplo, pela aparência física, índice de massa corporal (IMC) conforme conhecido na técnica, relações de circunferência da cintura-para-quadril, dobras cutâneas, circunferência da cintura e similares. O Center for Disease Control and Prevention (CDC) define peso excessivo como um ser humano adulto que tem um IMC de 25 a 29,9 e define obesidade como um ser humano adulto que tem um IMC de 30 ou maior. Há medidas adicionais para determinação de obesidade. Por exemplo, o CDC afirma que uma pessoa com uma relação cintura-para-quadril maior do que 1,0 está acima do peso.

[00015] "Massa corporal magra" refere-se à massa sem gordura do corpo, isto é, o peso corporal total menos o peso de gordura corporal é a massa corporal magra. A massa corporal magra pode ser medida por meio de métodos tais como pesagem hidrostática, câmaras computadorizadas, absorciometria de dupla energia de raios X, calibradores de pele, ressonância magnética nuclear (Magnetic Resonance Imaging - MRI) e análise de impedância bioelétrica (Bioelectric Impedance Analysis - BIA), conforme conhecido na técnica.

[00016] "Mamífero"refere-se a animais de sangue quente que têm, em geral, pele ou pêlo, que dão à luz a sua prole e que alimentam sua prole com leite. Mamíferos incluem seres humanos, animais de companhia (por exemplo, cães, gatos), animais de criação (por exemplo, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, cabras), animais selvagens e similares. Em uma modalidade, o mamífero é uma fêmea. Em uma modalidade, o mamífero é um ser humano do sexo feminino. Em uma modalidade, o mamífero é um cão ou gato. Em uma modalidade, o mamífero é um mamífero diabético, por exemplo, um ser humano com diabetes do tipo 2. Em uma modalidade, o mamífero é um mamífero diabético obeso, por exemplo, um mamífero obeso com diabetes do tipo 2. O termo "indivíduo", no contexto dos métodos descritos aqui, refere-se a um mamífero.

[00017] "Fragmento", no contexto de polipeptídeos refere-se, aqui, no sentido químico usual, a uma porção de um polipeptídeo. Por exemplo, um fragmento pode resultar a partir de deleção N-terminal ou deleção C-terminal de um ou mais resíduos de um polipeptídeo parental e/ou um fragmento pode resultar da deleção interna de um ou mais resíduos de um polipeptídeo parental. "Fragmento", no contexto de um anticorpo, refere-se a uma porção de um anticorpo que pode ser ligada a uma molécula biologicamente ativa para modular a solubilidade, distribuição dentro de um indivíduo e assim por diante. Por exemplo, leptina A200 descrita aqui é um conjugado de um fragmento Fc de anticorpo com uma leptina, conforme conhecido na técnica. Vide, por exemplo, documentos WO 98/28427 e US2007/002084. O termo "parental", no contexto de polipeptídeos refere-se, no sentido habitual, a um polipeptídeo que serve como uma estrutura de referência antes de modificação, por exemplo, inserção, deleção e/ou substituição.

[00018] "Análogo", conforme usado aqui no contexto de polipeptídeos, refere-se a um composto que tem inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos em relação a um composto parental. Um análogo pode ter uma estabilidade, solubilidade, eficácia, meia-vida superiores e similares. Em algumas modalidades, um análogo é um composto que tem pelo menos 50%, por exemplo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mesmo mais de identidade de sequência com o composto parental.

[00019] "Identidade", "identidade de sequência"e similares, no contexto de comparação de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeos, referem-se à duas ou mais sequências ou sub-sequências que são as mesmas ou têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, cerca de 50% de identidade, de preferência 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ao longo de uma região especificada, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada), conforme medido usando um algoritmo de comparação de sequências, conforme conhecido na técnica, por exemplo, BLAST ou BLAST 2.0. Esta definição inclui sequências que têm deleções e/ou adições, bem como aquelas que têm substituições, assim como variantes que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes polimórficas ou alélicas e variantes feitas pelo homem. Em algoritmos preferidos, contagem é feita por gaps e similares, conforme conhecido na técnica. Para comparação de sequências, tipicamente, uma sequência atua como sequência de referência com a qual sequências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequências, sequências de teste e de referência são introduzidas em um computador, são designadas coordenadas de sub- sequência se necessário e parâmetros do programa de algoritmo de sequência são designados. De preferência, parâmetros de default do programa podem ser usados ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula, então, a percentagem de identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência com base nos parâmetros de programa. Alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis) ou alinhamento manual e inspeção visual. Vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 1995 suplemento)). Exemplos preferidos de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência incluem os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, os quais são descritos em Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). BLAST e BLAST 2.0 são usados, conforme conhecido na técnica, para determinar a identidade percentual de sequência para os ácidos nucleicos e proteínas da presente invenção. Software para realização de análises pelo BLAST está publicamente disponível através do site do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiramente identificação de pares de sequência de alto escore (High Scoring Sequence Pairs - HSPs) ao identificar palavras curtas de comprimento W na seqüência de consulta, os quais correspondem ou satisfazem algum escore T de limiar de valor positivo quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra vizinha (Altschul et al., Id.). Estes "hits" de palavra vizinha inicial atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. Os "hits" de palavras são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tão longe quanto o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado. Escores cumulativos são calculado usando, por exemplo, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (escore de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de escore é usada para calcular o escore cumulativo. Extensão dos "hits" de palavras em cada direção é interrompida quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado; o escore cumulativo vai para zero ou abaixo em virtude do acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de escore negativo ou o fim de qualquer sequência é atingido. Os parâmetros W, T e X no algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa, como default, um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa, como default, um comprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (vide Henikoff & Henikoff, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89: 10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50,expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas.

[00020] O termo "cerca de", no contexto de um valor numérico, refere-se a +/- 10% do valor numérico, a menos que expressamente indicado de outro modo.

[00021] Os termos "peptídeo"e "polipeptídeo", no contexto de componentes dos polipeptídeos quiméricos descritos aqui, são sinônimos.

[00022] Leptinas. "Leptinas" e "uma leptina" significam: leptinas, fragmentos ativos de leptina, análogos de leptina e derivados de leptina; e uma leptina, um fragmento ativo de leptina, um análogo de leptina e um derivado de leptina; respectivamente. Consequentemente, a menos que indicado em contrário, referência a "leptinas" se destina a significar leptinas, fragmentos ativos de leptina, análogos de leptina e derivados de leptina, conforme descrito aqui. Similarmente, a menos que indicado em contrário, referência a "uma leptina" se destina a abranger uma leptina, um fragmento ativo de leptina, um análogo de leptina e um derivado de leptina, conforme descrito aqui. Tais leptinas exemplificativas as quais podem ser empregadas na concepção, preparo e uso dos polipeptídeos quiméricos descritos na presente invenção incluem aquelas as quais desencadeiam uma ou mais respostas biológicas conhecidas na técnica a ser desencadeada quando leptinas são administradas a voluntários (vide, por exemplo, Pedidos de Patente U.S. Publicados Nos US 2007/0020284 e US 2008/0207512, Patentes U.S. Nos 6.309.853, 7.183.254 e Pedido U.S. PCT Publicado Nos WO 96/005309, WO 98/28427 e WO 2009/064298), tais como: redução de ingestão de alimentos, redução de peso corporal, redução de ganho de peso, indução de saciedade, redução de disponibilidade calórica, redução de eficiência calórica, redução do platô metabólico, aumento de sensibilidade à insulina, diminuição de hiperlipidemia, correção de dislipidemia, redução de hipertrigliceridemia, melhora de obesidade, melhora de excesso de peso, melhora de diabetes mellitus (incluindo diabetes do tipo I, diabetes do tipo II e diabetes gestacional), melhora de resistência à insulina, melhora de condições de lipodistrofia associadas à mesma, bem como outras respostas biológicas conhecidas na técnica a serem desencadeadas quando de administração de uma leptina (vide, por exemplo, Pedidos de Patente U;S. Publicados Nos US 2007/0020284 e US 2008/0207512, Patentes U.S. Nos 6.309.853, 7.183.254 e Pedidos U.S. PCT Publicados Nos WO 96/005309, WO 98/28427 e WO 2009/064298).

[00023] Leptinas incluem, porém sem limitações, os compostos descritos nas Patentes U.S. Nos US 5.594.101, US 5.851.995, US 5.691.309, US 5.580.954, US 5.554.727, US 5.552.523, US 5.559.208, US 5.756.461, US A 6.309.853, Pedido de Patente U.S. Publicado No US 2007/0020284 e Pedidos PCT Publicados Nos WO 96/23517, WO 96/005309, WO 98/28427, WO 2004/039832, WO 98/55139, WO 98/12224 e WO 97/02004, cada um dos quais é aqui incorporado na íntegra e para todos os efeitos. Métodos para ensaio de atividades e respostas biológicas de leptina in vitro e in vivo, incluindo atividade de inibição de saciedade, atividade de inibição de ingestão de alimento e atividade de perda de peso, são conhecidos na técnica e são descritos aqui e também nas referências mencionadas acima e outras referências citadas aqui.

[00024] Leptinas, análogos de leptina, fragmentos ativos de leptina e derivados de leptina representativos incluem o seguinte: Leptinas Maduras de Murino: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQ ASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC, em que Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 1). Forma 1 de leptina madura de murino: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSL SKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLP QTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 2). Forma 2 de leptina madura de murino: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLS KMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQ TSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 3). Leptinas maduras de murino com metionina N-terminal: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQIS NDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVV ALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC, em que Xaa na posição 29 é Q ou está (SEQ ID NO: 4). Forma 1 de leptina madura de murino com metionina N-terminal: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPIL SLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCS LPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSP EC (SEQ ID NO: 5). Forma 2 de leptina madura de murino com metionina N-terminal: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSL SKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLP QTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 6). Leptina madura suína: VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVL SLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLP QARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO: 7). Leptina madura suína com metionina N-terminal: MVPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPV LSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPL PQARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPG C (SEQ ID NO: 8). Leptina bovina madura: VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSL SKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQ VRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC, em que Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 9). Leptina bovina madura com metionina N-terminal: MVPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQRVTGLDFIPGLHPL LSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCP LPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSP GC, em que Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 10). Leptina humana de comprimento total não processada (isto é, inclui sequência sinalizadora N-terminal de 21 resíduos): MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT QSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQI SNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQ DMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 11) Leptina humana madura (com sequência sinalizadora N-terminal de 21 aminoácidos removida): VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHL PWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSP GC, em que: Xaa na posição 27 é T ou A ; e Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 12). Leptina humana madura com metionina N-terminal: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSP GC, em que: Xaa na posição 28 is T ou A ; e Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 13). Leptina madura de Rhesus: VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLT LSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPL ASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 14). Leptina madura de Rhesus com metionina N-terminal: MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVL TLSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLP LASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 15). Leptina de rato madura: VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSL SKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLP QTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 16). Leptina de rato madura com metionina N-terminal: MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPIL SLSKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSL PQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 17). Leptina de ornitorrinco madura: Segue a sequência de leptina madura de ornitorrinco: ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNL ADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFT RSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO: 18). Leptina de ornitorrinco de comprimento total não processada (isto é, incluiu sequência sinalizadora N-terminal de 21 resíduos): Segue uma sequência de leptina de ornitorrinco de comprimento total, incluindo uma sequência sinalizadora N-terminal de 21 resíduos: MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGV STDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQIS NDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVT LDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO: 19). Forma 1 de leptina humana madura: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 20). Forma 2 de leptina humana madura: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 21). Forma 3 de leptina humana madura: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 22). Forma 4 de leptina humana madura: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 23). Forma 1 de leptina humana madura com metionina N-terminal (também conhecida como Metreleptina ou A100): MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLS PGC (SEQ ID NO: 24). Forma 2 de leptina humana madura com metionina N-terminal: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLS PGC (SEQ ID NO: 25). Forma 3 de leptina humana madura com metionina N-terminal: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 26). Forma 4 de leptina humana madura com metionina N-terminal: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 27). Leptina de Foca: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 28). Leptina de foca com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 29). Leptina de foca com aminoácidos 30 e 71-92 substituídos por aminoácidos 32 e 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 30). Leptina de foca com metionina N-terminal: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 31). Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 7192 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 32). Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 30 e 71-92 substituídos por aminoácidos 32 e 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 33). Leptina A200: Leptina A200 é um produto da condensação de anticorpo Fc com leptina, conforme conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Lo et al., 2005, Protein Eng. Design & Selection, 18: 1-10. A sequência de aminoácido de A200 é como segue: MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFI PGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLA FSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDML WQLDLSPGC (SEQ ID NO: 34) Leptina A300: Leptina A300 é metreleptina com substituições W101Q e W139Q (1Met N-terminal contada como resíduo 1): MVPIQKVQDDTKTLI KTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQI LTSM PSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEA SGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQ ID NO: 35).

[00025] Leptina A400: Leptina A400 é metreleptina com o resíduo de serina na posição 78 substituído por um resíduo de cisteína, conforme apresentado a seguir: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDF IPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLA FSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDML WQLDLSPGC (SEQ ID NO: 36); ao qual uma porção PEG de 20 kilodaltons (kDa) foi presa via o resíduo de cisteína na posição 78.

[00026] Leptina A500: Pesquisa por uma série de investigadores, incluindo os inventores, tem se focado sobre os efeitos de agregação de substituição de resíduos em leptina. Vide, por exemploRicci et al., 2006. “Mutational Approach to Improve Physical Stability of Protein Therapeutics Susceptible to Aggregation: Role of Altered Conformation in Irreversible Precipitation”, Book Chapter. em: Misbehaving Proteins: Protein (Mis)Folding, Aggregation, and Stability, Murphy RM, Tsai AM, Eds., New York. Springer. páginas 331-350, o qual é incorporado aqui por referência e para todos os efeitos. Consequentemente, leptina A500 com sequência a seguir foi usada em determinados compostos e métodos descritos aqui: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHL PQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSP GC (SEQ ID NO: 37).

[00027] Variantes de Leptina A100: Seguem variantes de Leptina A100 com as seguintes substituições de aminoácido: D41E, H98S, W101Q, D109E, G113E, M137I, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 38). H98S, W101Q, A102T, G113E, M137I, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 39). H98S, W101Q, G113E, M137I, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 40). W101Q, G113E, M137I, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 41). H98S, W101Q, M137I, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 42). W101Q, G113E, M137I, W139Q, L143V e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPE C (SEQ ID NO: 43). H98S, W101Q, A102T, M137I, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 44). H98S, W101Q, D109E, G113E e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPE C (SEQ ID NO: 45). W101Q, M137I, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSP EC (SEQ ID NO: 46). W101Q, M137I, W139Q, L143V e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSP EC (SEQ ID NO: 47). H98S, W101Q, A102T, M137I, W139Q, L143V e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPE C (SEQ ID NO: 48). H98S, W101Q, A102T, G113E e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQTSGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPE C (SEQ ID NO: 49). W101Q, G113E e W139Q: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSP GC (SEQ ID NO: 50). W101Q, G113E, W139Q e G146E: MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSP EC (SEQ ID NO: 51).

I. Polipeptídeos Quiméricos

[00028] Em um aspecto da presente descrição, uma série de polipeptídeos quiméricos são descritos. Estes polipeptídeos quiméricos são baseados em um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre em que pelo menos uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre tenha sido substituída por uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina humana madura. Uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre inclui a sequência de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28) e a sequência de leptina de foca com uma metionina N-terminal do tipo silvestre (SEQ ID NO: 31). Uma sequência de leptina humana madura útil para quimerização com leptina de foca do tipo silvestre, conforme proporcionado aqui, inclui as sequências descritas acima a seguir: leptinas humanas maduras (SEQ ID NO: 12), leptinas humanas maduras com metionina N-terminal (SEQ ID NO: 13), forma 1 de leptina humana madura (SEQ ID NO: 20), forma 2 de leptina humana madura (SEQ ID NO: 21), forma 3 de leptina humana madura (SEQ ID NO: 22), forma 4 de leptina humana madura (SEQ ID NO: 23), forma 1 de leptina humana madura com metionina N-terminal (Metreleptina ou A100, SEQ ID NO: 24), forma 2 de leptina humana madura com metionina N-terminal (SEQ ID NO: 25), forma 3 de leptina humana madura 3 com metionina N-terminal (SEQ ID NO: 26), forma 4 de leptina humana madura 4 com metionina N-terminal (SEQ ID NO: 27), A200 (SEQ ID NO: 34), A300 (SEQ ID NO: 35), A400 (SEQ ID NO: 36), A500 (SEQ ID NO: 37) e variantes de A100 (SEQ ID NO: 38-51). Em algumas modalidades, uma série de polipeptídeos quiméricos são descritos, em que pelo menos uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO. 28 ou SEQ ID NO: 31) tenha sido substituída por uma região contígua de 1-30 aminoácidos de A100 (SEQ ID NO. 24).

[00029] Em qualquer um dos polipeptídeos quiméricos descritos, uma região contígua de 1-30 aminoácidos pode compreender qualquer aminoácido que ocorre naturalmente ou não ocorre naturalmente. Qualquer combinação de aminoácidos pode ser empregada sem restrição. Isto é, dois ou mais aminoácidos em uma região contígua podem ser substituídos por um aminoácido que ocorre naturalmente, um aminoácido que não ocorre naturalmente, uma substituição conservativa, uma substituição não conservativa ou qualquer combinação dos mesmos.

[00030] Os polipeptídeos quiméricos descritos aqui têm atividade biológica demonstrada, além de propriedades físicas intensificadas. Por exemplo, os polipeptídeos quiméricos humanos-foca mostram atividade de leptina in vitro e in vivo.Os polipeptídeos quiméricos também mostram estabilidade e solubilidade intensificadas comparado com os polipeptídeos de leptina humana madura os quais são usados para derivar as sequências, conforme mostrado pelos Exemplos.

[00031] O termo "atividade de leptina" inclui atividade de ligação à leptina e atividade funcional de leptina. Aqueles versados na técnica reconhecerão compostos análogos de leptina com atividade de leptina usando ensaios adequados para medição de ligação à leptina ou atividade funcional de leptina. Compostos análogos de leptina podem ter uma IC50 de cerca de 200 nM ou menos, cerca de 100 nM ou menos ou cerca de 50 nM ou menos ou cerca de 5 nM ou menos ou cerca de 1 nM ou menos, em um ensaio de ligação à leptina, tal como aquele descrito aqui. O termo "IC50" refere-se, no sentido comum, à metade da concentração inibitória máxima de um composto que inibe uma função biológica ou bioquímica. Consequentemente, no contexto de estudos de ligação a receptor, IC50 refere-se à concentração de composto de teste a qual compensa metade de um ligante conhecido de um receptor especificado. Compostos análogos de leptina podem ter uma EC50 de cerca de 20 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 5 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos ou cerca de 0,1 nM ou menos, em um ensaio funcional de leptina, tal como aquele descrito aqui. O termo "EC50" refere-se, no sentido comum, à concentração efetiva de um composto a qual induz à metade da resposta entre uma resposta de linha de base e a resposta máxima, conforme conhecido na técnica.

A. Polipeptídeos Quiméricos que Incorporam Hélice 1 Humana

[00032] A região de Hélice 1 de um polipeptídeo de leptina humana madura abrange uma região contígua de 20 aminoácidos. Hélice 1 e Hélice 3 são hélices anti-paralelas que formam parte do Sítio de Ligação II de leptina a seu receptor. Este sítio interage com o o domínio de homologia do receptor de citocina (Cytokine Receptor Homology - CRH) do receptor de leptina e acredita-se que é o principal sítio de ligação a receptor, mas não envolvido em ativação de receptor. Vide, por exemplo, Peelman et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 41038.

[00033] Em um aspecto, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de hélice 1 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 3-22 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 5-24 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 52: Leptina de foca com aminoácidos 3-22 substituídos por aminoácidos 5-24 (hélice 1) de metreleptina, respectivamente: PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIP RVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLA SAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLR QLDRNPGC (SEQ ID NO: 52).

[00034] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 3-22 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 5-24 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 53: Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 3-22 substituídos por aminoácidos 5-24 (hélice 1) de metreleptina, respectivamente: MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 53).

B. Polipeptídeos Quiméricos que Incorporam Hélice 2 Humana

[00035] A região de Hélice 2 de um polipeptídeo de leptina humana madura abrange uma região de 16 aminoácidos contíguos. Está hélice está incrustada no feixe de 4 hélices, conforme descrito no artigo sobre estrutura de cristal original de Zhang et al. (Nature 1997 387: 206).

[00036] Em um aspecto, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de hélice 2 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 50-65 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 52-67 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 54: Leptina de foca com aminoácidos 50-65 substituídos por aminoácidos 52-67 (hélice 2) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 54).

[00037] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 50-65 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 52-67 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 55: Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 50-65 substituídos por aminoácidos 52-67 (hélice 2) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 55).

C. Polipeptídeos Quiméricos que Incorporam Hélice 3 Humana

[00038] A região de hélice 3 de um polipeptídeo de leptina humana madura abrange uma região contígua de 22 aminoácidos. Hélice 3 e Hélice 1 são hélices anti-paralelas que formam parte do Sítio de Ligação II de leptina a seu receptor. Este sítio interage com o domínio de homologia do receptor de citocina (Cytokine Receptor Homology - CRH) do receptor de leptina e acredita-se que é o principal sítio de ligação a receptor, mas não envolvido em ativação de receptor. Vide, por exemplo, Peelman et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 41038.

[00039] Em um aspecto, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de hélice 3 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 29: Leptina de foca com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 29).

[00040] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 32: Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 32).

D. Polipeptídeos Quiméricos que Incorporam uma Hélice 4 Humana

[00041] A região de Hélice 4 de um polipeptídeo de leptina humana madura abrange uma região contígua de 22 aminoácidos. Acredita-se que a hélice 4 forme parte do Sítio de Ligação I e Sítio de Ligação III da leptina, ambos os quais são importantes para ativação de receptor. Vide, por exemplo, Peelman et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 41038.

[00042] Em um aspecto, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de hélice 4 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 120-141 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 122-143 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 56: Leptina de foca com aminoácidos 120-141 substituídos por aminoácidos 122-143 (hélice 4) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 56).

[00043] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 120-141 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 122143 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 57: Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 120-141 substituídos por aminoácidos 122-143 (hélice 4) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 57).

E. Polipeptídeos Quiméricos que Incorporam o Loop AB Humano

[00044] A região de loop AB de um polipeptídeo de leptina humana madura abrange uma região contígua de 27 aminoácidos. Acredita-se que o loop AB forme parte do Sítio de Ligação III, bem como uma pequena porção do Sítio de Ligação I da leptina. Vide, por exemplo, Peelman et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 41038. Essa região também contém o motivo absolutamente conservado GLDFIP (SEQ ID NO: 164).

[00045] Em um aspecto, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de loop AB incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 58: Leptina de foca com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 58).

[00046] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 59: Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 59).

F. Polipeptídeos Quiméricos que Incorporam Loop 3-4 Humano

[00047] A região de Loop 3-4 de um polipeptídeo de leptina humana madura abrange uma região contígua de 27 aminoácidos. Acredita-se que o loop 3-4 contenha uma parte do Sítio de Ligação III de leptina a seu receptor. Vide, por exemplo, Peelman et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 41038.

[00048] Em um aspecto, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de loop 3-4 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 60: Leptina de foca com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 3-4) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 60).

[00049] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 61: Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 34) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 61).

G. Polipeptídeos Quiméricos Combinados

[00050] Em outro aspecto da presente descrição, uma série de polipeptídeos quiméricos combinados são descritos. Estes polipeptídeos quiméricos combinados são baseados em um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre em que duas ou mais regiões contíguas de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre (por exemplo, SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 31) tenham sido substituída, em cada região, por uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina humana madura. Polipeptídeos quiméricos combinados podem ser quiméricos para demonstrar propriedades físicas intensificadas comparado com os polipeptídeos de leptina humana madura os quais são usados para derivar as sequências, ao mesmo tempo em que retêm a atividade biológica de leptina humana.

[00051] Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de hélice 1 e uma sequência de hélice 3 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 3-22 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 5-24 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 62:Leptina de foca com aminoácidos 3-22 substituídos por aminoácidos 5-24 (hélice 1) de metreleptina e aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente:PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 62)

[00052] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 3-22 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 5-24 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 63:Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 3-22 substituídos por aminoácidos 5-24 (hélice 1) de metreleptina e aminoácidos 72-93 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente:MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 63)

[00053] Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de hélice 3 incorporada e uma sequência de loop AB incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 64:Leptina de foca com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina e com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina, respectivamente:PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRA RGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 64)

[00054] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 65:Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina e com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 65)

[00055] Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de hélice 3 incorporada e uma sequência de loop 3-4 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 66:Leptina de foca com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina e com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 34) de metreleptina, respectivamente:PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 66)

[00056] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 67:Leptina de foca com metionina N-terminal, com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina e com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 3-4) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 67)

[00057] Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de loop AB incorporada e uma sequência de hélice 4 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 120-141 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 122-143 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 68:Leptina de foca com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina e com aminoácidos 120-141 substituídos por aminoácidos 122-143 (hélice 4) de metreleptina, respectivamente:PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPGC (SEQ ID NO: 68)

[00058] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 120-141 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 122-143 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 69:Leptina de foca com metionina N-terminal, com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina e com aminoácidos 120-141 substituídos por aminoácidos 122-143 (hélice 4) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 69)

[00059] Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de loop AB incorporada and uma sequência de loop 3-4 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 70:Leptina de foca com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina e com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 34) de metreleptina, respectivamente:PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 70)

[00060] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal(SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 71: Leptina de foca com metionina N-terminal, com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina e com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 3-4) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 71).

[00061] Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se a polipeptídeos quiméricos que são baseados em leptina de foca do tipo silvestre com uma sequência de loop AB incorporada, uma sequência de loop 3-4 incorporada e uma sequência de hélice 3 incorporada a partir de uma leptina humana madura. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre (SEQ ID NO: 28), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24), a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 72:Leptina de foca com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina, com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 34) de metreleptina e com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 72)

[00062] Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre com uma metionina N-terminal (SEQ ID NO: 31), em que a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 23-49 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 25-51 de A100 (SEQ ID NO: 24), a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 93-119 de SEQ ID NO: 31 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 95-121 de A100 (SEQ ID NO: 24) e a região contígua que abrange os aminoácidos em posições 71-92 de SEQ ID NO: 28 tenham sido substituídos por uma região contígua que abrange os aminoácidos em posições 73-94 de A100 (SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico compreende a sequência descrita em SEQ ID NO: 73:Leptina de foca com metionina N-terminal, com aminoácidos 23-49 substituídos por aminoácidos 25-51 (loop AB) de metreleptina, com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 3-4) de metreleptina e com aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 73).

[00063] Em algumas modalidades, os polipeptídeos quiméricos proporcionados pela invenção contêm uma substituição de Cys para Ser na posição 30 da sequência polipeptídica de foca do tipo silvestre. De acordo com algumas modalidades, os polipeptídeos quiméricos a seguir são proporcionados:Leptina de foca com aminoácidos 30 e 3-22 substituídos por aminoácidos 32 e 5-24(helix 1) demetreleptina,respectivamente:PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 74).Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 30 e 3-22 substituídos por aminoácidos 32 e 5-24 (hélice 1) de metreleptina, respectivamente:MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 75).Leptina de foca com aminoácidos 30 e 50-65 substituídos por aminoácidos 32 e 52-67 (hélice 2) de metreleptina, respectivamente:PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 76).Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 30 e 50-65 substituídos por aminoácidos 32 e 52-67 (hélice 2) de metreleptina, respectivamente:MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 77). Leptina de foca com aminoácidos 30 e 71-92 substituídos por aminoácidos 32 e 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: VIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 30). Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 30 e 71-92 substituídos por aminoácidos 32 e 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 33). Leptina de foca com aminoácidos 30 e 120-141 substituídos por aminoácidos 32 e 122-143 (hélice 4) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 78). Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 30 e 120-141 substituídos por aminoácidos 32 e 122143 (hélice 4) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 79). Leptina de foca com aminoácidos 30 e 93-119 substituídos por aminoácidos 32 e 95-121 (loop 3-4) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 80). Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácidos 30 e 93-119 substituídos por aminoácidos 32 e 95121 (loop 3-4) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 81). Leptina de foca com aminoácido 30 substituído por aminoácido 32, aminoácidos 3-22 substituídos por aminoácidos 524 (hélice 1) de metreleptina e aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 82) Leptina de foca com metionina N-terminal e com aminoácido 30 substituído por aminoácido 32, aminoácidos 3-22 substituídos por aminoácidos 5-24 (hélice 1) de metreleptina e aminoácidos 72-93 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina, respectivamente: MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 83) Leptina de foca com aminoácido 30 substituído por aminoácido 32, aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina e com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 3-4) de metreleptina, respectivamente: PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 84) Leptina de foca com metionina N-terminal, com aminoácido 30 substituído por aminoácido 32, aminoácidos 71-92 substituídos por aminoácidos 73-94 (hélice 3) de metreleptina e com aminoácidos 93-119 substituídos por aminoácidos 95-121 (loop 3-4) de metreleptina, respectivamente: MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 85).

[00064] Outras Modalidades. Deverá ser entendido que cada um dos polipeptídeos descritos aqui são também considerados como incluindo (opcionalmente) uma metionina no N-término em rede com o primeiro aminoácido que ocorre naturalmente dos mesmos. Por exemplo, metreleptina (leptina A100) madura consiste em leptina humana, à qual foi adicionada uma metionina N-terminal, conforme descrito em SEQ ID NO: 24. Similarmente, um resíduo de metionina pode ser incluído no N-término de qualquer uma das sequências de aminoácidos e Fórmulas descritas aqui em geral.

[00065] Em algumas modalidades, análogos de polipeptídeo quimérico são proporcionados. Um análogo de polipeptídeo quimérico pode ter pelo menos 80%, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mesmo identidade de sequência maior em relação a um polipeptídeo quimérico parental. Em algumas modalidades, o polipeptídeo quimérico parental é um polipeptídeo apresentado em SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, ID NO:81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 ou SEQ ID NO: 85. Consequentemente, em algumas modalidades, análogo de polipeptídeo quimérico pode ter pelo menos 80%, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mesmo identidade de sequência maior em relação a qualquer polipeptídeo quimérico selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, um análogo de polipeptídeo quimérico pode ter pelo menos 80%, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mesmo identidade de sequência maior em relação ao polipeptídeo quimérico apresentado em SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, um análogo de polipeptídeo quimérico pode ter pelo menos 80%, por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mesmo identidade de sequência maior em relação ao polipeptídeo quimérico apresentado em SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, um análogo de polipeptídeo quimérico pode ter pelo menos 90% de identidade de sequência em relação ao polipeptídeo quimérico apresentado em SEQ ID NO: 33.

[00066] Adicionalmente, análogos de polipeptídeo quimérico podem ser concebidos, preparados e usados de acordo com a invenção, nos quais 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mesmo 21 aminoácidos de uma leptina selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, ID NO:81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, e SEQ ID NO: 85 são substituídos por outro aminoácido, tal como um aminoácido conservativo ou um aminoácido não conservativo ou são, de outro modo, alterados. Conforme habitual na técnica, o termo "conservativo", no contexto de substituições de aminoácidos, refere-se à substituição a qual mantém propriedades de tipo de carga (por exemplo, aniônica, catiônica, neutra, polar e similares), hidrofobicidade ou hidrofilicidade, densidade (por exemplo, contatos de van der Waals e similares) e/ou funcionalidade (por exemplo, hidroxila, amina, sulfidrila e similares). O termo "não conservativo" refere-se a uma substituição de aminoácidos que não é conservativa.

[00067] Em outro aspecto, a invenção proporciona análogos de polipeptídeo quimérico compreendendo pelo menos uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de análogo de leptina humana madura que contém pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição onde divergência é observada em uma posição correspondente em uma leptina de outra espécie.

[00068] Conforme entendido na técnica, por exemplo, letpinas de murino, leptinas de rato, leptinas bovinas, leptinas suínas e leptinas de rhesus, tais como aquelas descritas aqui são, cada uma, substancialmente homólogas à leptinas humanas; em particular, as formas maduras destas leptinas são substancialmente homólogas às leptinas maduros e, ainda, particularmente próximo da porção N- terminal da proteína. Pode-se preparar análogos de tais leptinas, tal como a forma 1 de letpina madura humana (SEQ ID NO: 20) e metreleptina (SEQ ID NO: 24) tal como, por exemplo, substituindo ou alterando resíduos de aminoácidos em uma ou mais posições em tais sequências onde divergência é observada em uma leptina madura de camundongo, rato, bovina, suína ou rhesus correspondente. Por exemplo, leptinas humanas maduras (por exemplo, SEQ ID NO: 20) induzem à respostas biológicas, por exemplo, em camundongos, ratos e macacos). Vide, por exemplo, documentos WO 98/28427, WO 2009/064298, US2007/0020284, US2008/0207512 e Murakami et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944-952. Em virtude do fato de que leptinas humanas maduras têm atividade biológica, por exemplo, em tais espécies, podem ser concebidos e preparados análogos de leptina nos quais um ou mais aminoácidos em posições as quais são divergentes na(s) posição(ões) correspondente(s) em uma leptina de uma ou mais de tais espécies são substituídos pelo(s) aminoácido(s) em tais posições divergentes correspondentes.

[00069] Por exemplo, usando uma proteína leptina humana madura de acordo com SEQ ID NO: 20 em que o primeiro aminoácido é valina e o aminoácido na posição 146 é cisteína, pode-se substituir por outro aminoácido um ou mais dos aminoácidos nas posições 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 pelo(s) aminoácido(s) correspondente(s) encontrado(s) na(s) posição(ões) correspondente(s) em SEQ ID NO: 2, de forma a conceber e preparar análogos de leptina compreendidos pelos polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção. Adicionalmente, pode-se também substituir outro aminoácido, tal como um aminoácido conservativo ou um aminoácido não conservativo, em uma ou mais das posições 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 101, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145, por exemplo, de SEQ ID NO: 20 de forma a conceber e preparar análogos de leptina compreendidos pelos polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção.

[00070] Pode-se ainda preparar análogos de leptinas adicionais com base na sequência da proteína leptina madura de rato (SEQ ID NO: 16). Vide, por exemplo, documentos WO 98/28427,US2007/0020284 e Murakami et al., 1995, Id., aqui incorporado por referência na íntegra e para todos os efeitos. Leptina madura de rato difere da forma 1 de leptina madura humana (SEQ ID NO: 20) nas seguintes posições: 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 e 145. Consequentemente, em uma ou mais das tais posições em SEQ ID NO: 20, pode-se substituir o(s) aminoácido(s) encontrado(s) na(s) posição(ões) correspondente(s) encontrado(s) na leptina madura de rato (SEQ ID NO: 16) de modo a conceber e preparar análogos de leptina compreendidos pelos polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção. Adicionalmente, pode-se também substituir outro aminoácido, tal como um aminoácido conservativo ou um aminoácido não conservativo, em uma ou mais das posições 4, 32, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89,97, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138 e 145, por exemplo, de SEQ ID NO: 20, de modo a conceber e preparar análogos de leptina compreendidos pelos polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção.

[00071] As posições da leptina madura de rato (SEQ ID NO: 16) e da forma 1 de leptina madura de murino (SEQ ID NO: 2) as quais divergem da forma 1 de leptina madura humana (SEQ ID NO: 20) são as seguintes: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 20 138, 142 e 145. Consequentemente, em uma ou mais das tais posições em SEQ ID NO: 20, pode-se substituir o(s) aminoácido(s) encontrado(s) na(s) posição(ões) correspondente(s) encontrado(s) na sequência de leptina madura de rato (SEQ ID NO: 16) ou sequência de forma 1 de leptina madura de murino ( SEQ ID NO: 2), de modo a conceber e preparar análogos de leptina compreendidos pelos polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção. Adicionalmente, pode-se também substituir outro aminoácido, tal como um aminoácido conservativo ou um aminoácido não conservativo, em uma ou mais das posições 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77 , 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145, de modo a conceber e prepararanálogos de leptina compreendidos pelos polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção.

[00072] Além disso, os aminoácidos encontrados em leptina madura de macaco rhesus (SEQ ID NO: 14) os quais divergem da forma 1 de leptina madura humana (SEQ ID NO: 20) são (com resíduos de aminoácidos indicados entre parênteses na abreviatura de aminoácido de uma letra): 8 (S), 35 (R), 48 (V), 53 (Q), 60 (1), 66 (1), 67 (N), 68 ((L), 89 (L), 100 (L), 108 (E), 112 (D) e 118 (L). Uma vez que leptinas humanas maduras desencadeiam respostas biológicas em macacos, uma leptina, tal como a forma 1 de leptina madura humana (SEQ ID NO: 20) com um ou mais dos aminoácido divergentes de macaco rhesus substituídos por outro aminoácido, tal como os aminoácidos entre parêntesis, podem ser empregados na concepção, preparo e uso de analogos de leptina compreendidos pelos polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção. Deverá ser notado que determinados aminoácidos divergentes de rhesus são também aqueles encontrados, por exemplo, na forma 1 de leptina madura de murino acima (posições 35, 68, 89, 100 e 112). Assim, pode-se preparar análogos de leptina nos quais um ou mais aminoácidos nas posições 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 e 145, por exemplo, da forma 1 de leptina madura humana (SEQ ID NO: 20), são substituídos pelo(s) aminoácido(s) correspondente(s) na(s) referida(s) posição(ões) em leptinas de macaco rhesus ou de murino (por exemplo, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 14).

[00073] De acordo com a invenção, análogos polipeptídicos quiméricos podem ser concebidos e preparados para compreender regiões contíguas de aminoácidos de análogos de leptina humana. Em algumas modalidades, a invenção proporciona análogos polipeptídicos quiméricos com base em um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre em que pelo menos uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre tenha sido substituída por uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de análogo de leptina humana madura e em que a sequência do ácido nucleico de leptina humana madura contém pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição onde divergência é observada em uma posição correspondente em uma leptina de outra espécie. Análogos de polipeptídeo quimérico compreendendo duas ou mais regiões contíguas de 1-30 aminoácidos de uma sequência de análogo de leptina humana madura também são considerados.

[00074] Polipeptídeos quiméricos aos quais uma porção química está ligada são derivados polipeptídicos. Descobriu-se que derivatização de polipeptídeos quiméricos por meio de ligação de uma ou mais porções química confere alguma vantagem em determinadas circunstâncias, tal como aumento da estabilidade e tempo de circulação da proteína terapêutica e diminuição da imunogenicidade e propensão, por exemplo, para gerar anticorpos neutralizantes e/ou incidência de reações no local de injeção. Vide, por exemplo, documentos WO 98/28427, US2007/0020284, Patente U.S. N°4.179.337, Davis et al., emitida em 18 de Dezembro de 1979. Para uma revisão, vide Abuchowski et al., em ENZYMES AS DRUGS (J. S. Holcerberg e J.

[00075] Derivados polipeptídicos podem constituir polipeptídeos aos quais uma modificação química foi feita em um ou mais dos seus grupos laterais de aminoácidos, átomos de a-carbono, grupo amino terminal ou grupo ácido carboxílico terminal. Uma modificação química inclui, porém sem limitações, ligação de uma ou mais porções químicas, criação de novas ligações e remoção de uma ou mais porções químicas. Modificações em grupos de cadeia lateral de aminoácido incluem, sem limitação, alquilação, acilação, formação de ésteres, formação de amida, acoplamento de maleimida, acilação de grupos ε-amino de lisina, N-alquilação de arginina, histidina ou lisina, alquilação de grupos ácido carboxílico glutâmico ou aspártico e desamidação de glutamina ou asparagina. Modificações do amino término incluem, sem limitação, as modificações desamino, N-alquila inferior, di-N-alquila inferior e N-acila. Modificações do amino término incluem, sem limitação, as modificações desamino, N-alquila inferior, N-di-alquila inferior e N-acila, tais como alquilacila, alquilacilas ramificadas, alquilaril-acilas. Modificações do grupo carbóxi terminal incluem, porém sem limitações, as modificações amida, alquil amida inferior, dialquil amida, arilamida, alquilarilamida e alquil éster inferior. Alquila inferior é C1-C4 alquila. Além disso, um ou mais grupos laterais ou grupos terminais podem ser protegidos por grupos de proteção conhecidos por aqueles versados em química sintética qualificados. O α-carbono de um aminoácido pode ser mono- ou dimetilado.

[00076] Tais derivados incluem polipeptídeos conjugados a um ou mais moléculas polímericas solúveis em água, tais como polietileno glicol ("PEG") ou cadeias de ácidos graxos de vários comprimentos (por exemplo, estearila, palmitoíla, octanoíla), mediante a adição de poliaminoácidos, tais como poli-his, poli-arg, poli-lys e poli-ala ou mediante a adição de substituintes de pequenas moléculas, incluindo alquilas curtas e alquilas restritas (por exemplo, ramificada, cíclica, fundida, adamantila) e grupos aromáticos. Em algumas modalidades, as moléculas poliméricas solúveis em água terão um peso molecular que varia de cerca de 500 Daltons a cerca de 60.000 Daltons.

[00077] Tais conjugações poliméricas podem ocorrer isoladamente no N- ou C-término ou nas cadeias laterais de resíduos de aminoácidos dentro da sequência de um polipeptídeo quimérico, conforme descrito aqui. Alternativamente, podem haver múltiplos locais de derivatização ao longo da sequência de aminoácidos de polipeptídeo quimérico. Substituição de um ou mais aminoácidos por lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína pode proporcionar locais adicionais para derivatização. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos 5.824.784 e 5.824.778. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico pode ser conjugado a uma, duas ou três moléculas poliméricas.

[00078] Em algumas modalidades, as moléculas poliméricas solúveis em água são ligadas a um grupo amino, carboxila ou tiol e podem estar ligadas pelo N ou C términos ou nas cadeias laterais de, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico ou cisteína. Alternativamente, as moléculas poliméricas solúveis em água podem estar ligadas com grupos diamina e dicarboxílicos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo quimérico é conjugado a uma, duas ou três moléculas de PEG através de um grupo epsilon amino de um aminoácido lisina.

[00079] Derivados polipeptídicos também incluem polipeptídeos com alterações químicas em um ou mais resíduos de aminoácidos. Tais alterações químicas incluem amidação, glicosilação, acilação, sulfatação, fosforilação, acetilação e ciclização. As alterações químicas podem ocorrer particularmente no N- ou C-término ou nas cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos dentro da sequência de uma leptina. Em uma modalidade, o C-término destes peptídeos pode ter um grupo -OH ou -NH2 livre. Em outra modalidade, o N-término pode ser "capped" com um grupo isobutilóxi carbonila, um grupo isopropilóxi carbonila, um grupo n-butilóxi carbonila, um grupo etóxi carbonila, um grupo isocaproíla ("isocap"), um grupo octanila, um grupo octilglicina (denotado como "G(Oct)" ou "octilGly"), um grupo ácido 8-amino-octânico, um grupo dansila e/ou Fmoc. Em algumas modalidades, ciclização pode ser através de formação de pontes de dissulfeto. Alternativamente, podem haver múltiplos locais de alteração química ao longo da sequência de aminoácido do polipeptídeo.

[00080] Em determinadas modalidades, polipeptídeos quiméricos são quimicamente alterados de modo a incluir um grupo de Bolton- Hunter. Reagentes de Bolton-Hunter são conhecidos na técnica ("Radioimmunoassay and Related Methods", A. E. Bolton e W. M. Hunter, Capítulo 26 do HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUME I, IMMUNOCHEMISTRY, editado por D. M. Weir, Blackwell Scientific Publications, 1986) e podem ser usados para introduzir porções semelhantes à tirosina com uma ligação neutra, através de grupos oc-amino terminais ou grupos 8-amino de lisina. Em algumas modalidades, a extremidade N-terminal de um polipeptídeo é modificada com um grupo de Bolton-Hunter. Em algumas modalidades, um resíduo de lisina interno é modificado com um grupo de Bolton-Hunter. Em algumas modalidades, podem haver múltiplos locais de modificação de Bolton-Hunter ao longo da sequência de aminoácido do polipeptídeo. Reagentes de Bolton-Hunter usados para modificação de polipeptídeo estão comercialmente disponíveis e podem incluir, porém sem limitações, reagente de Bolton-Hunter solúvel em água, sulfo-succinimidil-3-[4-hidrofenil]propionato (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) e reagente 2 de Bolton-Hunter, N- succinimidil-3-(4-hidróxi-3-iodo-fenil)propionato (Wako Pure Chemical Industries, Ltda., Japão, catálogo 199-09341). Um grupo de Bolton- Hunter exemplificativo conjugado através de uma ligação de amida a um polipeptídeo é ilustrado abaixo, em que a linha tracejada passa através da ligação de amida

[00081] Polipeptídeos podem ser iodados (tal como radiomarcados com 125I), antes ou após modificação de Bolton-Hunter.

[00082] Derivados de polipeptídeos podem incluir uma ou mais modificações de um resíduo de aminoácido "não essencial". No contexto da invenção, um resíduo de aminoácido "não essencial"é um resíduo que pode ser alterado, por exemplo, derivatizado, sem eliminar ou reduzir substancialmente a atividade (por exemplo, atividade agonista) do polipeptídeo quimérico. Os polipeptídeos quiméricos da invenção podem incluir derivatizações de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de aminoácidos; destes, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser resíduos de aminoácidos não essenciais. Adicionalmente, os polipeptídeos da invenção podem ser derivatizados de forma que eles incluam adições de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos sem eliminar ou reduzir substancialmente a atividade do polipeptídeo. Adicionalmente, tais resíduos de aminoácido não essenciais podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido que é passível de derivatização, conforme descrito aqui.

[00083] Conforme usado aqui, "aminoácido", "resíduo de aminoácido"e similares referem-se a aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais e aminoácidos modificados. Salvo indicação em contrário, qualquer referência a um aminoácido em geral ou especificamente pelo nome, inclui referência a ambos os estereoisômeros D e L se sua estrutura permite estas formas estereoisoméricas. Aminoácidos natural incluem alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), Lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptofano (Trp), tirosina (Tyr) e valina (Val). Aminoácidos não naturais incluem, porém sem limitações, homolisina, homoarginina, homo-serina, ácido azetidina carboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4- aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-amino-heptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2- aminopimélico, terc-butilglicina, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidróxilisina, alo- hidróxilisina, 3-hidróxiprolina, 4-hidróxiprolina, isodesmosina, alo- isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-me- tilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. Aminoácidos não naturais adicionais incluem resíduos de aminoácidos modificados que são quimicamente bloqueados, reversível ou irreversivelmente, ou quimicamente modificados sobre seu grupo amino N-terminal ou seus grupos de cadeia lateral, como por exemplo, D e L aminoácidos N- metilados ou resíduos em que os grupos funcionais de cadeia lateral são quimicamente modificados para outro grupo funcional. Por exemplo, aminoácidos modificados incluem sulfóxido de metionina; sulfona de metionina, ácido aspártico-(beta-metil éster), um aminoácido modificado de ácido aspártico; N-etilglicina; um aminoácido modificado de glicina; ou carboxamida de alanina; um aminoácido modificado de alanina. Resíduos adicionais que podem ser incorporados são descritos em Sandberg et al., J. Med. Chem. Chem. 41: 2481-91, 1998.

[00084] Conforme mencionado acima, porções químicas adequadas para tal derivatização dos polipeptídeos quiméricos incluem, por exemplo, vários polímeros solúveis em água. De preferência, para uso terapêutico do preparado de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável. Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar o polímero desejado com base em considerações tais como se o conjugado de polímero/proteína será usado terapeuticamente e, se assim for, a dosagem desejada, tempo de circulação, resistência à proteólise e outras considerações. Para os polipeptídeos quiméricos, a eficácia da derivatização pode ser verificada administrando a leptina derivatizada ou polipeptídeo derivatizado, na forma desejada (isto é, por meio de uma bomba osmótica ou, mais preferivelmente, através de injeção ou infusão ou, ainda, formulado para distribuição oral, pulmonar ou nasal, por exemplo) e observando os efeitos biológicos e respostas biológicas, conforme descrito aqui.

[00085] Tal polímero solúvel em água pode ser selecionado do grupo que consiste, por exemplo, em polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carbóxi metil celulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos(homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona) / polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados e álcool polivinílico. Propionaldeído de polietilenoglicol pode ter vantagens na fabricação em virtude de sua estabilidade em água. Também, succinato, estireno e hidróxietil amido podem ser usados.

[00086] Derivados de polipeptídeos quiméricos de acordo com a invenção podem ser preparados ligando poliaminoácidos ou aminoácidos de ponto de ramificação à porção de leptina. Por exemplo, o poliaminoácido pode ser uma proteína veículo adicional, tal como uma porção Fc, o qual pode servir também para aumentar a meia-vida em circulação da leptina ou do polipeptídeo quimérico. Adicionalmente, tais poliaminoácidos podem ser selecionados do grupo que consiste em albumina sérica (tal como albumina sérica humana), um anticorpo adicional ou porção do mesmo (por exemplo, a região Fc) ou outros poliaminoácidos, por exemplo, polilisinas. Conforme indicado abaixo, a localização de ligação do poliaminoácido pode ser no N-término da porção de leptina ou C-término ou em outros locais entre os mesmos e também podem ser ligados por uma porção química "ligante"à leptina, tal como um ligante peptídico ou um ligante não peptídico.

[00087] O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietileno glicol, o peso molecular preferido é entre cerca de 2 kilodaltons (kDa) e cerca de 100 kDa (o termo "cerca" indica que, em preparados de polietileno glicol, algumas moléculas pesarão mais, outras menos,do que o peso molecular indicado) para facilidade na manipulação e fabricação. Em determinadas modalidades, o polietileno glicol tem entre cerca de 2 kDa e cerca de 60 kDa. Em determinadas modalidades, o polietileno glicol tem entre cerca de 2 kDa e cerca de 40 kDa. Em determinadas modalidades, o polietileno glicol tem entre cerca de 5 kDa e cerca de 40 kDa. Em determinadas modalidades, o polietileno glicol tem entre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa. Em determinadas modalidades, o polietileno glicol tem entre cerca de 5 kDa e cerca de 30 kDa. Em determinadas modalidades, o polietileno glicol tem entre cerca de 5 kDa e a cerca de 20 kDa. Em determinadas modalidades, o polietileno glicol tem entre cerca de 10 kDa e cerca de 20 kDa. Outros tamanhos podem ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração de liberação sustentada desejada, características de solubilidade, os efeitos, se houver, sobre a atividade biológica, a facilidade de manipulação, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietileno glicol ligado a uma leptina e/ou a um polipeptídeo quimérico da invenção). Considerações adicionais que podem influenciar a escolha de um PEG de um determinado peso molecular que pode ser ligado a uma leptina para gerar um derivado de leptina de acordo com a invenção incluem a extensão até a qual o PEG de tal peso molecular pode: reduzir a agregação e/ou aumentar a solubilidade da leptina e/ou do polipeptídeo quimérico quando presente em uma composição ou formulação farmaceuticamente aceitável ou quando exposto a fluidos fisiológicos ou tecidos quando de administração a um indivíduo (por exemplo, através de injeção); e atenuar a incidência de reações no local de injeção causadas pela administração de leptina ou do polipeptídeo quimérico quando de administração a um indivíduo por injeção; aliviar a geração de anticorpos de neutralização que podem ser criados contra a leptina ou o polipeptídeo quimérico como um resultado de administração de tal leptina ou polipeptídeo quimérico a um indivíduo e assim por diante.

[00088] O número de moléculas poliméricas assim ligadas pode variar e aqueles versados na técnica serão capazes de verificar o efeito resultante sobre a função. Pode-se mono-derivatizar ou proporcionar uma di-, tri-, tetra- ou alguma combinação de derivatização, com as mesmas ou porções químicas diferentes (por exemplo, polímeros, tais como polietileno glicóis de diferentes pesos). A proporção de moléculas poliméricas para moléculas de leptina ou moléculas de polipeptídeo quimérico a ser derivatizado irá variar, bem como suas concentrações na mistura de reação. Em geral, a proporção ótima, em termos de eficiência de reação, onde não há excesso de leptina não reagida (ou polipeptídeo quimérico, conforme o caso) ou polímero será determinada por fatores, tais como o grau desejado de derivação (por exemplo, mono-, di-, tri-, etc.), o peso molecular do polímero selecionado, se o polímero é ramificado ou não ramificado e as condições de reação.

[00089] As porções químicas deverão ser ligadas à leptina e/ou polipeptídeo quimérico considerando-se os efeitos sobre domínios funcionais ou antigênicos da leptina e/ou polipeptídeo quimérico. Há uma série de métodos de ligação disponíveis para aqueles versados na técnica. Por exemplo, o documento EP 0 401 384, aqui incorporado por referência (acoplamento de PEG a G-CSF), vide também Malik et al., 1992, Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (que reporta a peguilação de GM-CSF usando cloreto de tresila). Por exemplo, o polietileno glicol pode ser covalentemente ligado através de resíduos de aminoácidos via um grupo reativo, tal como um grupo amino ou carboxila livre. Grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula de polietileno glicol ativada pode ser ligada. Os resíduos de aminoácido tendo um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e o resíduo de aminoácido N-terminal. Aqueles tendo um grupo carboxila livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutâmico e o resíduo de aminoácido C-terminal. Grupos sulfidrila podem também ser usados como um grupo reativo para ligação da(s) molécula(s) de polietileno glicol. Preferida para fins terapêuticos é a ligação em um grupo amino, tal como ligação no grupo lisina ou N-término. Fixação em resíduos importantes para ligação ao receptor deve ser evitada se ligação ao receptor é desejada.

[00090] Pode-se desejar conceber e preparar especificamente uma leptina quimicamente modificada no N-término para uso no preparo de polipeptídeos quiméricos da invenção. Usando polietileno glicol como uma ilustração das presentes composições pode-se selecionar, a partir de uma variedade de moléculas de polietileno glicol (pelo peso molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de polietileno glicol para leptina ou moléculas de polipeptídeo quimérico, conforme o caso, na mistura de reação, o tipo de reação de peguilação a ser executada e o método para obtenção da proteína N-terminalmente peguilada selecionada. O método de obtenção do preparado de N- terminalmente peguilado (isto é, separação desta porção de outras porções monopeguiladas, se necessário) pode ser através de purificação do material N-terminalmente peguilado a partir de uma população de moléculas de proteínas PEGuiladas. Modificação química N-terminal seletiva pode ser realizada por meio de alquilação redutiva, a qual explora a reatividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o N-término) disponíveis para derivatização em uma proteína em particular. Sob as condições de reação apropriadas, derivatização substancialmente seletiva da proteína no N-término com um polímero contendo grupo carbonila é obtida. Por exemplo, pode-se peguilar seletivamente a proteína N- terminalmente realizando a reação em um pH o qual permite que se tire vantagem das diferenças de pKaentre o grupo ε-amino de resíduos lisina e aquela do grupo α-amino do resíduo N-terminal da proteína. Por meio de tal derivatização seletiva, ligação de um polímero solúvel em água a uma proteína é controlada: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no N-término da proteína e não há modificação significativa de outros grupos reativos, tais como os grupos amino da cadeia lateral de lisina. Usando alquilação redutiva, o polímero solúvel em água pode ser do tipo acima descrito e deverá ter um único aldeído reativo para acoplamento à proteína. Propionaldeído de polietileno glicol, que contém um único aldeído reativo, pode ser usado.

III. Métodos de Design e Produção

[00091] Design de construtos. Os polipeptídeos quiméricos descritos aqui podem ser concebidos ao nível de aminoácido. Estas sequências podem, então, ser re-traduzidas usando uma variedade de produtos de software conhecidos na técnica, de modo que a sequência de nucleotídeos seja otimizada para o hospedeiro de expressão pretendido, por exemplo, expressão com base em proteína, otimização de códon, teor do sítio de restrição. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos pode ser otimizada para expressão de proteína com base em E. coli e para o teor de sítio de restrição. Com base na sequência de nucleotídeos de interesse, oligonucleotídeos que se sobrepõem podem ser fornecidos para várias etapas de PCR, conforme conhecido na técnica. Estes oligonucleotídeos podem ser usados em múltiplas reações de PCR sob condições bem conhecidas na técnica para a construção do cDNA que codifica a proteína de interesse. Um exemplo é 1X tampão Amplitaq, MgCh a 1,3 mM, dNTPs a 200 μm, 4 U de Amplitaq Gold, 0,2 μM de cada primer (AmpliTaq Gold, ABI), com parâmetros de ciclização: (94°C: 30s, 58°C: 1 min, 72°C: 1 min), 35 ciclos.

[00092] Sítios de restrição podem ser adicionados às extremidades dos produtos de PCR para uso em ligação a vetor, conforme conhecido na técnica. Sítios específicos podem incluir NdeI e XhoI, de modo que o cDNA possa, então, estar no quadro de leitura apropriado em um vetor de expressão pET45b (Novagen). Ao usar esses sítios, qualquer His Tag N-terminal que esteja neste vetor pode ser removida, uma vez que o sítio de início de tradução estaria, então, a jusante da tag. Uma vez que construtos de expressão são terminados, verificação pode ser conduzida por meio de sequenciamento usando, por exemplo, o iniciador promotor T7, iniciador terminador T7 e protocolos padrões da ABI BigDye Term v3.1, conforme conhecido na técnica. Informação de sequência pode ser obtida, por exemplo, a partir de um Analisador de DNA ABI 3730 e pode ser analisada usando o software Vector NTI v. 19 (Invitrogen). Construtos de expressão podem ser concebidos de uma forma modular, de modo que sequências ligantes possam ser facilmente cortadas e alteradas, conforme conhecido na técnica.

[00093] Sítios de reconhecimento de protease, conhecidos na técnica ou descritos aqui, podem ser incorporados em construtos úteis para a concepção, construção, manipulação e produção de polipeptídeos recombinantes quiméricos descritos aqui.

[00094] Métodos Gerais de Produção. Os polipeptídeos quiméricos descritos aqui podem ser preparados usando métodos biológicos, químicos e/ou de DNA recombinante que são conhecidos na técnica. Os métodos exemplificativos são descritos aqui e na Patente U.S. N° 6.872.700, documentos WO 2007/139941, WO 2007/140284, WO 2008/082274, WO 2009/011544 e Publicação US N° 5 2007/0238669, as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência na íntegra e para todos os efeitos. Outros métodos para o preparo dos compostos são apresentados aqui.

[00095] Os polipeptídeos quiméricos descritos aqui podem ser preparados usando técnicas padrões de síntese de peptídeos em fase sólida, tais como um sintetizador de peptídeos automatizado ou semi- automatizado. O polipeptídeo quimérico pode ser produzido por meio de síntese não biológica do peptídeo utilizando aminoácidos e/ou derivados de aminoácidos tendo cadeias laterais reativas protegidas, a síntese de peptídeo não-biológica compreendendo acoplamento gradual de aminoácidos e / ou os derivados de aminoácidos para formar um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto tendo cadeias laterais reativas protegidas, remoção dos grupos de proteção das cadeias laterais reativas do polipeptídeo e dobramento do polipeptídeo em solução aquosa. Assim, aminoácidos normais (por exemplo, glicina, alanina, fenilalanina, isoleucina, leucina e valina) e derivados de aminoácidos pré-protegidos são usados para construir sequencialmente uma sequência polipeptídica em solução ou sobre um suporte sólido em um solvente orgânico. Quando uma sequência polipeptídica completa é construída, os grupos de proteção são removidos e o polipeptídeo é deixado dobrar em uma solução aquosa.

[00096] Tipicamente, usando essas técnicas, um aminoácido alfa- N-carbamoíla e amino protegido de um aminoácido ligado à cadeia peptídica em crescimento sobre uma resina são acoplados em temperatura ambiente em um solvente inerte (por exemplo, dimetilformamida, N-metilpirrolidinona, cloreto de metileno e similares) na presença de agentes de acoplamento (por exemplo, diciclo- hexilcarbodiimida, 1-hidróxibenzotriazola e similares) na presença de uma base (por exemplo, di-isopropiletilamina e similares). O grupo de proteção alfa-N-carbamoíla é removido do peptídeo-resina resultante usando um reagente (por exemplo, ácido trifluoroacético, piperidina e similares) e a reação de acoplamento repetida com o próximo aminoácido N-protegido que se deseja adicionar à cadeia peptídica. Grupos de N-proteção apropriados são bem conhecidos na técnica, tais como t-butilóxicarbonila (tBoc) fluorenilmetóxicarbonila (Fmoc) e similares. Os solventes, derivados de aminoácidos e resina de 4-amino metilbenzidrila usados no sintetizador de peptídeos podem ser adquiridos da Applied Biosystems Inc. (Foster City, Califórnia).

[00097] Para síntese química, síntese peptídica em fase sólida pode ser usada para os polipeptídeos quiméricos uma vez que, em geral, síntese em fase sólida é uma abordagem simples com excelente capacidade de escalonamento para a escala comercial e, em geral, é compatível com polipeptídeos manipulados relativamente longos. Síntese de peptídeos em fase sólida pode ser realizada com um sintetizador de peptídeos automático (Modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) usando o sistema NMP/HOBt (Opção 1) e química de tBoc ou Fmoc (vide Manual do Usuário da Applied Biosystems para o ABI 430A Peptide Synthesizer A, Versão 1.3B, 01 de Julho de 1988, seção 6, páginas 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, Califórnia) com "capping". Boc-peptídeo-resinas podem ser clivadas com HF (-5 °C a 0 °C, 1 hora). O peptídeo pode ser extraído da resina alternando água com ácido acético e os filtrados liofilizados. As resinas Fmoc-peptídeo podem ser clivadas de acordo com métodos padrões (por exemplo, Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, páginas 6-12). Os peptídeos podem também ser montados usando um Advanced Chem Synthesizer Tech (Modelo MPS 350, Louisville, Kentucky).

[00098] Os compostos descritos aqui podem também ser preparados usando técnicas de DNA recombinante, usando métodos conhecidos na técnica, tal como Sambrook et al., 1989, MolecularCloning: A Laboratory Manual,2aEd., Cold Spring Harbor. Compostos não peptídicos podem ser preparados por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, aminoácidos contendo fosfato e peptídeos contendo tais aminoácidos podem ser preparados usando métodos conhecidos na técnica, conforme descrito em Bartlett et al., 1986, Biorg. Chem., 14: 356-377.

IV. Métodos de uso e tratamento de doenças

[00099] Indicações. Uma variedade de doenças e distúrbios estão considerados como sendo beneficamente tratados pelos compostos polipeptídicos e os métodos descritos aqui.

[000100] Obesidade e excesso de peso. Obesidade e suas doenças associadas, incluindo excesso de peso, são problemas comuns e graves de saúde pública nos Estados Unidos e em todo o mundo. Obesidade na parte superior do corpo é o principal fator de risco conhecido para diabetes mellitus do tipo 2 e é um forte fator de risco para doença cardiovascular. A obesidade é um fator de risco reconhecido para hipertensão, aterosclerose, insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, doença da vesícula biliar, osteoartrite, apneia do sono, distúrbios reprodutivos, tal como a síndrome de ovário policístico, câncer de mama, próstata e cólon e aumento da incidência de complicações de anestesia geral. Vide, por exemplo, Kopelman, 2000, Nature 404: 635-43.

[000101] A obesidade reduz a expectativa de vida e traz um sério risco das co-morbidades listadas acima, bem como distúrbios tais como infecções, varizes, acantose nigricans, eczema, intolerância ao exercício, resistência à insulina, hipercolesterolemia, hipertensão, colelitíase, lesões ortopédicas e doença tromboembólica. Vide, por exemplo, Rissanen et al., 1990, Br. Med. J., 301: 835-7. A obesidade também é um fator de risco para o grupo de condições conhecidas como síndrome de resistência à insulina ou "Síndrome X" e síndrome metabólica. O custo médico em todo o mundo pela obesidade e distúrbios associados é enorme.

[000102] Acredita-se que a patogênese da obesidade seja multi- fatorial. Um problema é que, em indivíduos obesos, a disponibilidade de nutrientes e dispêndio de energia não entram em equilíbrio até que haja excesso de tecido adiposo. O sistema nervoso central (Central Nervous System - CNS) controla o equilíbrio de energia e coordenada uma variedade de atividades comportamentais, autonômicas e endócrinas apropriadas ao estado metabólico do animal. Os mecanismos ou sistemas que controlam essas atividades estão amplamente distribuídos através do prosencéfalo (por exemplo, hipotálamo), rombencéfalo (por exemplo, tronco cerebral) e medula espinhal. Em última análise, informações metabólicas (isto é, disponibilidade de combust[ivel) e cognitivas (isto é, preferências aprendidas) desses sistemas são integradas e a decisão de se envolver em comportamentos de apetite (busca por alimento) e consumo (ingestão) é ativada (procura por alimento e início de ingestão) ou desativada (término de refeição). Acredita-se que o hipotálamo seja principalmente responsável pela integração desses sinais e, então, emite comandos para o tronco cerebral. Núcleos do tronco cerebral controlam os elementos do sistema de controle motor de consumo (por exemplo, músculos responsáveis pela mastigação e deglutição). Como tal, estes núcleos no CNS têm, literalmente, sido referidos como a "via em comum final" para o comportamento de ingestão.

[000103] Evidência neuroanatômica e farmacológica sustentam que os sinais de homeostase de energia e nutricional se integram nos núcleos do prosencéfalo e que o sistema de controle motor de consumo reside em núcleos do tronco cerebral, provavelmente em regiões em torno do núcleo motor trigeminal. Há conexão recíproca extensiva entre o hipotálamo e o tronco cerebral. Uma variedade de produtos terapêuticos anti-obesidade dirigidos ao CNS (por exemplo, pequenas moléculas e peptídeos) se concentram predominantemente sobre substratos do prosencéfalo que residem no hipotálamo e/ou sobre substratos no rombencéfalo que residem no tronco cerebral.

[000104] A obesidade continua a ser um distúrbio metabólico pobremente tratável, crônico, essencialmente intratável. Consequentemente, há uma necessidade por novas terapias úteis em redução de peso e/ou manutenção de peso em um indivíduo. Tais terapias levariam a um efeito benéfico profundo sobre a saúde do indivíduo. Métodos e terapias que empregam os peptídeos quiméricos descritos aqui, em si ou em combinação com outros agentes anti- obesidade (vide, por exemplo, documentos WO 2009064298 e US 20080207512) podem conferir tais efeitos benéficos.

[000105] Deficiência de Leptina. Foi mostrado que a deficiência de leptina resulta em obesidade. Uma forma de deficiência de leptina é a deficiência congênita de leptina, uma doença genética rara. Vide Montaque et al., 1997, Nature 387: 903-908. Deficiência grave de leptina pode ser um resultado de diabetes mellitus deficiente em insulina descontrolado que resulta de destruição de β-células secretoras de insulina. Postula-se que a falta de insulina leva à síntese e armazenamento de triglicerídeos em tecido adiposo, o qual impede que o ganho de peso e, por sua vez, reduz significativamente os níveis plasmáticos de leptina, uma vez que a leptina é sintetizada no tecido adiposo. Estas e outras deficiências de leptina e doenças e distúrbios que resultam de tais deficiências podem ser tratados com terapia de reposição de leptina, tal como através de injeções diárias de leptina ou agonistas de leptina. Os polipeptídeos quiméricos descritos aqui podem fornecer um tratamento terapêutico mais conveniente e vantajoso de tais doenças e distúrbios.

[000106] Diabetes e Doença Cardiovascular. Diabetes mellitus é reconhecido como uma doença crônica complexa na qual 60% a 70% de todas as mortes de casos entre pacientes diabéticos são um resultado de complicações cardiovasculares. Diabetes é considerado não só um risco equivalente à doença coronariana, mas também é identificado como um prognóstico independente de eventos adversos, incluindo enfarte do miocárdio recorrente, insuficiência cardíaca congestiva e morte após um incidente cardiovascular. Seria esperado que a adoção de controle mais rigoroso de glicose e tratamento agressivo para fatores de risco cardiovasculares viesse a reduzir o risco de complicações de doenças coronárias e melhorasse a sobrevida global em pacientes diabéticos. No entanto, pacientes diabéticos têm duas a três vezes mais probabilidade de sofrer um enfarte agudo do miocárdio do que aqueles não diabéticos e diabéticos vivem 8-13 anos a menos do que aqueles não diabéticos.

[000107] Entendendo a natureza de alto risco do diabetes/enfarte agudo do miocárdio, as diretrizes de prática clínica da American College of Cardiology/American Heart Association ("ACC/AHA") para o tratamento de pacientes internados com angina instável ou enfarte do miocárdio sem elevação em ST (coletivamente referidos como "ACS") reconheceu recentemente que pacientes diabéticos hospitalizados são uma população especial que requer um tratamento agressivo de hiperglicemia. Especificamente, as diretrizes afirmam que terapia de redução de glicose para pacientes com ACS/diabéticos hospitalizados deve ser orientada para alcançar níveis de glicose pré-prandial menores do que 10 mg/dL, uma meta diária máxima de 180 mg/dL e um nível de hemoglobina A1c pós-descarga de menos de 7%.

[000108] Em uma amostra nacional de pacientes idosos com ACS, foi demonstrado que um aumento na mortalidade a 30 dias em pacientes diabéticos correspondia a pacientes tendo valores mais elevados de glicose no momento de admissão no hospital. Vide " Diabetic Coronary Artery Disease & Intervention", Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, 20 de Setembro de 2002. Há evidências crescentes que sustentam que a hiperglicemia, em vez de glicose elevada transitória, quando de admissão hospitalar está relacionada a eventos adversos graves. Embora a medida ideal para hiperglicemia e risco vascular em pacientes não seja prontamente conhecida, parece que o valor médio de glicose durante hospitalização é mais prognóstico de mortalidade. Em um estudo distinto de pacientes com ACS em mais de 40 hospitais nos Estados Unidos, descobriu-se que hiperglicemia persistente, em oposição a valores de glicose aleatórios, quando de admissão no hospital, era mais prognóstica de mortalidade hospitalar. Vide Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO, 21 de Setembro de 2002. Comparado com os valores de glicose no momento de admissão, um modelo de regressão logística de controle glicêmico durante toda a hospitalização foi mais prognóstico de mortalidade. Houve um risco quase duas vezes maior de mortalidade durante a internação para cada aumento de 10 mg/dL na glicose acima de 120 mg/dL. Em um pequeno grupo de pacientes com ACS/diabéticos consecutivos, houve um aumento gradual na mortalidade em um ano, com crescentes níveis de glicose no momento de admissão hospitalar. No ambiente hospitalar, as diretrizes do ACC/AHA sugerem início de terapia com insulina agressiva para obter menor glicose no sangue durante hospitalização.

[000109] Foi reportado que a leptina pode ter benefícios diretos para o tratamento de diabetes, particularmente em diabetes do tipo I e diabetes do tipo II, com ou sem a presença de obesidade e, mais particularmente, em condições de baixo nível de leptina no soro. Foi reportado que a reposição de leptina reduziu ou evitou hiperinsulinemia, hiperglicemia e resistência à insulina em vários modelos animais de diabetes do tipo 1 e 2, com ou sem obesidade associada. Por exemplo, níveis plasmáticos elevados de leptina gerados por meio de administração farmacológica de leptina ou com terapia gênica adenoviral reduziu a hiperglicemia e aumentos associados dos níveis plasmáticos de glucagon em diabetes induzida por STZ, apesar dos níveis de insulina persistentemente baixos.

[000110] Doenças de Regulação de Lipídios. Conforme conhecido na técnica, lipodistrofia é caracterizada por condições anormais ou degenerativas do tecido adiposo do corpo. Dislipidemia é uma ruptura no componente lipídico normal no sangue. Acredita-se que elevação prolongada dos níveis de insulina pode levar à dislipidemia. Hiperlipidemia é a presença de níveis elevados ou anormais de lipídios e/ou lipoproteínas no sangue. Amenorréia hipotalâmica é uma condição na qual a menstruação pára por vários meses em virtude de um problema envolvendo o hipotálamo. Descobriu-se que a terapia de reposição de leptina em mulheres com amenorreia hipotalâmica melhora os eixos da tiróide, reprodutivo e hormônio de crescimento e marcadores de formação óssea sem causar efeitos adversos. Vide, por exemplo, Oral et al., N Engl J Med. 2004, 351: 959-962, 987-997. Doença do fígado gorduroso, por exemplo, doença do fígado gorduroso não alcoólica (NAFLD), refere-se a um amplo espectro de doenças do fígado que varia de fígado gorduroso simples (esteatose) a esteato-hepatite não alcoólica (NASH) à cirrose (irreversível, cicatrização avançada do fígado). Todas os estágios de NAFLD têm em comum o acúmulo de gordura (infiltração de gordura) nas células do fígado (hepatócitos). Acredita-se que a leptina é um dos reguladores chave para inflamação e progressão de fibrose em diversas doenças hepáticas crônicas, incluindo NASH. Vide, por exemplo, Ikejima et al., Hepatology Res. 33: 151-154.

[000111] Adicionalmente, sem desejar estar preso a qualquer teoria, acredita-se que a deficiência relativa de insulina em diabetes do tipo 2, toxicidade por glicose e carga aumentada de ácido graxo livre hepático através de distribuição elevada a partir do tecido adiposo intra-abdominal por meio da veia portal, estão implicados como possíveis causas em distúrbios de fígado gorduroso. Na verdade, foi levantada a hipótese de que o comportamento alimentar é o fator chave que determina a síndrome metabólica de obesidade com suas diversas complicações, incluindo NASH. Consequentemente, tratamentos que visam reduzir a ingestão de alimento e o aumento do número de pequenas refeições, conforme já foi demonstrado em pacientes com diabetes do tipo 2, podem tratar e prevenir efetivamente NASH. Fármacos que promovem a secreção de insulina e perda de peso e retardam o esvaziamento gástrico também são eficazes em melhora da tolerância à glicose e, portanto, podem melhorar o fígado gorduroso com concomitante hiperinsulinemia. Assim, o uso de uma leptina, um análogo de leptina, por exemplo, metreleptina ou um fragmento ativo da mesma, pode ser adequado como uma modalidade de tratamento para esta condição. Consequentemente, os polipeptídeos quiméricos descritos aqui que incluem uma leptina, um análogo de leptina ou um fragmento ativo da mesma podem ser úteis no tratamento de doenças de fígado gorduroso.

[000112] Mal de Alzheimer. Mal de Alzheimer (Alzheimer's Disease - AD), conforme conhecido na técnica, está associado à placas e emaranhados no cérebro, os quais incluem desregulação de proteína β-beta. Acredita-se que os lipídios cerebrais estão intimamente envolvidos em vias patogênicas relacionadas à β-beta e que um modulador importante de homeostase de lipídios é a leptina. Consequentemente, a leptina pode modular a cinese bidirecional de β- beta, reduzindo seus níveis extracelularmente. Na verdade, foi demonstrado que a administração crônica de leptina a animais AD- transgênicos reduziu a carga de β-beta no cérebro, fundamentando seu potencial terapêutico. Vide Fewlass et al., 2004, FASEB J., 18: 1870-1878. Adicionalmente, diabetes mellitus tipo 2 e AD compartilham características epidemiológicas e bioquímicas pelo fato de que ambos são caracterizados por agregados de proteínas insolúveis com uma conformação fibrilar - amilina em ilhotas pancreáticas de DM do tipo 2 e Ap em cérebro de AD. Sem desejar estar preso a qualquer teoria, acredita-se que mecanismos tóxicos similares podem caracterizar DM do tipo 2 e AD. Vide Lim et al., FEBS Lett., 582: 2188-2194.

[000113] Síndrome X metabólica. Síndrome X metabólica é caracterizada por resistência à insulina, dislipidemia, hipertensão e distribuição visceral de tecido adiposo e desempenha um papel fundamental na patofisiologia de diabetes do tipo 2. Descobriu-se também que ela está fortemente correlacionada com NASH, fibrose e cirrose do fígado. Consequentemente, polipeptídeos quiméricos descritos aqui podem ser úteis no tratamento de síndrome X metabólica.

[000114] Doença de Huntington. Doença de Huntington é uma doença neurodegenerativa autossômica dominante. Características da doença incluem distúrbios motores, demência, problemas psiquiátricos e perda de peso não intencional. Os polipeptídeos quiméricos descritos aqui podem ser úteis no tratamento da doença de Huntington.

[000115] Consequentemente, em um aspecto, é proporcionado um método para tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo. O indivíduo está precisando de tratamento para a doença ou distúrbio. A doença ou distúrbio pode ser lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, peso excessivo, obesidade, amenorréia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso e diabetes (incluindo Tipo I e Tipo II). Outras doenças e distúrbios que podem ser tratados pelos compostos e métodos descritos aqui incluem esteato-hepatite não alcoólica (NASH) e doença hepática não alcoólica (NAFLD), síndrome X metabólica e doença de Huntington. O método de tratamento inclui administração, ao indivíduo, de um polipeptídeo quimérico conforme descrito aqui em uma quantidade eficaz para o tratamento da doença ou distúrbio.

Ensaios

[000116] Métodos para a produção e ensaio de polipeptídeos quiméricos descritos aqui estão, em geral, disponíveis para aqueles versados na técnica. Ainda, métodos específicos são descritos aqui, bem como nas publicações de patentes e outras referências citadas aqui, as quais são incorporadas por referência por sua finalidade adicional.

[000117] Ingestão de Alimento. Sem desejar estar preso a qualquer teoria, acredita-se que a ingestão de alimento é útil na avaliação da utilidade de um composto conforme descrito aqui. Por exemplo, sabe- se que uma série de patologias metabólicas estão relacionadas à ingestão de alimento (por exemplo, diabetes, obesidade). Consequentemente, uma triagem inicial pode ser conduzida para determinar a extensão até a qual a ingestão de alimento é modulada pela administração de compostos descritos aqui e uma triagem inicial positiva pode ser útil em subsequente desenvolvimento de um composto.

[000118] Ensaios in vitro. Sem desejar estar preso a qualquer teoria ou mecanismo de ação, acredita-se que existam correlações entre os resultados de ensaios in vitro (por exemplo, receptor) e a utilidade de agentes para o tratamento de doenças e distúrbios metabólicos. Consequentemente, ensaios in vitro (por exemplo, ensaios baseados em células) são úteis como uma estratégia de triagem de agentes metabólicos potenciais, conforme descrito aqui. Uma variedade de ensaios in vitrosão conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos a seguir.

[000119] Ensaio de Ligação de Leptina. Ligação da leptina pode ser medida pela potência de um composto de teste em deslocamento de 125I-leptina recombinante (murino) da membrana de superfície que expressa o receptor de Leptina (Hu) - EPO (Mu) quimérico apresentado pela linhagem de células 32D OBECA (J Biol Chem 1998; 273 (29): 18365-18373). Membranas celulares purificadas podem ser preparadas por meio de homogeneização de culturas de células confluentes coletadas de células 32D OBECA. As membranas podem ser incubadas com 125I-rec-leptina de murino e concentrações crescentes de composto de teste durante 3 horas em temperatura ambiente em placas de poliestireno com 96 cavidades. Frações de ligante ligado e não ligado podem, então, ser separadas por meio de filtração rápida em placas GF/B com 96 cavidades pré-bloqueadas durante pelo menos 60' em PEI (polietilenimina) a a 0,5%. Placas de fibra de vidro podem, então, ser secas, cintilante adicionado e CPM determinada pela leitura sobre um contador de cintilação com múltiplas cavidades capaz de leitura de iodo radiomarcado.

[000120] Ensaio Funcional de Leptina. Níveis aumentados de STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription 5 -Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição 5) fosforilado podem ser medidos após tratamento de células 32D-Keptina que expressam ectopicamente o receptor Hu-Leptina/Mu-EPO quimérico com um composto de teste. As células 32D-Keptina (idênticas às células 32D- OBECA, mas mantidas em cultura com leptina) podem ser privadas de leptina durante a noite e, em seguida, tratadas com compostos de teste em placas com 96 cavidades durante 30 minutos a 37 °C, seguido por extração de células. Os níveis de pSTAT5 nos lisatos celulares podem ser determinados usando o kit de ensaio de pSTAT5 AlphaScreen® SureFire® da Perkin Elmer em um formato com 384 cavidades (Proxiplate™ 384 Plus). A eficácia dos compostos de teste pode ser determinada em relação ao sinal máximo em lisatos celulares a partir de células tratadas com leptina humana.

Composições farmacêuticas

[000121] Em um aspecto, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo os compostos descritos aqui em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, veículo). O termo "veículo farmaceuticamente aceitável", conforme usado aqui, refere-se a excipientes farmacêuticos, por exemplo, substâncias veículo orgânicas ou inorgânicas farmacêutica ou fisiologicamente aceitáveis adequadas para aplicação enteral ou parenteral que não reagem prejudicialmente com o agente ativo. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, soluções salinas (por exemplo, solução de Ringer e similares), álcoois, óleos, gelatinas e carboidratos, tais como lactose, amilose ou amido, ésteres de ácidos graxos, hidróxi metil celulose e polivinilpirrolidina. Tais preparados podem ser esterilizados e, se desejado, misturados com agentes auxiliares, tais como lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, colorantes e/ou substâncias aromáticas e similares que não reagem prejudicialmente com os compostos da invenção.

Métodos

[000122] Os polipeptídeos quiméricos descritos aqui podem ser administrados isoladamente ou podem ser co-administrados a um indivíduo. Co-administração deve ser entendida como incluindo administração simultânea ou sequencial dos compostos individualmente ou em combinação (mais de um composto). Por exemplo, descobriu-se que obesidade pode ser beneficamente tratada com uma combinação terapêutica incluindo uma leptina (por exemplo, metreleptina) e alguns outros compostos anti-obesidade. Vide, por exemplo, Pedido US Publicado N° 2008/0207512. Consequentemente, um polipeptídeo quimérico descrito aqui poderia ser útil para o tratamento de obesidade.

[000123] Em algumas modalidades, as formulações e métodos descritos aqui ainda permitem que o polipeptídeo quimérico seja administrado com um ou mais agentes anti-diabéticos, tais como agentes anti-hiperglicemia, por exemplo, insulina, amilinas, pramlintida, metformina.

[000124] Em algumas modalidades, as formulações e métodos descritos aqui ainda permitem que o polipeptídeo quimérico seja co- administrado com um ou mais agentes para diminuição de colesterol e/ou triglicerídeos. Agentes exemplificativos incluem inibidores de reductase de HMG CoA (por exemplo, atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina); agentes de captura de ácido biliar (por exemplo, colesevelam, colestiramina, colestipol); fibratos (por exemplo, fenofibrato, clofibrato, gemfibrozila); ezetimiba, ácido nicotínico, probucol, uma combinação de lovastatina/niacina; uma combinação de atorvastatina/amlodipina; e uma combinação de simvastatina/ezetimiba.

[000125] Alternativamente, os polipeptídeos quiméricos individuais podem ser co-administrados com outros agentes anti-obesidade, tais como exenatida ou liraglutida.

[000126] A presente descrição proporciona a composição para uso como um medicamento, isto é, para uso em terapia, uma vez que o composto de leptina é um composto terapeuticamente ativo. Composições compreendendo o polipeptídeo quimérico, quer na forma líquida ou seca, e opcionalmente pelo menos um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável são também especificamente consideradas e são exemplificadas aqui.

[000127] Co-administração pode ser obtida administrando separadamente o polipeptídeo quimérico com o segundo agente ou através de administração de uma formulação farmacêutica única compreendendo o polipeptídeo quimérico e o segundo agente. Regimes de dosagem apropriados para os segundos agentes são geralmente conhecidos na técnica.

[000128] Os preparados podem também ser co-administrados, quando desejado, com outras substâncias ativas (por exemplo, para reduzir a degradação metabólica) conforme conhecido na técnica ou outros agentes terapeuticamente ativos.

[000129] Amilinas. A amilina é um hormônio peptídico sintetizado por p-células do pâncreas que é co-segregada com insulina em resposta à ingestão de nutrientes. A sequência da amilina é altamente conservada entre as espécies de mamíferos, com similaridades estruturais com o peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (Calcitonin Gene-Related Peptide - CGRP), as calcitoninas, as intermedinas e adrenomedulina, conforme conhecido na técnica. Ações glico-reguladoras da amilina complementam aquelas da insulina mediante regulação da taxa de aparecimento de glicose na circulação via supressão da secreção de glucagon estimulada por nutrientes e retardo de esvaziamento gástrico. Em pacientes com diabetes tratados com insulina, pramlintida, um análogo sintético e equipotente de amilina humana, reduz as excursões de glicose pós-prandial ao suprimir a secreção de glucagon pós-prandial inapropriadamente elevada e retardando o esvaziamento gástrico. Seguem as sequências de amilina de rato, amilina humana e pramlintida: amilina de rato: KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 86);amilina humana: KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(SEQ ID NO: 87);Pramlintida: KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 88).

[000130] Davalintida. Davalintida, também conhecida como "AC- 2307", é um potente agonista de amilina útil no tratamento de uma variedade de indicações doentias. Vide documentos WO 2006/083254 e WO 2007/114838, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra e para todos os efeitos. Davalintida é um peptídeo quimérico que tem uma região de loop N-terminal de amilina ou calcitonina e análogos das mesmas, uma região alfa-helicoidal de pelo menos uma porção de uma região alfa-helicoidal de calcitonina ou análogos da mesma ou uma região alfa-helicoidal que tem uma porção de uma região alfa-helicoidal de amilina e uma região alfa-helicoidal de calcitonina ou análogos das mesmas e uma região de cauda C- terminal de amilina ou calcitonina. Seguem as sequências de calcitonina humana, calcitonina de salmão e davalintida: calcitonina humana: CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ IDNO: 89);calcitonina de salmão: CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO: 90);davalintida: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 91).

[000131] Sem pretender estar preso a qualquer teoria, acredita-se que amilinas e davalintida e fragmentos e análogos dos mesmos podem requerer amidação C-terminal para desencadear uma resposta biológica completa. Deverá ser entendido que compostos de amilina, tais como aqueles descritos aqui, os quais incluem amilinas e/ou davalintida e fragmentos e análogos dos mesmos, pode ser amidados no C-término.

[000132] "Compostos agonistas de amilina" incluem peptídeos de amilina nativos, peptídeos análogos de amilina e outros compostos (por exemplo, pequenas moléculas) que possuem atividade agonista de amilina. Os "compostos agonistas de amilina" podem ser derivados de fontes naturais, podem ser sintéticos ou podem ser derivados por meio de técnicas de DNA recombinante. Compostos agonistas de amilina têm atividade de ligação ao receptor agonista de amilina e podem compreender aminoácidos (por exemplo, naturais, não naturais ou uma combinação dos mesmos), miméticos peptídicos, porções químicas e similares. Aqueles versados na técnica reconhecerão compostos agonistas de amilina usando ensaios de ligação a receptores de amilina ou medindo a atividade agonista de amilina em ensaios com músculo soleus. Em uma modalidade, os compostos agonistas de amilina terão uma IC50 de cerca de 200 nM ou menos, cerca de 100 nM ou menos ou cerca de 50 nM ou menos, em um ensaio de ligação a receptor de amilina, tal como aquele descrito aqui, na Patente U.S. N° 5.686.411 e Publicação US N° 2008/0176804, as descrições das quais são aqui incorporadas por referência na íntegra e para todos os efeitos. Em uma modalidade, compostos agonistas de amilina terão uma EC50 de cerca de 20 nM ou menos, cerca de 15 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos ou cerca de 5 nM ou menos em um ensaio com músculo soleus, conforme descrito aqui e na Patente U.S. N° 5.686.411. Em uma modalidade, o composto agonista de amilina tem pelo menos 90% ou 100% de identidade de sequência com a 25,28,29Pro-amilina humana. Em uma modalidade, o composto agonista de amilina é uma quimera peptídica de amilina (por exemplo, amilina humana, amilina de rato e similares) e calcitonina (por exemplo, calcitonina humana, calcitonina de salmão e similares). Compostos agonistas de amilina adequados e exemplificativo são também descritos na Publicação US N° 2008/0274952, a descrição da qual é incorporada por referência na íntegra e para todos os efeitos.

[000133] Por "análogo de amilina", conforme usado aqui, entenda-se um agonista de amilina que tem pelo menos 50% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 70% de identidade de sequência a uma forma de amilina que ocorre naturalmente, quer de rato ou humana, ou qualquer outra espécie e é derivado das mesmas por meio de modificações, incluindo inserções, substituições, extensões e/ou deleções da sequência de aminoácidos de referência.

[000134] A sequência do análogo de amilina pode ter pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 25 a 90% ou 95% deidentidade de sequência de aminoácido com a amilina de referência. Em um aspecto, o análogo tem 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mesmo 16 substituições, inserções, extensões e/oudeleções de aminoácidos em relação ao composto de referência. Em uma modalidade, o análogo de amilina pode compreender substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas (incluindo aminoácidos naturais não naturais e as formas L e D). Estes análogos são, de preferência, peptídeos, derivados peptídicos ou mímicos peptídicos. Análogos de amilina típicos serão peptídeos, especialmente de 32-37 aminoácidos, por exemplo, 27-45, especialmente 28-38 e mesmo 31-36.

[000135] Os análogos de amilina com identidade à amilina de rato e humana incluem 25,28,29Pro-h-amilina (pramlintida) (SEQ ID NO: 88); des-1Lys-h-amilina (SEQ ID NO: 111); 25Pro,26Val,28,29Pro-h-amilina(SEQ ID NO: 112); 18Arg,25,28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 113); des- 1Lys,18Arg,25,28Pro-h amilina (SEQ ID NO: 114); 18Arg,25,28,29Pro-h- amilina (SEQ ID NO: 115); des-1Lys,18Arg,25,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 116); des-1,Lys25,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 117);25Pro,26Val,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 118); 28Pro-h-amilina, 2,7- Cyclo-[2Asp,7Lys]-h-amilina (SEQ ID NO: 119); 2-37h-amilina (SEQ ID NO: 120); 1Ala-h-amilina (SEQ ID NO: 121); 2Ala-h-amilina (SEQ ID NO: 122); 2,7Ala-h-amilina (SEQ ID NO: 123); 1Ser-h-amilina (SEQ ID NO: 124); 29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 125); 25,28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 126); des-1Lys,25,28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 127); 23Leu,25Pro, 26Val,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 128); 23Leu25Pro26Val28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 129); des- 1Lys,23Leu,25Pro,26Val,28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 130); 18Arg,23Leu,25Pro,26Val,28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 131); 18Arg,23Leu, 25,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 132); 18Arg23Leu,25,28Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 133); 17Ile,23Leu,25,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 134); 17Ile,25,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 135); des- 1Lys,17Ile,23Leu,25,28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 136); 17Ile,18Arg,23Leu-h-amilina (SEQ ID NO: 137); 17Ile,18Arg,23Leu, 26Val,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 138); 17Ile,18Arg,23Leu, 25Pro, 26Val, 28,29Pro-h-amilina (SEQ ID NO: 139); 13Thr,21His,23Leu, 26Ala,28Leu,29Pro, 31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 140); 13Thr,21His,23Leu, 26Ala, 29Pro,31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 141); des- 1Lys,13Thr,21His,23Leu,26Ala, 28Pro,31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 142); 13Thr,18Arg,21His,23Leu,26Ala, 29Pro,31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 143); 13Thr,18Arg,21His,23Leu,28,29Pro, 31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 144); e 13Thr,18Arg,21His,23Leu,25Pro,26Ala, 28,29Pro, 31Asp-h-amilina (SEQ ID NO: 145).

[000136] Análogos de amilina incluem sequências de aminoácidos dos resíduos 1-37 de Fórmula (I) a seguir, em que até 25% dos aminoácidos apresentados na Fórmula (I) podem ser deletados ou substituídos por um aminoácido diferente:X’-Xaa1-Cys2-Asn3-Thr4-Ala5-Thr6-Cys7-Ala8-Thr9-Gln10-Arg11-Leu12- Ala13-Asn14-Phe15-Leu16-Val17-His18-Ser19-Ser20- Xaa21-Asn22-Phe23-Xaa24- Xaa25- Xaa26- Xaa27- Xaa28- Xaa29-Thr30- Xaa31-Val32-Gly33- Ser34-Asn35-Thr36-Tyr37-X (SEQ ID NO: 92) (I).

[000137] Na Fórmula (I), X' representa hidrogênio, um grupo "capping" N-terminal ou um ligante a uma porção de intensificação de duração. Xaa1é Lys ou uma ligação, Xaa21é Lys, Cys ou Asn, Xaa24é Lys, Cys ou Gly, Xaa25é Lys, Cys ou Pro, Xaa26é Lys, Cys ou Ile, Xaa27é Lys, Cys ou Leu, Xaa28é Lys, Cys ou Pro, Xaa29é Lys, Cys ou Pro e Xaa31é Lys, Cys ou Asn. Ainda com relação à Fórmula (I), a variável X representa uma funcionalidade C-terminal (por exemplo, um "cap" C-terminal). X é alquilamino substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, dialquilamino substituído ou não substituído, cicloalquilamino substituído ou não substituído, arilamino substituído ou não substituído, aralquilamino substituído ou não substituído, arilóxi substituído ou não substituído, aralquilóxi substituído ou não substituído ou hidroxila. Se o C-término do componente polipeptídico com a sequência de resíduos 1-37 de Fórmula (I) é "capped" com uma funcionalidade X, então X é, de preferência, amina, deste modo, formando uma amida C-terminal. Em algumas modalidades, mais de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou mesmo 50% dos aminoácidos de resíduos 1-37 de Fórmula (I) são deletados ou substituídos por um componente polipeptídico de acordo com a Fórmula (I). Em algumas modalidades, o componente análogo de amilina tem 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mesmo 16 substituições de aminoácidos em relação à sequência de aminoácido apresentada na Fórmula (I). Em algumas modalidades, o análogo de amilina tem uma sequência que tem uma identidade de sequência definida com relação aos resíduos 1-37 da sequência de aminoácido de acordo com a Fórmula (I). Em algumas modalidades, a identidade de sequência entre um análogo de amilina descrito aqui e os resíduos 1-37 de Fórmula (I) é de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mesmo maior. Em algumas modalidades, mais de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou mesmo menos dos aminoácidos previstos nos resíduos 137 de Fórmula (I) podem ser deletados ou substituídos por um aminoácido diferente. Em algumas modalidades, a identidade de sequência está dentro da faixa de 75%-100%. Em algumas modalidades, a identidade de sequência está dentro da faixa de 75%- 90%. Em algumas modalidades, a identidade de sequência está dentro da faixa de 80%-90%. Em algumas modalidades, a identidade de sequência é de pelo menos 75%. Em algumas modalidades, o análogo da amilina tem a sequência de resíduos 1-37 de Fórmula (I).

[000138] Em algumas modalidades, análogos de amilina, incluindo aqueles de fórmula (I), formam a base de um componente polipeptídico ao qual uma ou mais porções de intensificação de duração estão ligadas, opcionalmente através de um ligante, para formar um conjugado polipeptídico de amilina. Assim, o componente polipeptídico funciona como um modelo ("polipeptídeo modelo"), ao qual estão ligadas, de preferência através de ligação covalente, uma ou mais porções de intensificação de duração. Ligação da porção de intensificação de duração ao componente polipeptídico pode ser através de um ligante, conforme descrito aqui. Alternativamente, ligação da porção de intensificação de duração ao componente polipeptídico pode ser através de uma ligação covalente direta. A porção de intensificação de duração pode ser um polímero solúvel em água conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, uma pluralidade de porções de intensificação de duração são ligadas ao componente polipeptídico, caso no qual cada ligante a cada porção de intensificação de duração é independentemente selecionado dentre os ligantes descritos aqui.

[000139] Análogos de amilina úteis como componentes polipeptídicos descritos aqui incluem, porém sem limitações, os compostos apresentados em resíduos 1-37 de Fórmula (I) apresentados na Tabela 3 abaixo. Salvo indicação em contrário, todos os peptídeos descritos aqui, incluindo peptídeos tendo uma sequência expressamente indicada, são considerados nas formas de carboxilato livre e amidada.Tabela 1. Componentes polipeptídicos úteis nos compostos descritos aqui

[000140] Os termos "ligante" e similares, no contexto de ligação de porções de intensificação de duração a um componente polipeptídico em um conjugado polipeptídico de amilina descrito aqui, significa uma espécie bivalente (-L-) covalentemente ligada, por sua vez, a um componente polipeptídico tendo uma valência disponível para ligação a uma porção de intensificação de duração tendo uma valência disponível para a ligação. O local de ligação disponível sobre o componente polipeptídico é, convenientemente, um resíduo de cadeia lateral (por exemplo, lisina, cisteína, ácido aspártico e homólogos dos mesmos). Em algumas modalidades, o local de ligação disponível sobre o componente polipeptídico é a cadeia lateral de um resíduo de lisina ou cisteína. Em algumas modalidades, o local de ligação disponível sobre o componente polipeptídico é a amina N-terminal. Em algumas modalidades, o local de ligação disponível sobre o componente polipeptídico é a carboxila C-terminal. Em algumas modalidades, o local de ligação disponível sobre o componente polipeptídico é um átomo do esqueleto do mesmo. Conforme usado aqui, o termo "resíduo de aminoácido de ligação"significa um aminoácido dentro dos resíduos 1-37 de Fórmula (I) ao qual uma porção de intensificação de duração é ligado, opcionalmente através de um ligante.

[000141] Em algumas modalidades, são proporcionados compostos tendo um ligante que liga covalentemente um componente polipeptídico com uma porção de intensificação de duração. O ligante é opcional, isto é, qualquer ligante pode simplesmente ser uma ligação. Em algumas modalidades, o ligante é ligado em uma cadeia lateral do componente polipeptídico. Em algumas modalidades, o ligante é ligado a um átomo do componente polipeptídico.

[000142] Em outro aspecto, é proporcionado um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e um resíduo de aminoácido na posição 2 a 37 foi substituído por um resíduo de lisina ou resíduo de cisteína e em que o referido resíduo de lisina ou resíduo de cisteína é ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante, em que a numeração de aminoácido está de acordo com o número de aminoácidos em SEQ ID NO: 88.

[000143] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1 ) e em que um resíduo de aminoácido na posição de qualquer um de 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27, 5 28, 29, 30, 31, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado de um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000144] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1 ) e em que um resíduo de aminoácido em qualquer uma das posições 21, 24-29 ou 31 ésubstituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000145] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1 ) e em que um resíduo de aminoácido na posição 21 é 15 substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000146] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 24 é 20 substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000147] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1 ) e em que um resíduo de aminoácido na posição 25 é 25 substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000148] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 26 está substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000149] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 27 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000150] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 28 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000151] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 29 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000152] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um conjugado polipeptídico de amilina o qual é um derivado de pramlintida com SEQ ID NO: 88 ou um análogo do mesmo, em que o resíduo de aminoácido na posição 1 está ausente (isto é, des-Lys1) e em que um resíduo de aminoácido na posição 31 é substituído por um resíduo de lisina e em que o referido resíduo de lisina está ligado a um polímero de polietileno glicol, opcionalmente através de um ligante.

[000153] Em algumas modalidades, a porção de intensificação de duração é um polímero solúvel em água. Um "polímero solúvel em água"significa um polímero que é suficientemente solúvel em água sob condições fisiológicas, por exemplo, temperatura, concentração iônica e similares, conforme conhecido na técnica, para serem úteis nos métodos descritos aqui. Um polímero solúvel em água pode aumentar a solubilidade de um peptídeo ou outra biomolécula à qual tal polímero solúvel em água é preso. Na verdade, tal ligação foi proposta como um meio para melhorar a vida em circulação, solubilidade em água e/ou antigenicidade de proteínas administradas in vivo. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.179.337; Pedido U.S. Publicado N° 2008/0032408. Diversos polímeros solúveis em água e químicas de fixação têm sido usados para esta finalidade, tais como polietileno glicol, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carbóxi metil celulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e similares.

[000154] Em algumas modalidades, a porção de intensificação de duração ligada inclui um polietileno glicol. Polietileno glicol ("PEG") tem sido usado em esforços para obter polipeptídeos terapeuticamente utilizáveis. Vide, por exemplo, Zalipsky, S., 1995, BioconjugateChemistry, 6: 150-165; Mehvar, R., 2000, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3: 125-136. Conforme apreciado por aqueles versados na técnica, o esqueleto de PEG [(CH2CH2-O-)n, n: número de monômeros repetidos] é flexível e anfifílico. Sem pretender estar preso a qualquer teoria ou mecanismo de ação, acredita-se que a molécula ou porção PEG de cadeia longa é muito hidratada e está em movimento rápido quando em meio aquoso. Acredita-se que este movimento rápido faz com que o PEG abranja um grande volume e impeça a aproximação e a interferência de outras moléculas. Como um resultado, quando ligado à outra entidade química (tal como um peptídeo), as cadeias poliméricas do PEG podem proteger tal entidade química contra resposta imune e outros mecanismos de eliminação. Como um resultado, peguilação pode levar à eficácia e segurança aprimorada de fármaco por meio de otimização de farmacocinética, aumento de biodisponibilidade e redução de imunogenicidade e frequência de dosagem. "Peguilação"refere-se, no sentido habitual, à conjugação de uma porção PEG com um outro composto. Por exemplo, foi mostrado que ligação de PEG protege as proteínas contra proteólise. Vide, por exemplo, Blomhoff, H.K. et al., 1983, Biochim Biophys Acta, 757: 202208. A menos que expressamente indicado em contrário, os termos "PEG", "polímero de polietileno glicol" e similares referem-se a polímeros de polietileno glicol e derivados do mesmo, incluindo metóxi- PEG (mPEG).

[000155] Uma variedade de meios têm sido usados para ligar porções poliméricas, tais como PEG e polímeros relacionados, a grupos reativos encontrados sobre a proteína. Vide, por exemplo, Patente U.S. N° 4.179.337; Patente U.S. N° 4.002.531; Abuchowski et al., 1981, em "Enzymes as Drugs", J. S. Holcerberg e J. Roberts,(Eds.), páginas 367-383; Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6: 150-165. O uso de PEG e outros polímeros para modificar proteínas foi discutido. Vide, por exemplo, Cheng, T.-L. et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10: 520-528; Belcheva, N. et al.,1999, Bioconjugate Chem., 10: 932-937; Bettinger, T. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9: 842-846; Huang, S.-Y. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9: 612-617; Xu, B. et al., 1998, Langmuir, 13: 2447-2456; Schwarz, J. B. et al., 1999, J. Amer. Chem. Soc, 121: 2662-2673; Reuter, J. D. et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10: 271-278; Chan, T.-H. et al., 1997, J. Org. Chem., 62: 3500-3504. Locais de ligação típicos em proteínas incluem grupos amino primários, tais como aqueles sobre resíduos de lisina ou no N-término, grupos tiol, tais como aqueles sobre cadeias laterais de cisteína e grupos carboxila, tais como aqueles sobre resíduos de glutamato ou aspartato ou no C-término. Locais comuns de ligação são aos resíduos de açúcar de glicoproteínas, cisteínas ou ao N- término e lisinas do polipeptídeo alvo. Os termos "peguilado" e similares referem-se à ligação covalente de polietileno glicol a um polipeptídeo ou outra biomolécula, opcionalmente através de um ligante conforme descrito aqui e/ou conforme conhecido na técnica.

[000156] Em algumas modalidades, uma porção PEG em umconjugado polipeptídico de amilina descrito aqui tem um peso molecular nominal dentro de uma faixa especificada. Conforme habitual na técnica, o tamanho de uma porção PEG é indicado por referência ao peso molecular nominal, tipicamente fornecido em kilodaltons (kD). O peso molecular é calculado através de uma variedade de modos conhecidos na técnica, incluindo número, peso, viscosidade e peso molecular médio "Z". Deverá ser entendido que polímeros, tais como PEG e similares, existem como uma distribuição de pesos moleculares de um valor nominal médio.

[000157] Exemplificativo da terminologia para o peso molecular de PEGs, o termo "mPEG40KD" refere-se a um polímero de metóxi polietileno glicol tendo um peso molecular nominal de 40 kilodaltons. Referência a PEGs de outros pesos moleculares seguem esta convenção. Em algumas modalidades, a porção PEG tem um peso molecular nominal na faixa de 10-100 KD, 20-80 KD, KD 20-60 ou 2040 KD. Em algumas modalidades, a porção PEG tem um peso molecular nominal de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou mesmo 100 KD. De preferência, a porção PEG tem um peso molecular de 20, 25, 30, 40, 60 ou 80 KD.

[000158] Moléculas de PEG úteis para derivatização de polipeptídeos são, em geral, classificadas em classes de PEG linear, ramificado e Warwick (isto é, PolyPEG®), conforme conhecido na técnica. A menos que expressamente indicado em contrário, as porções PEG descritas aqui são PEGs lineares. Além disso, os termos "com dois braços ramificados", "formatado em Y" e similares referem- se à porções PEG ramificado, conforme conhecidos na técnica. O termo "Warwick", no contexto de PEGs, também conhecido como PEGs "pente" ou "tipo pente", refere-se a uma variedade de PEGs com múltiplos braços presos a um esqueleto, tipicamente poli(metacrilato), conforme conhecido na técnica. Com relação à nomenclatura, incluindo convenções empregadas na tabela proporcionada aqui, salvo indicação em contrário, uma porção PEG está presa ao esqueleto do peptídeo. Por exemplo, Cmpd 19 é o resultado da conjugação de mPEG40KD ao nitrogênioo N-terminal de Cmpd 1. Similarmente, Cmpd 20 é o resultado da conjugação de mPEG40KD ao nitrogênio N-terminal de Cmpd 2. Abreviaturas padrões de uma única letra para os aminoácidos podem ser usadas, assim como abreviaturas padrões de três letras. Por exemplo, Cmpd 24 é um análogo de Cmpd 10, em que o resíduo na posição 26 do Cmpd 19 é substituído por lisina e a funcionalidade amina pendente da lisina 26 (isto é, K26) é conjugada com uma porção PEG40KD. Compostos exemplificativos são fornecidos na Tabela 2 abaixo.Tabela 2. Compostos peguilados

Formulacoes

[000159] Os compostos farmacêuticos da invenção podem ser formulados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais, tal como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Vide também Wang et al. (1988) J. of Parenteral Sci. and Tech.,Relatório Técnico N° 10, Sup. 42: 2S.

[000160] Em geral, os polipeptídeos quiméricos podem ser formulados em uma composição farmacêutica estável, segura para administração a um paciente. Formulações farmacêuticas consideradas para uso nos métodos da invenção podem compreender cerca de 0,01 a 1,0% (peso/v), em determinados casos 0,05 a 1,0% do polipeptídeo quimérico, cerca de 0,02 a 0,5% (peso/v) de um tampão de acetato, fosfato, citrato ou glutamato, o qual permite que um pH da composição final entre cerca de 3,0 e cerca de 7,0%, aproximadamente 1,0 a 10% (peso/v) de um agente de tonificação de carboidrato ou álcool poliídrico e, opcionalmente, aproximadamente 0,005 a 1,0% (peso/v) de um conservante selecionado do grupo que consiste em m-cresol, álcool benzílico, metil, etil, propil e butil parabenos e fenol. Tal um conservante é, em geral, incluído se o peptídeo formulado deve ser incluído em um produto de uso múltiplo.

[000161] Em modalidades particulares, uma formulação farmacêutica dos presentes polipeptídeos quiméricos pode conter uma faixa de concentrações de composto(s), por exemplo, entre cerca de 0,01% a cerca de 98% peso/peso ou entre cerca de 1 a cerca 98% peso/peso ou, de preferência, entre 80% e 90% peso/peso ou, de preferência, entre cerca de 0,01% a cerca de 50% peso/peso ou, mais preferivelmente, entre cerca de 10% a cerca de 25% peso/peso nestas modalidades. Uma quantidade suficiente de água para injeção pode ser usada para obter a concentração de solução desejada.

[000162] Agentes tonificantes adicionais, tal como cloreto de sódio, bem como outros excipientes conhecidos, podem também estar presentes, se desejado. Em alguns casos, tais excipientes são úteis em manutenção da tonicidade global do composto. Um excipiente pode ser incluído nas formulações presentemente descritas em várias concentrações. Por exemplo, um excipiente pode ser incluído na faixa de concentração de cerca de 0,02% a cerca de 20% peso/peso, de preferência entre cerca de 0,02% e 0,5% peso/peso, de cerca de 0,02% a cerca de 10% peso/peso ou cerca de 1% a cerca de 20% peso/peso. Além disso, similar às presentes formulações em si, um excipiente pode ser incluído na forma sólida (incluindo em pó), líquida, semi-sólida ou gel.

[000163] As formulações farmacêuticas podem ser compostas em várias formas, por exemplo, sólido, líquido, semi-sólidos ou líquidos. O termo "sólido", conforme usado aqui, se destina a abranger todos os usos normais deste termo incluindo, por exemplo, pós e formulações liofilizadas. As formulações presentemente descritas podem ser liofilizadas.

[000164] Os termos tampão, solução tampão e solução tamponada, quando usados com referência à concentração de íons de hidrogênio ou pH, referem-se à capacidade de um sistema, em particular uma solução aquosa, de resistir a uma alteração de pH quando de adição de ácido ou álcali ou quando de diluição com um solvente. Característica de soluções tamponadas, as quais sofrem pequenas alterações de pH quando de adição de ácido ou base, é a presença de um ácido fraco e um sal do ácido fraco ou uma base fraca e um sal da base fraca. Um exemplo do anterior sistema é ácido acético e acetato de sódio. A alteração de pH é pequena, contanto que a quantidade de íons de hidrogênio ou íons de hidroxila adicionados não exceda a capacidade do sistema tampão de neutralizá-los.

[000165] Conforme descrito aqui, uma variedade de veículos líquidos são adequados para uso nas formulações de polipeptídeos quiméricos, por exemplo, água ou uma mistura ou suspensão de solvente aquoso/orgânico.

[000166] A estabilidade de uma formulação de polipeptídeo quimérico para uso conforme descrito aqui é aumentada mantendo o pH da formulação em uma faixa determinada por meio de métodos conhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, o pH da formulação é mantido na faixa de cerca de 3,5 a 5,0 ou cerca de 3,5 a 6,5, em algumas modalidades, de cerca de 3,7 a 4,3 ou cerca de 3,8 a 4,2. Em algumas modalidades, o pH pode ser de cerca de 4,0, cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 8,0, cerca de 9,0 ou mesmo maior. Em algumas modalidades, o pH pode estar na faixa fisiológica, pH de 6-8, de preferência pH de 7-7,6.

[000167] Em determinadas modalidades, o tampão com o polipeptídeo quimérico é um tampão de acetato (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 1 -5 a cerca de 60 mM), tampão de fosfato (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 1-5 a cerca de cerca de 30 mM) ou tampão de glutamato (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 1-5 a cerca de 60 mM). Em algumas modalidades, o tampão é acetato de etila (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 5 a cerca de 30 mM).

[000168] Um estabilizante pode ser incluído nas formulações, mas não é necessariamente requerido. Se incluído, no entanto, um estabilizante útil na prática da presente invenção é um carboidrato ou um álcool poliídrico. Um estabilizante adequado útil na prática da presente invenção é aproximadamente 1,0 a 10% (peso/v) de um álcool poliídrico ou carboidrato. Os álcoois poliídricos e carboidratos compartilham a mesma característica em seus esqueletos, isto é, - CHOH-CHOH-, a qual é responsável pela estabilização das proteínas. Os álcoois poliídricos incluem compostos tais como sorbitol, glicerol, manitol e polietileno glicóis (PEG). Estes compostos são moléculas de cadeia linear. Os carboidratos, tais como manose, ribose, sucrose, frutose, trealose, maltose, inositol, lactose e, por outro lado, são moléculas cíclicas que podem conter um grupo ceto ou aldeído. Foi demonstrado que estas duas classes de compostos são eficazes em estabilização da proteína contra desnaturação causada pela temperatura elevada e por processos de congelamento- descongelamento ou processos de liofilização. Carboidratos adequados incluem: galactose, arabinose, lactose ou qualquer outro carboidrato o qual não tem um efeito adverso sobre um paciente diabético, isto é, o carboidrato não é metabolizado para formar concentrações inaceitavelmente grandes de glicose no sangue. Tais carboidratos são bem conhecidos na técnica como sendo adequados para diabéticos. Sacarose e frutose são adequados para uso com o composto em aplicações não diabéticas (por exemplo, tratamento de obesidade).

[000169] Em determinadas modalidades, se um estabilizante é incluído, o composto é estabilizado com um álcool poliídrico, tal como sorbitol, manitol, glicerol, inositol, xilitol e copolímero de polipropileno/etileno glicol, bem como polietilenos glicóis (PEG) de vários pesos moleculares - 200, 400, 1450, 3350, 4000, 6000, 8000 e mesmo maior). Manitol é o álcool poliídrico preferido em algumas modalidades. Outra característica útil das formulações liofilizadas da presente invenção é a manutenção da tonicidade das formulações liofilizadas descritas aqui com o mesmo componente de formulação que serve para manter a sua estabilidade. Em algumas modalidades, manitol é o álcool poliídrico preferido usado para esta finalidade.

[000170] A Farmacopeia dos Estados Unidos (United States Pharmacopeia - USP) afirma que agentes anti-microbianos, em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas, devem ser adicionados a preparados contidos em recipientes com doses múltiplas. Eles devem estar presentes em uma concentração adequada no momento de uso para evitar a multiplicação de microorganismos inadvertidamente introduzidos no preparado enquanto se extrai uma porção dos conteúdos com uma agulha hipodérmica e seringa ou usando outros meios invasivos para distribuição, tais como canetas injetoras. Agentes antimicrobianos deverão ser avaliados para garantir compatibilidade com todos os outros componentes da fórmula e sua atividade deverá ser avaliada na fórmula total para assegurar que um agente em particular que é eficaz em uma formulação não seja ineficaz em outra. Não é raro descobrir que um agente antimicrobiano em particular será eficaz em uma formulação, mas não em outra formulação.

[000171] Um conservante é, no sentido farmacêutico comum, uma substância que inibe ou previne o crescimento microbiano e pode ser adicionado a preparados farmacêuticos para esta finalidade para evitar consequente deterioração da formulação por micro-organismos. Embora a quantidade de conservante não seja grande, ela pode, no entanto, afetar a estabilidade geral do peptídeo.

[000172] Embora o conservante para uso nas composições farmacêuticas possam variar de 0,005-1,0% (peso/v), em algumas modalidades, a faixa para cada conservante, isoladamente ou em combinação com outros, é: álcool benzílico (0,1-1,0%) ou m-cresol (0,1-0,6%) ou fenol ( 0,1-0,8%) ou uma combinação de metil (0,050,25%) e etil ou propil ou butil (0,005%-0,03%) parabenos. Os parabenos são alquil ésteres de ácido para-hidróxi-benzóico. Uma descrição detalhada de cada conservante é apresentada em Remington's Pharmaceutical Sciences (Id.)

[000173] Os polipeptídeos quiméricos podem não ter uma tendência de adsorver sobre o vidro em um recipiente de vidro quando em uma forma líquida, portanto, um agente tensoativo pode não ser requerido para estabilizar adicionalmente a formulação farmacêutica. No entanto, no que diz respeito a compostos que têm tal tendência quando na forma líquida, um agente tensoativo deverá ser usado em sua formulação. Estas formulações podem ser, em seguida, liofilizadas. Tensoativos frequentemente causam desnaturação da proteína, por meio de ruptura hidrofóbica e separação de ponte de sal. Concentrações relativamente baixas de tensoativo podem exercer uma atividade de desnaturação potente em virtude das fortes interações entre porções de tensoativo e os sítios reativos sobre proteínas. No entanto, o uso criterioso desta interação pode estabilizar proteínas contra desnaturação interfacial ou superficial. Tensoativos os quais poderiam estabilizar adicionalmente o polipeptídeo quimérico podem, opcionalmente, estar presentes na faixa de cerca de 0,001 a 0,3% (peso/v) da formulação total e incluem polisorbato 80 (isto é, monooleato de polioxietileno (20) sorbitan), CHAPS® (isto é, 3-[(3- colamidopropil)dimetilamônio]-1-propano-sulfonato), Brij® (porexemplo, Brij® 35, o qual é (lauril éter de polioxietileno (23)), poloxâmero ou outro agente tensoativo não iônico.

[000174] Também, pode ser desejável adicionar cloreto de sódio ou outro sal para ajustar a tonicidade da composição farmacêutica, de acordo com o agente tonificante selecionado. No entanto, isto é opcional e depende da formulação selecionada em particular. Formulações parenterais podem, de preferência, ser isotônicas ou substancialmente isotônicas.

[000175] Um veículo preferido para produtos parenterais é água. Água de qualidade adequada para administração parenteral pode ser preparada quer por meio de destilação ou por osmose inversa. Água para injeção é o veículo aquoso preferido para uso em formulações farmacêuticas.

[000176] É possível que outros componentes possam estar presentes nas formulações farmacêuticas. Tais ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, umectantes, emulsificantes, lubrificantes, antioxidantes, agentes de composição de volume, modificadores de tonicidade, agentes de quelação, íons de metal, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina sérica humano, gelatina ou proteínas) e um zwiteríon (por exemplo, um aminoácido, tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Adicionalmente, soluções poliméricas ou misturas com polímeros proporcionam a oportunidade de liberação controlada do peptídeo. Tais ingredientes adicionais, naturalmente, não deverão afetar negativamente a estabilidade global da formulação farmacêutica da presente invenção.

[000177] Recipientes são também parte integral da formulação de uma injeção e podem ser considerados um componente, pois não há recipiente que seja totalmente inerte ou não afete de algum modo o líquido que ele contém, em particular se o líquido é aquoso. Portanto, a seleção de um recipiente para uma injeção em particular deverá ser com base em uma consideração da composição do recipiente, bem como da solução e o tratamento ao qual ela será submetida. Adsorção do peptídeo à superfície de vidro do frasco também pode ser minimizada, se necessário, mediante uso de vidro de boro-silicato, por exemplo, vidro de boro-silicato Wheaton Tipo 1 # 33 (Wheaton Tipo 133) ou seu equivalente (Wheaton Glass Co.). Outros fornecedores de frascos de vidro de boro-silicato similares e cartuchos aceitáveis para fabricação incluem Kimbel Glass Co., West Co., Bunder Glas GMBH e Form a Vitrum. As propriedades biológicas e químicas do composto podem ser estabilizadas por formulação e liofilização em um de frasco de soro de boro-silicato Wheaton Tipo 1-33 para uma final concentração de 0,1 mg/ml e 10 mg/ml do composto na presença de manitol a 5% e Tween 80 a 0,02%.

[000178] Para as formulações a serem distribuídas por meio de injeção, de forma a permitir introdução de uma agulha de uma seringa hipodérmica em um frasco com múltiplas doses e permitir re- fechamento, logo que a agulha é retirada, a extremidade aberta de cada um dos frascos é, de preferência, vedada com uma rolha de borracha mantida no lugar por uma tira de alumínio.

[000179] Rolhas para frascos de vidro, tais como West 4416/50, 4416/50 (revestida de Teflon) e 4406/40, Abbott 5139ou qualquer rolha equivalente podem ser usadas como a vedação para produtos farmacêuticos para injeção. Para formulações que compreendem agentes anti-obesidade peptídicos, estas rolhas são compatíveis com o peptídeo, bem como os outros componentes da formulação. Os inventores também descobriram que estas rolhas passam no teste de integridade de rolha quando testadas usando padrões de uso pelo paciente, por exemplo, a rolha pode suportar pelo menos cerca de 100 injeções. Alternativamente, o peptídeo pode ser liofilizado para frascos, seringas ou cartuchos para subsequente reconstituição. Formulações líquidas da presente invenção podem ser enchidas em um ou dois cartuchos com septo ou uma ou duas seringas com câmara.

[000180] Cada um dos componentes da formulação farmacêutica descrita acima é conhecido na técnica e é descrito em Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, vol. 1, 2aed., Avis et al. Ed., Mercel Dekker, New York, NY 1992, o qual é incorporado por referência na íntegra aqui e para todos os efeitos.

[000181] O processo de fabricação das formulações líquidas acima envolve, em geral, etapas de composição, filtração estéril e envasamento. O procedimento de composição envolve dissolução de de ingredientes em uma ordem específica (conservante seguido por estabilizante/agentes de tonicidade, tampões e peptídeo) ou dissolução ao mesmo tempo.

[000182] Formulações alternativas, por exemplo, não parenterais, pode não requerer esterilização. No entanto, se esterilização é desejada ou necessária, qualquer processo de esterilização adequado pode ser usado no desenvolvimento da formulação farmacêutica peptídica da presente invenção. Processos de esterilização por filtração típicos incluem vapor (calor úmido), calor seco, gases (por exemplo, óxido de etileno, formaldeído, dióxido de cloro, óxido de propileno, beta-propiolactona, ozônio, cloropicrina, brometo de metila, ácido peracético e similares), exposição a uma fonte de radiação e manipulação asséptica. Filtração é o método preferido de esterilização para formulações líquidas da presente invenção. A filtração estéril envolve filtros de 0,45 μm e 0,22 μm (1 ou 2) os quais podem ser ligados em série. Após filtração, a solução é vertida em ampolas ou outros recipientes adequados.

[000183] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos quiméricos descritos aqui são administrados perifericamente aos indivíduos. Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas líquidas da presente invenção são para administração parenteral. Vias de administração adequadas incluem administração intramuscular, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intra-articular, intratecal e similares. Em algumas modalidades, a via de administração subcutânea é preferida. Em determinadas modalidades, distribuição mucosal também é preferida. Estas vias incluem, porém sem limitações, vias oral, nasal, sub-lingual, bucal e pulmonar, as quais podem incluir administração do peptídeo na forma líquida, semi-sólida ou sólida. Para formulações que compreendem os polipeptídeos quiméricos, administração através destas vias pode requerer substancialmente mais composto para obtenção dos efeitos biológicos desejados em virtude de diminuição da biodisponibilidade comparado com distribuição parenteral. Além disso, distribuição parenteral com liberação controlada pode ser obtida mediante formação de microcápsulas poliméricas, matrizes, soluções, implantes e dispositivos e administração dos mesmos parenteralmente ou através de meios cirúrgicos. Exemplos de formulações com liberação controlada são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.368.630, 6.379.704 e 5.766.627, as quais são aqui incorporadas por referência. Estas formas de dosagem podem ter uma menor biodisponibilidade em virtude de retenção de uma parte do peptídeo na matriz polimérica ou dispositivo. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos 6.379.704, 6.379.703 e 6.296.842, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na íntegra e para todos os efeitos.

[000184] Os compostos podem ser fornecidos na forma de unidade de dosagem contendo uma quantidade de polipeptídeo quimérico que será eficaz em uma ou múltiplas doses.

[000185] Conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica, uma quantidade eficaz do polipeptídeo quimérico variará de acordo com muitos fatores, incluindo a idade e peso do indivíduo, a condição física do indivíduo, a condição a ser tratada e outros fatores conhecidos na técnica. Uma quantidade efetiva dos polipeptídeos quiméricos também variará com a combinação administrada em particular. Conforme descrito aqui, a administração dos polipeptídeos quiméricos em combinação pode permitir uma diminuição da quantidade de qualquer um dos polipeptídeos modificados a serem administrados em uma quantidade eficaz.

Dosagens Eficazes

[000186] Composições farmacêuticas proporcionadas na presente invenção incluem composições em que o ingrediente ativo está contido em uma quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, em uma quantidade eficaz para alcançar sua finalidade pretendida. A quantidade eficaz real para uma aplicação em particular dependerá, inter alia, da condição a ser tratada. Por exemplo, quando administradas em métodos para tratamento de diabetes, tais composições conterão uma quantidade de ingrediente ativo eficaz para atingir o resultado desejado (por exemplo, diminuição da glicose no sangue em jejum de um indivíduo). Quando administradas em métodos para tratar obesidade, tais composições conterão uma quantidade de ingrediente ativo eficaz para atingir o resultado desejado (por exemplo, redução de massa corporal).

[000187] A dosagem e frequência (dose únicas ou múltiplas) do composto administrado podem variar, dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a via de administração, tamanho, idade, sexo, saúde, peso corporal, índice de massa corporal e dieta do recipiente, a natureza e extensão dos sintomas da doença a ser tratada (por exemplo, a doença responde aos compostos descritos aqui), presença de outras doenças ou outros problemas relacionados com a saúde; tipo de tratamento concomitante e complicações a partir de qualquer doença ou regime de tratamento. Outros regimes ou agentes terapêuticos podem ser usados em conjunto com os métodos e compostos da invenção.

[000188] Quantidades terapeuticamente eficazes para uso em seres humanos podem ser determinadas a partir de modelos animais. Por exemplo, uma dose para seres humanos pode ser formulada para obter uma concentração que se descobriu ser eficaz em animais. A dosagem em seres humanos pode ser ajustada monitorando um ou mais parâmetros fisiológicos incluindo, porém sem limitações, o açúcar no sangue e massa corporal, e ajustando as dosagens para cima ou para baixo, conforme descrito acima e conhecido na técnica.

[000189] As dosagens podem ser variadas, dependendo dos requisitos do paciente e do composto que está sendo empregado. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deverá ser suficiente para obter uma resposta terapêutica benéfica no paciente com o tempo. O tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos. Em geral, o tratamento é iniciado com dosagens menores, as quais são menos do que a dose ótima do composto. Após o que, a dosagem é aumentada em pequenos incrementos até que o efeito ótimo sob as circunstâncias seja atingido. Em uma modalidade da invenção, a faixa de dosagem é de 0,001% a 10% peso/v. Em outra modalidade, a faixa de dosagem é de 0,1% a 5% peso/v.

[000190] No entanto, doses típicas podem conter de um limite mínimo de cerca de 0,1 mg a um limite máximo de cerca de 200 mg do composto farmacêutico por dia. Também considerados estão outras faixas de dose, tal como de 1 mg a 100 mg do composto por dose e de 3 mg a 70 mg por dose. Tipicamente, a dose de polipeptídeos quiméricos com longa duração de ação é administrada, por exemplo, diariamente ou mesmo uma vez por semana. As doses diárias podem ser distribuídas em doses unitárias distintas, fornecidas de forma contínua durante um período de 24 horas ou qualquer porção destas 24 horas.

[000191] Quantidades e intervalos de dosagem podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis do composto administrado eficazes para a indicação clínica a ser tratada em particular. Isto irá proporcionar um regime terapêutico que é compatível com a gravidade do estado doentio do indivíduo.

[000192] Utilizando os ensinamentos fornecidos aqui, um regime de tratamento profilático ou terapêutico eficaz pode ser concebido, o qual não causa toxicidade substancial e ainda é inteiramente eficaz para tratar os sintomas clínicos demonstrados pelo paciente em particular. Esse planejamento deverá envolver a escolha cuidadosa do composto ativo ao considerar fatores tais como potência do composto, biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente, a presença e severidade de efeitos colaterais adversos, o modo preferido de administração e o perfil de toxicidade do agente selecionado.

Toxicidade

[000193] A relação entre a toxicidade e o efeito terapêutico para um composto em particular é seu índice terapêutico e pode ser expresso como a proporção entre a LD50 (a quantidade de composto letal em 50% da população) e a ED50 (a quantidade de composto eficaz em 50% da população). Compostos que exibem índices terapêuticos elevados são preferidos. Dados de índices terapêuticos obtidos a partir de ensaios de cultura de células e/ou estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos reside, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações plasmáticas que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada. Vide, por exemplo, Fingi et al., em: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capítulo 1, p. 1, 1975. Aformulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual tendo em vista a condição do paciente e o método no qual o composto é usado em particular.

Exemplos Exemplo 1: Recuperação de polipeptídeo quimérico

[000194] Sequências de proteína foram concebidos e traduzidas novamente usando um software comercial para sequência de DNA para clonagem em um vetor de expressão de E. coli. As sequências foram obtidas como oligonucleotídeos e ligadas juntas usando técnicas de amplificação por PCR padrões ou foram digeridas a partir de construtos de expressão existentes usando enzimas de restrição padrões e, então, ligadas novamente juntas. Sequências que expressam a proteína de interesse foram colocadas em pET45 com um promotor T7 para expressão induzível. Após os construtos serem verificados através de sequenciamento, o DNA de vetor foi purificado e transformado em um hospedeiro de expressão, tipicamente BL21 (DE3). Uma única colônia foi selecionada para crescimento de uma cultura inicial em 4 ml de meio LB durante ~ 6 horas. Estoques de glicerol foram preparados mediante a adição de 100 μl de glicerol a 80% a 900 μl do estoque e armazenados a -80 °C. Opcionalmente, 500 μl de amostra não induzida foram retidos para análise em gel. Uma cultura de 60 ml (meio Magic) foi inoculada com 60 μl de cultura inicial em um frasco Thompson de 125ml e incubada @ 30 °C durante a noite. Remover 250 μl de amostra para análise. Centrifugar e congelar a pelota de células para posterior processamento.

[000195] Células bacterianas foram coletadas e subsequentemente submetidas à lise para isolar corpos de inclusão. Uma vez que a proteína estava presente nos corpos de inclusão, estas foram solubilizadas e a proteína redobrada a 4 °C. As proteínas foram, então, separadas usando cromatografia por exclusão de tamanho até que apenas uma única banda restasse e os níveis de endotoxina fossem aceitáveis para testagem in vivo. HPLC analítica, RP-LC-MS e gel de SDS-PAGE foram realizados como medidas de controle de qualidade sobre a proteína final. Proteína foi distribuída em alíquotas predeterminadas e armazenada a -80 °C.

Exemplo 2: Propriedades biológicas e farmacêuticas

[000196] Conforme apresentado na Tabela 3 a seguir, polipeptídeos quiméricos descritos aqui têm propriedades comparáveis e alguns mesmo superiores comparado com A100 (Composto 37, SEQ ID NO: 24). Estas propriedades incluem propriedades biológicas, tais como atividade de ligação de leptina, atividade funcional de leptina e ingestão de alimentos em ratos e propriedades farmacêuticas, tal como solubilidade em pH neutro.

[000197] Ensaios exemplificativos quanto à atividade de ligação de leptina e atividade funcional de leptina foram previamente descritos.

[000198] A atividade ingestão de alimentos em camundongos foi testada com o seguinte ensaio: camundongos fêmeas C57BL6 e seus alimentos foram pesados diariamente 3 horas antes de apagar as luzes. Imediatamente após pesagem, nos dias 0, 1, 2 e 3, os camundongos foram injetados SC com o composto de leptina ou mutante em 1xPBS. Os pontos representam médias ± SD de n = 9 gaiolas (três camundongos/gaiola). Os resultados, reportados em "Consumo de Alimento pelo Camundongo" na Tabela 3, correspondem à alteração %, corrigida para o veículo, no peso corporal medida após o Dia 4.

[000199] A solubilidade foi medida com o seguinte ensaio: proteínas foram concentradas a 4 °C, centrifugadas para remover osprecipitados, em seguida, deixadas equilibrar em temperatura ambiente durante a noite. Elas foram filtradas para remover osprecipitados e, em seguida, a concentração foi determinada medindose a absorbância a OD280 e usando o coeficiente de extinção molar teórico.Tabela 3. Propriedades biológicas e farmacêuticas de polipeptídeos quiméricos

*Estes números não representam necessariamente a solubilidade máxima de cada composto.

Exemplo 3: Estabilidade de polipeptídeos quiméricos

[000200] Conforme apresentado na Tabela 4 a seguir, os polipeptídeos quiméricos descritos aqui têm estabilidade física comparável e alguns mesmo superior comparado com A100 (Composto 37, SEQ ID NO: 24). Os compostos foram formulados no tampão a seguir: ácido glutâmico a 10 mM, glicina a 2%, sacarose a 1%, Tween 20 a 0,01%, pH de 4,25 e armazenados a 37 °C. As amostras foram coletadas a T = 0, 2, 5, 7 e 14 dias e testadas por meio de análise visual, cromatografia de líquido de alta desempenho (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) de fase reversa, espectrometria de UV e dispersão dinâmica de luz (Dynamic Light Scattering - DLS). Conforme mostrado na Tabela 4, os polipeptídeos quiméricos têm pureza e potência comparáveis ou superiores, comparado com o Composto 37.Tabela 4. Estabilidade de polipeptídeos quiméricos

*potência normalizada para UV relativa no T = 0 **pureza normalizada por RP-HPLC relativa no T = 0 ***potência por UV - pureza por LC (solúveis totais - graus solúveis)

Exemplo 4: Alteração no peso corporal apósadministração diária de polipeptídeo quimérico.

[000201] Método. Camundongos fêmeas C57BL6e seus alimentosforam pesados diariamente 3 horas antes de apagar as luzes. Imediatamente após pesagem, nos dias 0, 1, 2 e 3, os camundongos foram injetados SC com composto de leptina ou mutante em 1xPBS. Os pontos representam a média ± SD de n = 4 gaiolas (3camundongos/gaiola). Cada grupo (n = 12/grupo) foi designado para receber um dos seguintes: veículo; Cmpd 41 a 0,1 mg/kg; Cmpd 41 a 0,3 mg/kg; Cmpd 41 a 1 mg/kg; Cmpd 41 a 3 mg/kg; Cmpd 41 a 5 mg/kg; Cmpd 41 a 10 mg/kg. A ingestão de alimentos e alteração de peso corporal (% corrigido para veículo) foram monitorados durante 4 dias e os resultados registrados conforme ilustrado (Figuras 1A e 1B). Os pontos representam a média ± SD de n = 4 gaiolas (3 camundongos/gaiola). Compostos administrados: Veículo (círculo sólido); Cmpd 41 a 0,1 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo); Cmpd 41 a 0,3 mg/kg (diamantes vazios); Cmpd 41 a 1 mg/kg (círculos vazios); Cmpd 41 a 3 mg/kg (triângulo com a ponta para acima); Cmpd 41 a 5 mg/kg (estrela); Cmpd 41 a 10 mg/kg (diamante sólido).

[000202] Resultados. Conforme ilustrado nas Figuras 1A e 1B, administração de doses diferentes do polipeptídeo quimérico resultou em ingestão de alimentos e peso corporal reduzidos em relação ao grupo que recebeu apenas veículo. Uma dose-resposta é observada na Figura 1C.

Exemplo 5: Alteração no peso corporal apósadministração diária de polipeptídeo quimérico.

[000203] Método. Camundongos fêmeas C57BL6e seus alimentos foram pesados diariamente 3 horas antes de apagar as luzes. Imediatamente após pesagem, nos dias 0, 1, 2 e 3, os camundongos foram injetados SC com composto de leptina ou mutante em 1xPBS. Os pontos representam a média ± SD de n = 4 gaiolas (3camundongos/gaiola). Cada grupo (n = 12/grupo) foi designado para receber um dos seguintes: veículo; Cmpd 42 a 0,1 mg/kg; Cmpd 42 a 0,3 mg/kg; Cmpd 42 a 1 mg/kg; Cmpd 42 a 3 mg/kg; Cmpd 42 a 5 mg/kg; Cmpd 42 a 10 mg/kg. A ingestão de alimentos e alteração de peso corporal (% corrigido para veículo) foram monitorados durante 4 dias e os resultados registrados conforme ilustrado (Figuras 2A e 2B). Os pontos representam a média ± SD de n = 4 gaiolas (3 camundongos/gaiola). Compostos administrados: Veículo (círculo sólido); Cmpd 42 a 0,1 mg/kg (triângulo com a ponta para cima); Cmpd 42 a 0,3 mg/kg (triângulo para a ponta para baixo); Cmpd 42 a 1 mg/kg (quadrado sólido); Cmpd 42 a 3 mg/kg (barra em cima e ponto embaixo); Cmpd 42 a 5 mg/kg (estrela); Cmpd 42 a 10 mg/kg (barra acima do ponto).

[000204] Resultados. Conforme representado nas Figuras 2A e 2B, administração de doses diferentes do polipeptídeo quimérico resultou em ingestão de alimentos e peso corporal reduzidos em relação ao grupo que recebeu apenas veículo. Uma dose-resposta é observada na Figura 2C.

[000205] Conforme mostrado na Tabela 5 abaixo, as dose-respostas medidas para os polipeptídeos quiméricos da invenção são comparáveis com as dose-respostas medidas para leptina de foca (Cmpd 38) e leptina humana (Cmpd 37) a partir das quais os polipeptídeos quiméricos são derivados.Tabela 5. Dose-respostas de polipeptídeos quiméricos

VIII. Modalidades

[000206] Seguem Modalidades adicionais dos polipeptídeos quiméricos, método de uso dos mesmos e composições farmacêuticas descritas aqui:

[000207] Modalidade 1. Um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo de leptina de foca do tipo silvestre em que pelo menos uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre tenha sido substituída por uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina humana madura.

[000208] Modalidade 2. O polipeptídeo quimérico de acordo com a Modalidade 1, em que duas ou mais regiões contíguas de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre tenham sido substituídas em cada região por uma região contígua de 1-30 aminoácidos de uma sequência de leptina humana madura.

[000209] Modalidade 3. O polipeptídeo quimérico de acordo com a Modalidade 1 ou 2, em que uma sequência de leptina de foca do tipo silvestre compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 28 ou SEQ ID NO: 31.

[000210] Modalidade 4. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-3, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51.

[000211] Modalidade 5. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-4, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição onde divergência é observada em uma posição correspondente em uma leptina de outra espécie.

[000212] Modalidade 6. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-5, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos duas substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000213] Modalidade 7. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-6, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos três substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000214] Modalidade 8. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-7, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos quatro substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000215] Modalidade 9. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-8, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos cinco substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000216] Modalidade 10. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-9, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos seis substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000217] Modalidade 11. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-10, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos sete substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000218] Modalidade 12. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-11, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos oito substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000219] Modalidade 13. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-12, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos nove substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000220] Modalidade 14. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-13, em que uma sequência de leptina humana madura compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 51, em que a sequência de leptina humana madura tem pelo menos dez substituições de aminoácido em posições onde divergência é observada em posições correspondentes em uma leptina de outra espécie.

[000221] Modalidade 15. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-14, em que a sequência de leptina humana madura compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24.

[000222] Modalidade 16. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-15, em que o polipeptídeo quimérico compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, ID NO:81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 85.

[000223] Modalidade 17. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-16, em que o polipeptídeo quimérico compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33.

[000224] Modalidade 18. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-17, em que o polipeptídeo quimérico compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33.

[000225] Modalidade 19. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-18, em que o polipeptídeo quimérico compreende uma sequência de aminoácido com pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33.

[000226] Modalidade 20. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-19, em que o polipeptídeo quimérico compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, ID NO:81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 e SEQ ID NO: 85.

[000227] Modalidade 21. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-20, em que o polipeptídeo quimérico compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33.

[000228] Modalidade 22. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-21, em que o polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29.

[000229] Modalidade 23. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-21, em que o polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30.

[000230] Modalidade 24. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-21, em que o polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 32.

[000231] Modalidade 25. O polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-21, em que o polipeptídeo quimérico compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33.

[000232] Modalidade 26. Um método para tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo compreendendo administração de um polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 25 a um indivíduo que precisa do mesmo em uma quantidade efetiva para tratar a referida doença ou distúrbio.

[000233] Modalidade 27. O método de acordo com a Modalidade 26, em que a doença ou distúrbio é disease ou disorder é selecionada do grupo que consiste em: lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, peso excessivo, obesidade, amenorreia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso, diabetes (incluindo tipo I e tipo II), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença do fígado gorduroso não alcoólica (NAFLD), síndrome X metabólica e Doença de Huntington.

[000234] Modalidade 28. O método de acordo com a Modalidade 26 ou Modalidade 27, em que a doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, peso excessivo, obesidade, amenorreia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso ou diabetes.

[000235] Modalidade 29. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 26-28, em que a doença ou distúrbio é type I diabetes ou type II diabetes.

[000236] Modalidade 30. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 26-28, em que a doença ou distúrbio é obesidade.

[000237] Modalidade 31. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 26-28, em que a doença ou distúrbio é lipodistrofia ou deficiência de leptina.

[000238] Modalidade 32. Uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo quimérico de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-25 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[000239] Modalidade 33. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 32, em que a perda de peso é reduzido em pelo menos 10%.

[000240] Modalidade 34. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 33, em que a perda de peso é reduzido em pelo menos 12%.

[000241] Modalidade 35. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 34, em que a perda de peso é reduzido em pelo menos 15%.

B. Formulações

[000242] Os compostos farmacêuticos da invenção podem ser formulados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais, tal como descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Vide também Wang et al. (1988) J. of Parenteral Sci. and Tech.,Relatório Técnico N° 10, Sup. 42: 2S.

[000243] Em geral, os polipeptídeos manipulados podem ser formulados em uma composição farmacêutica estável, segura para administração a um paciente. Formulações farmacêuticas consideradas para uso nos métodos da invenção podem compreender cerca de 0,01 a 1,0% (peso/v), em determinados casos 0,05 a 1,0% do polipeptídeo manipulado, cerca de 0,02 a 0,5% (peso/v) de um tampão de acetato, fosfato, citrato ou glutamato, o qual permite que um pH da composição final entre cerca de 3,0 e cerca de 7,0%, aproximadamente 1,0 a 10% (peso/v) de um agente de tonificação de carboidrato ou álcool poliídrico e, opcionalmente, aproximadamente 0,005 a 1,0% (peso/v) de um conservante selecionado do grupo que consiste em m-cresol, álcool benzílico, metil, etil, propil e butil parabenos e fenol. Tal um conservante é, em geral, incluído se o peptídeo formulado deve ser incluído em um produto de uso múltiplo.

[000244] Em modalidades particulares, uma formulação farmacêutica dos presentes polipeptídeos manipulados pode conter uma faixa de concentrações de composto(s), por exemplo, entre cerca de 0,01% a cerca de 98% peso/peso ou entre cerca de 1 a cerca 98% peso/peso ou, de preferência, entre 80% e 90% peso/peso ou, de preferência, entre cerca de 0,01% a cerca de 50% peso/peso ou, mais preferivelmente, entre cerca de 10% a cerca de 25% peso/peso nestas modalidades. Uma quantidade suficiente de água para injeção pode ser usada para obter a concentração de solução desejada.

[000245] Agentes tonificantes adicionais, tal como cloreto de sódio, bem como outros excipientes conhecidos, podem também estar presentes, se desejado. Em alguns casos, tais excipientes são úteis em manutenção da tonicidade global do composto. Um excipiente pode ser incluído nas formulações presentemente descritas em várias concentrações. Por exemplo, um excipiente pode ser incluído na faixa de concentração de cerca de 0,02% a cerca de 20% peso/peso, de preferência entre cerca de 0,02% e 0,5% peso/peso, de cerca de 0,02% a cerca de 10% peso/peso ou cerca de 1% a cerca de 20% peso/peso. Além disso, similar às presentes formulações em si, um excipiente pode ser incluído na forma sólida (incluindo em pó), líquida, semi-sólida ou gel.

[000246] As formulações farmacêuticas podem ser compostas em várias formas, por exemplo, sólido, líquido, semi-sólidos ou líquidos. O termo "sólido", conforme usado aqui, se destina a abranger todos os usos normais deste termo incluindo, por exemplo, pós e formulações liofilizadas. As formulações presentemente descritas podem ser liofilizadas.

[000247] Os termos tampão, solução tampão e solução tamponada, quando usados com referência à concentração de íons de hidrogênio ou pH, referem-se à capacidade de um sistema, em particular uma solução aquosa, de resistir a uma alteração de pH quando de adição de ácido ou álcali ou quando de diluição com um solvente. Característica de soluções tamponadas, as quais sofrem pequenas alterações de pH quando de adição de ácido ou base, é a presença de um ácido fraco e um sal do ácido fraco ou uma base fraca e um sal da base fraca. Um exemplo do anterior sistema é ácido acético e acetato de sódio. A alteração de pH é pequena, contanto que a quantidade de íons de hidrogênio ou íons de hidroxila adicionados não exceda a capacidade do sistema tampão de neutralizá-los.

[000248] Conforme descrito aqui, uma variedade de veículos líquidos são adequados para uso nas formulações de polipeptídeos manipulado, por exemplo, água ou uma mistura ou suspensão de solvente aquoso/orgânico.

[000249] A estabilidade de uma formulação de polipeptídeo manipulado para uso conforme descrito aqui é aumentada mantendo o pH da formulação em uma faixa determinada por meio de métodos conhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, o pH da formulação é mantido na faixa de cerca de 3,5 a 5,0 ou cerca de 3,5 a 6,5, em algumas modalidades, de cerca de 3,7 a 4,3 ou cerca de 3,8 a 4,2. Em algumas modalidades, o pH pode ser de cerca de 4,0, cerca de 5,0, cerca de 6,0, cerca de 7,0, cerca de 8,0, cerca de 9,0 ou mesmo maior. Em algumas modalidades, o pH pode estar na faixa fisiológica, pH de 6-8, de preferência pH de 7-7,6.

[000250] Em determinadas modalidades, o tampão com o polipeptídeo manipulado é um tampão de acetato (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 1 -5 a cerca de 60 mM), tampão de fosfato (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 1-5 a cerca de cerca de 30 mM) ou tampão de glutamato (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 1-5 a cerca de 60 mM). Em algumas modalidades, o tampão é acetato de etila (de preferência em uma concentração final na formulação de cerca de 5 a cerca de 30 mM).

[000251] Um estabilizante pode ser incluído nas formulações, mas não é necessariamente requerido. Se incluído, no entanto, um estabilizante útil na prática da presente invenção é um carboidrato ou um álcool poliídrico. Um estabilizante adequado útil na prática da presente invenção é aproximadamente 1,0 a 10% (peso/v) de um álcool poliídrico ou carboidrato. Os álcoois poliídricos e carboidratos compartilham a mesma característica em seus esqueletos, isto é, - CHOH-CHOH-, a qual é responsável pela estabilização das proteínas. Os álcoois poliídricos incluem compostos tais como sorbitol, glicerol, manitol e polietileno glicóis (PEG). Estes compostos são moléculas de cadeia linear. Os carboidratos, tais como manose, ribose, sucrose, frutose, trealose, maltose, inositol, lactose e, por outro lado, são moléculas cíclicas que podem conter um grupo ceto ou aldeído. Foi demonstrado que estas duas classes de compostos são eficazes em estabilização da proteína contra desnaturação causada pela temperatura elevada e por processos de congelamento- descongelamento ou processos de liofilização. Carboidratos adequados incluem: galactose, arabinose, lactose ou qualquer outro carboidrato o qual não tem um efeito adverso sobre um paciente diabético, isto é, o carboidrato não é metabolizado para formar concentrações inaceitavelmente grandes de glicose no sangue. Tais carboidratos são bem conhecidos na técnica como sendo adequados para diabéticos. Sacarose e frutose são adequados para uso com o composto em aplicações não diabéticas (por exemplo, tratamento de obesidade).

[000252] Em determinadas modalidades, se um estabilizante é incluído, o composto é estabilizado com um álcool poliídrico, tal como sorbitol, manitol, glicerol, inositol, xilitol e copolímero de polipropileno/etileno glicol, bem como polietilenos glicóis (PEG) de vários pesos moleculares - 200, 400, 1450, 3350, 4000, 6000, 8000 e mesmo maior). Manitol é o álcool poliídrico preferido em algumas modalidades. Outra característica útil das formulações liofilizadas da presente invenção é a manutenção da tonicidade das formulações liofilizadas descritas aqui com o mesmo componente de formulação que serve para manter a sua estabilidade. Em algumas modalidades, manitol é o álcool poliídrico preferido usado para esta finalidade.

[000253] A Farmacopeia dos Estados Unidos (United States Pharmacopeia - USP) afirma que agentes anti-microbianos, em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas, devem ser adicionados a preparados contidos em recipientes com doses múltiplas. Eles devem estar presentes em uma concentração adequada no momento de uso para evitar a multiplicação de microorganismos inadvertidamente introduzidos no preparado enquanto se extrai uma porção dos conteúdos com uma agulha hipodérmica e seringa ou usando outros meios invasivos para distribuição, tais como canetas injetoras. Agentes antimicrobianos deverão ser avaliados para garantir compatibilidade com todos os outros componentes da fórmula e sua atividade deverá ser avaliada na fórmula total para assegurar que um agente em particular que é eficaz em uma formulação não seja ineficaz em outra. Não é raro descobrir que um agente antimicrobiano em particular será eficaz em uma formulação, mas não em outra formulação.

[000254] Um conservante é, no sentido farmacêutico comum, uma substância que inibe ou previne o crescimento microbiano e pode ser adicionado a preparados farmacêuticos para esta finalidade para evitar consequente deterioração da formulação por micro-organismos. Embora a quantidade de conservante não seja grande, ela pode, no entanto, afetar a estabilidade geral do peptídeo.

[000255] Embora o conservante para uso nas composições farmacêuticas possam variar de 0,005-1,0% (peso/v), em algumas modalidades, a faixa para cada conservante, isoladamente ou em combinação com outros, é: álcool benzílico (0,1-1,0%) ou m-cresol (0,1-0,6%) ou fenol ( 0,1-0,8%) ou uma combinação de metil (0,050,25%) e etil ou propil ou butil (0,005%-0,03%) parabenos. Os parabenos são alquil ésteres de ácido para-hidróxi-benzóico. Uma descrição detalhada de cada conservante é apresentada em Remington's Pharmaceutical Sciences (Id.)

[000256] Os polipeptídeos manipulados podem não ter uma tendência de adsorver sobre o vidro em um recipiente de vidro quando em uma forma líquida, portanto, um agente tensoativo pode não ser requerido para estabilizar adicionalmente a formulação farmacêutica. No entanto, no que diz respeito a compostos que têm tal tendência quando na forma líquida, um agente tensoativo deverá ser usado em sua formulação. Estas formulações podem ser, em seguida, liofilizadas. Tensoativos frequentemente causam desnaturação da proteína, por meio de ruptura hidrofóbica e separação de ponte de sal. Concentrações relativamente baixas de tensoativo podem exercer uma atividade de desnaturação potente em virtude das fortes interações entre porções de tensoativo e os sítios reativos sobre proteínas. No entanto, o uso criterioso desta interação pode estabilizar proteínas contra desnaturação interfacial ou superficial. Tensoativos os quais poderiam estabilizar adicionalmente o polipeptídeo manipulado podem, opcionalmente, estar presentes na faixa de cerca de 0,001 a 0,3% (peso/v) da formulação total e incluem polisorbato 80 (isto é, monooleato de polioxietileno (20) sorbitan), CHAPS® (isto é, 3-[(3- colamidopropil)dimetilamônio]-1-propano-sulfonato), Brij® (porexemplo,, Brij® 35, o qual é (lauril éter de polioxietileno (23)), poloxâmero ou outro agente tensoativo não iônico.

[000257] Também, pode ser desejável adicionar cloreto de sódio ou outro sal para ajustar a tonicidade da composição farmacêutica, de acordo com o agente tonificante selecionado. No entanto, isto é opcional e depende da formulação selecionada em particular. Formulações parenterais podem, de preferência, ser isotônicas ou substancialmente isotônicas.

[000258] Um veículo preferido para produtos parenterais é água. Água de qualidade adequada para administração parenteral pode ser preparada quer por meio de destilação ou por osmose inversa. Água para injeção é o veículo aquoso preferido para uso em formulações farmacêuticas.

[000259] É possível que outros componentes possam estar presentes nas formulações farmacêuticas. Tais ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, umectantes, emulsificantes, lubrificantes, antioxidantes, agentes de composição de volume, modificadores de tonicidade, agentes de quelação, íons de metal, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina sérica humano, gelatina ou proteínas) e um zwiteríon (por exemplo, um aminoácido, tal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Adicionalmente, soluções poliméricas ou misturas com polímeros proporcionam a oportunidade de liberação controlada do peptídeo. Tais ingredientes adicionais, naturalmente, não deverão afetar negativamente aestabilidade global da formulação farmacêutica da presente invenção.

[000260] Recipientes são também parte integral da formulação de uma injeção e podem ser considerados um componente, pois não há recipiente que seja totalmente inerte ou não afete de algum modo o líquido que ele contém, em particular se o líquido é aquoso. Portanto, a seleção de um recipiente para uma injeção em particular deverá ser com base em uma consideração da composição do recipiente, bem como da solução e o tratamento ao qual ela será submetida. Adsorção do peptídeo à superfície de vidro do frasco também pode ser minimizada, se necessário, mediante uso de vidro de boro-silicato, por exemplo, vidro de boro-silicato Wheaton Tipo 1 # 33 (Wheaton Tipo 133) ou seu equivalente (Wheaton Glass Co.). Outros fornecedores de frascos de vidro de boro-silicato similares e cartuchos aceitáveis para fabricação incluem Kimbel Glass Co., West Co., Bunder Glas GMBH e Form a Vitrum. As propriedades biológicas e químicas do composto podem ser estabilizadas por formulação e liofilização em um de frasco de soro de boro-silicato Wheaton Tipo 1-33 para uma final concentração de 0,1 mg/ml e 10 mg/ml do composto na presença de manitol a 5% e Tween 80 a 0,02%.

[000261] Para as formulações a serem distribuídas por meio de injeção, de forma a permitir introdução de uma agulha de uma seringa hipodérmica em um frasco com múltiplas doses e permitir re- fechamento, logo que a agulha é retirada, a extremidade aberta de cada um dos frascos é, de preferência, vedada com uma rolha de borracha mantida no lugar por uma tira de alumínio.

[000262] Rolhas para frascos de vidro, tais como West 4416/50, 4416/50 (revestida de Teflon) e 4406/40, Abbott 5139ou qualquer rolha equivalente podem ser usadas como a vedação para produtos farmacêuticos para injeção. Para formulações que compreendem agentes anti-obesidade peptídicos, estas rolhas são compatíveis com o peptídeo, bem como os outros componentes da formulação. Os inventores também descobriram que estas rolhas passam no teste de integridade de rolha quando testadas usando padrões de uso pelo paciente, por exemplo, a rolha pode suportar pelo menos cerca de 100 injeções. Alternativamente, o peptídeo pode ser liofilizado para frascos, seringas ou cartuchos para subsequente reconstituição. Formulações líquidas da presente invenção podem ser enchidas em um ou dois cartuchos com septo ou uma ou duas seringas com câmara.

[000263] Cada um dos componentes da formulação farmacêutica descrita acima é conhecido na técnica e é descrito em PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS: PARENTERAL MEDICATIONS, vol. 1, 2a ed., Avis et al. Ed., Mercel Dekker, New York, NY 1992, o qual é incorporado por referência na íntegra aqui e para todos os efeitos.

[000264] o processo de fabricação das formulações líquidas acima envolve, em geral, etapas de composição, filtração estéril e envasamento. o procedimento de composição envolve dissolução de de ingredientes em uma ordem específica (conservante seguido por estabilizante/agentes de tonicidade, tampões e peptídeo) ou dissolução ao mesmo tempo.

[000265] Formulações alternativas, por exemplo, não parenterais, pode não requerer esterilização. No entanto, se esterilização é desejada ou necessária, qualquer processo de esterilização adequado pode ser usado no desenvolvimento da formulação farmacêutica peptídica da presente invenção. Processos de esterilização por filtração típicos incluem vapor (calor úmido), calor seco, gases (por exemplo, óxido de etileno, formaldeído, dióxido de cloro, óxido de propileno, beta-propiolactona, ozônio, cloropicrina, brometo de metila, ácido peracético e similares), exposição a uma fonte de radiação e manipulação asséptica. Filtração é o método preferido de esterilização para formulações líquidas da presente invenção. A filtração estéril envolve filtros de 0,45 μm e 0,22 μm (1 ou 2) os quais podem ser ligados em série. Após filtração, a solução é vertida em ampolas ou outros recipientes adequados.

[000266] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos manipulados descritos aqui são administrados perifericamente aos indivíduos. Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas líquidas da presente invenção são para administração parenteral. Vias de administração adequadas incluem administração intramuscular, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intra-articular, intratecal e similares. Em algumas modalidades, a via de administração subcutânea é preferida. Em determinadas modalidades, distribuição mucosal também é preferida. Estas vias incluem, porém sem limitações, vias oral, nasal, sub-lingual, bucal e pulmonar, as quais podem incluir administração do peptídeo na forma líquida, semi-sólida ou sólida. Para formulações que compreendem os polipeptídeos manipulados, administração através destas vias pode requerer substancialmente mais composto para obtenção dos efeitos biológicos desejados em virtude de diminuição da biodisponibilidade comparado com distribuição parenteral. Além disso, distribuição parenteral com liberação controlada pode ser obtida mediante formação de microcápsulas poliméricas, matrizes, soluções, implantes e dispositivos e administração dos mesmos parenteralmente ou através de meios cirúrgicos. Exemplos de formulações com liberação controlada são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.368.630, 6.379.704 e 5.766.627, as quais são aqui incorporadas por referência. Estas formas de dosagem podem ter uma menor biodisponibilidade em virtude de retenção de uma parte do peptídeo na matriz polimérica ou dispositivo. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos 6.379.704, 6.379.703 e 6.296.842, cada uma das quais é aqui incorporada por referência na íntegra e para todos os efeitos.

[000267] Os compostos podem ser fornecidos na forma de unidade de dosagem contendo uma quantidade de polipeptídeo manipulado que será eficaz em uma ou múltiplas doses.

[000268] Conforme será reconhecido por aqueles versados na técnica, uma quantidade eficaz do polipeptídeo manipulado variará de acordo com muitos fatores, incluindo a idade e peso do indivíduo, a condição física do indivíduo, a condição a ser tratada e outros fatores conhecidos na técnica. Uma quantidade efetiva dos polipeptídeos manipulados também variará com a combinação administrada em particular. Conforme descrito aqui, a administração dos polipeptídeos manipulados em combinação pode permitir uma diminuição da quantidade de qualquer um dos polipeptídeos modificados a serem administrados em uma quantidade eficaz.

[000269] A longa duração de ação do polipeptídeo manipulado pode conferir a duração de ação prolongada desejada, tal como administração uma vez por dia ou uma vez por semana. A duração de ação pode ser selecionada, por exemplo, escolhendo o ABD e sua afinidade pela albumina. Embora não desejando estar limitado pela teoria, acredita-se que maior afinidade pela albumina proporcionará tempos de circulação mais longos, o que confere maior duração de ação. Um ou ambos de farmacodinâmica (efeitos terapêuticos) e farmacocinética (propriedades de fármaco) podem ser medidas ao longo do tempo após distribuição, tais como níveis plasmáticos de fármaco, glicose aguda ou crônica e/ou diminuição de HbA1c, níveis plasmáticos de insulina, inibição de ingestão de alimento ou perda de peso.

C. Dosagens Eficazes

[000270] Composições farmacêuticas proporcionadas na presente invenção incluem composições em que o ingrediente ativo está contido em uma quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, em uma quantidade eficaz para alcançar sua finalidade pretendida. A quantidade eficaz real para uma aplicação em particular dependerá, inter alia, da condição a ser tratada. Por exemplo, quando administradas em métodos para tratamento de diabetes, tais composições conterão uma quantidade de ingrediente ativo eficaz para atingir o resultado desejado (por exemplo, diminuição da glicose no sangue em jejum de um indivíduo). Quando administradas em métodos para tratar obesidade, tais composições conterão uma quantidade de ingrediente ativo eficaz para atingir o resultado desejado (por exemplo, redução de massa corporal).

[000271] A dosagem e frequência (dose únicas ou múltiplas) do composto administrado podem variar, dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a via de administração, tamanho, idade, sexo, saúde, peso corporal, índice de massa corporal e dieta do recipiente, a natureza e extensão dos sintomas da doença a ser tratada (por exemplo, a doença responde aos compostos descritos aqui), presença de outras doenças ou outros problemas relacionados com a saúde; tipo de tratamento concomitante e complicações a partir de qualquer doença ou regime de tratamento. Outros regimes ou agentes terapêuticos podem ser usados em conjunto com os métodos e compostos da invenção.

[000272] Quantidades terapeuticamente eficazes para uso em seres humanos podem ser determinadas a partir de modelos animais. Por exemplo, uma dose para seres humanos pode ser formulada para obter uma concentração que se descobriu ser eficaz em animais. A dosagem em seres humanos pode ser ajustada monitorando um ou mais parâmetros fisiológicos incluindo, porém sem limitações, o açúcar no sangue e massa corporal, e ajustando as dosagens para cima ou para baixo, conforme descrito acima e conhecido na técnica.

[000273] As dosagens podem ser variadas, dependendo dos requisitos do paciente e do composto que está sendo empregado. A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, deverá ser suficiente para obter uma resposta terapêutica benéfica no paciente com o tempo. O tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos. Em geral, o tratamento é iniciado com dosagens menores, as quais são menos do que a dose ótima do composto. Após o que, a dosagem é aumentada em pequenos incrementos até que o efeito ótimo sob as circunstâncias seja atingido. Em uma modalidade da invenção, a faixa de dosagem é de 0,001% a 10% peso/v. Em outra modalidade, a faixa de dosagem é de 0,1% a 5% peso/v.

[000274] No entanto, doses típicas podem conter de um limite mínimo de cerca de 0,1 mg a um limite máximo de cerca de 200 mg do composto farmacêutico por dia. Também considerados estão outras faixas de dose, tal como de 1 mg a 100 mg do composto por dose e de 3 mg a 70 mg por dose. Tipicamente, a dose de polipeptídeos manipulados com longa duração de ação é administrada, por exemplo, diariamente ou mesmo uma vez por semana. As doses diárias podem ser distribuídas em doses unitárias distintas, fornecidas de forma contínua durante um período de 24 horas ou qualquer porção destas 24 horas.

[000275] Quantidades e intervalos de dosagem podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis do composto administrado eficazes para a indicação clínica a ser tratada em particular. Isto irá proporcionar um regime terapêutico que é compatível com a gravidade do estado doentio do indivíduo.

[000276] Utilizando os ensinamentos fornecidos aqui, um regime de tratamento profilático ou terapêutico eficaz pode ser concebido, o qual não causa toxicidade substancial e ainda é inteiramente eficaz para tratar os sintomas clínicos demonstrados pelo paciente em particular. Esse planejamento deverá envolver a escolha cuidadosa do composto ativo ao considerar fatores tais como potência do composto, biodisponibilidade relativa, peso corporal do paciente, a presença e severidade de efeitos colaterais adversos, o modo preferido de administração e o perfil de toxicidade do agente selecionado.

[000277] A surpreende propriedade de moderação de dose dos polipeptídeos manipulados descritos aqui, juntamente com sua surpreendente meia-vida plasmática e duração de ação farmacológica longa, proporciona um agente farmacêutico superior. As propriedades superiores, incluindo moderação de dose, permitem menor dosagem, assim, menos ou efeitos colaterais menos graves e custo aprimorado dos produtos e/ou formulações de custo mais efetivo e mais simples para administração uma vez ao dia ou uma vez por semana não atualmente obtido pelos compostos parentais isoladamente.

D. Toxicidade

[000278] A relação entre a toxicidade e o efeito terapêutico para um composto em particular é seu índice terapêutico e pode ser expresso como a proporção entre a LD50 (a quantidade de composto letal em 50% da população) e a ED50 (a quantidade de composto eficaz em 50% da população). Compostos que exibem índices terapêuticos elevados são preferidos. Dados de índices terapêuticos obtidos a partir de ensaios de cultura de células e/ou estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagens para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos reside, de preferência, dentro de uma faixa de concentrações plasmáticas que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada. Vide, por exemplo, Fingi et al., em: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,Capítulo 1, p. 1, 1975. A formulação exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual tendo em vista a condição do paciente e o método no qual o composto é usado em particular.

[000279] Sem se pretender estar preso a qualquer teoria, acredita-se que conjugação de um domínio ABD de ligação à albumina com um domínio hormonal conforme descrito aqui pode conferir imunogenicidade diminuída, conforme avaliado por uma redução na resposta imune em relação ao domínio hormonal sem conjugação com ABD. Vide, por exemplo, documento WO 2009/016043, aqui incorporado por referência na íntegra e para todos os efeitos.

VII. Exemplos Exemplo 1: Recuperação de polipeptídeo manipulado

[000280] Sequências de proteína foram concebidos e traduzidas novamente usando um software comercial para sequência de DNA para clonagem em um vetor de expressão de E. coli. As sequências foram obtidas como oligonucleotídeos e ligadas juntas usando técnicas de amplificação por PCR padrões ou foram digeridas a partir de construtos de expressão existentes usando enzimas de restrição padrões e, então, ligadas novamente juntas. Sequências que expressam a proteína de interesse foram colocadas em pET45 com um promotor T7 para expressão induzível. Após os construtos serem verificados através de sequenciamento, o DNA de vetor foi purificado e transformado em um hospedeiro de expressão, tipicamente BL21 (DE3). Uma única colônia foi selecionada para crescimento de uma cultura inicial em 4 ml de meio LB durante ~ 6 horas. Estoques de glicerol foram preparados mediante a adição de 100 μl de glicerol a 80% a 900 μl do estoque e armazenados a -80 °C. Opcionalmente, 500 μl de amostra não induzida foram retidos para análise em gel. Uma cultura de 60 ml (meio Magic) foi inoculada com 60 μl de cultura inicial em um frasco Thompson de 125ml e incubada @ 30 °C durante a noite. Remover 250 μl de amostra para análise. Centrifugar e congelar a pelota de células para posterior processamento.

[000281] Células bacterianas foram coletadas e subsequentemente submetidas à lise para isolar corpos de inclusão. Uma vez que a proteína estava presente nos corpos de inclusão, estas foram solubilizadas e a proteína redobrada a 4°C. As proteínas foram, então, separadas usando cromatografia por exclusão de tamanho até que apenas uma única banda restasse e os níveis de endotoxina fossem aceitáveis para testagem in vivo. HPLC analítica, RP-LC-MS e gel de SDS-PAGE foram realizados como medidas de controle de qualidade sobre a proteína final. Proteína foi distribuída em alíquotas predeterminadas e armazenada a -80°C.

[000282] Recuperações típicas de polipeptídeo manipulado para os métodos descritos aqui são fornecidas na Tabela 5 a seguir. Surpreendentemente, as recuperações observadas para os compostos e métodos de produção descritos acima podem ser significativamente maiores do que as recuperações observadas com espécies conjugadas previamente reportadas, por exemplo, Fc-leptina e similares. Além disso, o domínio ABD estranho não afetou adversamente a expressão, recuperação, re-dobramento, rendimento ou solubilidade dos polipeptídeos manipulados recuperados, particularmente para os conjugados de leptina, a despeito das dificuldades geralmente reconhecidas em recuperação e manipulação de leptina.Tabela 5. Recuperações de polipeptídeos manipulados

Exemplo 2: Atividade funcional de leptina in vitro

[000283] Método. Este ensaio mede a sinalização ao receptor após tratamento de células que expressam um receptor de leptina modificado. Amostras a teste foram aceitas em uma pureza de 100% e re-solvatadas para a concentração de ensaio em 10X tampão de estimulação. Um total de 90 μl de 10X cada composto foi transferido para uma placa com cavidades profundas e serialmente diluído (série de 3 vezes) com tampão de estimulação usando Multiprobe® da Perkin Elmer e o programa "MSV_Lep_Func_3-Fold_Dil- Deepwell_96.MPT". A placa serialmente diluída foi composta na placa de estimulação com 96 cavidades contendo 2,5 x 10-5 pelotas de células de células de Keptina privadas de leptina 18 horas, conforme conhecido na técnica, usando o programa de teste "MSV_Lep_Func_200μl_Transfer"da MultiMek que transfere 200 μl de cada um dos compostos diluídos e mistura as células. Neste momento, a placa foi selada com uma tampa de placa adesiva e colocada a 37 °C durante 30 minutos para permitir estimulação de pSTAT5. Vide, por exemplo, Crouse et al., 1998, J. Biol. Chem., 273: 18365-18373. Após incubação, a placa de estimulação foi centrifugada para re-peletizar as células, o sobrenadante foi removido e as pelotas de células restantes foram congeladas a -80 (> 30 minutos). Lisatos celulares foram feitos mediante a adição de 100 μl de 1x lisato às pelotas de célula descongeladas (kit pSTAT5 Assay da Perkin Elmer) com rotação em RT durante 20 minutos. Os lisatos foram clarificados a 2500 rpm durante 20 minutos e analisados no kit pSTAT5 Assay como 4 μl/cavidade em ProxiplateTM com 384 cavidades de acordo com as instruções do fabricante. O sinal de pSTAT5 (RFU) foi determinado usando uma Fusion α-FP HT Plate Reader da Packard ajustado para parâmetros de leitura Alfa. O ensaio foi completado em placas Proxiplate™ com 384 cavidades em um volume total de 11 μl, com valores representando a média de n = 4 cavidades de ensaio por ponto de dose.

[000284] Com referência à Tabela 6 abaixo, Cmpds C1-C6 são leptinas, análogos de leptina e derivados de leptina exemplificativos, conforme descrito aqui. Especificamente, Cmpd C1 é SEQ ID NO: 20 conforme descrito aqui. Cmpd C2 é SEQ ID NO: 30 (isto é, A200). Cmpd C3 é SEQ ID NO: 32 em que uma única porção polietilenoglicol (PEG) de 20 kDa foi ligada através do resíduo de cisteína na posição 78. Métodos para a conjugação de peptídeos e proteínas com PEG são conforme conhecido na técnica. Cmpd C4 é um derivado PEGuilado de SEQ ID NO: 20, em que um único PEG de 20 kDa foi ligado via o N- término de SEQ ID NO: 20. Cmpd C5 é um derivado de PEG de SEQ ID NO: 32 duplamente PEGuilado, em que uma única porção PEG de 20 kDa foi ligada via o resíduo de cisteína na posição 78 e uma única fração PEG de 20 kDa foi ligada via o N-término. Cmpd C6 é um derivado PEGuilado em que um único PEG de 40 kDa foi ligado via o N-término.

[000285] Resultados. Conforme mostrado na Tabela 6 a seguir, os polipeptídeos manipulados descritos aqui (por exemplo, Cmpds 1-4) têm atividade funcional comparável e mesmo superior no ensaio STAT5 Obeca comparado com uma variedade de leptinas conjugadas. Tabela 6: Atividade funcional in vitro para leptinas

Exemplo 3: Alteração no peso corporal após uma única administração

[000286] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio foi de 319 gramas no início do estudo. Os animais foram divididos em seis grupos (n = 6/grupo). Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; Cmpd 1 a 2,6 mg/kg em veículo; Cmpd 2 a 2,7 mg/kg em veículo; Cmpd 4 a 2,7 mg/kg em veículo; Cmpd 2 a 10 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. A ingestão de alimento e alteração de peso corporal (% corrigido para veículo) foram monitorados durante 14 dias e os resultados registrados conforme mostrado (Figuras 1A a 1B). Compostos administrados: Veículo (quadrado); Cmpd 1 a 2,6 mg/kg (triângulo com a ponta para cima); Cmpd 2 a 2,7 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo); Cmpd 4 a 2,7 mg/kg (diamante); Cmpd C2 a 10 mg/kg (círculo).

[000287] Resultados. Conforme representado nas Figuras 1A a 1B, administração de cada polipeptídeo manipulado resultou em ingestão de alimento e peso corporal reduzidos. Todos os compostos foram fornecidos em uma dose equimolar em peso total de composto; compostos foram todos fornecidos a 120 nmol/kg (isto é, Cmpd 1 a 2,6 mg/kg; Cmpd 2 e Cmpd 4 a 2,7 mg/kg; Cmpd C2 a 10 mg/kg). Deverá ser notado que Cmpd C2 (por exemplo, A200) é um dímero de duas porções, cada porção consistindo na região FC de IgG1 fundida à leptina humana. Cmpd 1 e Cmpd 2 têm uma atividade similar ao Cmpd C2 o qual, em virtude de ser um dímero, tem duas leptinas por molécula. Embora a eficácia (menor peso corporal) pareça similar, é evidente que a tendência favorece ambos os polipeptídeos manipulados em relação ao Cmpd C2. Quando encarados em uma base por mole de leptina, os polipeptídeos manipulados são superiores para inibição da ingestão de alimento e do peso corporal, uma vez que Cmpd C2 tem 2 moles de leptina para cada complexo dimérico de Fc- leptina, enquanto que cada mole de porção ABD-leptina tem apenas 1 mole de leptina.

[000288] Resultados anteriores demonstraram que são necessários aproximadamente 500 μg/kg/dia de um composto A500 para obter uma perda de peso de 9-10% a 7 dias quando fornecido por meio de infusão contínua a um rato magro. Isto resulta em 2,5 mg de composto de leptina A500 durante 5 dias e 3,5 mg de composto a 7 dias. Uma vez que um composto A500 em si tem 16067,68 g/mol e a massa molecular do Cmpd 2 é ~22,510 g/mol, se poderia prever a necessidade de 1,4X mais proteína de fusão ABD durante os 5 dias. Antes, somente 1,08X mais composto (2,7 mg/2,5 mg) foi fornecido, o qual indica uma surpreendente propriedade de moderação de dose.

Exemplo 4: Alteração no peso corporal após uma única administração de Cmpd 2.

[000289] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era de 324 gramas no início do estudo. Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 6/grupo). Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; Cmpd 2 a 0,3 mg/kg em veículo; Cmpd 2 a 1,0 mg/kg em veículo; Cmpd 2 a 3,0 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. A ingestão de alimento e alteração de peso corporal (% corrigido para veículo) foram monitorados durante 14 dias e os resultados registrados conforme mostrado (Figuras 2a e 2b). Os compostos administrados: Veículo (quadrado); Cmpd 2 a 0,3 mg/kg (triângulo com a ponta para cima); Cmpd 2 a 1,0 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo); Cmpd 2 a 3,0 mg/kg (diamante).

[000290] Resultados. Conforme ilustrado na Figuras 2A a 2B, administração de polipeptídeo manipulado Cmpd 2 em cada uma das concentrações resultou em ingestão de alimento e peso corporal reduzidos. A resposta à dose é observada na Figura 2B.

Exemplo 5: Alteração no peso corporal após uma única administração de Cmpd C2

[000291] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era de 324 gramas no início do estudo. Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 6/grupo). Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; Cmpd C2 a 1,1 mg/kg em veículo; Cmpd C2 a 3,3 mg/kg em veículo; Cmpd C2 a 11,1 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. A ingestão de alimento e alteração no peso corporal (% corrigido para veículo) foram monitorados durante 14 dias e os resultados registrados conforme ilustrado (Figuras 3A a 3B). Compostos administrados: Veículo (quadrado); Cmpd C2 a 1,1 mg/kg (círculo); Cmpd C2 a 3,3 mg/kg (quadrado); Cmpd C2 a 11,1 mg/kg (triângulo com a ponta para cima).

[000292] Resultados. Conforme ilustrado na Figuras 3A através 3B, administração de Cmpd C2 de controle em cada concentração resultou em ingestão de alimento e peso corporal reduzidos.

Exemplo 6: Alteração no peso corporal após uma única administração de Cmpd C6

[000293] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era de 324 gramas no início do estudo. Os animais foram divididos em dois grupos (n = 6/grupo). Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; Cmpd C6 a 2,2 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. A ingestão de alimento e de alteração de peso corporal (% corrigido para veículo) foram controlados e os resultados registrados conforme mostrado (Figuras 4A a 4B)). Compostos administrados: Veículo (quadrado); Cmpd C6 a 2,2 mg/kg (triângulo com a ponta para baixo).

[000294] Resultados. Conforme representado nas Figuras 4A a 4B, administração de Cmpd C6 de controle em cada concentração resultou em ingestão de alimento e peso corporal reduzidos.

Exemplo 7: Alteração no peso corporal em ratos DIO

[000295] Método. Ratos Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta (DIO) pesando em média cerca de 500 gramas foram injetados IP com os compostos de teste e controle no dia 0 e no dia 7 (n = 6 por composto). O composto de teste foi SEQ ID NO: 54 fornecida a 1,3 mg/kg/semana em veículo. Peso corporal e ingestão de alimento foram medidos em vários pontos (dias 0, 4, 7, 12 e 14 d) durante o período de estudo. Compostos administrados: Veículo (quadrado); SEQ ID NO: 54 a 1,3 mg/kg em veículo (triângulo com a ponta para cima).

[000296] Resultados. Os resultados representados na Figura 5 demonstram que injeção IP de um intervalo de uma vez por semana resulta em uma perda de peso de 3% após 7 dias, conforme observado anteriormente com esta dose. Quando de uma segunda injeção, os ratos continuaram a perder peso, resultando em uma perda de peso cumulativa de 7-8% corrigida para veículo a 14 dias. Em contraste e surpreendentemente, estudos anteriores com FC-leptina (A200 leptina) resultaram em uma perda de peso de apenas aproximadamente 4% a 14 dias após uma dose de 5 mg/kg/semana com injeções no dia 0 e no dia 7, em um modelo DIO similar.

Exemplo 8: Detecção de polipeptídeos manipulados no plasma

[000297] Método. Ratos Sprague Dawley com obesidade induzida por dieta (DIO) pesando em média aproximadamente 483 g foram divididos em cinco grupos, dois dos quais foram implantados com bombas osmóticas. Um dos dois grupos com bombas osmóticas recebeu uma infusão contínua por via subcutânea (SC) de veículo apenas, o outro recebeu um CSI de SEQ ID NO: 33 (isto é, A500) em veículo em uma dose de 250 μg/kg/dia. Os outros três grupos foram tratados da seguinte maneira: um grupo recebeu 15 injeções subcutâneas de veículo apenas uma vez por semana nos dias 0, 7, 14 e 21 do estudo; outro grupo recebeu injeções subcutâneas uma vez por semana de SEQ ID NO: 54 ( um polipeptídeo manipulado ABD- A500) em uma dose de 1,3 mg/kg em veículo nos dias 0, 7, 14 e 21 do estudo; o grupo restante recebeu injeções subcutâneas uma vez por semana de SEQ ID NO: 54 em uma dose de 3,0 mg/kg em veículo nos dias 0, 7, 14 e 21 do estudo. Amostras de sangue foram tomadas de cada animal no dia 27, a qual foi o dia de término do estudo.

[000298] Resultados. Os resultados representados na Figura 6 demonstram que injeção uma vez por semana de SEQ ID NO: 54 a 1,3 mg/kg resultou em níveis plasmáticos que eram ligeiramente menores do que aqueles obtidos por meio de infusão contínua de SEQ ID NO: 33 e injeção uma vez por semana de SEQ ID NO: 54 a 3,0 mg/kg resultou em níveis plasmáticos que eram significativamente maiores do que aqueles obtidos com infusão contínua de SEQ ID NO: 33 (comparar painel esquerdo com painel direito; note a diferença nas escalas dos eixos Y de cada painel).

Exemplo 9: Alteração no peso corporal após uma única administração de polipeptídeos manipulados

[000299] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era 330 gramas no início do estudo. Cada animal de teste (n = 5/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. Os animais foram divididos em cinco grupos. Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO: 56 em veículo; SEQ ID NO: 58 em veículo; SEQ ID NO: 59 em veículo. SEQ ID NOs: 54, 56, 58 e 59 foram, cada uma, administradas em uma dose de 120 nmol/kg. A alteração percentual no peso corporal para cada grupo foi monitorada durante 14 dias e os resultados registrados conforme mostrado (Figura 7).

[000300] Resultados. Conforme ilustrado na Figura 7, cada grupo de animais que recebeu uma única injeção de uma das SEQ ID NOs testadas mostrou uma perda de peso significativa e constante ao longo de 14 dias do estudo em relação ao grupo que recebeu veículo apenas.

Exemplo 10: Alteração no peso corporal após uma única administração de polipeptídeos manipulados

[000301] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era 330 gramas no início do estudo. Os animais foram divididos em seis grupos (n = 5/grupo). Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. Cada grupo foidesignado para receber um dos seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO: 57 em veículo; SEQ ID NO: 60 em veículo; SEQ ID NO: 61 em veículo; SEQ ID NO: 62 em veículo. SEQ ID NOs: 54, 57, 60, 61 e 62 foram, cada uma, administradas em uma dose de 120 nmol/kg. Alteração percentual no peso corporal para cada grupo foi monitorada durante 14 dias e os resultados registrados conforme mostrado (Figura 8).

[000302] Resultados. Conforme ilustrado na Figura 8, cada grupo de animais que recebeu uma única injeção de uma das SEQ ID NOs testadas mostrou uma redução significativa e sustentada do peso corporal em relação ao grupo que recebeu veículo apenas.

Exemplo 11: Alteração no peso corporal e ingestão de alimento após uma única administração de polipeptídeos manipulados

[000303] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era de 317 gramas no início do estudo. Cada animal de teste (n = 7/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. Os animais foram divididos em quatro grupos. Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO: 63 em veículo; SEQ ID NO: 64 em veículo. SEQ ID NOS: 54, 63, e 64 foram, cada uma, administradas em uma dose de 120 nmol/kg. A alteração percentual na ingestão de alimento e peso corporal para cada grupo foi monitorada durante 14 dias e os resultados registrados conforme mostrado (Figuras 9A e 9B, respectivamente).

[000304] Resultados. Conforme representado nas Figuras 9A e 9B, cada grupo de animais que recebeu uma única injeção de uma das SEQ ID NOs testadas mostrou uma redução significativa e sustentada na ingestão de alimento (Figura 9A) e peso corporal (Figura 9B) em relação ao veículo apenas.

Exemplo 12: Alteração no peso corporal após uma única administração de polipeptídeos manipulados

[000305] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era de 330 g no início do estudo. Os animais foram divididos em seis grupos de 10. Cada animal de teste (n = 5/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO: 67 em veículo; SEQ ID NO: 68 em veículo; e SEQ ID NO: 69 em veículo. SEQ ID NOs: 54, 67, 68 e 69 foram, cada uma, administradas em uma dose de 120 nmol/kg. A alteração percentual no peso corporal para cada grupo foi monitorada durante 10 dias e os resultados registrados conforme mostrado (Figura 10).

[000306] Resultados. Conforme representado na Figura 10, cada grupo de animais que recebeu uma única injeção de uma das SEQ ID NOs testadas exibiu uma redução significativa e sustentada do peso corporal em relação ao grupo que recebeu veículo apenas.

Exemplo 13: Alteração no peso corporal após uma única administração de polipeptídeos manipulados

[000307] Método. Ratos Sprague Dawley magros foram mantidos sob uma dieta com baixo teor de gordura durante o estudo. O peso corporal médio era de 320 gramas no início do estudo. Os animais foram divididos em seis grupos. Cada animal de teste (n = 5/grupo) recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; SEQ ID NO: 54 em veículo; SEQ ID NO: 104 em veículo; SEQ ID NO: 105 em veículo; SEQ ID NO: 106 em veículo; e SEQ ID NO: 107 em veículo. SEQ ID NOs: 54, 104, 105, 106 e 107 foram, cada uma, administradas em uma dose de 120 nmol/kg. Alteração no peso corporal para cada grupo foi monitorada durante 9 dias e os resultados registrados conforme mostrado (Figuras 11A a 11C).

[000308] Resultados. Conforme representado na Figura 11, cada grupo de animais que recebeu uma única injeção de uma das SEQ ID NOS testadas exibiu uma redução significativa e sustentada na ingestão de alimento (Figura 11A) e peso corporal (Figuras 11B e 11C) em relação ao veículo isoladamente.

Exemplo 14: Determinação de afinidade parapolipeptídeos que se ligam à albumina

[000309] Neste exemplo, Composto 2 e Composto 15 foram caracterizados pela afinidade em diferentes variantes de albumina.

Material e Métodos

[000310] Todos os estudos foram realizados sobre um sistema BioRad ProteOn XPR36 usando um chip sensor GLC a 25 graus C. Para acoplamento de amina, o chip GLC foi ativado durante 5 minutos usando uma mistura a 1:1 de sulfo-NHS/EDC diluída 30 vezes a partir do estoque inicial em água, conforme mostrado abaixo. Cada amostra de albumina foi diluída para 25 μg/ml em Acetato de Na a 10 mM, pH de 5,0 e injetada durante 5 minutos sobre superfícies distintas do sensor. Cada superfície foi, então, bloqueada com etanolamina a 1 M, pH de 8,5. Cada albumina foi acoplada em uma densidade de 20005000 em unidades de ressonância.

[000311] A ligação de um polipeptídeo manipulado foi testada usando 5 nM como a maior concentração em uma série de diluições de três vezes. O tampão de operação continha HEPES a 10 mM, pH de 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM e Tween 20 a 0,005%. Todas as amostras foram testadas usando uma série de diluições de 3 vezes. Cada série de concentração foi testada em duplicata. A fase de dissociação para a maior concentração foi monitorada durante 3 horas.

Resultados

[000312] A KD relativa medida para os polipeptídeos manipulados é apresentada na Tabela 7 abaixo. Os resultados demonstram que os polipeptídeos de ligação à albumina se associam com albuminas séricas (Serum Albumin - SA) com alta afinidade.Tabela 7: KD de polipeptídeos que se ligam à albumina a variantes de albumina

Exemplo 15: Atividade funcional de leptina in vitro na presença de albumina.

[000313] Neste ensaio, o método descrito no Exemplo 2 foi usado, exceto que albumina foi adicionada ao tampão de estimulação para testar a função de leptina do Composto 2 na presença de albumina. As albuminas testadas incluíam albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin - BSA) a 0,1% ou 1%, albumina de soro de rato (Rat Serum Albumin - RSA) a 1% ou albumina de soro humano (Human Serum Albumin - HSA) a 1%. A amostra de controle foi leptina A100 com BSA a 0,1%.

[000314] Resultados. Conforme mostrado na Figura 12, não houve efeito de Albumina bovina/rato/humana a 1% sobre a atividade de EC50 gerada pelo Composto 2 no Ensaio de Função de Leptina. Os resultados são surpreendentes e mostram que os compostos terapêuticos são ativos, mesmo quando ligados à albumina.

Exemplo 16: Perfis farmacocinéticos prolongadosconferidos por polipeptídeos manipulados após injeções subcutâneas em ratos

[000315] Este estudo foi realizado para avaliar o Composto 2 e o Composto 15 em ratos ao comparar seus perfis de concentração no sangue versus tempo, ou seja, perfis farmacocinéticos.

[000316] Ratos foram colocados em grupos de tratamento. Composto 2 foi administrado por via subcutânea a 30 nmol/kg, 60 nmol/kg ou 120 nmol/kg. Amostras de sangue foram tomadas em pré, 12, 24, 48, 96 e 144 horas pós-administração na veia caudal lateral. A concentração de Composto 2 no plasma foi medida por meio de um método de ensaio imunoenzimétrico.

[000317] Composto 15 foi administrado por via subcutânea a 120 nmol/kg. Amostras de sangue foram tomadas em pré, 0,5, 1, 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas pós-administração na veia caudal lateral. A concentração de Composto 15 no plasma foi medida por meio de um método de ensaio imunoenzimétrico.

[000318] Composto 2 (Figura 13) e Composto 15 (Figura 14) exibiram perfis prolongados no plasma versus tempo.

Exemplo 17: Efeito de polipeptídeos manipulados mediados por receptores de leptina

[000319] Método. Ratos Sprague Dawley magros e ratos ZDF foram usados para este estudo. Ratos ZDF têm uma mutação (fa) a qual resulta em um receptor de leptina encurtado o qual não interage eficazmente com leptina. A média de peso corporal foi de 225 gramas no início do estudo. Os animais foram divididos em dois grupos (n = 5/grupo). Cada grupo foi designado para receber um dos seguintes: veículo; Cmpd 2 a 2,7 mg/kg em veículo. Cada animal de teste recebeu uma única injeção subcutânea no tempo = 0. Variação de peso corporal (% corrigido para veículo) foi monitorada e os resultados registrados conforme ilustrado (Figuras 15A, 15B)). Compostosadministrados: Veículo (círculo sólido); Cmpd 2 a 2,7 mg/kg (quadrado sólido).

[000320] Resultados. Conforme representado nas Figuras 15A e 15B, Composto 2 não é eficaz em ratos ZDF, indicando que seus efeitos são mediados via receptores de leptina.

Exemplo 18: Moderação de dose com polipeptídeos manipulados

[000321] Este estudo comparou doses de A500 (SEQ ID NO: 33) e Composto 2 (SEQ ID NO: 54) necessárias para atingir uma quantidade similar de perda de peso em ratos magros sensíveis à leptina. Os resultados são mostrados na Figura 16. Composto 2 dosado a 120 nmol/kg/semana obtém uma perda de peso de 18% corrigida para veículo. Para obter a mesma quantidade de perda de peso com A500, é necessária uma dose BID de 120 nmol/kg/d ou 1680 nmol/kg por injeção (120 por injeção x 2 para BID x 7 dias) ao longo de uma semana. Sem pretender estar preso a qualquer teoria, esta "moderação de dose" pode ser pelo menos parcialmente atribuível ao perfil PK aprimorado do Composto 2 com relação à A500.

Exemplo 19: Solubilidade de polipeptídeosmanipulados

[000322] Conforme apresentado na Tabela 8 abaixo, os polipeptídeos manipulados descritos aqui têm uma solubilidade surpreendentemente elevada em pH neutro.

[000323] A solubilidade foi medida com o ensaio a seguir: 6-10 mg de proteínas purificadas foram concentrados a 4 °C com unidades de filtro centrífugo (Amicon Ultra-15 ou Ultra-4, com corte de MW de 3 kDa; Millipore) para um volume de menos de 0,5 ml. Elas foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para remover os precipitados e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. As proteínas foram deixadas equilibrar durante a noite em temperatura ambiente no escuro, em seguida, foram filtradas com filtros paraseringa de 0,22 mícrons (Milex GV; Millipore) para remover os precipitados. A absorbância a OD280 foi medida com umespectrofotômetro NanoDrop e a concentração foi calculada usando o coeficiente de extinção molar teórico da proteína.Tabela 8. Solubilidade de polipeptídeos manipulados

Exemplo 20: Estabilidade de polipeptídeosmanipulados

[000324] Conforme apresentado na Tabela 9 a seguir, os polipeptídeos manipulados descritos aqui são quimicamente estáveis. Compostos foram formulados a 1 mg/mL em soluções tampão de diferentes pH's. Conforme mostrado na Tabela 9, polipeptídeos quiméricos têm boa potência (Tabela 9A) e pureza (Tabela 9B), após duas semanas a 40 °C, conforme determinado por cromatografia de líquido de elevado desempenho (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) de fase reversa.Tabela 9A. Potência de polipeptídeos manipulados

aPotência = área de pico principal da área padrãoTabela 9B. Pureza de polipeptídeos manipulados

Exemplo 21: Estabilidade de polipeptídeosmanipulados

[000325] Conforme apresentado na Tabela 10 a seguir, os polipeptídeos manipulados descritos aqui são quimicamente estáveis. Composto 15 foi formulado em três concentrações diferentes no tampão no tampão a seguir: ácido glutâmico a 10 mM, glicina a 2%, sacarose a 1%, Tween 20 a 0,01%, pH de 4,25 e armazenado a 5 °C, 15 °C ou 25 °C. Conforme mostrado na Tabela 10, Composto 15 é quimicamente estável a 10, 20 e 30 mg/mL durante pelo menos 1 mês a 5-25 °C, conforme determinado por HPLC.Tabela 10. Estabilidade de polipeptídeos manipulados

Exemplo 22: Estabilidade de polipeptídeosmanipulados

[000326] Conforme apresentado na Tabela 11 a seguir, polipeptídeos manipulados descritos aqui são fisicamente estáveis. Composto 15 foi formulado em três concentrações diferentes no tampão a seguir: ácido glutâmico a 10 mM, glicina a 2%, sacarose a 1%, Tween 20 a 0,01%, pH de 4,25 e armazenado a 37 °C. Conforme mostrado na Tabela 11, Composto 15 é fisicamente estável a 10, 20 e 30 mg/mL durante pelo menos 1 mês, conforme determinado por análise visual.Tabela 11. Estabilidade de polipeptídeos manipulados

Exemplo 23: Estabilidade de polipeptídeosmanipulados

[000327] Os polipeptídeos manipulados descritos aqui são fisicamente estáveis. A Tabela 12 mostra os resultados de cromatografia por exclusão de tamanho (Size Exclusion Chromatography - SEC) realizada em A100, ABD1-HuFoca e ABD1- A500. Os polipeptídeos manipulados mostram pouca ou nenhuma auto-associação a dímero/oligômero, comparado com A100.Tabela 12. Estabilidade de polipeptídeos manipulados

Pk 1 = Monômero Pk 2 = Dímero Pk 3 = Oligômero (Trímero/Tetrâmero) Método SEC: Coluna - Tosoh TSK Gel G3000 SW x 1, 7,8 mm x 30 cm (# 08541) Fase móvel - fosfato de Na a 10 mM, pH de 7,4 + NaCl a 238 mM + KCl a 2,7 mM Tempo de operação - 22 min Taxa de Fluxo - 0,8 mL/min Temp Coluna - 25 °C Temp Amostra - 5 °C Carga de amostra - 40 μg Detecção - 214 nm

Exemplo 24: Sinergia da amilina e leptina está ausente em indivíduos com alto IMC

[000328] Estudos anteriores tinham descrito sinergia entre amilina/leptina em ratos pesando 500-550 gramas. Após uma relação inversa entre a eficácia e IMC ter sido notada, nós avaliamos os efeitos da combinação em ratos muito obesos (750 gramas) e em ratos muito obesos que tiveram alimento restringido para a faixa moderadamente obesa (500-550 g) antes de iniciar o tratamento com fármaco.

[000329] Neste estudo, um grupo de ratos muito obesos (750 g) foi deixado se alimentar ad libitum e foi tratado com amilina, leptina ou a combinação de amilina + leptina. Embora a amilina fosse eficaz, não houve nenhuma sinergia evidente com a adição de leptina. Um segundo grupo de ratos muito obesos (750 g) teve calorias restringidas para a faixa de 500-550 g, no qual sinergia foi previamente demonstrada. Estes animais, então, começaram o tratamento com amilina/leptina e foram deixados se alimentar ad libitum. A Figura 17 mostra os resultados do estudo. Rápida recuperação de peso foi evidente em ratos tratados por monoterapia com veículo e leptina. Alguma manutenção de peso foi obtida com a monoterapia com amilina. Nenhuma manutenção de peso adicional foi obtida com a combinação. Estes resultados sugerem que a falta de sinergia em roedores com "alto" IMC não pode simplesmente ser recuperada por uma dieta de baixa caloria.

Exemplo 25: Sinergia de polipeptídeos manipulados com agonistas de amilina

[000330] Este estudo examinou se uma administração uma vez por semana de PEG-amilina de rato (Des-Lys1-[Lys26 (mPEG40K)]-amilina de rato, Composto 124) seria suficiente para sinergia quando co-administrada com ABD1-A500 (Composto 2). Para comparação, ABD1-A500 também foi co-administrada com amilina de rato infundida (Fig. 18A). A Figura 18B mostra que, embora PEG-amilina de rato tenha induzido à perda de peso, esta é um pouco mais lenta e de menor magnitude, a quantidade global de perda de peso (e sinergia) é qualitativamente similar àquela obtida pela amilina de rato infundida. Amilina foi administrada a 50 μ/kg/d por meio de uma mini bomba osmótica SC, PEG-amilina de rato foi administrada a 125 nmol/kg uma vez por semana e ABD1-A500 foi administrada a 120 nmol/kg uma vez por semana a ratos Harlan Sprague Dawley machos com obesidade induzida pela dieta (Diet Induced Obese - DIO) de 500 g de peso médio.

Exemplo 26: Sinergia de polipeptídeos manipulados com agonistas de amilina

[000331] Este estudo mostra que a administração uma vez por semana de ABD1-HuFoca (Composto 15) é suficiente para sinergia quando co-administrado com amilina de rato infundida. A Figura 19 mostra que a combinação do polipeptídeo manipulado e amilina infundida resultou em menor consumo de alimento (Figura 19A) e maior perda de peso (Figura 19B) do que os resultados observados para cada um dos agentes isoladamente. ABD1-HuFoca foi administrado a 120 nmol/kg e amilina foi administrada a 50 ug/kg/d por meio de uma mini bomba osmótica SC a ratos machos DIO HSD de 500 g de peso médio.

Exemplo 27: Sinergia de polipeptídeos manipulados com agonistas de amilina

[000332] Este estudo mostra que a administração uma vez por semana de ABD1-HuFoca (Composto 15) é suficiente para sinergia quando co-administrado com uma administração duas vezes por semana de PEG-amilina de rato (Des-Lys1-[Lys26 (mPEG40K)]-amilina de rato, Composto 124). A Figura 20 mostra que a combinação do polipeptídeo manipulado e PEG-amilina de rato resultou em maior perda de peso do que os resultados observados para cada um dos agentes isoladamente. ABD1-HuFoca foi administrado a 120 nmol/kg e PEG-amilina foi administrada a 125 nmol/kg a ratos machos DIO HSD de 500 g de peso médio.

Exemplo 28: Sinergia de polipeptídeos manipulados com agonistas de amilina em população com alto IMC

[000333] A Figura 21A mostra os resultados de estudos anteriores que descrevem a sinergia de amilina/leptina em ratos pesando 500550 gramas. A Figura 21B mostra que esta sinergia não é observada em uma população de ratos com alto IMC (peso médio de 700 g). A Figura 21C mostra que a administração uma vez por semana de ABD1-A500 (Composto 15) é suficiente para sinergia quando co- administrado com uma administração duas vezes por semana de PEG-amilina de rato (Des-Lys1-[Lys26 (mPEG40K)]-amilina de rato, Composto 124) em ratos com alto IMC. ABD1-A500 foi administrado a 120 nmol/kg e PEG-amilina foi administrada de 5 a 125 nmol/kg a ratos machos DIO HSD de 700 g de peso médio.

Exemplo 29: Sinergia de polipeptídeos manipulados com agonistas de amilina em uma população de alto IMC

[000334] Este estudo mostra que a administração uma vez por semana de ABD1-HuFoca (Composto 15) ou ABD1-A500 (Composto 2) é suficiente para sinergia quando co-administrado com amilina de rato infundida a ratos com alto IMC. ABD1-HuFoca (Figura 22A) ou ABD1-A500 (Figura 22B) foi administrado a 120 nmol/kg e amilina foi administrada a 50 μg/kg/d por meio de uma mini bomba osmótica SC a ratos machos DIO HSD de 700 g de peso médio.

Exemplo 30: Efeitos anti-diabéticos dos polipeptídeos manipulados sobre ratos não obesos com diabetes do tipo 1

[000335] O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos in vivo de polipeptídeos manipulados sobre endpoints metabólicos e diabéticos chave em um modelo de diabetes mellitus do tipo 1 (T1DM) em camundongo por alta dose de STZ. Camundongos machos C57 BL/6 receberam uma única injeção de STZ interperitoneal a 200 mg/kg para induzir ao diabetes do tipo 1. Compostos foram administrados duas vezes por semana por via subcutânea a 120 nmol/kg durante duas semanas. Endpoints medidos incluíram níveis de HbA1c, níveis de glicose, peso corporal e ingestão de alimento.

[000336] A Figura 23 mostra que tanto Composto 15 quanto Composto 2 normalizaram a glicose no sangue em ratos com diabetes induzido por STZ. Ambos os polipeptídeos manipulados também reduziram os níveis de hemoglobina A1c, conforme mostrado na Figura 24 e reduziram o peso corporal e a ingestão cumulativa de alimento, conforme mostrado na figura 25.

[000337] A fim de garantir que os efeitos de diminuição de glicose da terapia não são em virtude dos efeitos da insulina, um outro estudo foi conduzido para combinar a terapia com leptina com uma baixa dose de insulina. Composto 15 foi administrado com ou sem a adição de uma dose de 0,05 U/dia de insulina em um modelo de T1DM em camundongo por alta dose de STZ. Camundongos machos C57 BL/6 receberam uma única injeção de STZ interperitoneal a 175 mg/kg para induzir ao diabetes do tipo 1. Os compostos foram administrados duas vezes por semana por via subcutânea a 60 nmol/kg durante duas semanas. Endpoints medidos incluíram níveis de HbA1c, níveis de glicose, peso corporal e ingestão de alimento.

[000338] A Figura 26 mostra um efeito de diminuição da glicose potencializado com uma baixa dose de insulina na forma de um aditivo ao Composto 15. Ele também reduz os níveis de hemoglobina A1c, conforme mostrado na Figura 27 e reduz o peso corporal e ingestão cumulativa de alimento, conforme mostrado na Figura 28.

VIII. Modalidades

[000339] Seguem modalidades adicionais dos polipeptídeos manipulados, do método de uso dos mesmos e das composições farmacêuticas descritas aqui:

[000340] Modalidade 1. Um polipeptídeo manipuladocompreendendo: um peptídeo com domínio de ligação à albumina (ABD) e um primeiro domínio peptídico hormonal (HD1) selecionado dentre uma leptina, um análogo de leptina ou um fragmento ativo da mesma.

[000341] Modalidade 2. O polipeptídeo manipulado de acordo com a Modalidade 1, ainda compreendendo um primeiro ligante (L1) covalentemente ligado ao referido HD1.

[000342] Modalidade 3. O polipeptídeo manipulado de acordo com a Modalidade 1 ou 2, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende o referido ABD como uma porção N-terminal e o referido HD1 como uma porção C-terminal.

[000343] Modalidade 4. O polipeptídeo manipulado de acordo com a Modalidade 1 ou 2, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende o referido ABD como uma porção de C-terminal e O referido HD1 como uma porção N-terminal.

[000344] Modalidade 5. O polipeptídeo manipulado de acordo com a Modalidade 3, compreendendo a estrutura: ABD-HD1.

[000345] Modalidade 6. O polipeptídeo de acordo com a engenharia Modalidade 3, compreendendo a estrutura: ABD-L1-HD1.

[000346] Modalidade 7. O polipeptídeo manipulado de acordo com a Modalidade 4, 25 compreendendo a estrutura: HD1-ABD.

[000347] Modalidade 8. O polipeptídeo manipulado de acordo com a Modalidade 4, compreendendo a estrutura: HD1-L1-ABD.

[000348] Modalidade 9. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 8, em que o referido HD1 é uma leptina, um análogo de leptina, um fragmento ativo de leptina ou um derivado de leptina.

[000349] Modalidade 10. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 9, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146.

[000350] Modalidade 11. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 10, em que o referido HD1 tem pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146.

[000351] Modalidade 12. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 11, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% de identidade com uma leptina humana.

[000352] Modalidade 13. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 12, em que o referido HD1 tem pelo menos 90% de identidade com uma leptina humana.

[000353] Modalidade 14. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 13, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% com SEQ ID NO: 20.

[000354] Modalidade 15. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 14, em que o referido HD1 tem pelo menos 90% com SEQ ID NO: 20.

[000355] Modalidade 16. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 15, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% com uma leptina de ornitorrinco.

[000356] Modalidade 17. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 16, em que o referido HD1 tem pelo menos 50% com uma leptina de foca.

[000357] Modalidade 18. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 17, em que o referido HD1 tem de 1 a 5 modificações de aminoácidos selecionados independentemente de qualquer um ou uma combinação de uma inserção, deleção, adição ou substituição.

[000358] Modalidade 19. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146.

[000359] Modalidade 20. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 19, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146.

[000360] Modalidade 21. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 1.

[000361] Modalidade 22. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 2.

[000362] Modalidade 23. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 3.

[000363] Modalidade 24. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 4.

[000364] Modalidade 25. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 5.

[000365] Modalidade 26. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 6.

[000366] Modalidade 27. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 7.

[000367] Modalidade 28. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 8.

[000368] Modalidade 29. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 9.

[000369] Modalidade 30. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 10.

[000370] Modalidade 31. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 11.

[000371] Modalidade 32. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 12.

[000372] Modalidade 33. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 13.

[000373] Modalidade 34. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 14.

[000374] Modalidade 35. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 15.

[000375] Modalidade 36. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 16.

[000376] Modalidade 37. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 17.

[000377] Modalidade 38. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 18.

[000378] Modalidade 39. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 19.

[000379] Modalidade 40. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 20.

[000380] Modalidade 41. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 21.

[000381] Modalidade 42. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 22.

[000382] Modalidade 43. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 23.

[000383] Modalidade 44. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 24.

[000384] Modalidade 45. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 25.

[000385] Modalidade 46. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 26.

[000386] Modalidade 47. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 27.

[000387] Modalidade 48. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 28.

[000388] Modalidade 49. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 29.

[000389] Modalidade 50. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 30.

[000390] Modalidade 51. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 31.

[000391] Modalidade 52. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 32.

[000392] Modalidade 53. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 33.

[000393] Modalidade 54. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 53, em que o referido ABD compreende um motivo de ligação à albumina (ABM), que consiste na sequência de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 X23 X24 X25 I AL (SEQ ID NO: 34) em que, independentemente uns dos outros, X5 é selecionado dentre Y e F; X8 é selecionado dentre N, P e S; X9 é selecionado dentre V, I, L, M, F e Y; X11 é selecionado dentre S e D; X12 é selecionado dentre R, K e N; X14 é selecionado dentre K e R; X20 é selecionado dentre D, N, Q, E, H, S, R e K; X23 é selecionado dentre K, I e T; X24 é selecionado dentre A, S, T, G, H, L e D, e X25 é selecionado de H e D.

[000394] Modalidade 55. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 54 em que, independentemente uns dos outros: X5 é Y; X8 é N; X23 é T ou I; X24 é S ou L; e X25 é E ou H.

[000395] Modalidade 56. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 55, em que o motivo de ligação à albumina compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada do grupo que consiste em: GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO: 114) e GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO: 115) .

[000396] Modalidade 57. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 56, em que o referido ABD compreende um motivo de ligação à albumina (ABM) que não é GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 35).

[000397] Modalidade 58. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 57, em que o referido ABD compreende um ABM descrito na Tabela 1.

[000398] Modalidade 59. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 58, em que o referido ABD compreende a sequência de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY -[ABM]-LAALP (SEQ ID NO: 36) em que: [ABM] é um motivo de ligação à albumina, e, independentemente uns dos outros, Xa é selecionado dentre V e E; Xb é selecionado dentre L e D; Xc é selecionado dentre N, L e I; Xd é selecionado dentre R e K; Xe é selecionado dentre D e K; a leucina na posição 45 está presente ou ausente; e a prolina na posição 46 está presente ou ausente.

[000399] Modalidade 60. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 59 em que, independentemente uns dos outros: Xa é E; Xb é D; Xc é I; e Xd é K.

[000400] Modalidade 61. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 60, em que o polipeptídeo com domínio de ligação à albumina (ABD) compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada do grupo que consiste em: LAEABCEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLH ILAALP (SEQ ID NO: 50) e LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLFNKAKTVEGVEALISEIL AALP (SEQ ID NO: 51).

[000401] Modalidade 62. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 61, em que o referido ABD compreende a sequência de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY-[ABM]-LAALP (SEQ ID NO: 36) em que: [ABM] é um motivo de ligação à albumina, e, independentemente uns dos outros, Xa é selecionado dentre V e E; Xb é selecionado dentre L e D; Xc é selecionado dentre N, L e I; Xd é selecionado dentre R e K; Xe é selecionado dentre D e K; e a leucina na posição 45 está presente ou ausente; a prolina na posição 46 está presente ou está ausente; e em que ABM consiste na sequência de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X9 X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 (SEQ ID NO: 34) em que, independentemente uns dos outros, X5 é selecionado dentre Y e F; X8 é selecionado dentre N, P e S; X9 é selecionado dentre V, I, L, M, F e Y; X11 é selecionado dentre, S e D; X12 é selecionado dentre R, K e N; X14 é selecionado dentre K e R; X20 é selecionado dentre D, N, Q, E, H, S, R e K; X23 é selecionado dentre K, I e T; X24 é selecionado dentre A, S, T, G, H, L e D; e X25 é selecionado dentre H e D.

[000402] Modalidade 63. O polipeptídeo manipulado de acordo com a qualquer uma das Modalidades 1 a 62, em que o referido ABD compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos que é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, 10 SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52.

[000403] Modalidade 64. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 63, em que o referido ABD compreende qualquer um dos peptídeos selecionados do grupo que consiste em: LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSYINRAKTVEGVHTLIGHILAALP (SEQ ID NO: 38), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHILAALP (SEQ ID NO: 39), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHILAALP (SEQ ID NO: 40), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHILAALP (SEQ ID NO: 41), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVSSLKGHILAALP (SEQ ID NO: 42), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 43), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHILAALP (SEQ ID NO: 44), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHILAALP (SEQ ID NO: 45), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVNSLTSHILAALP (SEQ ID NO: 46), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADILAALP (SEQ ID NO: 47), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHILAALP (SEQ ID NO: 48), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP (SEQ ID NO: 49), LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHILAALP (SEQ ID NO: 50), LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO: 51) e LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEILAALP (SEQ ID NO: 52).

[000404] Modalidade 65. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 64, em que o referido ligante L1 é um peptídeo de 1 a 30 aminoácidos ou menos de 30 aminoácidos.

[000405] Modalidade 66. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 5 1 a 65, em que o referido ligante L1 é selecionado dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente.

[000406] Modalidade 67. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 66, em que o referido ligante L1 é um aminoácido não natural incorporado por síntese química, modificação química pós-traducional ou por meio de incorporação in vivoatravés de expressão recombinante em uma célula hospedeira.

[000407] Modalidade 68. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 67, em que os aminoácidos do referido ligante L1 são selecionados de serina, glicina, alanina, asparagina, prolina, glutamina, glutamato, aspartato e lisina.

[000408] Modalidade 69. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 68, em que o referido ligante L1 compreende uma maioria de aminoácidos que não são estericamente impedidos.

[000409] Modalidade 70. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 69, em que o referido ligante L1 compreende um ou mais dos seguintes: um ligante ácido, um ligante básico e um motivo estrutural.

[000410] Modalidade 71. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 70, em que o referido ligante L1 compreende poliglicina, polialanina, poli(Gly-Ala) ou poli(Gly-Ser).

[000411] Modalidade 72. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 71, em que o referido ligante L1 compreende uma poliglicina de (Gly)3, (Gly)4 ou (Gly)5.

[000412] Modalidade 73. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 72, em que o referido ligante L1 compreende (Gly)3Lys(Gly)4, (Gly)3AsnGlySer(Gly)2, (Gly)3Cys(Gly)4 e GlyProAsnGlyGly.

[000413] Modalidade 74. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 73, em que o referido ligante L1 compreende uma combinação de Gly e Ala.

[000414] Modalidade 75. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 74, em que o referido ligante L1 compreende uma combinação de Gly e Ser.

[000415] Modalidade 76. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 75, em que o referido ligante L1 compreende uma combinação de Gly e Glu.

[000416] Modalidade 77. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 76, em que o referido ligante L1 compreende uma combinação de Gly e Lys.

[000417] Modalidade 78. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 77, em que o referido ligante L1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: [Gly-Ser]n, [Gly-Gly-Ser]n, [Gly-Gly-Gly-Ser]n e [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 10 6, 7, 8, 9 ou 10.

[000418] Modalidade 79. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 78, em que o referido ligante L1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: [Gly-Glu]n, [Gly-Gly-Glu]n, [Gly-Gly-Gly-Glu]n, [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n, [Gly-Asp]n, [Gly-Gly-Asp]n, [Gly-Gly-Gly-Asp]n, [Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n, onde n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

[000419] Modalidade 80. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 79, em que o referido ligante L1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: [Gly-Glu]n, [Gly-Gly-Glu]n, [Gly-Gly-Gly-Glu]n, [Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n, [Gly-Asp]n, [Gly-Gly-Asp]n, [Gly-Gly-Gly-Asp]n, [Gly-Gly-Gly -Gly-Asp]n, onde n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

[000420] Modalidade 81. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 80, em que o referido ligante L1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: [Gly-Lys]n, [Gly-Gly-Lys]n, [Gly-Gly-Gly-Lys]n, [Gly-Gly-Gly-Gly-Lys]n, [Gly-Arg]n, [Gly-Gly-Arg]n, [Gly-Gly-Gly-Arg]n, [Gly-Gly-Gly-Gly-Arg]n, onde n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

[000421] Modalidade 82. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 81, em que o referido ligante L1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n, onde n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.

[000422] Modalidade 83. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 81, em que o referido ligante L1 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: [Gly-Gly-Glu]6[Gly-Gly-Lys]6, [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3, [Glu-Ala-Ala-Ala- Lys]4 ou [Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5.

[000423] Modalidade 84. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 83, em que o referido ligante L1 compreende um dipeptídeo TG N-terminal.

[000424] Modalidade 85. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 84, em que o referido ligante L1 compreende um dipeptídeo AS C-terminal.

[000425] Modalidade 86. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 85, em que o referido ligante L1 compreende um dipeptídeo TG N-terminal e um dipeptídeo AS C- terminal.

[000426] Modalidade 87. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 86, em que o referido ligante L1 compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada do grupo que consiste em TG-(GGGS)1, TG-(GGGS)2, TG-(GGGS)3, TG- (GGGS)4, TG-(GGGS)5, (GGGS)1-AS, (GGGS)2-AS, (GGGS)3-AS, (GGGS)4-AS, (GGGS)5-AS, TG-(GGGS)1-AS, TG-(GGGS)2-AS, TG- (GGGS)3-AS, TG-(GGGS)4-AS e TG-(GGGS)5-AS.

[000427] Modalidade 88. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 87, em que o referido dipeptídeo TG e/ou o referido dipeptídeo AS estão ausentes ou são substituídos por um par de aminoácidos selecionados de T, A, S e G.

[000428] Modalidade 89. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 88, em que o referido polipeptídeo compreende adicionalmente um ou mais ligantes adicionais.

[000429] Modalidade 90. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 89, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63,SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 e SEQ ID NO: 107.

[000430] Modalidade 91. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 53.

[000431] Modalidade 92. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 54.

[000432] Modalidade 93. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 55.

[000433] Modalidade 94. A engenharia de polipeptídeo de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 56.

[000434] Modalidade 95. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 57.

[000435] Modalidade 96. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 58.

[000436] Modalidade 97. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 59.

[000437] Modalidade 98. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 60.

[000438] Modalidade 99. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 61.

[000439] Modalidade 100. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 62.

[000440] Modalidade 101. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 63.

[000441] Modalidade 102. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 64.

[000442] Modalidade 103. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 65.

[000443] Modalidade 104. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 66.

[000444] Modalidade 105. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 67.

[000445] Modalidade 106. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 68.

[000446] Modalidade 107. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 69.

[000447] Modalidade 108. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 70.

[000448] Modalidade 109. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 71.

[000449] Modalidade 110. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 72.

[000450] Modalidade 111. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 73.

[000451] Modalidade 112. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 74.

[000452] Modalidade 113. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 75.

[000453] Modalidade 114. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 76.

[000454] Modalidade 115. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 77.

[000455] Modalidade 116. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 78.

[000456] Modalidade 117. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 79.

[000457] Modalidade 118. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 80.

[000458] Modalidade 119. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 81.

[000459] Modalidade 120. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 82.

[000460] Modalidade 121. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 83.

[000461] Modalidade 122. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 84.

[000462] Modalidade 123. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 85.

[000463] Modalidade 124. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 86.

[000464] Modalidade 125. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 87.

[000465] Modalidade 126. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 88.

[000466] Modalidade 127. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 89.

[000467] Modalidade 128. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 90.

[000468] Modalidade 129. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 91.

[000469] Modalidade 130. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 92.

[000470] Modalidade 131. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 93.

[000471] Modalidade 132. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 94.

[000472] Modalidade 133. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 95.

[000473] Modalidade 134. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 96.

[000474] Modalidade 135. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 97.

[000475] Modalidade 136. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 98.

[000476] Modalidade 137. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 99.

[000477] Modalidade 138. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 100.

[000478] Modalidade 139. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 102.

[000479] Modalidade 140. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 102.

[000480] Modalidade 141. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 103.

[000481] Modalidade 142. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 104.

[000482] Modalidade 143. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 105.

[000483] Modalidade 144. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 90, em que o referido polipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 106.

[000484] Modalidade 145. O segundo polipeptídeo manipulado com qualquer uma das Modalidades 5 1 a 90, em que o referidopolipeptídeo manipulado compreende a sequência de aminoácidos selecionada apresentada em SEQ ID NO: 107.

[000485] Modalidade 146. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 145, tendo afinidade pela albumina sérica com uma constante de dissociação menor do que cerca de 10-6 mol/L.

[000486] Modalidade 147. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 146, tendo afinidade pela albumina sérica com uma constante de dissociação menor do que cerca de 10-9 mol/L.

[000487] Modalidade 148. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 147, tendo afinidade pela albumina sérica com uma constante de dissociação menor do que cerca de 10-12 mol/L.

[000488] Modalidade 149. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 148, em que o polipeptídeo tem uma duração de ação de pelo menos 1 dia.

[000489] Modalidade 150. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 149, em que o polipeptídeo tem uma duração de ação de pelo menos 3 dias.

[000490] Modalidade 151. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 150, em que o polipeptídeo tem uma duração de ação de pelo menos 5 dias.

[000491] Modalidade 152. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 151, em que o polipeptídeo tem uma duração de ação de pelo menos 5 dias em um indivíduo humano.

[000492] Modalidade 153. Um método para tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo compreendendo a administração de um polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 152 e 170-192 a um indivíduo que precisa do mesmo em uma quantidade eficaz para tratar a referida doença ou distúrbio.

[000493] Modalidade 154. O método de acordo com a Modalidade 153, em que a referida doença ou distúrbio pode ser lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, obesidade, amenorreia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso, diabetes (incluindo Tipo I e Tipo II), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e síndrome X metabólica.

[000494] Modalidade 155. O método de acordo com a Modalidade 153 ou 154, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, obesidade, amenorreia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso ou diabetes.

[000495] Modalidade 156. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 153 a 155, em que a referida doença ou distúrbio é diabetes do tipo I ou diabetes do tipo II.

[000496] Modalidade 157. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 153 a 155, em que a referida doença ou distúrbio é obesidade.

[000497] Modalidade 158. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 153 a 155, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia ou deficiência de leptina.

[000498] Modalidade 159. Uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 152 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[000499] Modalidade 160. A composição farmacêutica de acordo com a Modalidade 159, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica injetável.

[000500] Modalidade 161. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Modalidades 159 a 160, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica com liberação sustentada ou de longa duração.

[000501] Modalidade 162. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Modalidades 159 a 161, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para administração uma vez ao dia.

[000502] Modalidade 163. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Modalidades 159 a 161, em que a referida composição farmacêutica é uma composição farmacêutica para administração uma vez por semana.

[000503] Modalidade 164. Uma composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades 159 a 163 para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

[000504] Modalidade 165. A composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das Modalidades 159 a 164, em que a doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, obesidade, amenorreia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso, diabetes (incluindo Tipo I e Tipo II), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e síndrome X metabólica.

[000505] Modalidade 166. A composição farmacêutica da Modalidade 164 ou 165, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, obesidade, amenorreia hipotalâmica, mal de Alzheimer, deficiência de leptina, doença do fígado gorduroso ou diabetes.

[000506] Modalidade 167. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 164 a 166, em que a referida doença ou distúrbio é diabetes do tipo I ou diabetes do tipo II.

[000507] Modalidade 168. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 164 a 166, em que a referida doença ou distúrbio é obesidade.

[000508] Modalidade 169. O método de acordo com qualquer uma das Modalidades 164 a 166, em que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia ou deficiência de leptina.

[000509] Modalidade 170. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18, em que o referido HD1 é selecionado do grupo que consiste em:(a) a sequência de aminoácidos 1-146 de uma leptina selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID 25 NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID N0: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146, em que um aminoácido diferente é substituído em uma ou mais das seguintes posições e retendo a mesma numeração (mesmo na ausência de um resíduo de glutaminila na posição 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145; (b) a sequência de aminoácidos da sub-parte (a), na qual o resíduo de glutaminila na posição 28 está ausente; (c) a sequência de aminoácidos das sub-partes (a) ou (b), na qual um resíduo de metionila é adicionado ao N-terminal; (d) uma leptina que consiste em um fragmento da sequência de aminoácidos de (a), (b) ou (c) selecionada do grupo que consiste em: (i) aminoácidos 98-146; (ii) aminoácidos 1-32; (iii) aminoácidos 40-116, (iv) aminoácidos 1-99 e 112-146; (v) aminoácidos 1-99 e 112-146, em que um ou mais dos aminoácidos 100-111 estão colocados entre os aminoácidos 99 e 112; (vi) a sequência de aminoácidos da sub-parte (i) em que um ou mais dos aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoácido, (vii) a sequência de aminoácidos da sub-parte (ii) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 8 e 32 são substituídos por outro aminoácido, (viii) a sequência de aminoácidos da sub-parte (iii), em que um ou mais dos aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 e 112 são substituídos por outro aminoácido, (ix) a sequência de aminoácidos da sub-parte (iv) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 30 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoácido; e (x) a sequência de aminoácidos da sub-parte (v) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoácido; (xi) a sequência de aminoácidos de qualquer uma das sub- partes (i) - (x), em que uma metionina foi adicionada ao N-término; (e) a sequência de aminoácidos de qualquer uma das sub- partes (a) a (d) em que a referida sequência de aminoácidos está ligada a uma porção química; (f) a sequência de aminoácidos da sub-parte (e) em que a referida porção química é uma porção polimérica solúvel em água; (g) a sequência de aminoácidos da subparte (f) em que a referida porção polimérica solúvel em água é selecionada do grupo que consiste em: polietileno glicol, um copolímero de etileno glicol/propileno glicol, uma carbóxi metil celulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, um poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, um copolímero de etileno/anidrido maleico, um homopolímero de poliaminoácido, um copolímero aleatório de poliaminoácido, uma albumina, uma proteína Fc, uma poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, um homopolímero de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, um poliol polioxietilado, um álcool polivinílico, um propionaldeído polietileno glicol, um succinato e um estireno; (h) a sequência de aminoácidos da subparte (g) em que a referida porção polimérica solúvel em água é um polietileno glicol e; (i) a sequência de aminoácidos da subparte (g) em que o referido polímero solúvel em água é um poliaminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em: uma albumina, um anticorpo, uma proteína Fc e uma porção de polilisina.

[000510] Modalidade 171. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 170, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que uma ou mais substituições de aminoácidos foram feitas.

[000511] Modalidade 172. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 10 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que uma substituição de aminoácidos foi feita.

[000512] Modalidade 173. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 20 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; no qual duas substituições de aminoácidos foram feitas.

[000513] Modalidade 174. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 30 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que três substituições de aminoácidos foram feitas.

[000514] Modalidade 175. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 10 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que quatro substituições de aminoácidos foram feitas.

[000515] Modalidade 176. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 20 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que cinco substituições de aminoácidos foram feitas.

[000516] Modalidade 177. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 30 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que seis substituições de aminoácidos foram feitas.

[000517] Modalidade 178. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 10 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que sete substituições de aminoácidos foram feitas.

[000518] Modalidade 179. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 20 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que oito substituições de aminoácidos foram feitas.

[000519] Modalidade 180. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 30 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que nove substituições de aminoácidos foram feitas.

[000520] Modalidade 181. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 10 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 10 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000521] Modalidade 182. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 20 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 11 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000522] Modalidade 183. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 30 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que 12 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000523] Modalidade 184. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 10 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 13 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000524] Modalidade 185. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 20 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 14 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000525] Modalidade 186. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 30 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que 15 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000526] Modalidade 187. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 10 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 16 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000527] Modalidade 188. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 20 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 17 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000528] Modalidade 189. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 30 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que 18 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000529] Modalidade 190. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 10 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 19 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000530] Modalidade 191. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID 20 NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e SEQ ID NO: 146; em que 20 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000531] Modalidade 192. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 18 e 171, em que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 e de SEQ ID NO: 146; em que 21 substituições de aminoácidos foram feitas.

[000532] Modalidade 193. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 143.

[000533] Modalidade 194. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 144.

[000534] Modalidade 195. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 145.

[000535] Modalidade 196. O polipeptídeo manipulado de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 20, em que o referido HD1 é SEQ ID NO: 146.

[000536] Embora a descrição precedente descreva a presente invenção, com exemplos fornecidos para fins de ilustração, será entendido que a prática da presente invenção abrange todas as variações habituais, adaptações ou modificações como estando dentro do âmbito da invenção reivindicada. Portanto, as descrições e os exemplos não deverão ser construídos como limitativos do âmbito da invenção, a qual é delineada pelas reivindicações em anexo.

Listagem de Sequência Informal

[000537] Segue uma listagem informal de sequências descritas aqui: VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQIS NDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVV ALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC, em que Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 1). VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSL SKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLP QTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 2). VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLS KMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQ TSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 3). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQIS NDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVV ALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC, em que Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 4). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPIL SLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCS LPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSP EC (SEQ ID NO: 5). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSL SKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLP QTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ ID NO: 6). VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVL SLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLP QARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ ID NO: 7). MVPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPV LSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPL PQARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPG C (SEQ ID NO: 8). VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQIS NDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVA LSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC, em que Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 9). MVPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa- SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQIS NDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVA LSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC, em que Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 10). MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT QSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQI SNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEV VALSRLQGSLQD MLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 11) VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQIS NDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVV ALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC, em que: Xaa na posição 27 é T ou A ; and Xaa na posição 28 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 12). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa- SVSSKQKVTGLDFIPGLHPI LTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSC HLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDL SPGC, em que: Xaa na posição 28 é T ou A ; and Xaa na posição 29 é Q ou está ausente (SEQ ID NO: 13). VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLT LSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPL ASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 14). MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVL TLSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLP LASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 15). VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSL SKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLP QTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ ID NO: 16). MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPIL SLSKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSL PQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 17). ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNL ADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFT RSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO: 18). MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGV STDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQIS NDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVT LDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO: 19). VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 20). VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 21). VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 22). VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS KMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 23). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLS PGC (SEQ ID NO: 24). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLS PGC (SEQ ID NO: 25). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 26). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG C (SEQ ID NO: 27). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 28). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 29). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 30). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 31). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 32). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 33). MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVPIQK VQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMD QTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASG LETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 34) MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSP GC (SEQ ID NO: 35). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLS PGC (SEQ ID NO: 36). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHL PQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSP GC (SEQ ID NO: 37). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILT LSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 38). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 39). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 40). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 41). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 42). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSP EC (SEQ ID NO: 43). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPE C (SEQ ID NO: 44). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPE C (SEQ ID NO: 45). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSP EC (SEQ ID NO: 46). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSP EC (SEQ ID NO: 47). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPE C (SEQ ID NO: 48). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSL PQTSGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPE C (SEQ ID NO: 49). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSP GC (SEQ ID NO: 50). MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPIL TLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCH LPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSP EC (SEQ ID NO: 51). PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 52). MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 53). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 54). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 55). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 56). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 57). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 58). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 59). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 60). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 61). PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 62) MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 63) PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRA RGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 64) MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 65) PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 66) MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 67) PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPGC (SEQ ID NO: 68) MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 69) PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 70) MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 71) PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLS GMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPW ASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 72) MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 73). PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 74). MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 75). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 76). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSKMDQTLAVYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 77). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 78). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVP RARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLNPG C (SEQ ID NO: 79). PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 80). MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 81). PIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPR ARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ ID NO: 82) MPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVR TLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPV PRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 83) PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTL SGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 84) MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRT LSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLP WASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPG C (SEQ ID NO: 85) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 86); KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO: 87); KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 88). CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO: 89); CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO: 90); KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO: 91). X’-Xaa1-Cys2-Asn3-Thr4-Ala5-Thr6-Cys7-Ala8-Thr9-Gln10- Arg11-Leu12-Ala13-Asn14-Phe15-Leu16-Val17-His18-Ser19-Ser20-Xaa21- Asn22-Phe23- Xaa24- Xaa25- Xaa26- Xaa27- Xaa28- Xaa29-Thr30- Xaa31- Val32-Gly33-Ser34-Asn35-Thr36-Tyr37-X (SEQ ID NO: 92) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 93) KCNTATCATQRLANFLVRSSKNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 94) CNTATCATQRLANFLVRSSKNLGPVLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 95) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 96) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 97) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 98) CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 99) KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 100) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 101) CNTATCATQRLANFLVHSSKNFGPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 102) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPKLPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 103) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTKVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 104) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFKPILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 105) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGKILPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 106) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPIKPPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 107) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILKPTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 108) CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPKTNVGSNTY-NH2 (SEQ ID NO: 109)

Claims

1. Polipeptídeo construído, caracterizado pelo fato de que compreende: um polipeptídeo de domínio de ligação de albumina (ABD) que compreende um motivo de ligação à albumina (ABM) compreendendo a sequência de aminoácidos: GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 AL X23 X24 X25 I (SEQ ID NO: 34), em que, independentemente uns dos outros, X5 é selecionado dentre Y e F; X8 é selecionado dentre N, R e S; X9 é selecionado dentre V, I, L, M, F e Y; X11 é selecionado dentre N, S, E e D; X12 é selecionado dentre R, K e N; X14 é selecionado dentre K e R; X20 é selecionado dentre D, N, Q, E, H, S, R e K; X23 é selecionado dentre K, I e T; X24 é selecionado dentre A, S, T, G, H, L e D, e X25 é selecionado de H, E e D; e um primeiro domínio de hormônio de peptídeo (HD1) tendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre: (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, aminoácidos 2-147 da SEQ ID NO:31, e aminoácidos 2-147 da SEQ ID NO:33; ou (b) a sequência de aminoácidos 1-146 de uma leptina selecionada dentre: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, e SEQ ID NO:146; em que um aminoácido diferente é substituído em uma ou mais das seguintes posições e retendo a mesma numeração (mesmo na ausência de um resíduo glutaminil na posição 28): 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142, e 145; (c) a sequência de aminoácidos da subparte (b) na qual o resíduo glutaminil na posição 28 está ausente; (d) a sequência de aminoácidos das subpartes (b) ou (c) em que um resíduo metionil é adicionado ao N-terminal; (e) uma leptina que consiste em um fragmento da sequência de aminoácidos de (b), (c) ou (d) selecionada a partir de: (i) aminoácidos 98-146; (ii) aminoácidos 1-32; (iii) aminoácidos 40-116; (iv) aminoácidos 1-99 e 112-146; (v) aminoácidos 1-99 e 112-146 em que um ou mais dos aminoácidos 100-111 está colocado entre os aminoácidos 99 e 112; (vi) a sequência de aminoácidos da subparte (i) em que um ou mais dos aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 são substituídos por outro aminoácido; (vii) a sequência de aminoácidos da subparte (ii) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 8 e 32 são substituídos por outro aminoácido; (viii) a sequência de aminoácidos da subparte (iii) em que um ou mais dos aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 e 112 são substituídos por outro aminoácido; (ix) a sequência de aminoácidos da subparte (iv) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 e 145 é substituído por outro aminoácido; e (x) a sequência de aminoácidos da subparte (v) em que um ou mais dos aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 e 145 é substituído por outro aminoácido; (xi) a sequência de aminoácidos de qualquer uma das subpartes (i) (x) em que uma metionina foi adicionada ao N-terminal; (f) a sequência de aminoácidos de qualquer uma das subpartes (b) a (e) em que a referida sequência de aminoácidos está ligada a uma porção química; (g) a sequência de aminoácidos da subparte (f) em que a referida porção química é uma porção de polímero solúvel em água; (h) a sequência de aminoácidos da subparte (g) em que a referida fração de polímero solúvel em água é selecionada a partir de: polietilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol/propilenoglicol, uma carboximetilcelulose, um dextrano, um álcool polivinílico, uma polivinilpirolidona, um poli-1,3-dioxolano, um poli-1,3,6-trioxano, um copolímero de etileno/anidrido maleico, um homopolímero de poliaminoácido, um copolímero aleatório de poliaminoácido, uma albumina, uma proteína Fc, um polietilenoglicol de poli(n- vinilpirolidona) , um homopolímero de propilenoglicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, um poliol polioxietilado, um álcool polivinílico, um propionadeído de polietilenoglicol, um succinato e um estireno; (i) a sequência de aminoácidos da subparte (h) em que a referida porção de polímero solúvel em água é um polietilenoglicol; e (j) a sequência de aminoácidos da subparte (h) em que o referido polímero solúvel em água é um poliaminoácido selecionado de: uma albumina, um anticorpo, uma proteína Fc e uma porção de polilisina; e um primeiro ligante (L1) covalentemente ligado ao referido HD1, o referido ligante compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de Gly-Gly-Gly, [Gly-Ser]n, [Gly-Gly- Ser]n, [Gly-Gly-Gly-Ser]n e [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

2. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o HD1 tem uma sequência selecionada a partir das sequências da subparte (a).

3. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação2, caracterizado pelo fato de que compreende o referido ABD como uma fração N-terminal e o referido HD1 como uma fração C-terminal.

4. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação2, caracterizado pelo fato de que compreende o referido ABD como uma fração C-terminal e o referido HD1 como uma fração N-terminal.

5. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido HD1 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, aminoácidos 2-147 da SEQ ID NO:31, e aminoácidos 2-147 da SEQ ID NO:33.

6. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido HD1 tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33 e aminoácidos 2-147 da SEQ ID NO: 33.

7. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que, independentemente um do outro, X5 é Y; X8 é N; X23 é T ou I; X24 é S ou L; e X25 é E ou H.

8. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o motivo de ligação à albumina compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada a partir de:GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI (SEQ ID NO:114) e GVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEI (SEQ ID NO:115).

9. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido ABD compreende um motivo de ligação à albumina (ABM) diferente de GVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEI (SEQ ID NO: 35).

10. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de domínio de ligação à albumina (ABD) compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada a partir de: LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHIL AALP (SEQ ID NO:50); eLAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALISEILAALP (SEQ ID NO:51).

11. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido ABD compreende a sequência de aminoácidos: LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY -[ABM]- LAALP (SEQ ID NO:36) em que [ABM] é o motivo de ligação à albumina, e, independentemente um do outro, Xa é selecionado dentre V e E; Xb é selecionado dentre L, E e D; Xc é selecionado dentre N, L e I; Xd é selecionado dentre R e K; Xe é selecionado dentre D e K; a leucina na posição 45 está presente ou ausente; e a prolina na posição 46 está presente ou está ausente.

12. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido ABD compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85% de identidade com uma sequência de aminoácidos que é selecionada a partir de: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51 e SEQ ID NO:52.

13. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido ABD compreende qualquer um dos peptídeos selecionados a partir de: LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVNALTHHI LAALP (SEQ ID NO:39), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINRARTVEGVHALIDHI LAALP (SEQ ID NO:40), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNIINRAKTVEGVRALKLHI LAALP (SEQ ID NO:41), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHI LAALP (SEQ ID NO:43), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNLINRAKTVEGVDALIAHI LAALP (SEQ ID NO:44), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKSLINRAKTVEGVDALTSHI LAALP (SEQ ID NO:45), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKNVINKAKTVEGVEALIADI LAALP (SEQ ID NO:47), LAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVQALIAHI LAALP (SEQ ID NO:48), LAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHI LAALP (SEQ ID NO:49), LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALTLHIL AALP (SEQ ID NO:50), LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKNLINKAKTVEGVEALiseILA ALP (SEQ ID NO:51), e LAEAKEDAIKELDKYGVSDYYKRLISKAKTVEGVKALISEIL AALP (SEQ ID NO:52).

14. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido ABD compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.

15. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido ligante L1 é um peptídeo de 1 a 30 aminoácidos ou menor que 30 aminoácidos.

16. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o referido ligante L1 compreende um dipeptídeo TG N-terminal ou um dipeptídeo AS C-terminal, ou ambos.

17. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o referido ligante L1 compreende uma sequência de aminoácidos que é selecionada a partir de: TG-(GGGS)1 (SEQ ID NO: 215), TG- (GGGS)2 (SEQ ID NO: 216), TG (GGGS)3 (SEQ ID NO: 217), TG- (GGGS)4 (SEQ ID NO: 218), TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 219), (GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 220), (GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 221), (GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 222), (GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 223), (GGGS)5AS (SEQ ID NO: 224), TG-(GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 225), TG-(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 226), TG-(GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 227), TG (GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 228), e TG-(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 229).

18. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106,e SEQ ID NO:107.

19. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 61.

20. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido HD1 tem uma sequência selecionada a partir das sequências nas subpartes (b) - (j).

21. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido HD1 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, e SEQ ID NO:146; em que uma ou mais substituições de aminoácidos foram feitas.

22. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido HD1 é SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 ou SEQ ID NO: 146.

23. Polipeptídeo construído, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido HD1 é SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29 ou SEQ ID NO: 33, em que uma ou mais substituições de aminoácidos foram feitas.

24. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o referido ABD compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.

25. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

26. Polipeptídeo construído, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio selecionado de lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência de leptina, doença de fígado gorduroso, diabetes (incluindo tipo I e tipo II), esteatohepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), síndrome metabólica X e doença de Huntington.

27. Polipeptídeo construído de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou distúrbio é lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência de leptina, doença hepática gordurosa ou diabetes.

28. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo construído, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que é uma composição farmacêutica injetável.

30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizada pelo fato de que é uma composição farmacêutica de liberação sustentada ou de longa duração.

31. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de lipodistrofia, dislipidemia, hiperlipidemia, obesidade, amenorreia hipotalâmica, doença de Alzheimer, deficiência de leptina, doença hepática gordurosa, diabetes (incluindo tipo I e tipo II) , esteatohepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) ou síndrome metabólica X.

32. Uso de um polipeptídeo construído, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

33. Uso de pelo menos dois agentes anti-obesidade diferentes, em que pelo menos um agente anti-obesidade é uma amilina conjugada com polietilenoglicol (PEG) e pelo menos um agente anti-obesidade é um polipeptídeo construído, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o referido uso caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para o tratamento da obesidade em um indivíduo.

34. Uso de pelo menos dois agentes anti-obesidade diferentes, em que pelo menos um agente anti-obesidade é uma amilina conjugada com polietilenoglicol (PEG) e pelo menos um agente anti-obesidade é um polipeptídeo construído, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o referido uso caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição farmacêutica para reduzir o peso corporal de um indivíduo.