CN108285919A - 一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒 - Google Patents

一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒 Download PDF

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CN108285919A CN201710015023.3A CN201710015023A CN108285919A CN 108285919 A CN108285919 A CN 108285919A CN 201710015023 A CN201710015023 A CN 201710015023A CN 108285919 A CN108285919 A CN 108285919A
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蔡启良
干劲
朱彩霞
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Fudan University
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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Abstract

本发明属生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其是克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。本发明中使用大肠杆菌原核表达并纯化泛素化E1酶Uba1，E2酶Ubc5a和泛素分子GST‑ubiquitin，在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以对特定的泛素E3连接酶或是蛋白底物进行体外泛素化修饰。该试剂盒可以方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有泛素化修饰，能被广范围应用于泛素化验证实验。

Description

一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒
技术领域
本发明属生物化学与分子生物学领域，涉及基因的开发与应用，具体涉及一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其是克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。
背景技术
现有技术公开了泛素分子为存在于真核细胞中的一类小分子保守蛋白，由76个氨基酸组成，分子量约8.5kDa；泛素分子依次经过E1激活酶，E2结合酶和E3连接酶作用之后，其C末端甘氨酸可与底物蛋白上的赖氨酸共价链接，从而实现泛素化修饰。泛素化修饰是细胞内重要的蛋白翻译后修饰之一，在细胞内参与多项生理过程调节，如DNA损伤修复、细胞周期调节、蛋白酶体降解等，其中泛素化-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)为细胞内最主要的一条蛋白质降解途径，其功能异常可诱发神经退行性疾病，癌症，免疫紊乱以及细菌、病毒感染等人类疾病。因此研究蛋白质的泛素化具有重要的意义，而鉴定泛素化修饰是泛素相关研究中最重要的内容之一。
基于现有技术的研究现状，本申请的发明人拟提供一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其是克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，尤其涉及克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子，以及应用于人源蛋白体外泛素化修饰验证。
本发明提供的一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其包括，克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子以及反应缓冲液配方和蛋白体系配方。
本发明中，克隆人源泛素化E1激活酶Uba1全长cDNA序列至pET-23b原核表达载体，并在其N端和C端分别加上用于纯化和检测的Myc和His蛋白标签核酸序列。
本发明中，利用泛素化E1激活酶Uba1重组原核表达载体，在E.coli BL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化Uba1蛋白。
本发明中，克隆人源泛素化E2激活酶Ubc5a全长cDNA序列至pRSETB原核表达载体，并在其N端和C端分别加上用于纯化和检测的His和Flag蛋白标签核酸序列。
本发明中，利用泛素化E1激活酶Ubc5a重组原核表达载体，在E.coli BL21(DE3)中成功表达并利用His标签纯化Ubc5a蛋白。
本发明中，克隆人源泛素化蛋白全长cDNA序列至pGEX-4T-2原核表达载体，并在其N端和C端分别加上用于纯化和检测的GST蛋白标签核酸序列。
本发明中，利用泛素化蛋白重组原核表达载体，在E.coli BL21(DE3)中成功表达并利用GST标签纯化泛素蛋白。
本发明的实施例中，公开了一种编码蛋白为人源泛素化E1蛋白酶Uba1的氨基酸序列，所述序列cDNA片段长为3174bp,编码1058个氨基酸，分子量为117849Da的蛋白，序列如SEQID No:1所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列，还包括SEQID No:1的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及公开了一种核苷酸序列，该核酸序列编码所述的蛋白质。
本发明的实施例中，公开了一种编码蛋白为人源泛素化E2蛋白酶Ubc5a的氨基酸序列，该序列cDNA片段长为441bp,编码147个氨基酸，分子量为16602Da的蛋白，序列如SEQID No:2所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列还包括SEQID No:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及公开了一种核苷酸序列，该核酸序列编码所述的蛋白质。
本发明的实施例中，公开了一种编码蛋白为人源泛素化蛋白的氨基酸序列，该序列cDNA片段长为228bp,编码76个氨基酸，分子量为8565Da的蛋白，序列如SEQID No:3所示的氨基酸序列；所述的氨基酸序列还包括SEQID No:3的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列；以及公开了一种核苷酸序列，该核酸序列编码所述的蛋白质。
本发明研究并确立了蛋白体外泛素化修饰的反应缓冲液条件：50mM Tris,pH7.5,5mM MgCl2,200mM NaCl,5mM ATP
本发明研究并确立了蛋白体外泛素化修饰的反应温度和时间：30-37℃区间范围内的水温，水浴0.5-3小时
本发明研究并确立了蛋白体外泛素化修饰的蛋白酶浓度配比：20μl总的反应体系，其中Uba1蛋白的浓度在21-340nM浓度区间范围内，Ubc5a蛋白的浓度在0.375-6μM浓度区间范围内，泛素分子蛋白浓度在1-25μM浓度区间范围内。
本发明研究并确立了使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法和Western blot法检测蛋白体外泛素化修饰。
本发明提供了一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其包括克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子以及反应缓冲液配方和蛋白体系配方。本发明中使用大肠杆菌原核表达并纯化泛素化E1酶Uba1，E2酶Ubc5a和泛素分子GST-ubiquitin，在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以对特定的泛素E3连接酶或是蛋白底物进行体外泛素化修饰。所述试剂盒可以方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有泛素化修饰，能被广范围应用于泛素化验证实验。
为便于理解，以下将通过具体的附图和具体实施方式对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实施方式和附图仅是为了说明，显示本领域的技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
附图说明
图1示出人源泛素化E1蛋白Uba1氨基酸序列(即SEQ ID NO：1)，人源泛素化E2蛋白Ubc5a氨基酸序列(即SEQ ID NO：2)，人源泛素蛋白氨基酸序列(即SEQ ID NO：3)。
图2示出人源泛素化E1蛋白Uba1经原核表达纯化之后的蛋白条带，使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为Uba1。
图3示出人源泛素化E2蛋白Ubc5a经原核表达纯化之后的蛋白条带。使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为Ubc5a。
图4示出人源泛素蛋白GST-ubiquitin经原核表达纯化之后的蛋白条带。使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为GST-ubiquitin。
图5示出SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法检测蛋白体外泛素化修饰结果。使用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色，结果经仪器扫描后调为黑白色，星号(*)标记的蛋白条带为多聚GST-ubiquitin修饰条带。
图6示出western blot(anti-GST抗体)检测蛋白体外泛素化修饰结果。红色线条标示的范围为多聚GST-ubiquitin修饰条带。
具体实施方案
实施例1
1、基因Uba1,Ubc5a和GST-ubiquitin表达载体的构建
以人源细胞的cDNA为模板，设计引物分别PCR扩展基因片段Uba1,Ubc5a和ubiquitin，经BamH I和EcoR I酶切后，分别连入对应的原核表达载体pET-23b(已带有Myc和His标签)，pRSETB(已带有His和Flag标签)和pGEX-4T-2(已带有GST标签)，经测序验证正确之后，保存对应的质粒；
2、重组蛋白Myc-Uba1-His，His-Ubc5a-Flag和GST-ubiquitin的表达与纯化
依次将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含重组质粒pET-23b(Uba1)，pRSETB(Ubc5a)和pGEX-4T-2(GST-ubiquitin)的原核表达工程菌。各个工程菌在1mM IPTG、20℃、180rpm条件下诱导24h后，得到融合重组蛋白Myc-Uba1-His，His-Ubc5a-Flag和GST-ubiquitin，经特异吸附的镍柱纯化Myc-Uba1-His和His-Ubc5a-Flag融合蛋白，经特异吸附的谷胱甘肽亲和纯化GST-ubiquitin；
具体步骤包括：
1)重组质粒转化
a)取-80℃冻存的E.coli BL21(DE3)感受态菌株，冰上融化；
b)加入50ng质粒，混匀，冰浴30min；
c)42℃热激90s；
d)迅速冰浴2min；
e)加入400μl LB培养基(不含抗生素)，37℃缓慢震荡60min；
f)5,000rpm离心5min，去掉上层300ul培养液；
g)将剩余菌液重悬，涂布于含Amp+的LB培养基平板上，37℃温箱中倒置培养过夜；
2)重组表达菌的诱导表达
a)挑取重组菌的单菌落，接入5ml含Amp+的LB培养液中，37℃摇菌过夜；
b)取2.5ml菌液接入250ml含Amp+的LB培养液中，在100ml摇瓶中37℃摇菌培养约2h，至菌液OD600达到0.5-0.8；
c)加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，在20℃、180rpm条件下继续通气培养24h；
d)诱导后的菌液于4500rpm离心10min，弃上清，用10ml PBS重悬沉淀，转入50ml离心管中。10000rpm离心5min，弃上清。细菌沉淀-20℃保存，冰冻有利于菌体的裂解；
e)用30ml预冷的PBS重悬细菌沉淀，加入3ml 10％Triton X-100PBS溶液，使用高压均质机破碎；
f)4℃,12000rpm离心20min，上清移入另一干净的50ml离心管中，用于亲和纯化重组蛋白；
3)GST蛋白亲和层析
a)准备Glutathione-Sepharose 4B亲和层析柱。放空保存柱材用的20％乙醇，用10倍柱床体积的(10-15mL)PBS平衡柱材，放空液体后夹住柱子出口；
b)用上述过滤后的上清重悬柱材，转移入50ml离心管中，4℃结合约2h；
c)充分结合之后的柱材过柱子3遍；
d)用0.6-1M预冷NaCl/PBS溶液过柱，洗去非特异性结合的杂蛋白；
e)用还原型谷胱甘肽洗脱液(50mM Tris-HCl,10mM reduced glutathione,pH8.0)洗脱，收集蛋白流出液；
4)His蛋白亲和层析
a)准备Ni-NTA亲和层析柱。放空保存柱材用的20％乙醇，用10倍柱床体积的PBS平衡柱材，用wash buffer清洗柱子，再用20ml PBS平衡柱材，放空液体后夹住柱子出口；
b)用上述过滤后的上清重悬柱材，转移入50ml离心管中，4℃结合约2h；
c)充分结合之后的柱材过柱3遍；
d)用预冷Ni-NTA wash buffer溶液过柱，洗去非特异性结合的杂蛋白；
e)用Ni-NTA elution buffer(imidazole浓度依次为20Mm,40mM,60mM,100mM,250mM)洗脱，收集蛋白流出液；
5)相关试剂准备
a)氨苄青霉素(Amp)：用灭菌ddH20配制成浓度为100mg/mL，小管分装后置-20℃冻存备用；
b)IPTG：用ddH20配制成10mg/mL，过滤除菌，-20℃贮存；
c)PBS(pH 7.4)配制:NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g，加入1L去离子水中；
d)LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，先溶于800ml ddH2O，调pH至7.0，定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌30min，室温保存；
e)LB固体培养基：在LB液体培养基中加入l.5l.5％的琼脂，于15psi高压蒸汽灭菌30min 30min，温度降至50℃左右，加入Amp抗生素后铺制平皿待培养基凝固好后，置于4℃冰箱保存；
3、蛋白体外泛素化修饰系统的构建与检测
1)蛋白体外泛素化修饰系统的构建
a)配制10×反应缓冲液：500mM Tris,pH 7.5,50mM MgCl2,2000mM NaCl,50mMATP；
b)使用BCA法测定重组蛋白Myc-Uba1-His，His-Ubc5a-Flag和GST-ubiquitin的蛋白浓度。调节上样量，在20μl反应体系中，Uba1为170nM,Ubc5a为3μM，GST-ubiquitin为5μM；
c)加入10×反应缓冲液2μl，并用PBS补充至20μl；
d)37℃水浴2h后加入蛋白上样缓冲液终止反应，经煮样之后进行SDS-PAGE考马斯亮蓝染色或是Western blot检测；
2)SDS-PAGE及Western Blot检测靶蛋白的表达
a)洗干净胶板，按照仪器使用说明安装好垂直板SDS－聚丙烯酰胺凝胶制胶装置并确保不会漏胶；
b)依次按照配方配制并灌注分离胶和浓缩胶；
c)将制好的胶板放入电泳仪，在槽中加入电极缓冲液；
d)按一定顺序在加样孔中加入煮好的样品(已加入loading buffer)；
e)打开电源将电压调到80V，待样品跑过压缩胶后将电压调到100V至样品电泳到胶底部为止；
f)转膜：顺序为负极+海绵+3层滤纸+凝胶+NC膜+3层滤纸+海绵+正极，夹紧，每层之间不能有气泡，且需防止膜干；
g)100V转膜60min；
h)清洗：膜从电转槽中取出，1×TBST稍加漂洗；
i)封闭:封闭液为5％脱脂奶粉(1×PBS溶解)，NC膜浸没与封闭液中于室温摇荡1h；
j)一抗孵育：一抗用PBS稀释单克隆抗体，稀释度为1∶3000，4℃过夜；
k)清洗：用PBST快速漂洗膜后，将膜在1×TBST中清洗3次，每次5min
l)二抗孵育：二抗用PBS稀释荧光二抗)，稀释度为1∶10000，室温摇动60min。
m)清洗：用TBST快速漂洗膜后，将膜在1×TBST中清洗3次，每次5min
n)显色：膜正面朝下，在Li-cor双红外激光显色仪上扫描显色；
3)相关试剂制备
a)膜转移缓冲液(Transfer buffer)：Tris粉末30.28g，甘氨酸144.13g，甲醇(20％V/V)，加入ddH20定容至10L；
b)5×电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸(Glycine)94g，10％SDS 50ml，先溶解于800ml ddH2O中，再加入SDS，加入ddH20定容至1000ml；
c)蛋白上样缓冲液：加入1M Tris-HCl(pH＝6.8)17.5ml,SDS 5g,DTT 4.65g,甘油20ml，BPB(溴酚蓝)6mg，搅拌溶解后定容至50ml，分装，-20℃保存；
d)考马斯亮蓝R-250染色液：加入R-250粉末0.5g，异丙醇125ml，冰醋酸50ml，加ddH2O定容至500ml，室温保存；
e)考马斯亮蓝染色脱色液：冰醋酸100ml，乙醇50ml，加ddH2O定容至1L，室温保存。
上述实验显示，本发明中使用大肠杆菌原核表达并纯化泛素化E1酶Uba1，E2酶Ubc5a和泛素分子GST-ubiquitin，在合适的反应缓冲液、时间、温度和蛋白浓度配比下，可以对特定的泛素E3连接酶或是蛋白底物进行体外泛素化修饰；且方便、准确地鉴定底物蛋白是否具有泛素化修饰。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒
<130> 20170109
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1058
<212> PRT
<213> 人源泛素化E1蛋白Uba1
<400> 1
Met Ser Ser Ser Pro Leu Ser Lys Lys Arg Arg Val Ser Gly Pro Asp
1 5 10 15
Pro Lys Pro Gly Ser Asn Cys Ser Pro Ala Gln Ser Val Leu Ser Glu
20 25 30
Val Pro Ser Val Pro Thr Asn Gly Met Ala Lys Asn Gly Ser Glu Ala
35 40 45
Asp Ile Asp Glu Gly Leu Tyr Ser Arg Gln Leu Tyr Val Leu Gly His
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Leu Gln Thr Ser Ser Val Leu Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Arg Gly Leu Gly Val Glu Ile Ala Lys Asn Ile Ile Leu Gly Gly Val
85 90 95
Lys Ala Val Thr Leu His Asp Gln Gly Thr Ala Gln Trp Ala Asp Leu
100 105 110
Ser Ser Gln Phe Tyr Leu Arg Glu Glu Asp Ile Gly Lys Asn Arg Ala
115 120 125
Glu Val Ser Gln Pro Arg Leu Ala Glu Leu Asn Ser Tyr Val Pro Val
130 135 140
Thr Ala Tyr Thr Gly Pro Leu Val Glu Asp Phe Leu Ser Gly Phe Gln
145 150 155 160
Val Val Val Leu Thr Asn Thr Pro Leu Glu Asp Gln Leu Arg Val Gly
165 170 175
Glu Phe Cys His Asn Arg Gly Ile Lys Leu Val Val Ala Asp Thr Arg
180 185 190
Gly Leu Phe Gly Gln Leu Phe Cys Asp Phe Gly Glu Glu Met Ile Leu
195 200 205
Thr Asp Ser Asn Gly Glu Gln Pro Leu Ser Ala Met Val Ser Met Val
210 215 220
Thr Lys Asp Asn Pro Gly Val Val Thr Cys Leu Asp Glu Ala Arg His
225 230 235 240
Gly Phe Glu Ser Gly Asp Phe Val Ser Phe Ser Glu Val Gln Gly Met
245 250 255
Val Glu Leu Asn Gly Asn Gln Pro Met Glu Ile Lys Val Leu Gly Pro
260 265 270
Tyr Thr Phe Ser Ile Cys Asp Thr Ser Asn Phe Ser Asp Tyr Ile Arg
275 280 285
Gly Gly Ile Val Ser Gln Val Lys Val Pro Lys Lys Ile Ser Phe Lys
290 295 300
Ser Leu Val Ala Ser Leu Ala Glu Pro Asp Phe Val Val Thr Asp Phe
305 310 315 320
Ala Lys Phe Ser Arg Pro Ala Gln Leu His Ile Gly Phe Gln Ala Leu
325 330 335
His Gln Phe Cys Ala Gln His Gly Arg Pro Pro Arg Pro Arg Asn Glu
340 345 350
Glu Asp Ala Ala Glu Leu Val Ala Leu Ala Gln Ala Val Asn Ala Arg
355 360 365
Ala Leu Pro Ala Val Gln Gln Asn Asn Leu Asp Glu Asp Leu Ile Arg
370 375 380
Lys Leu Ala Tyr Val Ala Ala Gly Asp Leu Ala Pro Ile Asn Ala Phe
385 390 395 400
Ile Gly Gly Leu Ala Ala Gln Glu Val Met Lys Ala Cys Ser Gly Lys
405 410 415
Phe Met Pro Ile Met Gln Trp Leu Tyr Phe Asp Ala Leu Glu Cys Leu
420 425 430
Pro Glu Asp Lys Glu Val Leu Thr Glu Asp Lys Cys Leu Gln Arg Gln
435 440 445
Asn Arg Tyr Asp Gly Gln Val Ala Val Phe Gly Ser Asp Leu Gln Glu
450 455 460
Lys Leu Gly Lys Gln Lys Tyr Phe Leu Val Gly Ala Gly Ala Ile Gly
465 470 475 480
Cys Glu Leu Leu Lys Asn Phe Ala Met Ile Gly Leu Gly Cys Gly Glu
485 490 495
Gly Gly Glu Ile Ile Val Thr Asp Met Asp Thr Ile Glu Lys Ser Asn
500 505 510
Leu Asn Arg Gln Phe Leu Phe Arg Pro Trp Asp Val Thr Lys Leu Lys
515 520 525
Ser Asp Thr Ala Ala Ala Ala Val Arg Gln Met Asn Pro His Ile Arg
530 535 540
Val Thr Ser His Gln Asn Arg Val Gly Pro Asp Thr Glu Arg Ile Tyr
545 550 555 560
Asp Asp Asp Phe Phe Gln Asn Leu Asp Gly Val Ala Asn Ala Leu Asp
565 570 575
Asn Val Asp Ala Arg Met Tyr Met Asp Arg Arg Cys Val Tyr Tyr Arg
580 585 590
Lys Pro Leu Leu Glu Ser Gly Thr Leu Gly Thr Lys Gly Asn Val Gln
595 600 605
Val Val Ile Pro Phe Leu Thr Glu Ser Tyr Ser Ser Ser Gln Asp Pro
610 615 620
Pro Glu Lys Ser Ile Pro Ile Cys Thr Leu Lys Asn Phe Pro Asn Ala
625 630 635 640
Ile Glu His Thr Leu Gln Trp Ala Arg Asp Glu Phe Glu Gly Leu Phe
645 650 655
Lys Gln Pro Ala Glu Asn Val Asn Gln Tyr Leu Thr Asp Pro Lys Phe
660 665 670
Val Glu Arg Thr Leu Arg Leu Ala Gly Thr Gln Pro Leu Glu Val Leu
675 680 685
Glu Ala Val Gln Arg Ser Leu Val Leu Gln Arg Pro Gln Thr Trp Ala
690 695 700
Asp Cys Val Thr Trp Ala Cys His His Trp His Thr Gln Tyr Ser Asn
705 710 715 720
Asn Ile Arg Gln Leu Leu His Asn Phe Pro Pro Asp Gln Leu Thr Ser
725 730 735
Ser Gly Ala Pro Phe Trp Ser Gly Pro Lys Arg Cys Pro His Pro Leu
740 745 750
Thr Phe Asp Val Asn Asn Pro Leu His Leu Asp Tyr Val Met Ala Ala
755 760 765
Ala Asn Leu Phe Ala Gln Thr Tyr Gly Leu Thr Gly Ser Gln Asp Arg
770 775 780
Ala Ala Val Ala Thr Phe Leu Gln Ser Val Gln Val Pro Glu Phe Thr
785 790 795 800
Pro Lys Ser Gly Val Lys Ile His Val Ser Asp Gln Glu Leu Gln Ser
805 810 815
Ala Asn Ala Ser Val Asp Asp Ser Arg Leu Glu Glu Leu Lys Ala Thr
820 825 830
Leu Pro Ser Pro Asp Lys Leu Pro Gly Phe Lys Met Tyr Pro Ile Asp
835 840 845
Phe Glu Lys Asp Asp Asp Ser Asn Phe His Met Asp Phe Ile Val Ala
850 855 860
Ala Ser Asn Leu Arg Ala Glu Asn Tyr Asp Ile Pro Ser Ala Asp Arg
865 870 875 880
His Lys Ser Lys Leu Ile Ala Gly Lys Ile Ile Pro Ala Ile Ala Thr
885 890 895
Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Leu Val Cys Leu Glu Leu Tyr Lys Val
900 905 910
Val Gln Gly His Arg Gln Leu Asp Ser Tyr Lys Asn Gly Phe Leu Asn
915 920 925
Leu Ala Leu Pro Phe Phe Gly Phe Ser Glu Pro Leu Ala Ala Pro Arg
930 935 940
His Gln Tyr Tyr Asn Gln Glu Trp Thr Leu Trp Asp Arg Phe Glu Val
945 950 955 960
Gln Gly Leu Gln Pro Asn Gly Glu Glu Met Thr Leu Lys Gln Phe Leu
965 970 975
Asp Tyr Phe Lys Thr Glu His Lys Leu Glu Ile Thr Met Leu Ser Gln
980 985 990
Gly Val Ser Met Leu Tyr Ser Phe Phe Met Pro Ala Ala Lys Leu Lys
995 1000 1005
Glu Arg Leu Asp Gln Pro Met Thr Glu Ile Val Ser Arg Val Ser
1010 1015 1020
Lys Arg Lys Leu Gly Arg His Val Arg Ala Leu Val Leu Glu Leu
1025 1030 1035
Cys Cys Asn Asp Glu Ser Gly Glu Asp Val Glu Val Pro Tyr Val
1040 1045 1050
Arg Tyr Thr Ile Arg
1055
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> 人源泛素化E2蛋白Ubc5a
<400> 2
Met Ala Leu Lys Arg Ile Gln Lys Glu Leu Ser Asp Leu Gln Arg Asp
1 5 10 15
Pro Pro Ala His Cys Ser Ala Gly Pro Val Gly Asp Asp Leu Phe His
20 25 30
Trp Gln Ala Thr Ile Met Gly Pro Pro Asp Ser Ala Tyr Gln Gly Gly
35 40 45
Val Phe Phe Leu Thr Val His Phe Pro Thr Asp Tyr Pro Phe Lys Pro
50 55 60
Pro Lys Ile Ala Phe Thr Thr Lys Ile Tyr His Pro Asn Ile Asn Ser
65 70 75 80
Asn Gly Ser Ile Cys Leu Asp Ile Leu Arg Ser Gln Trp Ser Pro Ala
85 90 95
Leu Thr Val Ser Lys Val Leu Leu Ser Ile Cys Ser Leu Leu Cys Asp
100 105 110
Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu Val Pro Asp Ile Ala Gln Ile Tyr Lys
115 120 125
Ser Asp Lys Glu Lys Tyr Asn Arg His Ala Arg Glu Trp Thr Gln Lys
130 135 140
Tyr Ala Met
145
<210> 3
<211> 76
<212> PRT
<213> 人源泛素蛋白
<400> 3
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
1 5 10 15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75

Claims (14)

1.一种蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，其包括，克隆和原核表达泛素化修饰系统的E1，E2与泛素分子以及反应缓冲液配方和蛋白体系配方。
2.一种编码蛋白为人源泛素化E1蛋白酶Uba1的氨基酸序列，其特征在于：该序列cDNA片段长为3174bp,编码1058个氨基酸，分子量为117849Da的蛋白，序列如SEQID No:1所示的氨基酸序列。
3.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求2所述的蛋白质。
4.按权利要求2所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SEQID No:1的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。
5.一种编码蛋白为人源泛素化E2蛋白酶Ubc5a的氨基酸序列，其特征在于：该序列cDNA片段长为441bp,编码147个氨基酸，分子量为16602Da的蛋白，序列如SEQID No:2所示的氨基酸序列。
6.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求5所述的蛋白质。
7.按权利要求5所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SEQID No:2的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。
8.一种编码蛋白为人源泛素化蛋白的氨基酸序列，其特征在于：该序列cDNA片段长为228bp,编码76个氨基酸，分子量为8565Da的蛋白，序列如SEQID No:3所示的氨基酸序列。
9.一种核苷酸序列，其特征在于，该核酸序列编码权利要求8所述的蛋白质。
10.按权利要求8所述的氨基酸序列，其特征在于，它还包括SEQID No:3的氨基酸序列的多肽、或其人工蛋白或相应编码所需的核苷酸序列。
11.按权利要求1所述的蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应缓冲液配方为50mM Tris,pH 7.5,5mM MgCl2,200mM NaCl,5mM ATP。
12.按权利要求1所述的蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的蛋白体系配方为：20μl总的反应体系，其中Uba1蛋白的浓度在21-340nM浓度区间范围内，Ubc5a蛋白的浓度在0.375-6μM浓度区间范围内，泛素分子蛋白浓度在1-25μM浓度区间范围内。
13.按权利要求1所述的蛋白体外泛素化修饰快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件：30-37℃区间范围内的水温，水浴0.5-3小时。
14.权利要求2、5或8的编码蛋白的氨基酸序列在用于蛋白体外泛素化修饰实验中的用途。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109358145A (zh) * 2018-07-24 2019-02-19 甘肃农业大学 渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法
CN113514445A (zh) * 2021-08-05 2021-10-19 荆州市第一人民医院（荆州市肿瘤医院、长江大学附属第一医院） 一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法
CN114456275A (zh) * 2022-01-27 2022-05-10 苏州大学 一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法
CN117471106A (zh) * 2023-12-27 2024-01-30 北京爱思益普生物科技股份有限公司 一种高通量筛选Cbl-b抑制剂的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766214A (zh) * 2011-05-05 2012-11-07 中国科学院上海生命科学研究院 含蛋白标签的sumo融合蛋白及其应用
CN103091498A (zh) * 2013-01-08 2013-05-08 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物体外泛素蛋白降解系统及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766214A (zh) * 2011-05-05 2012-11-07 中国科学院上海生命科学研究院 含蛋白标签的sumo融合蛋白及其应用
CN103091498A (zh) * 2013-01-08 2013-05-08 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物体外泛素蛋白降解系统及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECK D B等: "ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1 [Homo sapiens]", 《NP_003325.2，GENEBANK》 *
HAENIG C等: "ubiquitin-conjugating enzyme E2 D1 isoform 1 [Homo sapiens]", 《NP_003329.1，GENEBANK》 *
MAKAR A B等: "UBIQUITIN NMR STRUCTURE", 《1D3Z_A，GENEBANK》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109358145A (zh) * 2018-07-24 2019-02-19 甘肃农业大学 渗透胁迫泛素化修饰蛋白筛选方法
CN113514445A (zh) * 2021-08-05 2021-10-19 荆州市第一人民医院（荆州市肿瘤医院、长江大学附属第一医院） 一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法
CN113514445B (zh) * 2021-08-05 2023-12-26 荆州市第一人民医院（荆州市肿瘤医院、长江大学附属第一医院） 一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法
CN114456275A (zh) * 2022-01-27 2022-05-10 苏州大学 一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法
CN114456275B (zh) * 2022-01-27 2023-05-12 苏州大学 一种多位点单泛素修饰组蛋白的合成方法
CN117471106A (zh) * 2023-12-27 2024-01-30 北京爱思益普生物科技股份有限公司 一种高通量筛选Cbl-b抑制剂的方法及其应用
CN117471106B (zh) * 2023-12-27 2024-03-12 北京爱思益普生物科技股份有限公司 一种高通量筛选Cbl-b抑制剂的方法及其应用

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