CN108414772B - 一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用，属于生物学技术领域。本发明的试剂盒包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，还可以包括MgCl₂和Tris‑HCl反应缓冲液、DTT和ATP。ThiF蛋白具有连接酶的功能，在体外，在存在ATP时，可以将ThiS蛋白连接到底物蛋白上，形成类泛素化修饰，并且这种类泛素化修饰具有底物选择性，FtsA和PriC能够被ThiS蛋白和ThiF蛋白修饰，而MoaC不能。本发明的试剂盒可以有效的研究底物的类泛素化修饰情况，方便快捷效率高。

Description

一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用，属于生物学技术领域。

背景技术

大肠杆菌类泛素蛋白ThiS是分子量7.2kDa的小分子蛋白，它的结构与泛素蛋白非常相似，它们都有五个β折叠片，两个α螺旋，之前研究发现它参与维生素B1的合成(Iyer,L.M.,Burroughs,A.M.&Aravind,L.The prokaryotic antecedents of the ubiquitin-signaling system and the early evolution of ubiquitin-likeβ-graspdomains.Genome Biology 7,91-96(2006))。在体内ThiS和ThiF蛋白主要参与维生素B1的合成，ThiF能够将ThiSC末端的两个GG活化，随后参与硫转运过程，ThiF蛋白在维生素B1合成时，主要功能是腺苷酰化ThiS蛋白(激活功能)，能够将ThiS携带的硫转运给下游蛋白，ThiF蛋白与泛素系统的E1激活酶类似(Lehmann,C.,Begley,T.P.&Ealick,S.E.Structureof the Escherichia coli ThiS-ThiF complex,a key component of the sulfurtransfer system in thiamin biosynthesis.Biochemistry 45,11-19(2006),Xibing,X.et al.Heat shock transcription factorδ(32)is targeted for degradation viaan ubiquitin-like protein ThiS in Escherichia coli.Biochemical&BiophysicalResearch Communications 459,240-245(2015))。

目前，通过基因工程技术，微生物可以高效地将可再生碳水化合物转化为各种有用产品，如柠檬酸、维生素、氨基酸、溶剂、抗生素、酶制剂、生物杀虫剂、生物染色剂、生物表面活性剂、生物碱、类固醇等等，对国民经济所作的贡献令人瞩目。而这些产物的合成往往涉及各种酶的参与，研究微生物蛋白质(包括酶)翻译后修饰为提高代谢产物的产量提供理论依据，泛素化修饰即为一种重要的翻译后修饰过程。

大肠杆菌是常用的基因工程菌株，其遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，可以实现大规模发酵经济，因此倍受遗传工程专家的重视。例如利用大肠杆菌能够表达人胰岛素，抗菌蛋白等，但是在表达外源蛋白时其表达量和可溶性往往较差，目前有研究发现在胰岛素的N末端融合类泛素蛋白ThiS，能够提高其可溶性，但是原因不清楚(Yuan,S.,et al.,Prokaryotic ubiquitin-like ThiS fusion enhances the heterologousprotein overexpression and aggregation in Escherichia coli.PloS one,2013.8(4):p.e62529)。为了扩展ThiS蛋白的应用范围，需要对ThiS蛋白在体外类泛素系统的作用加以研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，该试剂盒可以方便的用于底物蛋白的体外泛素化研究。

本发明还提供了上述试剂盒在研究体外类泛素化系统中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，或者包括用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体或菌种；所述ThiS蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ThiF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。优选的，ThiS蛋白的N末端含有用于western blot检测的标签，例如Flag标签。

本发明中的ThiS与ThiF蛋白在体外能够共价连接，实验研究发现，ThiS能够共价连接到ThiF上，ThiF作为一种激活酶，很可能与古细菌的类似蛋白一样，具有连接酶的功能。因此，本发明将ThiS与ThiF蛋白制备成一种试剂盒，用于体外类泛素化系统的研究。

具体的，所述ThiS蛋白的使用浓度为0.15-0.25μg/μL。在该浓度下，能够满足底物修饰的需要。优选的，ThiS蛋白的使用浓度为0.2μg/μL。

在实际的试剂盒制备过程中，ThiS蛋白和ThiF蛋白可以制备为高浓度的母液，优选为1mg/mL。

上述的试剂盒，还包括反应缓冲液、DTT和/或ATP，所述反应缓冲液中包括MgCl₂和Tris-HCl。其中反应缓冲液为泛素化反应提供反应环境，DTT可以避免ThiF氧化失活，ATP为泛素化反应提供能量。

所述反应缓冲液中MgCl₂和Tris-HCl的摩尔浓度比为2.3-2.7：45-55，优选的，摩尔浓度比为1-20。

所述反应缓冲液中MgCl₂的使用浓度为2.3-2.7mmol/L，优选为2.5mmol/L。Tris-HCl的使用浓度为45-55mmol/L，优选为50mmol/L，pH为7.5。在实际的试剂盒制备过程中反应缓冲液可以制备为20x、10x、5x或其他浓缩倍数的母液，在使用时添加H₂O补至使用浓度。优选的，配置成5x的母液，Tris-HCl的浓度优选为250mM，MgCl₂的浓度优选为12.5mM，pH7.5。反应缓冲液命名Reaction buffer。

所述ATP的使用浓度为3.5-4.5mmol/L，优选为4mmol/L。在实际的试剂盒制备过程中，ATP可以制备为高浓度的母液，优选为1M。

所述DTT的使用浓度为0.5-1.5mmol/L，优选为1mmol/L。在实际的试剂盒制备过程中，DTT可以制备为高浓度的母液，优选为100mM。

所述ThiS蛋白和ThiF蛋白由基因工程的方法制备得到，具体为：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化即得。thiS的N末端加上Flag标签，有利于后续的western blot检测。pET28-a表达载体上带有His6标签，因此表达的ThiS和ThiF都带有His6标签。

所述用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体中包含thiS基因和/或thiF基因。所述thiS基因如SEQ ID NO.3所示，所述thiF基因如SEQ ID NO.4所示。该载体的制备包括：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，即得。

所述用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的菌种中包含具有thiS基因和/或thiF基因的载体。该菌种的制备包括：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，转化到大肠杆菌中，即得。

上述的试剂盒在研究体外类泛素化系统中的应用。具体的，将底物蛋白、ThiS蛋白和ThiF蛋白加入到使用浓度的含有DTT的反应缓冲液中，然后加入ATP，于28-32℃反应4-6h。研究反应前后底物蛋白的性质差异，判断底物蛋白是否能在ThiF蛋白的作用下发生ThiS类泛素化连接。优选的，在30℃反应5h，随后进行检测。在反应前，先将DTT加入至反应缓冲液中混合均匀。由于试剂盒中的各组分均为使用浓度的母液，因此需要计算需加入的H₂O的体积，加样顺序：依次加入H₂O，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)，ThiS蛋白，ThiF蛋白，底物蛋白，最后加入ATP。本申请的ATP最后添加是为了最大限度使用ATP，降低非特异反应。

优选的，ThiS蛋白的N末端含有用于western blot检测的标签，例如Flag标签；底物蛋白的N末端含有与ThiS蛋白N末端不同的用于western blot检测的标签，例如Myc标签。

所述ThiS蛋白、ThiF蛋白和底物蛋白的质量浓度比为4：2-4：1-4。所述ThiS蛋白的使用浓度为0.15-0.25μg/μL，优选为0.02μg/μL。本申请中的ThiS与ThiF也会共价连接，之后ThiS会转移到底物蛋白上，因此需要保持ThiS过量。本发明中的ThiS蛋白和ThiF蛋白都来自大肠杆菌K-12。

所述反应缓冲液中MgCl₂的使用浓度为2.3-2.7mmol/L，优选为2.5mmol/L。Tris-HCl的使用浓度为45-55mmol/L，优选为50mmol/L，pH为7.5。所述ATP的使用浓度为3.5-4.5mmol/L，优选为4mmol/L。所述DTT的使用浓度为0.5-1.5mmol/L，优选为1mmol/L。

利用本发明的试剂盒，检测了大肠杆菌中蛋白的类泛素化修饰情况，结果表明该试剂盒能有效的研究底物的类泛素化修饰情况。例如使用本发明的试剂盒检测了细胞分裂蛋白FtsA和MoaC的修饰情况，结果表明，FtsA和PriC能够被ThiS蛋白和ThiF蛋白修饰，而MoaC不能，说明ThiS蛋白和ThiF蛋白在大肠杆菌中的底物具有选择性。在类泛素化修饰时，ThiS蛋白连接在底物蛋白上，ThiF蛋白其连接酶的作用。

附图说明

图1为不同来源的类泛素蛋白的氨基酸序列比对图；

图2为纯化得到的ThiS蛋白和ThiF蛋白的SDS-PAGE检测图，A为ThiS蛋白，B为ThiF蛋白；

图3为体内外ThiS蛋白和ThiF蛋白自反应结果图，A为体内反应，B为体外反应；

图4为含有ATP与不含ATP时ThiS蛋白和ThiF蛋白自反应结果图，A为考马斯亮蓝染色，B为western blot染色；

图5为大肠杆菌PriC蛋白的体外类泛素化修饰结果图；

图6为大肠杆菌FtsA蛋白的体外类泛素化修饰结果图，A为Anti-Myc，B为Anti-Flag；

图7为大肠杆菌MoaC蛋白的体外类泛素化修饰结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。

实施例1

本实施例中的用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，ThiS蛋白和ThiF蛋白的浓度分别为1mg/mL。ThiS蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ThiF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将ThiS蛋白氨基酸序列与其他物种的同源蛋白序列进行比对，结果如图1所示，ecol为本申请中的ThiS蛋白，其他的为链霉菌、古细菌来源的同源序列，通过序列比对发现ThiS在C末端有两个非常保守的甘氨酸，是泛素及类泛素与底物赖氨酸共价连接的位点。

所述ThiS蛋白和ThiF蛋白的制备步骤如下：

1)将thiS基因和thiF基因分别克隆到商业表达载体pET28-a，并在thiS的N末端加上Flag标签，利于后续的western blot检测。得到大肠杆菌表达载体pET28-a-thiS^N-Flag和pET28-a-thiF。

thiS基因的序列如SEQ ID NO.3所示，thiF基因基因的序列如SEQ ID NO.4所示。

2)蛋白质表达：将pET28-a-thiS^N-Flag和pET28-a-thiF分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，挑取单克隆，LB培养基37℃培养过夜，按1：100稀释到1L新鲜的LB培养基，培养至OD600到达0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃诱导过夜。

3)纯化：4℃离心收集菌体，利用binding buffer(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mMNaCl,and 10mM咪唑)洗一次，并加入100ml的binding buffer重悬；随后在冰上利用超声破碎，16000g 4℃离心30min，并利用0.45μm膜过滤，获得菌体蛋白上清；在上清中加入5ml的Ni-NTA His结合树脂，4℃上下旋转混匀30min，1000g离心1min，弃上清；加入50ml的washbuffer(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,and 50mM咪唑)，4℃上下旋转混匀5min，1000g离心1min，弃上清，重复4次；最后加入1ml的Elution buffer(50mM Tris-HCl pH8.0,150mM NaCl,and 250mM咪唑)，1000g离心1min，取出上清，即为目标蛋白，重复洗四次，共收集4ml的ThiS^N-Flag和ThiF蛋白。pET28-a表达载体上带有His6标签，因此表达的ThiS和ThiF都带有His6标签，可以使用Ni-NTA His结合树脂进行纯化。

4)超滤：为了后续的体外反应，需要除去咪唑。将4ml蛋白分别加入到超滤管中，超滤管孔径大小为3KDa和10KDa，并加入5ml的超滤缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0,150mMNaCl)，8000g 4℃离心30min，再次加入超滤缓冲液，重复三次，最后收集得到1ml的蛋白。

5)保存：测定收集到的蛋白的质量浓度，调整至需要浓度，加入200μl的甘油，混匀分装(分装后的浓度为1mg/mL)，-80℃保存备用。

将制得的ThiS蛋白和ThiF蛋白用SDS-PAGE进行电泳，直接使用考马斯亮蓝染色观看，结果如图2所示，图2-A为ThiS蛋白的检测结果图，图2-B为ThiF蛋白的检测结果图；从图中可以看出纯化得到的ThiS蛋白和ThiF蛋白条带均在预期位置，并且条带清晰，杂质少。

实施例2

本实施例中的用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，包括ThiS蛋白、ThiF蛋白，反应缓冲液、DTT和ATP。ThiS蛋白、ThiF蛋白利用实施例1中的方法纯化获得，浓度都为1mg/ml。所述反应缓冲液中包括MgCl₂和Tris-HCl，Tris-HCl为250mM pH 7.5，MgCl₂为12.5mM，在一个瓶子中(命名Reaction buffer)。另有1M的DTT一管，100mM的ATP一管。使用时，取Reaction buffer 100μl，加入DTT 0.5μl，即为5x的缓冲液。

上述的试剂盒在使用时：所述ThiS蛋白、ThiF蛋白和底物蛋白的质量浓度比为4：2-4：1-4。所述ThiS蛋白的使用浓度为0.15-0.25μg/μL，优选为0.02μg/μL。

所述反应缓冲液中MgCl₂的使用浓度可以为2.3-2.7mmol/L，优选为2.5mmol/L。Tris-HCl的使用浓度可以为45-55mmol/L，优选为50mmol/L，pH为7.5。所述ATP的使用浓度可以为3.5-4.5mmol/L，优选为4mmol/L。所述DTT的使用浓度可以为0.5-1.5mmol/L，优选为1mmol/L。

实施例3

大肠杆菌内ThiS蛋白与ThiF蛋白过表达后的类泛素化反应。

同实施例1中将pET28-a-thiS^N-Flag和/或pET28-a-thiF分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，挑取单克隆，LB培养基37℃培养过夜，按1：100稀释到1L新鲜的LB培养基，培养至OD600到达0.6-0.8，加入(或不加)终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃诱导过夜。收集菌体，加入2x的SDS-PAGE上样缓冲液，95℃加热10min得到总蛋白样品，跑SDS-PAGE胶(15％)，不染色，使用Anti-Flag的鼠单抗孵育2h，冲洗后再使用鼠二抗孵育1h，ECL曝光1min，结果如图3-A所示，从图中可以看出在大肠杆菌体内使用IPTG诱导，过表达ThiS蛋白和ThiF蛋白后，ThiS蛋白有明显的聚集现象，即类泛素化多聚现象。

实施例4

使用实施例2中的试剂盒研究ThiS蛋白与ThiF蛋白的体外自反应。检测方法如下：

1)实验组：分别取4μg的ThiS蛋白和2μg的ThiF蛋白，加入到20μL的类泛素反应缓冲液中，缓冲液配方为：50mM Tris-HCl pH 7.5、2.5mM MgCl₂、1mM DTT和4mM ATP，在30℃下反应5个小时。

组1：本组中不加入ThiF蛋白和ATP，具体的加样顺序：依次加入H₂O 12μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL。

组2：本组中不加入ThiS蛋白和ATP，具体的加样顺序：依次加入H₂O 14μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiF蛋白2μL。

组3：本组中不加入ATP，具体的加样顺序：依次加入H₂O 10μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，ThiF蛋白2μL。

组4：本组中不加入ThiF蛋白，具体的加样顺序：依次加入H₂O 11.2μL，reactionbuffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，最后加入ATP 0.8μL。

组5：本组中不加入ThiS蛋白，具体的加样顺序：依次加入H₂O 11.2μL，reactionbuffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiF蛋白4μL，最后加入ATP 0.8μL。

组6：即实验组：具体的加样顺序：依次加入H₂O 9.2μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，ThiF蛋白2μL，最后加入ATP 0.8μL。

以上6组都在30℃下反应5个小时。

2)各取10μl反应液，加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min，跑SDS-PAGE胶(15％)，不染色，使用Anti-Flag抗体孵育2h，冲洗后再使用鼠二抗孵育1h，曝光1min，结果如图3-B所示，同样的，从图中可以看出在加有ATP时，反应中会形成类泛素化的多聚现象。

从上述实验可以得出，在ThiS和ThiF的反应中，我们可以发现在含有ATP时，ThiS能够共价连接到ThiF上。ThiF作为一种激活酶，很可能与古细菌的类似蛋白一样，具有连接酶的功能。

实施例5

在实施例4后，又重复进行了实验。

1)该实验中设置两组：

对照组：本组中不加入ATP，具体的加样顺序：依次加入H₂O 10μL，reactionbuffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，ThiF蛋白2μL。

实验组：本组中加入ATP：具体的加样顺序：依次加入H₂O 9.2μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，ThiF蛋白2μL，最后加入ATP 0.8μL。

以上2组都在30℃下反应5个小时。

2)各取10μl反应液，加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min，跑SDS-PAGE胶(15％)，使用考马斯亮蓝进行染色，脱色液脱色，结果如图4-A所示，泳道1为实验组反应后结果，泳道2为对照组反应后结果，从图中可以看出在加有ATP时，反应中会形成类泛素化的多聚现象。

3)另取10μl反应液，加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min，跑SDS-PAGE胶(15％)，不染色，使用Anti-Flag抗体孵育2h，冲洗后再使用鼠二抗孵育1h时间，曝光1min，结果如图4-B所示，泳道1为实验组反应后结果，泳道2为对照组反应后结果，同样的，从图中可以看出在加有ATP时，反应中会形成类泛素化的多聚现象。

实施例6

使用实施例2中的试剂盒检测大肠杆菌的PriC蛋白体外泛素化修饰过程。

大肠杆菌PriC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，基因序列如SEQ ID NO.6所示。将大肠杆菌PriC的N末端加上Myc标签，同样的转入表达载体pET28-a，得到pET28-a-PriC^N-Myc，将pET28-a-PriC^N-Myc转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，挑选阳性菌株扩大培养后，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃诱导过夜。其表达的PriC蛋白的带有His6和Myc两个标签，使用Ni-NTA His结合树脂对其进行纯化，得到待检测的PriC蛋白。

类泛素化反应体系为20μL，依次加入H₂O 8.2μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，ThiF蛋白2μL，PriC蛋白1μg，最后加入ATP 0.8μL。以不加入ATP作为对照。以上2组都在30℃下反应5个小时。

取10μl反应液，加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min，跑SDS-PAGE胶(*％)，不染色，使用anti-Myc鼠单抗孵育2h，冲洗后再使用鼠二抗孵育1h，曝光30s，结果如图5所示，泳道1表示反应中不加ATP，泳道2表示反应中有ATP。结果表明在有ATP时，ThiF能作为连接酶，将ThiS连接到底物PriC。

实施例7

使用实施例2中的试剂盒检测大肠杆菌的细胞分裂蛋白FtsA体外泛素化修饰过程。

细胞分裂蛋白FtsA的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，基因序列如SEQ ID NO.8所示。将大肠杆菌FtsA的N末端加上Myc标签，同样的转入表达载体pET28-a，得到pET28-a-FtsA^N-Myc，将pET28-a-FtsA^N-Myc转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，挑选阳性菌株扩大培养后，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃诱导过夜。其表达的FtsA蛋白的带有His6和Myc两个标签，使用Ni-NTA His结合树脂对其进行纯化，得到待检测的FtsA蛋白。

类泛素化反应体系为20μL，依次加入H₂O 8.2μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，ThiF蛋白2μL，FtsA蛋白1μg，最后加入ATP 0.8μL。以不加入ATP作为对照。以上2组都在28℃下反应6个小时。

取10μl反应液，加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min，跑SDS-PAGE胶(*％)，不染色，使用anti-Myc鼠单抗孵育2h，冲洗后再使用鼠二抗孵育1h，曝光30s，结果如图6-A所示，泳道1表示反应中不加ATP，泳道2表示反应中有ATP。结果表明在有ATP时，ThiF能作为连接酶，将ThiS连接到底物FtsA。

另取10μl反应液，加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min，跑SDS-PAGE胶(*％)，不染色，使用Anti-Flag抗体孵育2h，冲洗后再使用鼠二抗孵育1h时间，曝光30s，结果如图6-B所示，泳道1表示反应中不加ATP，泳道2表示反应中有ATP。结果表明在有ATP时，还进行了ThiS多聚反应，ThiF能作为连接酶，将ThiS连接到其他ThiS上，形成多聚物。

实施例8

使用实施例2中的试剂盒检测大肠杆菌的细胞分裂蛋白MoaC体外泛素化修饰过程。

细胞分裂蛋白MoaC的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，基因序列如SEQ ID NO.10所示。将大肠杆菌MoaC的N末端加上Myc标签，同样的转入表达载体pET28-a，得到pET28-a-MoaC^N-Myc，将pET28-a-MoaC^N-Myc转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，挑选阳性菌株扩大培养后，加入终浓度为0.5mM的诱导剂IPTG，16℃诱导过夜。其表达的MoaC蛋白的带有His6和Myc两个标签，使用Ni-NTA His结合树脂对其进行纯化，得到待检测的MoaC蛋白。

类泛素化反应体系为20μL，依次加入H₂O 8.2μL，reaction buffer(即为含有DTT的反应缓冲液)4μL，ThiS蛋白4μL，ThiF蛋白2μL，MoaC蛋白1μg，最后加入ATP 0.8μL。以不加入ATP作为对照。以上2组都在32℃下反应4个小时。

取10μl反应液，加入蛋白质上样缓冲液，95℃加热5min，跑SDS-PAGE胶(15％)，不染色，使用Anti-Myc单抗孵育2h时间，冲洗后再使用鼠二抗孵育1h时间，曝光30s，结果如图7所示，泳道1表示反应中不加ATP，泳道2表示反应中有ATP。结果表明不管在有没有ATP时，将ThiS都没有连接到底物MoaC上。结果表明MoaC不能被类泛素化修饰，此系统在大肠杆菌中的底物具有选择性。

<110> 河南科技大学

<120> 一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 66

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<221> ThiS蛋白

<400> 1

MET Gln Ile Leu Phe Asn Asp Gln Ala MET Gln Cys Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gln Thr Val His Glu Leu Leu Glu Gln Leu Asp Gln Arg Gln Ala

20 25 30

Gly Ala Ala Leu Ala Ile Asn Gln Gln Ile Val Pro Arg Glu Gln

35 40 45

Trp Ala Gln His Ile Val Gln Asp Gly Asp Gln Ile Leu Leu Phe

50 55 60

Gln Val Ile Ala Gly Gly

65 66

<211> 251

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<221> ThiF蛋白

<400> 2

MET Asn Asp Arg Asp Phe MET Arg Tyr Ser Arg Gln Ile Leu Leu

1 5 10 15

Asp Asp Ile Ala Leu Asp Gly Gln Gln Lys Leu Leu Asp Ser Gln

20 25 30

Val Leu Ile Ile Gly Leu Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ala Ala Leu

35 40 45

Tyr Leu Ala Gly Ala Gly Val Gly Thr Leu Val Leu Ala Asp Asp

50 55 60

Asp Asp Val His Leu Ser Asn Leu Gln Arg Gln Ile Leu Phe Thr

65 70 75

Thr Glu Asp Ile Asp Arg Pro Lys Ser Gln Val Ser Gln Gln Arg

80 85 90

Leu Thr Gln Leu Asn Pro Asp Ile Gln Leu Thr Ala Leu Gln Gln

95 100 105

Arg Leu Thr Gly Glu Ala Leu Lys Asp Ala Val Ala Arg Ala Asp

110 115 120

Val Val Leu Asp Cys Thr Asp Asn MET Ala Thr Arg Gln Glu Ile

125 130 135

Asn Ala Ala Cys Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ile Thr Ala Ser

140 145 150

Ala Val Gly Phe Gly Gly Gln Leu MET Val Leu Thr Pro Pro Trp

155 160 165

Glu Gln Gly Cys Tyr Arg Cys Leu Trp Pro Asp Asn Gln Glu Pro

170 175 180

Glu Arg Asn Cys Arg Thr Ala Gly Val Val Gly Pro Val Val Gly

185 190 195

Val MET Gly Thr Leu Gln Ala Leu Glu Ala Ile Lys Leu Leu Ser

200 205 210

Gly Ile Glu Thr Pro Ala Gly Glu Leu Arg Leu Phe Asp Gly Lys

215 220 225

Ser Ser Gln Trp Arg Ser Leu Ala Leu Arg Arg Ala Ser Gly Cys

230 235 240

Pro Val Cys Gly Gly Ser Asn Ala Asp Pro Val

245 250 251

<211> 198

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<221> ThiS基因

<400> 3

atgcagatcc tgtttaacga tcaagcgatg cagtgcgccg ccgggcaaac tgttcacgaa 60

ctactggagc aactcgacca acgacaagcg ggcgcggctc tggcgattaa tcagcaaatc 120

gtcccgcgtg agcagtgggc gcaacatatc gtgcaggatg gcgaccagat cctgcttttt 180

caggttattg cagggggt 198

<211> 753

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<221> ThiF基因

<400> 4

atgaatgacc gtgactttat gcgttatagc cgccaaatcc tgctcgacga tatcgctctg 60

gacgggcagc aaaaactgct cgacagccag gtgctgatta tcggtctggg cgggctgggt 120

acacctgctg cgctgtacct ggcgggcgct ggcgtcggga cgctggtact ggcagatgac 180

gacgatgtgc atttaagcaa tctgcaacga caaatcctct ttaccactga agatatcgat 240

cgcccgaaat cgcaggtcag ccaacagcga ctgacacagt tgaatcccga cattcaactg 300

acagcattac aacaacggtt aacgggtgag gcgttaaaag atgcggttgc acgggccgat 360

gtggtgctcg actgtaccga caatatggcg actcgccagg agattaatgc cgcctgcgtg 420

gcactcaaca cgccgcttat caccgccagc gcggtcggat ttggcggtca gttgatggta 480

ctgacgccgc cctgggagca ggggtgttac cgctgcctgt ggccagataa ccaggagcca 540

gaacgcaact gccgcacggc gggcgtggtt ggcccggtgg tcggggttat gggcactttg 600

caggcactgg aagccattaa gttattaagc ggtatagaga cacctgcggg agaactccga 660

ctgttcgacg gtaaatcgag ccagtggcgc agcctggcgt tgcgccgcgc cagtggttgc 720

ccggtatgcg gaggaagcaa tgcagatcct gtt 753

<211> 175

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<221> PriC蛋白

<400> 5

Val Lys Thr Ala Leu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Gly Gln Leu Ala

1 5 10 15

Thr Leu Arg Gln Arg Cys Ala Pro Val Ser Gln Phe Ala Thr Leu

20 25 30

Ser Ala Arg Phe Asp Arg His Leu Phe Gln Thr Arg Ala Thr Thr

35 40 45

Leu Gln Ala Cys Leu Asp Glu Ala Gly Asp Asn Leu Ala Ala Leu

50 55 60

Arg His Ala Val Glu Gln Gln Gln Leu Pro Gln Val Ala Trp Leu

65 70 75

Ala Glu His Leu Ala Ala Gln Leu Glu Ala Ile Ala Arg Glu Ala

80 85 90

Ser Ala Trp Ser Leu Arg Glu Trp Asp Ser Ala Pro Pro Lys Ile

95 100 105

Ala Arg Trp Gln Arg Lys Arg Ile Gln His Gln Asp Phe Glu Arg

110 115 120

Arg Leu Arg Glu MET Val Ala Glu Arg Arg Ala Arg Leu Ala Arg

125 130 135

Val Thr Asp Leu Val Glu Gln Gln Thr Leu His Arg Glu Val Glu

140 145 150

Ala Tyr Glu Ala Arg Leu Ala Arg Cys Arg His Ala Leu Glu Lys

155 160 165

Ile Glu Asn Arg Leu Ala Arg Leu Thr Arg

170 175

<211> 525

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<221> PriC基因

<400> 6

gtgaaaaccg ccctgctgct ggaaaaactg gaaggacagc tcgctacgct gcgtcagcgt 60

tgtgccccgg tgtcacagtt cgccacgcta agtgctcgtt tcgacaggca tctttttcag 120

actcgtgcga caacactaca ggcttgtctc gacgaggcgg gcgataatct ggctgcgctt 180

cgtcatgcag ttgagcagca acagctgccg caagtggcct ggctggcgga acatctggcg 240

gcacaactgg aagccatcgc gcgtgaagcc tccgcctggt cattgcgcga gtgggacagt 300

gcaccaccga aaattgcccg ctggcagcgt aaacgtattc agcatcagga ttttgagcgg 360

cggctacgtg agatggttgc cgaacgcaga gcccgtctgg cgcgggtgac cgatctcgtg 420

gaacagcaaa cgctgcatcg tgaagtggaa gcctatgaag cgcgcctggc acgctgccgc 480

catgcgctgg aaaaaatcga aaacaggtta gcgcgtttaa cccgc 525

<211> 420

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<221> FtsA蛋白

<400> 7

MET Ile Lys Ala Thr Asp Arg Lys Leu Val Val Gly Leu Glu Ile

1 5 10 15

Gly Thr Ala Lys Val Ala Ala Leu Val Gly Glu Val Leu Pro Asp

20 25 30

Gly MET Val Asn Ile Ile Gly Val Gly Ser Cys Pro Ser Arg Gly

35 40 45

MET Asp Lys Gly Gly Val Asn Asp Leu Glu Ser Val Val Lys Cys

50 55 60

Val Gln Arg Ala Ile Asp Gln Ala Glu Leu MET Ala Asp Cys Gln

65 70 75

Ile Ser Ser Val Tyr Leu Ala Leu Ser Gly Lys His Ile Ser Cys

80 85 90

Gln Asn Glu Ile Gly MET Val Pro Ile Ser Glu Glu Glu Val Thr

95 100 105

Gln Glu Asp Val Glu Asn Val Val His Thr Ala Lys Ser Val Arg

110 115 120

Val Arg Asp Glu His Arg Val Leu His Val Ile Pro Gln Glu Tyr

125 130 135

Ala Ile Asp Tyr Gln Glu Gly Ile Lys Asn Pro Val Gly Leu Ser

140 145 150

Gly Val Arg MET Gln Ala Lys Val His Leu Ile Thr Cys His Asn

155 160 165

Asp MET Ala Lys Asn Ile Val Lys Ala Val Glu Arg Cys Gly Leu

170 175 180

Lys Val Asp Gln Leu Ile Phe Ala Gly Leu Ala Ser Ser Tyr Ser

185 190 195

Val Leu Thr Glu Asp Glu Arg Glu Leu Gly Val Cys Val Val Asp

200 205 210

Ile Gly Gly Gly Thr MET Asp Ile Ala Val Tyr Thr Gly Gly Ala

215 220 225

Leu Arg His Thr Lys Val Ile Pro Tyr Ala Gly Asn Val Val Thr

230 235 240

Ser Asp Ile Ala Tyr Ala Phe Gly Thr Pro Pro Ser Asp Ala Glu

245 250 255

Ala Ile Lys Val Arg His Gly Cys Ala Leu Gly Ser Ile Val Gly

260 265 270

Lys Asp Glu Ser Val Glu Val Pro Ser Val Gly Gly Arg Pro Pro

275 280 285

Arg Ser Leu Gln Arg Gln Thr Leu Ala Glu Val Ile Glu Pro Arg

290 295 300

Tyr Thr Glu Leu Leu Asn Leu Val Asn Glu Glu Ile Leu Gln Leu

305 310 315

Gln Glu Lys Leu Arg Gln Gln Gly Val Lys His His Leu Ala Ala

320 325 330

Gly Ile Val Leu Thr Gly Gly Ala Ala Gln Ile Glu Gly Leu Ala

335 340 345

Ala Cys Ala Gln Arg Val Phe His Thr Gln Val Arg Ile Gly Ala

350 355 360

Pro Leu Asn Ile Thr Gly Leu Thr Asp Tyr Ala Gln Glu Pro Tyr

365 370 375

Tyr Ser Thr Ala Val Gly Leu Leu His Tyr Gly Lys Glu Ser His

380 385 390

Leu Asn Gly Glu Ala Glu Val Glu Lys Arg Val Thr Ala Ser Val

395 400 405

Gly Ser Trp Ile Lys Arg Leu Asn Ser Trp Leu Arg Lys Glu Phe

410 415 420

<211> 1260

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<221> FtsA基因

<400> 8

atgatcaagg cgacggacag aaaactggta gtaggactgg agattggtac cgcgaaggtt 60

gccgctttag taggggaagt tctgcccgac ggtatggtca atatcattgg cgtgggcagc 120

tgcccgtcgc gtggtatgga taaaggcggg gtgaacgacc tcgaatccgt ggtcaagtgc 180

gtacaacgcg ccattgacca ggcagaattg atggcagatt gtcagatctc ttcggtatat 240

ctggcgcttt ctggtaagca catcagctgc cagaatgaaa ttggtatggt gcctatttct 300

gaagaagaag tgacgcaaga agatgtggaa aacgtcgtcc ataccgcgaa atcggtgcgt 360

gtgcgcgatg agcatcgtgt gctgcatgtg atcccgcaag agtatgcgat tgactatcag 420

gaagggatca agaatccggt aggactttcg ggcgtgcgga tgcaggcaaa agtgcacctg 480

atcacatgtc acaacgatat ggcgaaaaac atcgtcaaag cggttgaacg ttgtgggctg 540

aaagttgacc aactgatatt tgccggactg gcatcaagtt attcggtatt gacggaagat 600

gaacgtgaac tgggtgtctg cgtcgtcgat atcggtggtg gtacaatgga tatcgccgtt 660

tataccggtg gggcattgcg ccacactaag gtaattcctt atgctggcaa tgtcgtgacc 720

agtgatatcg cttacgcctt tggcacgccg ccaagcgacg ccgaagcgat taaagttcgc 780

cacggttgtg cgctgggttc catcgttgga aaagatgaga gcgtggaagt gccgagcgta 840

ggtggtcgtc cgccacggag tctgcaacgt cagacactgg cagaggtgat cgagccgcgc 900

tataccgagc tgctcaacct ggtcaacgaa gagatattgc agttgcagga aaagcttcgc 960

caacaagggg ttaaacatca cctggcggca ggcattgtat taaccggtgg cgcagcgcag 1020

atcgaaggtc ttgcagcctg tgctcagcgc gtgtttcata cgcaagtgcg tatcggcgcg 1080

ccgctgaaca ttaccggttt aacggattat gctcaggagc cgtattattc gacggcggtg 1140

ggattgcttc actatgggaa agagtcacat cttaacggtg aagctgaagt agaaaaacgt 1200

gttacagcat cagttggctc gtggatcaag cgactcaata gttggctgcg aaaagagttt 1260

<211> 161

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<221> MoaC蛋白

<400> 9

MET Ser Gln Leu Thr His Ile Asn Ala Ala Gly Glu Ala His MET

1 5 10 15

Val Asp Val Ser Ala Lys Ala Glu Thr Val Arg Glu Ala Arg Ala

20 25 30

Glu Ala Phe Val Thr MET Arg Ser Glu Thr Leu Ala MET Ile Ile

35 40 45

Asp Gly Arg His His Lys Gly Asp Val Phe Ala Thr Ala Arg Ile

50 55 60

Ala Gly Ile Gln Ala Ala Lys Arg Thr Trp Asp Leu Ile Pro Leu

65 70 75

Cys His Pro Leu MET Leu Ser Lys Val Glu Val Asn Leu Gln Ala

80 85 90

Glu Pro Glu His Asn Arg Val Arg Ile Glu Thr Leu Cys Arg Leu

95 100 105

Thr Gly Lys Thr Gly Val Glu MET Glu Ala Leu Thr Ala Ala Ser

110 115 120

Val Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Asp MET Cys Lys Ala Val Gln Lys

125 130 135

Asp MET Val Ile Gly Pro Val Arg Leu Leu Ala Lys Ser Gly Gly

140 145 150

Lys Ser Gly Asp Phe Lys Val Glu Ala Asp Asp

155 160 161

<211> 483

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<221> MoaC基因

<400> 10

atgtcgcaac tgacccatat caacgccgct ggcgaagcgc acatggtgga tgtctccgcc 60

aaagcggaaa ccgtgcgtga agcgcgggcg gaagcctttg tcaccatgcg cagcgagacg 120

ctggcgatga ttattgatgg tcgccaccac aaaggcgacg tatttgccac tgcgcgtatt 180

gccggtattc aggcggcaaa acgcacctgg gatctgatcc cgctctgtca tccgctgatg 240

ctcagcaaag ttgaagtcaa tttacaggcc gagccggagc acaatcgggt gcgtatagaa 300

accttatgcc gcctgaccgg gaaaaccggt gtcgaaatgg aagcattaac cgcggcctcc 360

gtggcggcgc tgaccattta tgacatgtgc aaagcggtgc aaaaagatat ggtgattggt 420

ccggtacgtt tgctggcgaa gagcggcggc aagtcgggtg actttaaggt ggaagcggat 480

gat 483

Claims (8)

1.一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，其特征在于：包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，或者包括用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体或菌种，还包括反应缓冲液、DTT和ATP，所述反应缓冲液中包括MgCl₂和Tris-HCl，所述反应缓冲液中MgCl₂和Tris-HCl的摩尔浓度比为2.3-2.7：45-55；所述ThiS蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ThiF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述ThiS蛋白和ThiF蛋白由基因工程的方法制备得到，具体为：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化即得。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体中包含thiS基因和/或thiF基因。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的菌种中包含具有thiS基因和/或thiF基因的载体。

5.如权利要求1所述的试剂盒在研究体外类泛素化系统中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将底物蛋白、ThiS蛋白和ThiF蛋白加入到使用浓度的反应缓冲液中，然后加入ATP和DTT，于28-32℃反应4-6h。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述ThiS蛋白、ThiF蛋白和底物蛋白的质量浓度比为4：2-4：1-4。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述ThiS蛋白的使用浓度为0.15-0.25 μg/μL。

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