CN114195878A

CN114195878A - 泛素突变体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN114195878A
Application number: CN202111572300.3A
Authority: CN
Inventors: 段小涛; 杜现礼; 王勃; 庞静
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2022-03-18

Abstract

本发明提供含有非天然氨基酸的泛素突变体，其中至少一个参与泛素化连接的氨基酸经修饰或突变从而不参与泛素化连接。还提供用于制备所述泛素突变体的方法、分离的核酸分子、表达载体和宿主细胞，以及所述泛素突变体的用途。

Description

泛素突变体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及蛋白质翻译后修饰的领域，具体而言涉及蛋白质的泛素化修饰的检测。本发明提供含有非天然氨基酸的泛素突变体，特别是含有非天然氨基酸的KR突变体，以及使用该泛素突变体来标记具有泛素化修饰(例如线性泛素化修饰)的蛋白质的方法。本发明还提供用于检测和/或富集蛋白质的方法，所述蛋白质带有包含所述泛素突变体的泛素化修饰。本发明还提供用于制备所述泛素突变体的方法、编码所述泛素突变体的核酸分子、表达载体、包含所述表达载体的细胞，以及包含这些的试剂盒。

背景技术

蛋白质的泛素化修饰为一种翻译后修饰。作为调节各种细胞生物功能的过程，已有大量针对泛素化修饰的研究。目前报道的多聚泛素化修饰主要有8种不同类型的泛素连接方式，其中7种涉及通过泛素链内7个赖氨酸(K)之一与另一泛素C末端甘氨酸(G)的连接。这7个赖氨酸分别位于野生型泛素的K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位。第八种在2006年由日本Kazuhiro Iwai教授首次发现，其连接方式是通过泛素的N末端甲硫氨酸(M1)与另一泛素C末端的甘氨酸的羧基相连，因此也称为M1连接。这种通过泛素首尾相连形成的泛素化修饰也被称为线性泛素化修饰。

细胞内的线性泛素化水平受到线性泛素组装复合物(LUBAC，由HOIP、HOIL-1和SHARPIN组成)和特异性去泛素酶OTULIN(也称为FAM105B或Gumby)的紧密调控。研究表明，这种特殊的翻译后修饰在生理活动中扮演十分重要的角色，例如调控血管生成，参与炎症，抗入侵病原体的选择性自噬以及先天免疫相关的信号通路等。异常线性泛素化是一系列免疫功能障碍和炎症性疾病的原因，因此近年来对线性泛素化修饰的研究日益增多。

然而，内源线性泛素化与其他泛素化不同，其丰度很低，无法通过质谱等技术直接检测。富集泛素化修饰底物的传统方法在鉴定线性泛素化方面显得十分乏力。因此迄今为止，仅有为数不多的线性泛素修饰底物得以鉴定和分析，例如NF-κb复合物NEMO(Tokunaga,F.et al.Nat Cell Biol,2009,11:123-132.)、炎症小体适配器蛋白ASC(M.A.Rodgers etal.J Exp Med,2014,211:1333-1347.)、坏死中介物质RIPK1(R.Wei et al.Genes Dev,2017,31:1162-1176.)以及干扰素信号STAT1(Y.Zuo et al..Nat Commun,2020,11:1146.)等。即使是关于已知的LUBAC(由HOIP、HOIL-1和SHARPIN组成)和特异性去泛素酶OTULIN的分子机制和复合物结构等，也仍具有争议和未解之处。

目前关于泛素化底物的规模化研究方法主要有三类，包括在肽段层面使用针对泛素残基的特异性抗体的免疫纯化方法、标签富集法以及在蛋白层面基于UBD(Ubiquitin-binding domains)结构域的亲和纯化方法。

一方面，目前的商业化抗体对线性泛素链的亲和力较差，无法实现底物的高效富集(M.L.Matsumoto et al.,J Mol Biol.,2012,418:134-144.)，特异性针对线性泛素化的抗体多数不适用于免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，IP)富集底物，只适用于潜在线性泛素化底物的确认。另一方面，若使用在泛素两端加蛋白标签的传统方法，N/C末端添加的标签会影响泛素首尾相连的线性连接，因而也不可行。利用泛素结合结构域进行拖拽(pull-down)等方法效能较低。总之，常用的方法均不能满足线性泛素化底物的富集与鉴定需求(Rahighi,S.et al.Cell,2009,136:1098-1109.)。因此，迫切需要发展新的技术方法对线性泛素化底物进行富集和鉴定，特别是在接近生理条件下建立高效富集线性泛素化底物的方法，进行体内的定位与跟踪。

对发生线性泛素修饰的蛋白进行全面的分析，尤其是在活细胞环境下的分析，不仅可以扩展对线性泛素化功能多样性的认识，还可以为线性泛素信号转导机制提供新的见解，具有十分重要的科学和应用价值。因此，本领域在蛋白质的泛素化修饰检测方法上，特别是对于线性泛素化修饰的检测上，仍然存在未被满足的需求。

发明内容

近年来遗传密码子扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子为有义编码子，通过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白质中。根据非天然氨基酸的性质，可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止，这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在蛋白质表面，涉及的非天然氨基酸中带有炔基和叠氮等，利用这些生物正交基团，就可以特异性地对蛋白质进行定点修饰。

本发明的发明人通过创新性地使泛素蛋白中含有非天然氨基酸，获得了一种泛素突变体。在此基础上，将野生型泛素中参与泛素化修饰的赖氨酸替换为其他氨基酸(例如精氨酸)，在对泛素天然结构的改变尽可能小的前提下，获得了能参与线性泛素化的功能性泛素突变体。

以这样的泛素突变体作为泛素化的原料时，得到的具有线性泛素化修饰的蛋白中将包含上述非天然氨基酸，而具有其他(非线性的)泛素化修饰的蛋白不受影响。从而可以实现对线性泛素化进行标记(原位标记)，检测，分离，体内追踪，显影等各种功能，由此完成了本发明。

基于类似的思路，也可以构建用于特异性标记一种或多种非线性泛素化的泛素突变体。例如，非特异性标记泛素化修饰时，只需要在表面位点纳入非天然氨基酸，而无需对泛素化连接位点上的氨基酸进行突变。例如，在对一种或多种非线性泛素化进行标记时，可以使进行线性泛素化的甲硫氨酸丧失形成线性泛素链的能力，例如通过在末端添加标签，同时将除了想要检测的泛素化类型所需的赖氨酸之外的其他一个或多个赖氨酸替换为不参与非线性泛素化的氨基酸，并且在表面位点引入非天然氨基酸。

因此，第一方面，本发明涉及一种泛素突变体，与野生型泛素相比，所述泛素突变体具有如下特征：(1)至少一个位于野生型泛素的表面位点的氨基酸突变为非天然氨基酸；和(2)1至7个参与泛素化的氨基酸被替换为不参与泛素化的氨基酸。

在第一方面的一个具体实施方案中，与野生型泛素相比，所述泛素突变体具有如下特征：(1)至少一个位于野生型泛素的表面位点的氨基酸突变为非天然氨基酸；和(2)全部的赖氨酸被替换为不参与非线性泛素化连接的氨基酸，优选为精氨酸。所述泛素突变体适合于特异性标记线性泛素化修饰。

在第一方面的另一个实施方案中，所述泛素突变体具有如下特征：(1)至少一个位于野生型泛素的表面位点的氨基酸突变为非天然氨基酸；(2)N-末端甲硫氨酸被替换为不参与线性泛素化连接的氨基酸；且(3)1至6个赖氨酸被替换为不参与非线性泛素化连接的氨基酸，优选为精氨酸。所述泛素突变体适合于特异性标记通过未经替换的(保留的)赖氨酸形成的泛素化修饰。

本发明优选采用密码子扩展技术来引入非天然氨基酸。因此，第二方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其包含编码第一方面的泛素突变体的核苷酸序列。所述核苷酸序列的特征在于：(1)在对应于至少一个位于野生型泛素的表面位点的氨基酸密码子处，被替换为不编码20种天然氨基酸的特殊密码子；和(2)编码1至7个参与泛素化的氨基酸的密码子被替换为编码不参与泛素化的氨基酸的密码子。

第三方面，本发明提供包含第二方面的分离的核酸分子的表达构建体或表达载体。

第四方面，本发明提供包含第三方面的表达构建体或表达载体的宿主细胞。进一步地，所述宿主细胞还表达用于引入非天然氨基酸的正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶体系所需的元件，例如特殊tRNA和氨酰-tRNA合成酶的表达构建体或表达载体。

第五方面，本发明提供制备第一方面泛素突变体的方法，包括在所述非天然氨基酸存在下培养第四方面的细胞。

第六方面，本发明涉及第一方面的泛素突变体的用途。具体来说，涉及所述泛素突变体在检测、追踪、分离、富集包含所述泛素突变体的泛素化底物中的用途。优选地，所述泛素化底物是线性泛素化底物，如线性泛素化蛋白。

第七方面，本发明涉及泛素链，其包含至少一个第一方面的泛素突变体。优选地，所述泛素链为线性泛素链。

第八方面，本发明涉及泛素化的底物，其包含至少一个第一方面的泛素突变体，或第七方面的泛素链。

第九方面，本发明提供试剂盒，其包含第一方面的泛素突变体、第二方面的分离的核酸分子、第三方面的表达载体、第四方面的宿主细胞或第七方案的泛素链。

第十方面，本发明提供分离或富集泛素化底物的方法，包括使所述泛素化底物的泛素链中包含至少一个第一方面的泛素化变体，并且通过所述泛素化变体中的非天然氨基酸上的官能团参与的反应来分离或富集所述泛素化底物。优选地，所述方法在细胞内或体内原位进行，包括使所述细胞表达第一方面的泛素化变体。

附图说明

图1为载体pcDNA3.1-UAA质粒的功能元件示意图。

图2为在泛素高级结构中可用于替换非天然氨基酸的表面位点的示意图。

图3为在不同表面位点发生替换的突变体的表达与富集效率。

图4为泛素突变体与野生型泛素蛋白的圆二色谱图。

图5为显示了本发明的泛素突变体与野生型泛素的多聚化泛素链的形成的Western印迹结果。

图6A为实施例4进行的实验的流程示意图。

图6B为富集底物蛋白试验的蛋白质SDS-PAGE凝胶图片。

发明详述

定义

“泛素”指泛素蛋白。野生型泛素由76个氨基酸残基组成，其在真核细胞中普遍存在且序列高度保守。作为一种小分子球形蛋白质，其分子量约为8.5kda。泛素可以通过共价键与细胞中的受体蛋白结合，从而对受体蛋白进行修饰。在本文的上下文中，“野生型泛素活性”或“泛素活性”是指能够被泛素活化酶如E1酶、E2酶、E3酶及去泛素化酶识别并作用于其上，以及形成泛素化修饰链的能力。

“泛素突变体”指与野生型泛素相比，具有不完全相同的氨基酸序列的变体。

“泛素化”或“泛素化修饰”是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下添加到细胞内的蛋白质底物上。添加的泛素可以是一个泛素(单泛素化)或多个泛素(多聚泛素化)。添加的泛素通过C-末端的甘氨酸(G)的羧基与蛋白质底物缀合。本发明主要涉及多聚泛素化。泛素化是一种翻译后修饰，其可能以多种不同的方式影响蛋白质。

在多聚泛素化中，泛素之间的连接通过泛素中的7个赖氨酸(K)和N-末端甲硫氨酸(M1)这8个氨基酸之一与另一泛素的C-末端甘氨酸进行。所述8个氨基酸中的哪一个是与C-末端甘氨酸进行连接的氨基酸决定了泛素化的类型。因此，在本发明的上下文中，将这8个氨基酸称为“参与泛素化连接的氨基酸”。尽管C-末端甘氨酸也会参与泛素化连接，但因为泛素化的类型与之无关，因此除非另有说明，否则在讨论“参与泛素化连接的氨基酸”时，并不涉及C-末端甘氨酸。

泛素化中多个泛素分子形成的结构称为“泛素链”或“多聚泛素链”。泛素链可以根据参与泛素化连接的氨基酸的不同，形成单一、混合以及树枝状的结构。需要说明的是，在泛素链中，每个泛素本身可以进一步具有磷酸化、乙酰化、磺酰化和去甲酰化等翻译后修饰，这样的情形也包括在本发明的泛素化例如线性泛素化中。

“线性泛素化”或“线性泛素链”指各个泛素之间通过泛素N-末端的甲硫氨酸(M1)进行连接的泛素化，是通过7种赖氨酸连接的泛素化之外的第8种泛素化连接方式，也称为“Met1连接”泛素化。与“线性泛素化”相对应，在泛素链中存在至少一个通过赖氨酸残基进行泛素化连接时，则形成“非线性泛素化”或“非线性泛素链”。

本文中的“底物”除非有特别说明，指泛素化的底物。泛素化的底物可以为蛋白质、脂多糖。所述底物能够被泛素修饰蛋白酶(例如，泛素连接酶(E3)家族)特异性识别，并由此能够被泛素修饰。

“KR突变体”或“泛素KR突变体”在本文中指这样的泛素突变体，其中的赖氨酸(K)全部(即7个赖氨酸)突变为精氨酸(R)。在一些情况下也称为“KR突变的泛素突变体”。

“泛素表面位点”指处于泛素例如野生型泛素蛋白三级结构的表面的位点。在本发明中，将泛素表面位点之一突变为非天然氨基酸(UAA)。

“非天然氨基酸(UAA)”为除了由生物合成的天然氨基酸以外的生物反应性氨基酸。非天然氨基酸也称为“非蛋白原性氨基酸(non-proteinogenic amino acid)”。非天然氨基酸可以替代肽类分子中的天然氨基酸，形成多种多样的肽模拟物。这些肽模拟物中的一些在性质和功能上相对于其天然对应物可能具有更好的性质，这在药物开发中极具价值。另一方面，非天然氨基酸特别适合于作为分子探针来探测和捕获蛋白分子的相互作用，有助于在基础研究和药物开发中了解生物系统的作用方式。

“非天然氨基酸突变”、“UAA突变”或“非天然氨基酸的引入”理解为野生型中特定位点的氨基酸变为非天然氨基酸的突变。

“生物正交化学”或“生物正交反应”是指能够在生物系统内于生理条件下发生但是不干扰内源性生物化学过程的化学反应，有时也称活细胞化学修饰。正交反应在生命科学的研究和临床观察中具有重要意义。在本发明中，非天然氨基酸的引入，以及利用非天然氨基酸发生的后续反应优选为生物正交反应。

“点击化学”指一种化学合成方法，其受到自然界中通过小模块合成复杂大分子的过程的启发，旨在通过一系列小分子的反应来最终合成期望的产物。点击化学又称“链接化学”或“动态组合化学”。点击化学通常用于将特定生物分子与底物结合的生物缀合中。在活细胞中也可以作为生物正交反应来进行点击化学。点击化学反应可以具有如下优点：(1)可在细胞内发生，因而适合于例如原位直接找到药物作用靶点；(2)合成反应快速、副产物对细胞无毒害；(3)操作简单、条件温和、对水与氧等环境不敏感。

参与点击化学的基团、分子可以称为“点击化学配偶体(click chemistrypartner)”。在本发明中，引入泛素突变体中的非天然氨基酸所携带的基团可以作为点击化学配偶体，从而可以基于与其他分子的连接实现对线性泛素化修饰蛋白的纯化、富集和鉴定。

“tRNA”指转运RNA(transfer RNA)，是一种长度在76-90个核苷酸的RNA序列。在蛋白质翻译过程中，tRNA发挥衔接mRNA和多肽链的作用。tRNA中的反义三密码子能够识别对应的mRNA三密码子，从而将对应的氨基酸带入核糖体内正在合成的肽链中。

“正交tRNA”在本文的上下文中特指遗传密码子扩展技术中利用的tRNA。

“氨酰-tRNA合成酶”或“tRNA连接酶”是催化氨基酸共价附接到对应的tRNA之上的3’端的酶。

“遗传密码子扩展技术”是通过一对tRNA和氨酰-tRNA合成酶(amino acyl tRNAsynthetases)，在蛋白质翻译过程中利用不编码20种氨基酸的特殊密码子(例如，被称为琥珀密码子的TAG)在蛋白质产物中的特定位点引入非天然氨基酸(UAA)的一种化学生物学技术。这种技术是由Peter G.Schultz最先提出的。通过在氨酰-tRNA合成酶突变体文库中进行筛选，找到能够使无义tRNA携带非天然氨基酸的突变体并加以利用。如此一来，在同时使用该突变体氨酰tRNA合成酶和tRNA时，可以在翻译过程中通过无义密码子的tRNA将非天然氨基酸引入到蛋白质多肽序列中，相当于使无义密码子“编码”特定的非天然氨基酸，实现了对密码子的“扩展”。理论上，通过该技术可以在任意蛋白质的任意位点插入非天然氨基酸，而不影响20种天然氨基酸的编码。因此，这个过程也是一种生物正交过程。目前已经有上百种非天然氨基酸在密码子扩展技术中得到应用。

如上所述，通过密码子扩展技术，可以将核酸密码子“扩展”到编码20种天然氨基酸以外的非天然氨基酸。在本发明使用密码子扩展技术的上下文中，可以将对应于非天然氨基酸的密码子视为“编码”该非天然氨基酸的密码子，因为该密码子与特定的非天然氨基酸之间借由特殊的tRNA能够在蛋白质翻译过程中实现唯一对应的关系。如此一来，在本发明的上下文中，将含有“编码”该非天然氨基酸的密码子的核苷酸序列视为含有该非天然氨基酸的泛素突变体的“编码序列”。

在术语“分离的核酸分子”中，“分离的”意指已经进行了去除想要的成分或细胞之外的因子的操作，并且所述成分或细胞不再以天然存在的状态存在。

“核苷酸”在本发明的上下文中包括DNA和RNA。

“表达构建体”或“表达盒”指包含目的基因和基因表达调控序列的一段核苷酸序列。所述表达调控序列包括但不限于启动子、增强子、终止子、多聚腺苷酸化序列等。

“载体”指将能够外源基因携带至细胞内的运载体DNA分子。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体。用于将外源转基因引入细胞中并促成该转基因表达的载体称为“表达载体”。

“宿主细胞”这里指包含表达载体、被表达的蛋白和/或用于进行本发明的检测、富集等的细胞。在一个实施方式中，作为宿主细胞，只要是能够用于蛋白例如本发明的突变体的表达的宿主细胞即可，没有特别的限制。

“标记”在本发明涉及泛素化的上下文中，意指使得形成的泛素链中含有本发明的泛素突变体，如此一来非天然氨基酸会使含有该泛素突变体的泛素链能够被区分、识别和/或捕获。“非特异性标记”指8种泛素化类型的任何一种都可能含有本发明的泛素突变体。相对而言，“特异性标记”指8种泛素化类型中只有特定一种或多种泛素链会含有本发明的泛素突变体。本发明尤其适合构建用于特异性标记线性泛素化的泛素突变体，即其中全部赖氨酸都突变为精氨酸且带有非天然氨基酸的泛素突变体。

泛素突变体

本发明提供了一种新颖的泛素突变体。本发明的泛素突变体的特点之一在于相对于野生型泛素而言，其中至少一个氨基酸被非天然氨基酸(UAA)取代。

如上所述，包含非天然氨基酸的肽、多肽或蛋白质可以具有不同的用途，例如作为肽类似物用作一种新的候选药物，或作为一种“探针”帮助科学家理解生物过程。因此，在优选的实施方案中，可以根据包含非天然氨基酸的蛋白质，例如本发明的泛素突变体的目的和用途来选择非天然氨基酸的种类。在一些实施方案中，本发明的泛素突变体适合作为探针来研究蛋白质翻译后修饰，或用于捕获、富集具有特定泛素化修饰类型的蛋白质。基于此，适合包括在本发明的泛素突变体中的非天然氨基酸优选具有反应性基团，其能够与另一分子发生反应。所述反应可以是例如点击化学、光化学、糖基化或荧光显色反应。

在具体的实施方案中，非天然氨基酸可以是20种天然氨基酸的衍生物。本发明可以使用的天然氨基酸的衍生物包括，例如苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、丝氨酸衍生物、赖氨酸衍生物。在具体的实施方案中，可用于本发明的非天然氨基酸可以含有选自下组的官能团，例如叠氮基团、炔基、酮基、巯基、醛基、酰胺基、烯基、硝基、磷酸根、磺酸根或双吖丙啶基团。通过这些官能团，所述非天然氨基酸可以参与化学反应和/或形成修饰。所述化学反应包括但不限于选自点击化学、光化学、糖基化或荧光显色反应。

在优选的实施方案中，所述非天然氨基酸可以作为交联剂实现蛋白质-蛋白质交联。在具体的实施方案中，所述非天然氨基酸可以是NAEK(Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸)或其它含有叠氮结构的非天然氨基酸，例如氟硫酸盐-L-酪氨酸(FSY，fluorosulfate-L-tyrosine)、氟磺酰氧基苯甲酰赖氨酸(FSK)或DiZPK(((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙氨基)羰基)-Nε-L-赖氨酸)。在一个具体的实施方案中，所述非天然氨基酸是NAEK。

在一些实施方案中，所述非天然氨基酸参与光交联反应。所述非天然氨基酸可以参与光交联反应。这样的非天然氨基酸可称为光反应性非天然氨基酸并作为光交联探针使用。在包含光交联非天然氨基酸的蛋白与另一蛋白形成蛋白-蛋白复合物时，在特定波长激发下可将蛋白-蛋白非共价作用转化为共价作用，进而使蛋白-蛋白复合物能够被捕获。已知的包含在非天然氨基酸中的光交联基团主要包括芳基叠氮基团、二苯甲酮、双吖丙啶等几类。芳基叠氮和双吖丙啶在交联效率和背景信号等方面均优于二苯甲酮。在具体的实施方案中，可用于光交联的非天然氨基酸可以是带有芳基叠氮基团如二氮嗪或带有二苯甲酮的天然氨基酸衍生物。例如，可用于光交联的非天然氨基酸可以是带有二氮嗪的亮氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸。在具体的实施方案中，可用于光交联的非天然氨基酸可以是AbK(N⁶-[[2-(3-甲基-3H-二氮嗪-3-基)乙氧基]羰基]-L-赖氨酸)、DiZPK。

考虑到本发明的泛素突变体作为“探针”的作用，纳入适合用于标记蛋白质的非天然氨基酸是理想的。因此，在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是适合用于对目标蛋白，例如泛素，进行标记的非天然氨基酸。这样的非天然氨基酸包括但不限于：3-(6-乙酰萘-2-基氨基)-2-氨基丙酸(Anap)、(S)-1-羧基-3-(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)丙-1-胺(CouAA)、3-(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰胺)丙酸(丹磺酰丙氨酸(Dansylalanine))、Nε-对叠氮基苄氧基羰基赖氨酸(PABK)、炔丙基-L-赖氨酸(PrK)、Nε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺基)赖氨酸(CpK)、Nε-丙烯酰赖氨酸(AcrK)、Nε-(环辛-2-炔-1-基氧基)羰基)L-赖氨酸(CoK)、双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇赖氨酸(BCNK)、反式环辛基-2-烯赖氨酸(2'-TCOK)、反式环辛基-4-烯赖氨酸(4'-TCOK)、二氧-TCO赖氨酸(DOTCOK)、3-(2-环丁烯-1-基)丙酸(CbK)、Nε-5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-赖氨酸(NBOK)、环辛炔赖氨酸(SCOK)、5-降冰片烯-2-醇酪氨酸(NOR)、环辛-2-醇酪氨酸(COY)、(E)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙醇酪氨酸(DS1/2)、叠氮高丙氨酸(AHA)、高丙炔基甘氨酸(HPG)、叠氮亮氨酸(ANL)和Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)。

在优选的实施方案中，包含非天然氨基酸的所述泛素突变体仍然具有与天然泛素相似的三级结构和活性。换言之，非天然氨基酸对原有氨基酸的替换对泛素的结构、功能、活性的影响尽可能地小。为了实现这点，除了选择非天然氨基酸的种类，也应同时考虑引入非天然氨基酸的位点。

在泛素中选择需要突变成非天然氨基酸的位点时，希望在该处引入的非天然氨基酸不影响泛素立体结构、活性和功能，并且需要使非天然氨基酸的功能性基团如参与交联反应的基团能够被暴露，以促进反应的发生。在一些实施方案中，引入非天然氨基酸的位点位于泛素蛋白三级结构的表面。在一些实施方案中，待引入的非天然氨基酸与被替换掉的野生型泛素中的对应氨基酸具有相似的结构和/或接近的等电点，以减少对蛋白活性的影响，和/或提高被泛素抗体识别时的偏好性。作为这样的泛素表面位点，可列举例如：K6、T9、G10、K11、T14、E16、V17、E18、S20、D21、T22、E24、N25、K27、A28、K29、Q31、D32、K33、E34、G35、P37、D39、Q40、R42、A46、Q49、E51、D52、R54、T55、S57、D58、Y59、N60、Q62、R63、E64、S65或T66。在优选的实施方案中，本发明的泛素突变体中引入的非天然氨基酸位于选自下组的氨基酸位置以替换对应的野生型氨基酸：N10、K29、R42、A46、R54和N60。在更优选的实施方案中，本发明的泛素突变体中引入的非天然氨基酸位于A46或R54以替换对应的野生型氨基酸，最优选位于R54以替换对应的精氨酸。

在一个具体的实施方案中，当引入的非天然氨基酸为NAEK(Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸)时，优选被突变的位点为A46或R54，最优选R54。

本发明的泛素突变体的另一个特征在于将8个参与泛素化修饰的氨基酸中的一个或多个进行了突变或修饰，使得泛素突变体仅能通过未经突变或修饰的参与泛素化修饰的氨基酸来进行泛素化，从而实现对特定泛素化的标记、追踪、捕获和/或富集。所述8个参与泛素化修饰的氨基酸为M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63。

在一个具体的实施方案中，本发明的泛素突变体特异性地针对某一种泛素化修饰。在这样的实施方案中，仅保留M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63中的一个，并通过突变(如突变成其他不参与泛素化连接的氨基酸)或修饰使其他7个不参与泛素化修饰、无法进行泛素化连接。鉴于本发明特别适用于检测丰度显著较低的M1泛素化，因此在最特别的技术方案中，本发明的泛素化突变体相对于野生型泛素而言，全部7个赖氨酸，即K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63均被突变为除赖氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸，优选精氨酸，而仅保留M1。在另外的实施方案中，本发明的泛素化突变体相对于野生型泛素而言，通过修饰(例如在末端添加标签)使M1无法进行泛素化，同时使K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63中的6个突变为除赖氨酸和甲硫氨酸之外的氨基酸，而保留一个能够参与非线性泛素化连接的赖氨酸位点。

在另外的实施方案中，可以保留上述8个泛素化连接位点中的2个或更多个，如3个、4个、5个、6个或7个，以实现对通过这些位点进行泛素化的标记、追踪、捕获和/或富集。

在突变或修饰所述参与泛素化连接的8个氨基酸位置时，包含突变后的氨基酸的泛素突变体仍然具有与天然泛素相似的三级结构和活性。换言之，对一个或多个(至多7个)参与泛素化修饰的氨基酸的替换对泛素的结构、功能、活性的影响尽可能地小。在优选的实施方案中，将一个或多个意图突变的赖氨酸突变为精氨酸。在优选的实施方案中，通过为甲硫氨酸添加标签(例如Flag、血凝素(HA)等蛋白标签)来使其失去形成泛素链的能力。

在没有特殊说明的情况下，本发明中所有的泛素氨基酸位置均参考人野生型泛素的氨基酸序列进行编号。需要说明的是，泛素蛋白具有高度保守性。物种间泛素序列的相似程度很高，特别是在哺乳动物之间。因此，本领域技术人员能够在哺乳动物中确定与上述位点对应的氨基酸位置。在等低等生物如酵母中，泛素序列存在一些差异，但本领域技术人员可以根据物种间差异找到符合要求的相应表面位点。

泛素突变体的制备和密码子扩展技术

本发明的泛素突变体包含两类主要突变，即非天然氨基酸的引入和参与泛素化连接的氨基酸的突变，因此在制备过程中需要实现这两个目的。

参与泛素化连接的氨基酸的突变可以借由常规的分子生物学技术实现。例如，在设计表达泛素突变体的编码序列时，将参与泛素连接的氨基酸的密码子替换成期望突变成的氨基酸的密码子。这样的操作对于本领域技术人员可以通过常规技术完成。

对于非天然氨基酸的引入，优选使用密码子扩展技术来进行。具体而言，通过密码子扩展技术引入非天然氨基酸中包含几个步骤：(1)在编码序列中引入不编码20种天然氨基酸的特殊密码子，以获得泛素突变体的编码序列；(2)在存在与所述特殊密码子对应的反义三联密码子并且携带非天然氨基酸的tRNA的存在下，使步骤(1)中获得的编码序列进行表达。

步骤(2)中的tRNA带有与所述特殊密码子对应的反义三联密码子并且携带非天然氨基酸，其是一种非天然存在的tRNA，需要通过特定的方法获得。在优选的实施方案中，采用正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶体系来实现这个步骤。具体来说，步骤(2)中特殊tRNA的形成通过将某种“前体”tRNA和想要引入的非天然氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的存在下进行接触来实现。这里使用的“前体”tRNA以及能够催化其与某种非天然氨基酸形成特殊tRNA的氨酰-tRNA合成酶构成特定的正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶体系。在一些情况下，将这样的“前提tRNA”称为“正交tRNA”或“生物正交tRNA”。这样的体系的实例是本领域中已知的。随着技术的发展，也会从氨酰-tRNA合成酶的突变体中筛选获得更多能够用于引入非天然氨基酸的tRNA和氨酰-tRNA合成酶体系。任何这些体系都可以用于实现本发明的目的。

在利用这样的正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶体系时，特殊tRNA的合成与泛素突变体的表达可以在细胞中同步进行。换言之，只要使合成特殊tRNA的各个元件与编码序列同时存在于一个细胞中，即可实现在编码序列翻译成多肽时，将其中的特殊密码子借由特殊tRNA翻译为想要的非天然氨基酸。所述合成特殊tRNA所需的各个元件包括：提供正交tRNA和与之对应的氨酰-tRNA合成酶的正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶体系，以及需要负载到正交tRNA之上以形成特殊tRNA的非天然氨基酸。

因此，在这样的实施方案中，通过密码子扩展技术引入非天然氨基酸的方法包括：(1)在编码序列中引入不编码20种天然氨基酸的特殊密码子，以获得泛素突变体的编码序列；(2)使用正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶体系在该非天然氨基酸存在下，使步骤(1)中获得的编码序列进行表达。所述非天然氨基酸可以以大约0.1mM至5mM，优选大约0.5mM-2mM，更优选大约1mM的浓度存在于培养基中。

所述不编码20种天然氨基酸的特殊密码子可以是无义三联密码子、四联密码子，或在某些情况下可以是冗余的稀有密码子。本领域技术人员可以理解，只要该密码子在宿主细胞中未被用于编码20种必需氨基酸即可。在优选的实施方案中，步骤(1)使用的特殊密码子是无义三联密码子，例如TAG(琥珀密码子)、TGA或TAA。在一个具体的实施方案中，所述特殊密码子是TAG。

如上所述，已知多种正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶体系。在一个具体的实施方案中，所述正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶体系包含古甲烷球菌的tRNA(tRNA^Pyl)和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。将该体系简称为tRNA^Pyl/PylRS体系。

提供正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶体系的方法可以是构建含有tRNA和氨酰-tRNA合成酶的编码序列包含在载体，并将其进入到细胞中。

在正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶体系中，tRNA的转录水平是限速步骤。因此，优选采用多拷贝启动子-tRNA串联的方式提高其转录，其中最为常见的是采用4联的启动子-tRNA的表达模块。

在构建本发明的泛素突变体的编码序列时，使参与泛素化连接的氨基酸密码子被替换和引入不编码20种天然氨基酸的特殊密码子这两个过程可以分开进行，也可以组合在一起进行。在一个实施方案中，可以先构建仅将参与泛素化连接的氨基酸密码子替换的核苷酸序列，例如通过人工合成构建；然后在另一步骤中通过其他方法将选定的密码子替换为特殊密码子，例如使用基因编辑方法或使用含有所述特殊密码子的引物对目标核苷酸序列进行扩增。在另一个实施方案中，在一步中构建同时含有上述两种突变的编码序列。

在最具体的实施方案中，本发明的泛素突变体的编码序列如SEQ ID NO:2所示。

在分步引入上述两类突变，并通过引物扩增引入特殊密码子时，所述引物可以是符合下述要求的引物对：在上游引物中包含5’端重叠区和3’端延伸区，引物长度大约为25-30bp，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区至少包含10个碱基；反向引物从特殊密码子开始，即特殊密码子应处于突变用下游引物的5’端，引物长度同样为约25-30bp。

在本发明的方法中，至少涉及两类关键的表达构建体：包含泛素突变体编码序列的表达构建体(“泛素构建体”)，和包含tRNA和/或氨酰-tRNA合成酶编码序列的表达构建体(“tRNA构建体”)。

对于tRNA构建体，可以包含多个拷贝的tRNA基因片段，例如2-20个，优选3-10个，更优选4-8个。在具体的实施方案中，tRNA表达盒使用如基因序列SEQ ID NO:3所示的tRNA基因片段(U6-tRNA)，优选包含4个拷贝的所述tRNA基因片段。

tRNA构建体中的氨酰-tRNA合成酶可以是来自于巴氏甲烷八叠球菌的MbPylRS(Srinivasan G；.et al.Science,2002,296:1459；其编码序列如SEQ ID NO:16所示)，来自马氏甲烷八叠球菌的MmPylRS(Bryson,DI.et al.Nat.Chem.Biol.2017,13:1253.)或来自大肠杆菌的EcTyrRS(Chin,JW.et al.Science,2003,301:964.)。这些氨酰-tRNA合成酶均可与带有CUA反密码子的tRNA配合，将琥珀密码子(TAG)翻译成期望的非天然氨基酸。在具体的实施方案中，所述氨酰-tRNA合成酶是来自于巴氏甲烷八叠球菌的MbPylRS。

在优选的实施方案中，将泛素构建体和tRNA构建体通过不同的表达载体表达。

例如，用于表达泛素构建体的载体可以是pXJ40载体或其他真核细胞过表达载体，如pcDNA3.1、pCMV5、pLVX、pCDH。

本发明的泛素突变体表达载体与氨酰-tRNA合成酶系统可以采用脂质体转染的方法进行共转染，也可以采用例如质粒注射、电转染、慢病毒感染、腺病毒感染及腺相关病毒感染等方式。

用途

本发明的泛素突变体可用于多种用途。

例如，所述泛素突变体特别适合于作为探针用于标记、追踪、捕获、富集带有泛素化修饰，例如特定泛素化修饰的底物。所述底物可以为蛋白质、脂多糖等。所述底物能够被泛素修饰蛋白酶(例如，泛素连接酶(E3)家族)识别，并由此能被泛素修饰。

例如，本发明的泛素突变体可用于在活细胞环境中捕捉低丰度的线性泛素化蛋白质底物，发现具有线性泛素化的蛋白新种类，也可用于生物信息学，以及与其他翻译后修饰的关联研究。

所述泛素突变体的用途部分取决于泛素突变体中所含的非天然氨基酸的类型、被突变的参与泛素化连接的氨基酸类型等。本发明的具体实施方案中，非天然氨基酸是NAEK，并且所述泛素突变体是全部赖氨酸被突变的突变体，例如突变成精氨酸的KR突变体。

在一个实施方案中，包含非天然氨基酸的KR突变体特别适合于找出目前尚未知晓的发生了线性泛素化修饰的蛋白新种类。

在一个实施方案中，所述泛素突变体包含的非天然氨基酸使其能够与其他分子进行生物正交反应。所述生物正交反应例如，点击化学、光交联、光敏感、糖基化。作为点击化学基团，还可列举例如非天然氨基酸FSY(fluorosulfate-L-tyrosine)等，FSY可与其位置邻近的丝氨酸或苏氨酸发生SuFEx点击化学反应。

在本发明的泛素链中，参与连接的泛素突变体本身可以进一步具有磷酸化、乙酰化、磺酰化和去甲酰化的翻译后修饰。

含有本发明的泛素突变体的合成人工泛素链为分析泛素信号提供了一种有力工具。可用于体内泛素化的示踪，影像化等。

本发明还涉及以下各项的内容。

1.泛素突变体，与野生型泛素相比，在所述泛素突变体的氨基酸序列中：(1)至少一个位于野生型泛素的表面位点的氨基酸被替换为非天然氨基酸；并且(2)1至7个参与泛素化连接的氨基酸被修饰或突变从而丧失参与泛素化连接的能力；所述野生型泛素的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

2.根据项1所述的泛素突变体，所述参与泛素化连接的氨基酸为M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63。

3.根据项1或2所述的泛素突变体，其中与野生型泛素相比，7个参与泛素化连接的氨基酸被修饰或突变从而丧失参与泛素化连接的能力；

优选地，在修饰或突变的氨基酸为M1时，通过添加标签对其进行修饰，在修饰或突变的氨基酸为赖氨酸时，通过将其替换为不参与泛素化连接的氨基酸进行突变。

4.根据项3所述的泛素突变体，其用于特异性标记一种泛素化修饰，所述泛素化修饰通过唯一未被突变的参与泛素化连接的氨基酸进行。

5.根据项3所述的泛素突变体，其中全部赖氨酸被替换为不参与非线性泛素化连接的氨基酸。

6.根据项5所述的泛素突变体，其中全部的赖氨酸被替换为精氨酸。

7.根据项5或6所述的泛素突变体，所述泛素突变体用于特异性标记线性泛素化修饰。

8.根据前述任一项所述的泛素突变体，其中所述表面位点选自下组：K6、T9、G10、K11、T14、E16、V17、E18、S20、D21、T22、E24、N25、K27、A28、K29、Q31、D32、K33、E34、G35、P37、D39、Q40、R42、A46、Q49、E51、D52、R54、T55、S57、D58、Y59、N60、Q62、R63、E64、S65和T66。

9.根据项8所述的泛素突变体，其中所述表面位点选自下组：N10、K29、R42、A46、R54和N60。

10.根据项9所述的泛素突变体，其中所述表面位点为A46或R54。

11.根据项10所述的泛素突变体，其中所述表面位点为R54。

12.根据前述任一项所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸包含参与生物正交反应的基团。

13.根据项12所述的泛素突变体，其中所述生物正交反应选自下组：点击化学、光交联、光敏感和糖基化。

14.根据项12或13所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸包含选自下组的官能团：叠氮基团、炔基、酮基、巯基、醛基、酰胺基、烯基、硝基、磷酸根、磺酸根和双吖丙啶基团。

15.根据项12至14任一项所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸选自下组：3-(6-乙酰萘-2-基氨基)-2-氨基丙酸(Anap)、(S)-1-羧基-3-(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)丙-1-胺(CouAA)、3-(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰胺)丙酸(丹磺酰丙氨酸(Dansylalanine))、Nε-对叠氮基苄氧基羰基赖氨酸(PABK)、炔丙基-L-赖氨酸(PrK)、Nε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺基)赖氨酸(CpK)、Nε-丙烯酰赖氨酸(AcrK)、Nε-(环辛-2-炔-1-基氧基)羰基)L-赖氨酸(CoK)、双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇赖氨酸(BCNK)、反式环辛基-2-烯赖氨酸(2'-TCOK)、反式环辛基-4-烯赖氨酸(4'-TCOK)、二氧-TCO赖氨酸(DOTCOK)、3-(2-环丁烯-1-基)丙酸(CbK)、Nε-5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-赖氨酸(NBOK)、环辛炔赖氨酸(SCOK)、5-降冰片烯-2-醇酪氨酸(NOR)、环辛-2-醇酪氨酸(COY)、(E)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙醇酪氨酸(DS1/2)、叠氮高丙氨酸(AHA)、高丙炔基甘氨酸(HPG)、叠氮亮氨酸(ANL)、Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)、氟硫酸盐-L-酪氨酸、氟磺酰氧基苯甲酰赖氨酸或((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙氨基)羰基)-Nε-L-赖氨酸，或其他带有叠氮基团的非天然氨基酸。

16.根据项15所述的泛素突变体，其中所述带有叠氮基团的非天然氨基酸为Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)。

17.根据前述任一项所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸通过遗传密码子扩展技术引入。

18.根据前述任一项所述的泛素突变体，其中所述野生型泛素源自真核生物。

19.根据项18所述的泛素突变体，所述真核生物为哺乳动物。

20.根据前述任一项所述的泛素突变体，其具有与野生型泛素类似的二级结构。

21.根据前述任一项所述的泛素突变体，其具有野生型泛素的活性。

22.分离的核酸分子，其包含编码项1-21任一项的泛素突变体的核苷酸序列。

23.项22的分离的核酸分子，所述核苷酸序列中编码非天然氨基酸的密码子为不编码20种天然氨基酸的密码子。

24.项23的分离的核酸分子，所述编码非天然氨基酸的密码子为无义三联密码子、四联密码子或在目标宿主中冗余的稀有密码子。

25.项24的分离的核酸分子，所述编码非天然氨基酸的密码子为选自TAG、TGA和TAA的无义三联密码子。

26.项25的分离的核酸分子，所述编码非天然氨基酸的密码子为TAG。

27.表达载体，其包含根据项22至26任一项所述的分离的核酸分子。

28.宿主细胞，其包含根据项22至26任一项所述的核酸分子或根据项27所述的载体。

29.项28所述的宿主细胞，其进一步表达正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶，所述正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶能够将所述核苷酸序列中所述不编码20种天然氨基酸的密码子翻译成非天然氨基酸。

30.项29所述的宿主细胞，其中所述正交tRNA源自古甲烷球菌的tRNA。

31.项29或30所述的宿主细胞，其中所述氨酰-tRNA合成酶为吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。

32.项31所述的宿主细胞，所述氨酰-tRNA合成酶为来自Methanosarcina barkeri的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MbpylRS)或来自Methanosarcina mazei的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(MmpylRS)。

33.项29所述的宿主细胞，其表达tRNA^Pyl和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。

34.项33所述的宿主细胞，其中编码非天然氨基酸的密码子为TAG。

35.项28至34任一项所述的宿主细胞，其中所述正交tRNA由tRNA载体编码。

36.项35所述的宿主细胞，所述tRNA载体包含多个拷贝数的启动子-tRNA构建体。

37.项36所述的宿主细胞，其中所述拷贝数为2-20个，优选3-10个，更优选4-8个。

38.项36或37所述的宿主细胞，其中所述启动子-tRNA中的启动子为Pol III型启动子，优选为7SK、U6、H1启动子，更优选为U6启动子。

39.制备泛素突变体的方法，包括培养项28至38中任一项的宿主细胞。

40.项39的方法，所述宿主细胞在存在所述非天然氨基酸的条件下培养。

41.根据项1至21任一项所述的泛素突变体在鉴定、表征、跟踪泛素化修饰，富集泛素化修饰的底物，鉴定具有泛素化修饰的新蛋白中的用途。

42.根据项41所述的用途，所述泛素化修饰是线性泛素化修饰。

43.根据项41所述的用途，其中所述泛素突变体用作泛素化修饰的探针。

44.用于分离细胞中带有线性泛素化修饰的底物的方法，所述方法包括：

(1)使细胞表达根据项1至21任一项所述的泛素突变体，所述泛素突变体中的全部赖氨酸突变为精氨酸，并且所述非天然氨基酸选自下组：氟硫酸盐-L-酪氨酸，氟磺酰氧基苯甲酰赖氨酸，或((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙氨基)羰基)-Nε-L-赖氨酸，或带有叠氮基团的非天然氨基酸如Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸，从而使所述泛素突变体仅参与细胞中的线性泛素化修饰；

(2)通过叠氮-炔基反应捕获包含所述泛素突变体的泛素化底物；并且

(3)分离步骤(2)中捕获的泛素化底物。

45.项44的方法，使细胞表达所述泛素突变体如下进行：

向所述细胞中引入项27的表达载体，和正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶的表达载体，并

在所述非天然氨基酸存在下培养引入了所述表达载体的细胞。

46.聚合化的泛素链，其包含至少一个项1-21任一项的泛素突变体。

47.项46的泛素链，其中全部泛素为所述泛素突变体。

48.项46或47的泛素链，其为线性泛素链。

49.泛素化的底物，其中与所述底物连接的泛素链中包含至少一个项1-21任一项的泛素突变体。

50.泛素化的底物，其中所述泛素链为线性泛素链。

51.包含项49或50中所述的泛素化底物的细胞。

52.试剂盒，其包含项1-21任一项的泛素突变体，项22-26中任一项的分离的核酸分子，项27的载体，或项28至38任一项的宿主细胞。

53.用于富集或检测细胞中带有线性泛素化修饰的底物的方法，包括：

(1)使细胞表达根据项1至21任一项所述的泛素突变体，所述泛素突变体中的全部赖氨酸突变为精氨酸，从而使所述泛素突变体仅参与细胞中的线性泛素化修饰，

(2)通过所述泛素突变体中的非天然氨基酸的生物反应性基团参与的反应检测所述泛素突变体的存在或含量，

优选地，所述非天然氨基酸的生物反应性基团为叠氮化物，所述反应为无铜点击化学反应。

54.项53所述的方法，使细胞表达所述泛素突变体如下进行：

实施例

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。例如，实施例中以突变全部赖氨酸的方式来说明本发明的技术方案以及在探测线性泛素化时效果，但本领域技术人员能够理解当其用于探测丰度更大的非线性泛素化时也同样适用。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1.含有非天然氨基酸的泛素KR突变体在宿主细胞的表达与纯化

本实施例以将野生型泛素的R54位替换为非天然氨基酸，且全部K突变为R为例，示例性说明构建本发明的泛素突变体的方法。在下文中，将仅进行了全部K突变为R，但不包含任何非天然氨基酸的突变体称为KR突变的泛素突变体，或泛素KR突变体。

1.1构建编码泛素KR突变体的目标载体

通过DNA全合成的方法合成了泛素KR突变体的编码序列seq-1(核苷酸序列如SEQID NO:1所示)，并使其5’端和3’端分别携带EcoR I和Xba I的酶切位点。通过酶切连接的方式，将该seq-1序列克隆至pXJ40载体(NCBA,J010-011)，获得的载体命名为pXJ40-UB-7KR。

1.2琥珀密码子TAG的引入

为了在选定位点引入在正交系统中用于编码非天然氨基酸的琥珀密码子TAG，根据选定位点(R54位)处的序列信息设计了PCR引物，并在引物中包含琥珀密码子，从而通过PCR反应扩增步骤1.1中构建的pXJ40-UB-7KR质粒载体来获得引入琥珀密码子的泛素突变体编码序列。

在用于引入琥珀密码子的PCR反应中使用如下引物对。

上游引物：5’-CAGCTGGAAGACGGCTAGACTCTTTCTGAC-3’(SEQ ID NO:12)；

下游引物：5’-CTAGCCGTCTTCCAGCTGCCTGCCTGCAAA-3’(SEQ ID NO:13)。

利用高保真PCR试剂盒(Takara，R050A)进行所述PCR反应，使用步骤1.1中构建的pXJ40-UB-7KR作为扩增模板。

反应体系(50μl)为：

反应条件为：98℃ 10s，55℃ 15s，68℃ 10min，25个循环。将反应产物用DpnI消化。取5μl消化后的产物用于转化DH5a感受态细胞。然后挑取单克隆并使用LB培养基在37℃下摇菌16h。用质粒小提试剂盒(TianGen，DP104)提取菌液中的质粒并测序，确认了TAG序列已正确引入。得到的载体称为pXJ40-UB54TAG。

1.3编码正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶载体的构建

本发明的非天然氨基酸通过利用正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶的密码子扩展技术引入。

首先通过DNA全合成制备了包含4个拷贝的U6-tRNA基因片段，如SEQ ID NO:3所示。

采用的氨酰-tRNA合成酶来自于巴氏甲烷八叠球菌的MbPylRS基因(Si,L.etal.Science,2016,354:1171.)。采用酶切连接的方式，首先将MbPylRS基因克隆到pcDNA3.1(Invitrogen)的多克隆位点。随后在CMV启动子的上游插入四联的U6-tRNA模块(SEQ IDNO:3)，得到编码tRNA/氨酰-tRNA合成酶的质粒，命名为pcDNA3.1-UAA。该质粒中tRNA/氨酰-tRNA合成酶构建体的示意图可参考图1。

1.4TAG泛素KR突变体表达载体与氨酰-tRNA合成酶系统共转染宿主细胞

采用脂质体转染的方法，使用上述步骤1.2和步骤1.3的两个载体，即pXJ40-UB54TAG载体与pcDNA3.1-UAA载体，共转染宿主细胞HEK293T细胞，具体包括以下步骤：

(1)预先接种2×10⁶个HEK293T细胞(ATCC)到10cm细胞培养皿中，培养12h让细胞贴壁完全。

(2)配置细胞转染体系，将5μg的pXJ40-UB54TAG质粒和5μg的pcDNA3.1-UAA质粒的DNA分别与20μl TurboFect(Thermo Fisher，R0541)、500μl Opti-MEM(Gibco，31985062)减血清培养基混合均匀，随后将两组分混合到一起，室温静置15min，作为转染体系。

(3)将转染体系逐滴加入到细胞培养皿中，6h后更换新鲜培养基，并向培养基中加入1mM的非天然氨基酸NAEK(CAS编号：1167421-25-1)。24h后通过免疫沉淀(IP)，并利用泛素的抗体(ab33893,Abcam)进行Western印迹检测，比较了添加和不添加UAA的培养基中泛素蛋白的表达水平，Western印迹结果如图3所示。

实施例2.非天然氨基酸引入位点的优化

为了比较将不同的泛素表面位点氨基酸替换为非天然氨基酸后所获得的泛素突变体的表达水平和富集效率，在本实施例中发明人选择了六个不同的位点并进行了非天然氨基酸的引入(见图2)。

2.1泛素表面位点的选择及过表达质粒的构建

发明人根据泛素蛋白的PDB结构文件，选择了野生型泛素表面的N10、K29、R42、A46、R54及N60位点作为引入非天然氨基酸的突变位点，以考察不同突变位点对泛素突变体的表达水平和富集效率的影响。这些位点的选择标准为分别处于泛素蛋白三维结构表面的不同区域，可以较好地覆盖蛋白表面的不同方位，有利于筛选出优选的非天然氨基酸引入位点。

通过实施例1中描述的方法，以类似的方式在这些位点引入了琥珀密码子TAG，使用的引物示于表2。

将在N10、K29、R42、A46、R54和N60引入琥珀密码子的泛素突变体质粒分别命名为pXJ40-UB10TAG、pXJ40-UB29TAG、pXJ40-UB42TAG、pXJ40-UB46TAG、pXJ40-UB54TAG、pXJ40-UB60TAG。

2.2转染宿主细胞

按照实施例1中第1.4部分的方法进行了转染。

具体来说，将上述2.1中获得的六种质粒中的每一种分别与实施例1获得的pcDNA3.1-UAA质粒作为一组，转染两皿(直径10cm)HEK293T细胞，共接种了12个细胞培养皿。细胞转染后，向同组的两个培养皿分别加入1mM的NAEK或PBS(作为对照)。

2.3细胞破碎与蛋白样品制备

在加入UAA 24小时后收集细胞。用RIPA缓冲液(20mM Tris-HCI pH 7.5、150mMNaCl、10mM EDTA、1％Triton X-100、1％脱氧胆酸、1mM PMSF、完全蛋白酶抑制剂和20mM n-乙基马来酰亚胺(E3876,Sigma))在冰上裂解细胞30min。随后采用2s/5s的破碎程序进行超声波破碎。破碎后的细胞样品在4℃以12000rpm离心10min，并收集上清液。采用BCA试剂盒(Thermo fisher,23227)检测蛋白浓度，配平所有样品的蛋白浓度至2mg/ml。

每个样本取80μl作为Input样品，加入5×蛋白上样缓冲液(鼎国,WB0091)20μl，98℃煮样10min之后备用。剩余的蛋白样品用于“2.4点击化学反应与免疫共沉淀”。

2.4点击化学反应与免疫共沉淀

点击化学(Click chemistry)，也称为"链接化学"、"速配接合组合式化学。二苯并环辛炔(ADIBO，DBCO)是用于应变促进的炔叠氮化物环加成(spAAC；strain-promotedalkyne azide cycloaddition)(一种无铜Click化学反应)的具反应性的环炔。这是一种胺反应性NHS酯，可将反应性部分轻松连接几乎任何伯或仲胺基团，例如蛋白质，肽或小分子胺基团。

该反应尤其强调开辟以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，其代表反应为铜催化的叠氮-炔基的环加成反应。由于本实施例的泛素突变体在特定位点引入了非天然氨基酸NAEK，因此其特有的叠氮基团可以特异性地和偶联物，例如生物素化DIBO炔发生点击反应，将生物素化的小分子DIBO炔定点偶联在目的蛋白上。

DBCO立即与叠氮化物反应。该反应速率远高于铜催化的反应速率以及与许多其他环辛炔的反应速率。与某些其他环辛炔不同，DBCO不与四嗪发生反应，这允许叠氮化物与DBCO和反式环辛烯与四嗪进行正交共轭。

富集与纯化：向2.3中剩余的蛋白样品加入10μM Biotin DIBO Alkyne(生物素DIBO炔，Thermo Fisher，C20023)，室温孵育2h，然后与预平衡的链霉亲和素琼脂糖凝胶(Thermo Fisher，20357)共孵育4℃过夜。随后，用10倍体积的RIPA缓冲液漂洗结合了蛋白的琼脂糖凝胶6次，每次2min。最后，向漂洗后的琼脂糖凝胶中加入80μl 1×蛋白上样缓冲液，98℃煮样10min。

2.5SDS-PAGE和Western印迹检测

(1)SDS-PAGE采用标准化流程进行。采用4-12％的SDS-PAGE预制胶，每孔上样量为20μg，200V恒压电泳35min。

(2)转膜。将PVDF膜在甲醇中激活，并浸泡在转膜液中5min，随后制备转膜的“三明治”夹，将PVDF膜置于胶的正极方向夹紧。250mA恒电流转膜2h。

(3)转膜完成后，将膜取出，用5％脱脂奶粉/TBST封闭1h。封闭完成后，用TBSTbuffer漂洗3次，后加入稀释后的一抗孵育过夜。使用的抗体包括：anti-Ubiquitin(ab33893,Abcam)，mouse-anti-Tubulin(T5168,Sigma)。

(4)将膜从一抗缓冲液中取出，用TBST缓冲液漂洗3次，每次10min。漂洗完成后加入对应的二抗，室温孵育1h。孵育结束后，用TBST漂洗3次，每次10min。

(5)显影。将膜上的多余缓冲液去除，均匀加上ECL发光液，避光孵育1-2min，显影。

2.6结果分析

结果显示，如图3所示。从Western结果可见，使用添加了UAA的培养基的样品(“+”)中检测到了条带，而未添加的样品(“-”)则未检出条带。这是因为只有在UAA存在时才能形成完整的泛素突变体。在没有UAA存在时，肽链会在无义密码子处终止，因此无法被抗泛素抗体探测到。因此，该结果说明试验成功地生成了在不同的泛素表面位点引入了非天然氨基酸突变的泛素突变体。另外，在不同的泛素表面位点引入突变时，其表达效率具有比较明显的差别。K29，R42，A46，R54都有较高表达。在R54位引入非天然氨基酸的对应突变体的表达水平高于N10、K29、R42、A46及N60。

此外，从免疫印迹结果体现的富集效率来看，不同突变体在通过化学生物学反应进行富集时，其纯化效率也存在较为显著的差别，其中，A46位和R54位的富集效率较高，提示所述表面位点可能更易于参与化学生物学反应。

实施例3.含有非天然氨基酸的泛素KR突变体与野生型泛素的活性对比

3.1在R54位含有非天然氨基酸的泛素化修饰探针的富集、分离和纯化

采用上述实施例1和2中的方法，在HEK293TN细胞中过表达了引入TAG的泛素KR突变体UB54TAG(对应编码序列为SEQ ID NO:2所示的Seq-2，对应构建体为质粒pXJ40-UB54TAG)，并通过加入DIBO进行化学生物学反应，得到生物素化的NAEK-UB54-KR突变体蛋白，将其用作探针。

通过BCA试剂盒测定蛋白浓度，按照每3mg蛋白加入约1mg琼脂糖凝胶的比例，加入相应量的Streptavidin琼脂糖凝胶进行富集，得到结合了NAEK-UB54-KR突变体蛋白的凝胶。

分离纯化的流程包括：

1)预平衡Streptavidin琼脂糖凝胶，随后加入蛋白样本低温共孵育过夜；

2)用10倍体积的RIPA缓冲液冲洗琼脂糖凝胶6次；

3)加入约6倍体积的洗脱缓冲液(Thermo Fisher)，共孵育30min，2000G离心2min，收集上清。

4)通过milipore超滤管对蛋白进行换液和浓缩，逐步将蛋白溶解的溶剂替换为含有5％甘油的PBS，浓缩后的蛋白样品通过BCA试剂盒测定蛋白浓度，于-80℃冰箱冷冻保存。

3.2利用圆二色谱仪比较含有非天然氨基酸的泛素突变体与野生型泛素的二级结构

分别将25μM的NAEK-UB54-KR突变体蛋白与野生型泛素溶解于2,2,2-三氟乙醇，随后将溶解的样品加入到1毫米光程的的熔融硅比管中(德国耶拿helma)。圆二色谱仪采用Jasco分光偏振仪(型号J-815，日本)。光谱测量条件为：室温，使用1nm带宽，扫描波段为190到260nm。CD数据显示为平均残差椭圆度，即[θ]_222-Value of-33000°cm²/dmol，对应于100％α-螺旋度。结果示于图4。

结果显示，由图4可见，本发明所述的泛素突变体NAEK-UB54-KR突变体蛋白与野生型泛素的CD曲线接近重合，表明引入了非天然氨基酸突变的泛素突变体蛋白与野生型泛素具有基本一致的二级结构。

3.3体外泛素化反应

作为泛素化反应探针可以应用于标记的重要标准，为能否正常形成多聚泛素链。在本实施例中，发明人使用本发明的泛素突变体NAEK-UB54-KR突变体蛋白作为泛素化探针，通过体外泛素化反应测试了所构建的泛素化修饰探针及野生型泛素(UB)形成多聚泛素链的情况。

体外反应用到的试剂包括：泛素酶UBE1、UBE2D3和HOIPRBR-LDD(购自BostonBiochem公司)，泛素化底物GST-UB(本实验室表达纯化)，泛素突变体探针NAEK-UB(NAEK-UB54-KR突变体蛋白，表达纯化方法如前所述)，野生型UB(购自Boston Biochem公司)，泛素偶联缓冲液(购自Boston Biochem公司)。

反应体系如下：(体积20μl)

共设四个反应组，两两分为探针NAEK-UB(即，NAEK-UB54-KR突变体蛋白)组和野生型UB(即，野生型泛素)组。每个组内的两个反应，一个加入ATP为酶促反应提供能量，另外一个作为对照，不加入ATP。

反应在37℃下进行3小时，随后添加含有β-巯基乙醇的蛋白上样缓冲液停止反应。样品在4-12％梯度的SDS-PAGE凝胶上分离，并使用泛素抗体兔抗-泛素抗体(ab33893,Abcam)和人抗线性泛素抗体(GeneTech公司)进行Western印迹分析，结果示于图5。

结果显示：由图5可见，在体外泛素反应体系下，泛素突变体组NAEK-UB54-KR突变体蛋白与野生型泛素蛋白都可以在GST-UB底物上形成多聚泛素链(通用型泛素抗体，左图泳道4，左图泳道2；线性泛素化抗体，右图泳道4，右图泳道2)，泛素链的结构和丰度基本相同。

由两种泛素蛋白形成的泛素链都可以被通用型泛素抗体和线性泛素化抗体识别，证明本发明的泛素突变体可以参与线性泛素化修饰，并形成正常的多聚线性泛素链。

另外，结果显示，泛素突变体在未加入ATP的泳道中(左，右图泳道3)未形成泛素链。提示，泛素突变体参加的泛素链的形成是依赖于ATP的，表明该体外反应是依赖于E1、E2、E3泛素酶活性的，确认了本发明的突变体探针可以被泛素酶识别。

以上实验结果证明，本发明所构建的包含非天然氨基酸的泛素KR突变体当用作泛素化探针时，能够保持泛素的正常生理功能，能够特异的被泛素酶识别并形成线性泛素链，可作为有效的泛素化修饰生物探针进行使用。

实施例4.利用NAEK-Ub探针进行线性泛素化底物的富集与分析

应用前述实施例的方法，构建了NAEK-UB54-KR突变体蛋白作为含有NAEK的泛素化修饰探针，在HEK293T细胞中进行了线性泛素化底物的富集与分析。

具体实施流程如图6A所示。

首先，与以上实施例所述的方法相同地，预先接种两个细胞培养皿的HEK293T细胞，待细胞贴壁后通过脂质体转染的方法瞬转pcDNA3.1-UAA和pXJ40-UB54TAG质粒到细胞中。一个培养皿加入含NAEK的DMEM培养基，另外一个培养皿加入空的DMEM培养基作为对照。细胞转染24h后收集细胞，破碎提取蛋白。随后加入sDIBO室温反应2h，再加入预先平衡好的Streptavidin凝胶富集蛋白。富集后的蛋白在蛋白上样缓冲液中煮10min，离心收集上清，得到蛋白样品。

样品在4-12％梯度的SDS-PAGE凝胶上分离，溴酚蓝染色10min，脱色液脱色6h，结果示于图6B。

由图6B可见，相对于未加NAEK的样品(条带1，在最明显的免疫球蛋白条带上基本上为空白)，对于从培养在加入了NAEK的培养基中的细胞提取的蛋白，实现了蛋白的显著富集(条带2，在最明显的免疫球蛋白条带上存在明显的蛋白条带)。两条电泳条带均用作胶内酶切和蛋白质质谱鉴定。

将目标胶块切成约1mm大小，置于EP管中脱色至透明，以DTT还原蛋白质、IAA烷基化，加入Trypsin于37℃酶解反应过夜。脱盐冻干后以0.1％FA重溶，质谱(Q-Exactive)检测，Maxquant(1.6.5.0)搜库检索，控制蛋白质鉴定假阳性率小于1％，得到候选线性泛素化修饰底物。

通过本发明的方法，使用特异性针对线性泛素化检测的泛素突变体(具有非天然氨基酸NAEK的KR泛素突变体)作为探针在HEK293T细胞中鉴定到的底物蛋白中，有18种蛋白是文献报道到的已知线性泛素化底物。这18种蛋白涵盖了大多数已知的线性泛素化底物，具体示于表1。该结果说明，本发明所述探针具有很高的特异性和准确率。

表1.鉴定到的已知线性泛素化底物质谱数据列表

表2.序列说明

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 泛素突变体及其制备方法和用途

<130> PS12934AMS33CN

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcagatct tcgtgaggac ccttaccggc aggaccatca cccttgaggt ggagcccagt 60

gacaccatcg aaaatgtgag ggccaggatc caggataggg aaggcattcc ccccgaccag 120

cagaggctca tctttgcagg caggcagctg gaagacggcc gtactctttc tgactacaac 180

atccagaggg agtcgaccct gcacctggtc ctgcgtctga gaggtggtta a 231

<210> 2

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcagatct tcgtgaggac ccttaccggc aggaccatca cccttgaggt ggagcccagt 60

gacaccatcg aaaatgtgag ggccaggatc caggataggg aaggcattcc ccccgaccag 120

cagaggctca tctttgcagg caggcagctg gaagacggct agactctttc tgactacaac 180

atccagaggg agtcgaccct gcacctggtc ctgcgtctga gaggtggtta a 231

<210> 3

<211> 1349

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg gaaacctgat catgtagatc gaatggactc taaatccgtt cagccgggtt 300

agattcccgg ggtttccgcc atttttgtcg aggggcagga agagggccta tttcccatga 360

ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga 420

ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt 480

agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa 540

agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc ggaaacctga 600

tcatgtagat cgaatggact ctaaatccgt tcagccgggt tagattcccg gggtttccgc 660

catttttgtc gaggggcagg aagagggcct atttcccatg attccttcat atttgcatat 720

acgatacaag gctgttagag agataattag aattaatttg actgtaaaca caaagatatt 780

agtacaaaat acgtgacgta gaaagtaata atttcttggg tagtttgcag ttttaaaatt 840

atgttttaaa atggactatc atatgcttac cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc 900

tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac cggaaacctg atcatgtaga tcgaatggac 960

tctaaatccg ttcagccggg ttagattccc ggggtttccg ccatttttgt cgaggggcag 1020

gaagagggcc tatttcccat gattccttca tatttgcata tacgatacaa ggctgttaga 1080

gagataatta gaattaattt gactgtaaac acaaagatat tagtacaaaa tacgtgacgt 1140

agaaagtaat aatttcttgg gtagtttgca gttttaaaat tatgttttaa aatggactat 1200

catatgctta ccgtaacttg aaagtatttc gatttcttgg ctttatatat cttgtggaaa 1260

ggacgaaaca ccggaaacct gatcatgtag atcgaatgga ctctaaatcc gttcagccgg 1320

gttagattcc cggggtttcc gccattttt 1349

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgagaaccc ttacctagag gaccatcacc 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctaggtaagg gttctcacga agatctgca 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaaatgtga gggcctagat ccaggatag 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctaggccctc acattttcga tggtgtcact 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccccccgacc agcagtagct catctttgca 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tactgctggt cggggggaat gccttccct 29

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagaggctca tcttttaggg caggcagctg 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaaaagatg agcctctgct ggtcgggggg 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagctggaag acggctagac tctttctgac 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctagccgtct tccagctgcc tgcctgcaaa 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actctttctg actactagat ccagagggag 30

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctagtagtca gaaagagtac ggccgtc 27

<210> 16

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggataaaa aaccactaaa cactctgata tctgcaaccg ggctctggat gtccaggacc 60

ggaacaattc ataaaataaa acaccacgaa gtctctcgaa gcaaaatcta tattgaaatg 120

gcatgcggag accaccttgt tgtaaacaac tccaggagca gcaggactgc aagagcgctc 180

aggcaccaca aatacaggaa gacctgcaaa cgctgcaggg tttcggatga ggatctcaat 240

aagttcctca caaaggcaaa cgaagaccag acaagcgtaa aagtcaaggt cgtttctgcc 300

cctaccagaa cgaaaaaggc aatgccaaaa tccgttgcga gagccccgaa acctcttgag 360

aatacagaag cggcacaggc tcaaccttct ggatctaaat tttcacctgc gataccggtt 420

tccacccaag agtcagtttc tgtcccggca tctgtttcaa catcaatatc aagcatttct 480

acaggagcaa ctgcatccgc actggtaaaa gggaatacga accccattac atccatgtct 540

gcccctgttc aggcaagtgc ccccgcactt acgaagagcc agactgacag gcttgaagtc 600

ctgttaaacc caaaagatga gatttccctg aattccggca agcctttcag ggagcttgag 660

tccgaattgc tctctcgcag aaaaaaagac ctgcagcaga tctacgcgga agaaagggag 720

aattatctgg ggaaactcga gcgtgaaatt accaggttct ttgtggacag gggttttctg 780

gaaataaaat ccccgatcct gatccctctt gagtatatcg aaaggatggg cattgataat 840

gataccgaac tttcaaaaca gatcttcagg gttgacaaga acttctgcct gagacccatg 900

cttgctccaa acctttacaa ctacctgcgc aagcttgaca gggccctgcc tgatccaata 960

aaaatttttg aaataggccc atgctacaga aaagagtccg acggcaaaga acacctcgaa 1020

gagtttacca tgctgaactt ctgccagatg ggatcgggat gcacacggga aaatcttgaa 1080

agcataatta cggacttcct gaaccacctg ggaattgatt tcaagatcgt aggcgattcc 1140

tgcatggtct atggggatac ccttgatgta atgcacggag acctggaact ttcctctgca 1200

gtagtcggac ccataccgct tgaccgggaa tggggtattg ataaaccctg gataggggca 1260

ggtttcgggc tcgaacgcct tctaaaggtt aaacacgact ttaaaaatat caagagagct 1320

gcaaggtccg agtcttacta taacgggatt tctaccaacc tgtaa 1365

<210> 17

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgcagatct tcgtgaagac tctgactggt aagaccatca ccctcgaggt tgagcccagt 60

gacaccattg agaatgtcaa ggcaaagatc caagataagg aaggcatccc tcctgaccag 120

cagaggctga tctttgctgg aaaacagctg gaagatgggc gcaccctgtc tgactacaac 180

atccagaaag agtccaccct gcacctggta ctccgtctca gaggtgggtg a 231

<210> 18

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly

65 70 75

Claims

1.一种泛素突变体，与野生型泛素相比，在所述泛素突变体的氨基酸序列中：(1)至少一个位于野生型泛素的表面位点的氨基酸被替换为非天然氨基酸；并且(2)1至7个参与泛素化连接的氨基酸被修饰或突变从而丧失参与泛素化连接的能力；其中所述野生型泛素的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。

2.根据权利要求1所述的泛素突变体，其中与野生型泛素相比，全部赖氨酸被替换为不参与非线性泛素化连接的氨基酸，例如精氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的泛素突变体，其中所述表面位点选自下组：K6、T9、G10、K11、T14、E16、V17、E18、S20、D21、T22、E24、N25、K27、A28、K29、Q31、D32、K33、E34、G35、P37、D39、Q40、R42、A46、Q49、E51、D52、R54、T55、S57、D58、Y59、N60、Q62、R63、E64、S65和T66；

优选选自N10、K29、R42、A46、R54和N60；

更优选选自A46或R54，例如R54。

4.根据前述任一项权利要求所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸包含参与生物正交反应的基团，优选地所述生物正交反应选自下组：点击化学、光交联、光敏感和糖基化。

5.根据权利要求4所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸包含选自下组的官能团：叠氮基团、炔基、酮基、巯基、醛基、酰胺基、烯基、硝基、磷酸根、磺酸根和双吖丙啶基团。

6.根据权利要求4或5所述的泛素突变体，其中所述非天然氨基酸选自下组：3-(6-乙酰萘-2-基氨基)-2-氨基丙酸(Anap)、(S)-1-羧基-3-(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)丙-1-胺(CouAA)、3-(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰胺)丙酸(丹磺酰丙氨酸(Dansylalanine))、Nε-对叠氮基苄氧基羰基赖氨酸(PABK)、炔丙基-L-赖氨酸(PrK)、Nε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺基)赖氨酸(CpK)、Nε-丙烯酰赖氨酸(AcrK)、Nε-(环辛-2-炔-1-基氧基)羰基)L-赖氨酸(CoK)、双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇赖氨酸(BCNK)、反式环辛基-2-烯赖氨酸(2'-TCOK)、反式环辛基-4-烯赖氨酸(4'-TCOK)、二氧-TCO赖氨酸(DOTCOK)、3-(2-环丁烯-1-基)丙酸(CbK)、Nε-5-降冰片烯-2-基氧羰基-L-赖氨酸(NBOK)、环辛炔赖氨酸(SCOK)、5-降冰片烯-2-醇酪氨酸(NOR)、环辛-2-醇酪氨酸(COY)、(E)-2-(环辛-4-烯-1-基氧基)乙醇酪氨酸(DS1/2)、叠氮高丙氨酸(AHA)、高丙炔基甘氨酸(HPG)、叠氮亮氨酸(ANL)、Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)、氟硫酸盐-L-酪氨酸、氟磺酰氧基苯甲酰赖氨酸或((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙氨基)羰基)-Nε-L-赖氨酸，或其他带有叠氮基团的非天然氨基酸。

7.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-6任一项所述的泛素突变体的核苷酸序列。

8.权利要求7的分离的核酸分子，所述核苷酸序列中编码所述非天然氨基酸的密码子为不编码20种天然氨基酸的密码子；例如所述编码非天然氨基酸的密码子为无义三联密码子、四联密码子或在目标宿主中冗余的稀有密码子；优选所述编码非天然氨基酸的密码子为选自TAG、TGA和TAA的无义三联密码子。

9.表达载体，其包含根据权利要求7或8所述的分离的核酸分子。

10.宿主细胞，其包含根据权利要求7或8所述的核酸分子或根据权利要求9所述的表达载体。

11.权利要求10所述的宿主细胞，其进一步表达生物正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶，所述生物正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶能够将所述核苷酸序列中编码所述不编码20种天然氨基酸的密码子翻译成非天然氨基酸。

12.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述生物正交tRNA源自古甲烷球菌的tRNA，和/或所述氨酰-tRNA合成酶为吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。

13.一种制备泛素突变体的方法，包括在存在所述非天然氨基酸的条件下培养权利要求10至12中任一项的宿主细胞。

14.根据权利要求1至6任一项所述的泛素突变体在鉴定、表征、跟踪泛素化修饰，富集泛素化修饰的底物，鉴定具有泛素化修饰的新蛋白中的用途，优选所述泛素化修饰是线性泛素化修饰，任选地将所述泛素突变体用作泛素化修饰的探针。

15.用于分离或富集带有线性泛素化修饰的底物的方法，所述方法包括：

(1)使细胞表达根据权利要求1至6任一项所述的泛素突变体，所述泛素突变体中的全部赖氨酸突变为精氨酸，并且所述非天然氨基酸选自下组：氟硫酸盐-L-酪氨酸，氟磺酰氧基苯甲酰赖氨酸，或((3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烯-3-基)丙氨基)羰基)-Nε-L-赖氨酸，或带有叠氮基团的非天然氨基酸如Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸；

(3)分离或富集步骤(2)中捕获的泛素化底物。

16.聚合化的泛素链，其包含至少一个权利要求1-6任一项的泛素突变体，优选所述泛素链为线性泛素链。

17.试剂盒，其包含权利要求1-6任一项所述的泛素突变体，权利要求7或8所述的分离的核酸分子，权利要求9所述的表达载体，或权利要求10-12任一项所述的宿主细胞。