CN103543257A - 一种致敏鸡红细胞的制备方法及ibv检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种致敏鸡红细胞的制备方法及IBV检测试剂盒。一种致敏鸡红细胞的制备方法，包括如下步骤：细胞固化：将新鲜鸡红细胞用缓冲液洗涤干净，加入醛溶液稀释，振荡反应，洗涤得到固化鸡红细胞；细胞鞣化：将固化鸡红细胞稀释，加入鞣酸，得到鞣化鸡红细胞；细胞致敏：将鞣化鸡红细胞稀释，加入IBV液混合作用，得到致敏鸡红细胞。本发明的致敏鸡红细胞，具有很高的特异性，检测结果具有很好的符合性。用其制备得到的IHA检测试剂，具有成本低廉，易于操作，25分钟即可观察结果，大大缩短了检测时间。

Description

一种致敏鸡红细胞的制备方法及IBV检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测用材料的制备方法及其检测试剂盒，特别涉及一种用于间接血凝检测IBV抗体的致敏鸡红细胞的制备方法及IBV检测试剂盒。
背景技术
传染性支气管炎（IB）是鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性呼吸道和泌尿生殖道疾病。其特征是咳嗽、喷嚏、气管啰音和呼吸道粘膜呈浆液性卡他性炎症。本病流行呈世界性分布，可感染所有品种和日龄的鸡，导致病鸡生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低，成年鸡感染后主要表现为开产期推迟，产蛋量、蛋品质明显下降，康复后的蛋鸡产蛋量很难恢复到患病前的水平，本病常常引起霉形体、大肠杆菌等的继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡业带来巨大的经济损失。
IBV的血清型众多，据不完全统计，迄今已至少发现27个血清型，而且新的血清型和变异株还在不断出现，这就给IB的预防带来很大困难。据调查，我国目前大部分地区的IBV毒株属于Massachusetts血清型和基因型（其代表株为M41株）。主要引起呼吸道症状。但有些地区也存在类似美国Gray株和Holte株的野毒的局部流行，其共同特点是引起典型肾脏损伤。
国内外普遍采用Massachusetts血清型的H120和H52弱毒疫苗来控制IB，对于饲养周期长的蛋鸡和种鸡于开产前接种一次IB油乳剂灭活疫苗，代表株为M41株，这与该毒株的流行最广泛有关。因IBV变异很快，所以用疫苗前必须掌握当地流行的病毒血清型，并使用与当地流行毒株抗原性一致的疫苗品系 ，这样才能达到有效的免疫预防目的。
目前国内外IBV抗体的血清学检测方法主要包括病毒中和试验、琼脂扩散试验、血凝抑制试验、ELISA等。以上血清学检测方法可能由于试验对象的个体差异会导致试验结果的不准确，琼脂扩散试验相对于IB灵敏度较差，有些血清型很难出现沉淀线，临床上很少用该方法进行IB抗体的检测，HI和ELISA灵敏度高，生产成本也随之提高，临床上抗体检测较常用的为HI，目前国内尚未有提供较好的IB凝集抗原的厂家，需从荷兰Gezonheidsdienst Voor Dieren B.V.公司购买，这就大大提高了检测成本。
在病原抗体检测领域，IHA(间接血凝试验)经过大量试验验证，是一项简便、快速、结果准确、可重复性强、经济实用的检测技术，可应用于临床抗体的大量、快速检测，值得推广应用。在IHA实验中，红细胞的处理至关重要，直接影响检测速度和检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于间接血凝检测IBV抗体的鞣化鸡红细胞的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种IBV检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种致敏鸡红细胞的制备方法，包括如下步骤：
1)      细胞固化：将新鲜鸡红细胞用缓冲液洗涤干净，加入醛溶液稀释，振荡反应，洗涤得到固化鸡红细胞；
2)      细胞鞣化：将固化鸡红细胞稀释，加入鞣酸，得到鞣化鸡红细胞；
3)      细胞致敏：将鞣化鸡红细胞稀释，加入IBV液混合作用，得到致敏鸡红细胞。
作为本发明的进一步改进，细胞固化的操作为：
1)      将新鸡红细胞用pH7.0 PBS液洗涤干净，通过离心沉淀将红细胞分离；
2)      将红细胞用PBS液悬浮，加入戊二醛进行固化处理，振荡处理10 min以上至固化完全且红细胞未发生自凝；
3)      用pH7.0 PBS液将戊二醛固化处理后的红细胞洗涤干净，得到固化鸡红细胞。
优选的，在进行细胞固化时，红细胞悬液中，红细胞的浓度为8.48×108～8.72×108个/ml，戊二醛的质量浓度为0.3～1.25‰。
作为本发明的进一步改进，细胞鞣化的操作为：将固化鸡红细胞用稀释液稀释制成悬液，在悬液中加入鞣酸，鞣化处理20～90 min，之后用PBS液洗净。
优选的，稀释后的固化鸡红细胞悬液中，红细胞的浓度为8.52×108～8.68×108个/ml，鞣酸的质量浓度为0.125～0.5%。稀释液为蒸馏水。
作为本发明的进一步改进，细胞致敏的操作为：将鞣化鸡红细胞稀释至4.26×108～4.34×108个/ml，与IBV病毒混合，35～40℃作用15～45 min，之后洗涤干净，得到致敏鸡红细胞。
一种IBV间接血凝试剂盒，含有致敏红细胞、阳性对照血清、阴性对照血清和致敏红细胞稀释剂，致敏红细胞按上述任意一项所述方法制备得到。
作为本发明的进一步改进，稀释液为含有体积比为1%新生牛血清的pH7.0 PBS液。
本发明的有益效果是：
本发明的致敏鸡红细胞，具有很高的特异性，检测结果具有很好的符合性。用其制备得到的IHA检测试剂，具有成本低廉，易于操作，25分钟即可观察结果，大大缩短了检测时间。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。
新鲜鸡红细胞的制备：
取SPF鸡新鲜血液，离心去血清，用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，离心沉淀红细胞，4℃保存备用。
当然，也可以使用其他公知的方法获得鸡红细胞。以下实验中所使用的鸡红细胞
鸡红细胞的固化：
将鸡红细胞用pH7.0 PBS液稀释至8.48×108～8.72×108个/ml，分成10份，分别加入戊二醛，调整其质量浓度依次为0.075‰、0.15‰、0.3‰、0.6‰、1.25‰、2.5‰、5‰、10‰、15‰、25‰，25℃振摇作用30分钟取出，之后用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，离心沉淀得到固化红细胞，4℃保存备用；
对比例：使用同浓度的甲醛替换戊二醛，其他操作相同。
将鸡红细胞用pH7.0 PBS液稀释至8.48×108～8.72×108个/ml，，取8份等量红细胞，分别加入甲醛，调整其质量浓度依次为0.075‰、0.15‰、0.3‰、0.6‰、1.25‰、2.5‰、5‰、10‰、15‰、25‰，分别置于25℃和4℃振摇作用20分钟、30分钟、50分钟、60分钟取出，用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，离心沉淀得到固化红细胞，4℃保存备用。
固化效果评价：
分别取部分上述制备得到的固化鸡红细胞进行自凝性检测，剩余部分4℃保存备用。
用甲醛和戊二醛两种试剂溶液按不同浓度固化红细胞，经震荡后离心和红细胞自凝性检测，甲醛浓度在0.075‰、0.15‰、0.3‰、0.6‰、1.25‰、2.5‰、5‰、10‰时可使红细胞固化，自凝试验甲醛浓度在2.5‰、5‰、10‰时红细胞会发生自凝现象，甲醛浓度在0.075‰、0.15‰、0.3‰、0.6‰、1.25‰时红细胞沉积于孔底并呈泪滴样流淌，甲醛浓度在15‰、25‰时红细胞迅速溶血，可见甲醛浓度在0.075‰、0.15‰、0.3‰、0.6‰、1.25‰时可使红细胞很好的固化，缺点是固化过的红细胞颜色呈暗红色。
戊二醛浓度在0.3‰、0.6‰、1.25‰、2.5‰、5‰、10‰、15‰、25‰时可使红细胞固化，自凝试验戊二醛浓度在10‰、15‰、25‰时红细胞会发生自凝现象，戊二醛浓度在2.5‰、5‰时发生半自凝现象，戊二醛浓度在0.3‰、0.6‰、1.25‰时红细胞沉积于孔底并呈泪滴样流淌，戊二醛浓度在0.075‰、0.15‰时震荡后离心红细胞出现溶血现象，可见戊二醛浓度在0.3‰、0.6‰、1.25‰时可使红细胞很好的固化，且红细胞颜色鲜艳如新鲜红细胞。
通过两种醛类固化红细胞对比，戊二醛固化效果要好于甲醛固定。
加入适量戊二醛的红细胞，在25℃和4℃作用不同时间的红细胞自凝性检测表明，红细胞在25℃时作用20分钟时不能完全被固化，作用30分钟红细胞被完全固化，且不发生自凝现象，作用50分钟红细胞出现了自凝，红细胞在4℃作用20分钟、30分钟、50分钟均不能使红细胞完全固化，作用60分钟及以上可使红细胞完全固化，且不出现自凝现象。
通过不同温度作用不同时间表明，红细胞在25℃作用30分钟和4℃作用60分钟即可使红细胞完全固化。
 
固化鸡红细胞的鞣化：
鞣化红细胞稀释液选择
分别用pH7.0 PBS液、生理盐水和双蒸水将固化红细胞稀释至4.26×108～4.34×108个/ml，，得到固化红细胞悬液，之后加入鞣酸使其在固化红细胞悬液的质量浓度为0.5%，38℃水浴作用30分钟取出，用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，离心沉淀得到鞣化红细胞，4℃保存备用。
 
鞣酸液浓度选择
用灭菌蒸馏水将固化红细胞稀释至4.26×108～4.34×108个/ml，，得到固化红细胞悬液，分成6等份，之后加入鞣酸使其在固化红细胞悬液的质量浓度分别为4%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%，38℃水浴作用30分钟取出，用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，离心沉淀得到鞣化红细胞，4℃保存备用。
 
红细胞鞣化温度及时间选择
用灭菌蒸馏水将固化红细胞稀释至4.26×108～4.34×108个/ml，，得到固化红细胞悬液，分成12等份，之后加入鞣酸使其在固化红细胞悬液的质量浓度为0.3%，分别放入38℃、25℃和4℃作用20分钟、30分钟、50分钟、60分钟取出，用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，离心沉淀得到鞣化红细胞，4℃保存备用。
鞣化效果评价：
取上述鞣酸浓度为1%、0.5%、0.25%、0.125%的鞣化红细胞，38℃作用20～30分钟、25℃和4℃作用20分钟、30分钟、50分钟、60分钟的红细胞，分别加入IBV病毒液混合，红细胞与病毒液浓度为1:5进行混合，38℃作用30分钟取出，用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，进行致敏红细胞自凝性检测和间接血凝试验。
固化红细胞用PBS、生理盐水和蒸馏水稀释后加入适量鞣酸液进行鞣化，在鞣化红细胞洗涤过程中发现用PBS液和生理盐水稀释红细胞进行的鞣化，红细胞呈现颗粒状，用蒸馏水稀释红细胞进行的鞣化，红细胞呈均匀的云雾状分散。自凝性试验，用PBS液和生理盐水进行的鞣化，红细胞加入V型孔内静止20～25分钟呈颗粒状沉积于孔底且呈块状下滑，用蒸馏水稀释进行的鞣化，红细胞加入V型孔内静止20～25分钟呈泪滴样流淌。
用三种稀释液进行的红细胞鞣化，蒸馏水的鞣化效果要好于PBS液和生理盐水的鞣化，且三种鞣化液在4℃放置一定时间后，进行自凝性检测，只有蒸馏水鞣液未发生自凝现象，另两个鞣化液红细胞沉积于孔底不下滑。
试验证明固化红细胞的鞣化应选用蒸馏水作为稀释液，能使固化红细胞表面均匀软化，以利于下游试验中病毒的吸附。
用不同浓度鞣酸固化红细胞，自凝性试验表明，鞣酸浓度在4%时会发生自凝现象，浓度在1%～2%时出现半自凝现象，浓度在0.5%、0.25%和0.125%时鞣化红细胞在20～25分钟很快下滑。
试验表明固化红细胞表面软化用鞣酸浓度在0.5%～0.125%能使固化红细胞表面很好的鞣化。
将加入0.3%鞣酸液的固化红细胞，放入38℃、25℃和4℃作用不同时间段取出进行自凝性检测，红细胞在38℃作用50和60分钟均可使红细胞出现自凝现象，38℃作用20和30分钟、25℃和4℃作用20、30、50、60分钟红细胞均不出现自凝现象。
用同一份阳性血清进行间接血凝试验表明：鞣酸液浓度在0.5%、0.25%、0.125%及38℃作用30分钟的致敏红细胞与阳性血清作用，凝集价均在1:16以上；38℃作用20分钟、25℃作用50～60分钟的致敏红细胞与阳性血清作用，凝集价为1:2～1:4；25℃作用20、30分钟、4℃作用20、30、50、60分钟的致敏红细胞与阳性血清作用，红细胞均不出现凝集。
试验表明固化红细胞用鞣酸浓度为0.125%～0.5%，温度为38℃，时间为30分钟，能使红细胞很好的鞣化并能使病毒很好的吸附。
致敏红细胞用IBV病毒液的病毒含量每0.1ml不低于107.5EID50方可用于致敏。
 
红细胞的致敏：
本实验中所使用的鞣化红细胞为上述“鞣酸液浓度选择”中，鞣酸浓度为0.5%的鞣化红细胞。
致敏浓度的选择
取鞣化红细胞稀释至4.26×108～4.34×108个/ml，加入IBV病毒液（病毒含量每0.1ml不低于107.5EID50）混合，红细胞与病毒液比例分别为：1:1、1:2、1:3、1:4、1:5混合均匀，38℃水浴作用30分钟取出，用pH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，用pH7.0 PBS液配制成1%的红细胞溶液，4℃保存备用。
 
致敏温度及时间的选择
取鞣化红细胞1份、病毒液2份混合均匀，38℃和56℃水浴作用10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟时取出，用PH7.0 PBS液洗涤红细胞3～4次，4℃保存备用。
致敏效果的评价：
结果判定标准：红细胞全部凝集表示为“++++”；75%红细胞凝集表示为“+++”；50%红细胞凝集表示为“++”；25%红细胞凝集表示为“+”；红细胞无凝集表示为“-”。阳性对照血清呈现50%以上凝集的不低于1:16；阴性血清和空白对照呈现50%凝集的不高于1:2。
结果判定应在阳性对照和阴性对照成立的前提下，观察待检血清各孔凝集情况，以呈现50%凝集的血清最大稀释倍数作为该血清的抗体效价。
待检血清1:2呈现50%凝集的判为阴性；待检血清1:4及以上呈现50%凝集的判为阳性；待检血清1:16及以上呈现50%凝集的判为血清抗体保护效价。
鞣化红细胞与不同浓度IBV病毒液作用，经间接血凝试验表明：红细胞与病毒液比例为1:1时，红细胞凝集价≤1:8；红细胞与病毒液比例为1:2、1:3、1:4、1:5时红细胞凝集价相同，均≥1:16。为节省病毒用量，病毒液的致敏浓度选择1:2～1:3为佳。
红细胞与病毒液在56℃作用10分钟、38℃作用40、50和60分钟均发生了自凝，38℃作用10、20、30分钟不发生自凝。间接血凝试验，红细胞与病毒液38℃作用10分钟，红细胞无凝集价，38℃作用20分钟，红细胞凝集价为1:4，38℃作用30分钟红细胞凝集价为1:16。可见红细胞与病毒液在38℃作用30分钟，能使病毒很好的吸附于红细胞。
 
IBV检测试验
间接血凝试验
96孔微量板法，取96孔V型血凝板，每孔加入25μl PBS液，左边第1孔各加入25μl阳性血清，用移液器从左边第1孔开始将血清2倍系列稀释至第11孔，弃去移液器内25μl液体（稀释倍数以次为2、4、8、16、32……2048），第1～6列分别加入上述致敏10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟的红细胞，每孔25μl，第7列加入阴性血清，每孔25μl，然后加入每个时间段的致敏红细胞，每个样加2孔，第8列加入醛化红细胞作对照，混合均匀，室温静止作用20～25分钟观察结果。
 
特异性试验
用制备好的致敏红细胞检测新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV，H9、H5亚型）、减蛋综合症病毒（EDSV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、大肠杆菌（O1、O78型）、鸭疫里默氏杆菌（1、2型）阳性血清，结果均为阴性反应。说明制备的红细胞具有很高的特异性。
 
IHA与HI试验
取IBV病毒，分成两份，一份用来做成致敏红细胞，另一份制备成具有血凝性的病毒抗原，用同一份阳性血清进行IHA和HI对比试验，反复检测3次，结果抗体效价符合率为97.9%。说明用两种方法检测抗体结果基本一致，可用IHA试验代替HI试验，可节省成本，简单易操作，25分钟即可观察结果，还可大幅节省时间。
 
批量血清样品检测
取实验室和田间血清样品共计210份，用致敏好的红细胞进行IHA和用同批病毒制备的具有血凝的病毒抗原进行HI两种方法同时进行检测，结果两种方法检测结果符合率达97.9%，与进口抗原进行HI抗体检测，结果符合率达64.3%，这可能与不同地区病毒株存在差异有关。具体检测结果如表1所示。
表1  IHA试剂盒与同种病毒制备血凝抗原和进口抗原HI试验结果
Figure 2013105113694100002DEST_PATH_IMAGE002
小结：
试验表明，进行间接血凝试验，在红细胞的固定、鞣化及致敏方面对试剂的浓度、作用温度和时间上要求非常严格，否则红细胞发生自凝现象，无法再进行间接血凝试验，尤其固定红细胞的鞣化是非常关键的一部，用PBS液或生理盐水与鞣酸作用可能由于离子的相互作用使红细胞出现颗粒状，不仅降低了病毒与红细胞表面的吸附面积，在4℃保存2周，致敏红细胞、鞣化红细胞和固定红细胞均发生了自凝；而用蒸馏水与鞣酸作用鞣化的红细胞，红细胞呈均匀混悬的云雾状，能使病毒与红细胞表面充分吸附，在4℃保存3个月致敏红细胞无自凝现象，间接血凝试验红细胞凝集价不低于1:16。
 
IBV间接血凝试剂盒，包括：
试剂1：致敏红细胞5ml，含10%甘油的pH7.0 PBS液配制的含10%致敏红细胞的混合液，可冷冻保存；
试剂2：阳性对照血清0.5ml；
试剂3：阴性对照血清0.5ml；
试剂4：稀释液50ml，为含1%新生牛血清的pH7.0 PBS液；
材料：微量血凝板。
 
试剂盒使用说明：
将试剂1用试剂4进行10倍稀释，混合均匀，4℃保存备用。
pH7.0 PBS液自行配制。
取96孔微量血凝板，每孔加入25μl PBS液，1～7排的第1孔加入待检血清样品25μl，第8排的第1孔加入阳性对照血清25μl，用移液器从左边第1孔开始将待检血清、阳性对照血清依次作2倍系列稀释，待检血清稀释至第11孔，第12孔作为空白对照，阳性对照血清稀释至第9孔，第10孔作为空白对照，弃去移液器内25μl液体，（稀释倍数以次为2、4、8、16、32……2048），第8排的第11、12孔加入阴性对照血清25μl，然后每孔加入25μl致敏红细胞，混合均匀，室温静止作用20～25分钟观察结果。
结果判定：红细胞全部凝集表示为“++++”；75%红细胞凝集表示为“+++”；50%红细胞凝集表示为“++”；25%红细胞凝集表示为“+”；红细胞无凝集表示为“-”。阳性对照血清呈现50%以上凝集的不低于1:16；阴性血清和空白对照呈现50%凝集的不高于1:2。
结果判定应在阳性对照和阴性对照成立的前提下，观察待检血清各孔凝集情况，以呈现50%凝集的血清最大稀释倍数作为该血清的抗体效价。

Claims (9)

1.一种致敏鸡红细胞的制备方法，包括如下步骤：
1)细胞固化：将新鲜鸡红细胞用缓冲液洗涤干净，加入醛溶液稀释，振荡反应，洗涤得到固化鸡红细胞；
2)细胞鞣化：将固化鸡红细胞稀释，加入鞣酸，得到鞣化鸡红细胞；
3)细胞致敏：将鞣化鸡红细胞稀释，加入IBV液混合作用，得到致敏鸡红细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：细胞固化的操作为：
1)将新鸡红细胞用pH7.0 PBS液洗涤干净，通过离心沉淀将红细胞分离；
2)将红细胞用PBS液悬浮，加入戊二醛进行固化处理，振荡处理10 min以上至固化完全且红细胞未发生自凝；
3)用pH7.0 PBS液将戊二醛固化处理后的红细胞洗涤干净，得到固化鸡红细胞。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：红细胞悬液中，红细胞的浓度为8.48×108～8.72×108个/ml，戊二醛的质量浓度为0.3～1.25‰。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：细胞鞣化的操作为：将固化鸡红细胞用稀释液稀释制成悬液，在悬液中加入鞣酸，鞣化处理20～90 min，之后用PBS液洗净。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：稀释后的固化鸡红细胞悬液中，红细胞的浓度为8.52×108～8.68×108个/ml，鞣酸的质量浓度为0.125～0.5%。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：稀释液为蒸馏水。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：细胞致敏的操作为：将鞣化鸡红细胞稀释至4.26×108～4.34×108个/ml，与IBV病毒混合，35～40℃作用15～45 min，之后洗涤干净，得到致敏鸡红细胞。
8.一种IBV间接血凝试剂盒，含有致敏红细胞、阳性对照血清、阴性对照血清和致敏红细胞稀释剂，其特征在于：致敏红细胞按权利要求1～7任意一项所述方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的IBV间接血凝试剂盒，其特征在于：稀释液为含有体积比为1%新生牛血清的pH7.0 PBS液。
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