CN1621416A

CN1621416A - 用于重度急性呼吸综合症病毒抗原检测的方法

Info

Publication number: CN1621416A
Application number: CN 200310115244
Authority: CN
Inventors: 高强; 张建三; 李静; 李晶; 胡良湘; 李淑芬; 公雪杰; 尹卫东
Original assignee: SINOVAC BIOTECH CO Ltd
Current assignee: SINOVAC BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2005-06-01

Abstract

本发明主要涉及SARS病毒抗原的检测。具体的，本发明涉及SARS病毒抗体、抗SARS病毒IgG致敏红细胞、它们的制备方法、和SARS病毒抗原检测方法和试剂盒等。本发明通过反向间接血凝法来检测SARS病毒抗原。反向间接血凝法是用抗－SARS病毒IgG(例如兔抗－SARS病毒IgG)致敏的红细胞(例如人“O”型红细胞)检测待检样品中的SARS病毒抗原。反向间接血凝方法可用于检测SARS灭活疫苗制备过程中的SARS病毒抗原含量。

Description

用于重度急性呼吸综合症病毒抗原检测的方法

相关申请的引用

特此将申请号为200310114341.3、申请日为2003年11月12日的中国专利申请完整地引入本申请作为参考。

技术领域

本发明主要涉及SARS病毒抗原的检测。具体的，本发明涉及SARS病毒抗体、抗SARS病毒IgG致敏红细胞、它们的制备方法、和SARS病毒抗原检测方法等。

背景技术

重度急性呼吸综合症(sever acute respiratory syndrome，SARS)是2002年底开始影响世界上几个国家和地区的一种传染性极强的疾病。根据目前的研究，这种疾病是由一种新的冠状病毒引起的。这种疾病的传染性强，严重影响患者的身体健康，并且有较高的致死率。要很好地预防这种疾病，只有通过接种疫苗来实现。疫苗主要分为减毒活疫苗(例如甲肝减毒活疫苗)，灭活疫苗(例如甲肝灭活疫苗)，基因工程疫苗，亚单位疫苗。而研制快而有效的就是灭活疫苗，在灭活疫苗的制备过程中需要一种检测SARS病毒的方法。现有技术中迫切需要能快速且灵敏的测定样品中的SARS病毒，以便能对疫苗的纯化工艺及疫苗本身作出评价的方法。

本发明提供了评价疫苗纯化工艺及疫苗本身的方法，从而满足了现有技术中的这一需求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种测定SARS病毒抗原的方法。为此，本发明提供如下技术方案。

一方面，本发明涉及特异性结合SARS病毒抗原的抗体，特别是多克隆抗体，优选IgG，更优选人IgG、猴IgG、兔IgG，最优选兔IgG。在另一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。优选的，所述抗体具有高效价。

本发明还涉及制备特异性结合SARS病毒抗原的抗体的方法，该方法包括：

(a)用纯化的SARS病毒抗原免疫动物(例如哺乳动物，如家兔或猴)，例如，采用0，14，21天三针免疫程序，将纯化SARS抗原与弗氏完全佐剂等比混合后，2ml/次/只，肌肉注射；

(b)从免疫动物采血，分离出血清；

(c)任选的，将血清灭活，例如经56℃，30min灭活；和

(d)任选的，用蛋白A法提取SARS抗体阳性血清中的IgG。

另一方面，本发明制备经抗SARS病毒IgG致敏的红细胞的方法，包括如下步骤：

(a)制备醛化红细胞，优选双醛化红细胞；

(b)将醛化红细胞鞣化；

(c)用抗SARS病毒IgG致敏鞣化红细胞；和

(d)任选地，加入适当的保护剂，冻干。

红细胞可采用本领域已知的任何方法进行醛化。例如，可将红细胞配成10％(体积比)红细胞悬液。缓慢加入等体积1％(体积比)戊二醛，室温振荡30分钟，进行单醛化。经过洗涤之后加入百分之一体积的甲醛溶液双醛化。对于醛化后的红细胞，可加入终浓度1∶10000(质量比)的NaN₃，2-8℃保存备用。

在优选的实施方案中，步骤(a)的红细胞是O型红细胞，依次采用戊二醛和甲醛进行醛化；和/或

步骤(b)包括用1∶20000(质量比)等体积新鲜配制鞣酸37℃作用15分钟；和/或

步骤(c)包括将适当浓度的抗SARS病毒IgG和适当浓度的步骤(b)的鞣化红细胞在足以致敏红细胞的时间和条件下接触；优选地，步骤(c)包括将4倍体积0.15mol/L pH6.4的PBS、1倍体积适当浓度的IgG、1倍体积2.5％鞣化红细胞混合均匀后，室温振荡结合1小时；和/或

步骤(c)还可以包括用约1％灭活正常兔血清-PBS洗涤2次，任选地，用0.15mol/L pH7.2的PBS配成约1.25％的致敏红细胞；和/或

步骤(d)的保护剂是蔗糖和吐温-20，优选终浓度为10％(质量比)蔗糖和万分之三(体积比)吐温-20。

在另一个的实施方案中，本发明方法步骤(c)的IgG优选人IgG、猴IgG或兔IgG，更优选兔IgG；和/或

步骤(c)的IgG的浓度为0.01-2.0mg/ml，更优选0.05-0.5mg/ml，最优选0.1-0.2mg/ml。

在一个具体实施方案中，本发明方法步骤(c)使用0.1-0.2mg/ml的兔IgG致敏红细胞。

另一方面，本发明涉及经抗SARS病毒IgG致敏的红细胞，优选“O”型红细胞。该红细胞可以是任何来源的，优选哺乳动物红细胞，更优选人红细胞，特别是人“O”型红细胞。本发明的红细胞可通过本发明的方法制备。优选地，按照本发明的方法或相当的方法，本发明敏化红细胞检测SARS病毒抗原对照的效价不低于1∶16，优选不低于1∶32，更优选不低于1∶40，不低于1∶50，不低于1∶60，甚至更优选不低于1∶80，不低于1∶96，最优选不低于1∶128或更高。

另一方面，本发明涉及测定SARS病毒抗原的方法，包括如下步骤：

(a)获得待测样品；和

(b)采用本发明的致敏红细胞通过反向间接血凝方法测定所述待测样品是否存在SARS病毒抗原，优选地，定量测定该样品的血凝效价。

所述待测样品可以是任何样品，例如制备SARS疫苗过程中的中间产品、过程液及疫苗原液：灭活液、澄清液、超滤液、超滤原滤过液、纯化液、纯化二峰等等，也可以是动物或人的分泌物、排泄物、血液样品、组织样品、或任何临床样品。而且，如果需要，这些样品可以经过适当处理，例如离心、裂解、破碎、纯化、灭活等。

反向间接血凝方法是用抗-SARS病毒IgG(兔抗-SARS病毒IgG)致敏的红细胞(例如人“O”型红细胞)检测待检样品中的SARS病毒抗原。反向间接血凝方法可用于检测SARS灭活疫苗制备过程中的SARS病毒抗原含量。

反向间接血凝方法是本领域熟知的，可以由本领域普通技术人员按照常规方法进行合理的设计和实施。例如，可以按照实施例中提供的方法进行。

反向间接血凝方法应用时，出现的非特异反应可通过增加SARS病人恢复期血清的抑制而确定。

在一个实施方案中，该方法还包括用血凝抑制试验测定非特异性反应。在一个具体实施方案中，血凝抑制试验包括：每次检测样品时，增加SARS抗体阳性血清(例如SARS病人恢复期血清)的抑制；当样品稀释液检测待测样品血凝效价≥1∶4，优选≥1∶8，更优选≥1∶16，例如≥1∶32甚至更高，SARS抗体阳性血清抑制后结果较抑制前低至少4倍时判定为SARS抗原阳性；未出现SARS抗体阳性血清抑制，判定为SARS病毒抗原阴性。

另一方面，本发明还涉及用血凝抑制试验测定反向间接血凝中非特异性反应的方法。

再一方面，本发明涉及检测SARS抗原的试剂盒，包含经抗SARS病毒IgG致敏的红细胞和任选的SARS抗体阳性血清。该试剂盒还可以包含样品稀释液、阳性对照、阴性对照、微量血凝板、和/或说明书等等。

在本发明的特别具体的实施方式中，如果适当的话，本发明所有方面都使用以下SARS病毒毒株：Sino 1，Sino 2，Sino 3，Sino 4，和Sino 5。所述病毒毒株分别于2003年6月26日保藏在国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号分别为CGMCC No.0962、0963、0964、0965和0966。分类命名为冠状病毒属(Coronavirus)SARS病毒。

本发明所用的病毒抗原和病毒抗原阳性对照可通过以下方法制备。通过Vero细胞培养SARS病毒，并用甲醛或β-丙内酯进行灭活而得病毒灭活液；将病毒灭活液进行离心后即得病毒澄清液；病毒澄清液通过一定截留直径的膜包进行超滤，滤出的称为超滤滤过液，未滤出的称为病毒超滤液；将病毒超滤液进行分子筛层析，层析第一峰即是纯化液，层析第二峰称为纯化二峰。具体地，灭活和纯化方法可参见实施例所述。

以下通过实施例对本发明进行举例说明，这些实施例对本发明的范围没有任何限制作用。参考这些实施例，本发明的上述方面和其他方面对于本领域技术人员而言是明显的。

附图说明

图1.选择不同福尔马林溶液浓度进行灭活对SARS病毒感染滴度的影响。

图2.选择不同β-丙内酯溶液浓度对SARS病毒感染滴度的影响。

实施例

材料和方法

1.SARS病人恢复期血清——北京、张家口、内蒙古地区，北京科兴临床医学部提供。经56℃，30min灭活后，2-8℃保存备用。用0.15mol/L pH7.2的PBS 1∶25稀释，用于血凝抑制试验。

2.阴性血清

2. 1健康人血清

购自北京市红十字血液中心。SARS中和抗体阴性。经56℃，30min灭活后，2-8℃保存备用。用0.15mol/L pH7.2的PBS 1∶25稀释，用于血凝抑制试验。

2. 2正常兔血清

采自健康家兔，分离出血清。经56℃，30min灭活后，2-8℃保存备用。用0.15mol/L pH7.2的PBS 1∶100稀释，得到1％灭活正常兔血清-PBS，用作样品稀释液。

3.SARS病毒抗原参比品

用Vero细胞培养、收获SARS病毒，经灭活、离心、超滤、分子筛层析而得。

4.样品

北京科兴生物制品有限公司通过Vero细胞培养SARS病毒，并用甲醛或β-丙内酯进行灭活而得病毒灭活液；将病毒灭活液进行离心后即得病毒澄清液；病毒澄清液通过一定截留直径的膜包进行超滤，滤出的称为超滤滤过液，未滤出的称为病毒超滤液；将病毒超滤液进行分子筛层析，层析第一峰即是纯化液，层析第二峰称为纯化二峰。具体灭活和纯化方法同以下实施例所述。

5.Vero细胞冻融液

将Vero细胞培养至致密单层，弃培养液。加入维持液，-20℃冻融三次。2-8℃保存备用。蛋白含量：2.5mg/ml。

6.Vero蛋白纯化液

将Vero细胞培养、收获，用SARS病毒同一提纯工艺提纯而得。蛋白含量：28μg/ml。

实施例1 SARS病毒灭活

在本发明中，采用选自福尔马林溶液和β-丙内酯的灭活剂，对含有SARS病毒的样品进行灭活。

1)福尔马林溶液灭活

分别以等体积向待处理的SARS病毒样品中加入经1∶100(体积比)稀释的福尔马林溶液，在37℃下用工作浓度分别为1∶1000、1∶2000、1∶4000(体积比)稀释的福尔马林溶液处理SARS病毒液，得到SARS病毒推算灭活时间分别为2.9小时、6.0小时和12.5小时。结果详见表1灭活动力学曲线参见图1。

表1 不同浓度福尔马林溶液灭活SARS病毒时间

灭活前推算灭活时间

福尔马林斜率

CCID50/ml (hr)

1∶1000 6.7 -2.4 2.9

1∶2000 6.7 -1.13 6.0

1∶4000 6.7 -0.53 12.5

2)β-丙内酯溶液灭活

分别以等体积向待处理的SARS病毒样品中加入经1∶10(体积比)稀释的β-丙内酯溶液，在4℃下用工作浓度分别为1∶4000、1∶6000、1∶8000(体积比)稀释的β-丙内酯溶液处理SARS病毒液，得到SARS病毒推算灭活时间分别为2.9小时、7.2小时和11.6小时，结果见表2。在此基础上延长至少2倍时间即为首次灭活时间。灭活动力学曲线参见图2。

表2 不同浓度β-丙内酯灭活SARS病毒时间

灭活前推算灭活时间

β-丙内酯浓度斜率

CCID50/ml (hr)

1∶4000 7.2 -2.4 2.9

1∶6000 7.2 -1.025 7.2

1∶8000 7.2 -0.63 11.6

实施例2 在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活SARS病毒

在本发明中还可以在规模化制备SARS病毒的细胞工厂中原位灭活SARS病毒。

将制备好的灭活剂，即经1∶100(体积比)稀释的福尔马林溶液，等量加入盛有待灭活SARS病毒的细胞工厂(购自丹麦NUNC公司)内，混匀，在搅拌下，经37℃原位灭活2.9～12.5小时后收获。

或者当采用β-丙内酯溶液作为灭活剂时，将1∶10稀释后加入，使得β-丙内酯溶液与总样品体积比为1∶6000～1∶8000。灭活温度2～8℃ 16～24小时。

实施例3 SARS病毒超时灭活或二次灭活

1)对由实施例2所得采用福尔马林为灭活剂处理得到的病毒灭活液，将其在与如实施例2所述相同的灭活条件下以首次灭活时间的3倍进行超时灭活。

2)对由实施例2所得采用β-丙内酯为灭活剂处理得到的灭活病毒液，进行二次灭活。再次加入与病毒样品总体积比为1∶4000-1∶6000(为两次加β-丙内酯工作浓度之和)的量进行二次灭活，第二灭活条件是在2-8℃下灭活SARS病毒16-24小时，室温作用2天或37℃水浴作用2小时，以将SARS病毒彻底灭活。

实施例4 灭活SARS病毒的纯化

将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作，以纯化所得病毒灭活液：

1)离心澄清，即以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，得到病毒澄清液；

2)超滤浓缩：将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)，获得病毒超滤液；滤出的称为超滤滤过液；

3)柱层析：将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，收集第一穿流峰即为病毒纯化液。洗脱液0.01M PBS。层析第二峰称为纯化二峰。

或者，将如实施例3所得病毒灭活液进行如下操作，以纯化所得病毒灭活液：

1)将病毒灭活液进行离心澄清，具体的以2000～4000g离心力在2-8℃离心10～35分，吸上清，即为病毒澄清液；

2)超滤浓缩：将病毒澄清液用100-500kd(截留分子量)的膜包进行超滤浓缩10倍以上，等体积透析3-7次，透析液用0.01M PBS(pH7.0～7.6)获得病毒超滤液；

3)向步骤2)所的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度10-100单位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg²⁺室温处理4小时以上，消化体系中Vero细胞残留DNA和体系的RNA；消化体系中Vero细胞残留DNA；

4)再次超滤；

5)柱层析：将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰即为病毒精纯液。

3)柱层析：将病毒超滤液用Sepharose four fast flow进行层析，洗脱液0.01M PBS，收集第一穿流峰；

4)向步骤3)中收集的经纯化的灭活病毒液中加入终浓度10-100单位Benzonase(默克公司)，1-10mM Mg²⁺室温处理4小时以上，消化体系中Vero细胞残留DNA和体系的RNA；

5)再次超滤，获得病毒精纯液。

将SARS病毒精纯液用作制备高效价抗体的免疫原和反向间接血凝试验的阳性对照。

将经过实施例1-3所述方法灭活的病毒灭活液依照实施例4所述方法纯化后，将所得病毒纯化液进一步经过如下处理：将病毒精纯液用选自0.2μm滤器或4-10千戈瑞剂量的钴60照射样品(体积不限)60分钟，除菌，获得疫苗原液。

实施例5 高效价SARS病毒抗体的制备

1. SARS抗原免疫兔血清

用北京科兴纯化的SARS病毒抗原免疫家兔，采用0，14，21天三针免疫程序，将纯化SARS抗原与弗氏完全佐剂(鼎国生物)等比混合后，2ml/次/只，后肢肌肉注射，28天采血，分离出血清。经56℃，30min灭活后，2-8℃保存备用。

2. SARS抗原免疫猴血清

用北京科兴纯化的SARS抗原免疫猴，采用0，14，21天三针免疫程序，1ml/次/只，后肢肌肉注射，28天采血，分离出血清。经56℃，30min灭活后，2-8℃保存备用。

3.血清中IgG提取方法

用蛋白A法提取SARS抗体阳性血清中的IgG。

(1)加入1/10体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)，调含抗体样品的pH值至8.0。

(2)将抗体溶液通过蛋白A(Protein A Sepharose^TM CL-4B，Amersham)微球柱，流速0.5ml/min。

(3)用10倍柱体积的100mmol/L Tris(pH8.0)洗涤微球。

(4)用10倍柱体积的10mmol/L Tris(pH8.0)洗涤微球。

(5)用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，根据OD280值收集蛋白，即得纯化的IgG(酶标1∶100)。

实施例6 敏化红细胞的制备

单醛化

取人“O”型红细胞(购自北京市红十字血液中心)，用生理盐水洗涤6次，用0.15mol/L，pH7.2PBS配成10％(体积比)红细胞悬液。缓慢加入等体积1％(体积比)戊二醛，室温振荡30分钟。如上所述洗涤6次，配成10％(体积比，下同)红细胞悬液。

双醛化

10％单醛化红细胞悬液中加入百分之一体积的甲醛溶液(38％)，37℃作用1小时，15分钟摇一次。用生理盐水洗涤6次。用0.15mol/L，pH7.2PBS配成10％红细胞悬液。加入终浓度1∶10000(质量比)的NaN₃，2-8℃保存备用。

敏化红细胞

取双醛化红细胞，用1∶20000(质量比)等体积新鲜配制鞣酸37℃作用15分钟，洗涤1次，配制成2.5％红细胞悬液。

将SARS病人恢复期血清、SARS抗原免疫猴血清、SARS抗原免疫兔血清提取的IgG(以下简称人IgG、猴IgG、兔IgG)按蛋白浓度稀释，用0.15mol/L pH6.4的PBS稀释为适宜的致敏浓度。

4倍体积0.15mol/L pH6.4的PBS，1倍体积IgG，1倍体积2.5％鞣化红细胞混合均匀后，室温振荡结合1小时。用1％灭活正常兔血清-PBS洗涤2次，然后用0.15mol/L pH7.2的PBS配成1.25％的致敏红细胞，4℃保存备用。或加入终浓度为10％(质量比)蔗糖和万分之三(体积比)吐温-20的保护剂，冻干备用。

实施例7反向间接血凝方法的建立

反向间接血凝试验

1.方法：取洁净的96孔“V”型微量血凝板。将样品稀释液加于血凝板各孔中，30μl/孔。取待检的SARS抗原30μl，从第1孔起顺序作倍比稀释。最后1孔留作空白对照。取阳性对照30μl，从另一排的第1孔起顺序作倍比稀释。各孔中加入致敏红细胞悬液(使用以前一定要摇匀)30μl，室温静置1-2小时，判定结果。

2.结果判定：100％红细胞凝集为++++；孔底均匀铺满一层红细胞；75％红细胞凝集为+++；边缘滑下；50％红细胞凝集为++；呈环状，周围有凝集颗粒；25％红细胞凝集为+；沉在孔底的红细胞周围有凝集颗粒。阴性(-)：红细胞沉在孔底，呈圆点，周围光滑。以50％凝集为终点。

阳性对照、阴性对照成立，实验成立。

3.结果计算方法：

将结果整理为可判定结果孔的高一个稀释度为阴性，低一个稀释度为++++。根据可判定结果孔的四种凝集情况计算最终的血凝效价。血凝效价计算方法见表一。

表一：血凝效价计算方法

病毒稀释度(C＝2B＝2A) 血凝效价

1∶A 1∶B 1∶C (1∶)

++++ +++ - B×5/4

++++ ++ - B

++++ + - B×7/8

++++ - - (A+B)/2

血凝抑制试验

取洁净的96孔“V”型微量血凝板。将样品稀释液、4％阳性血清稀释液、4％阴性血清稀释液，加于血凝板各孔中，30μl/孔，各一排。取待检的SARS抗原样品30μl，从每排第1孔起顺序作倍比稀释。最后1孔留做空白对照。取阳性对照30μl，从另一组每排的第1孔起顺序作倍比稀释。37℃作用半小时，各孔中加入致敏红细胞悬液(红细胞使用以前一定要摇匀)30μl，室温静置1-2小时，判定结果。结果判定标准同反向间接血凝试验。

结果

1.比较不同提纯IgG的致敏效果

人IgG、猴IgG、兔IgG致敏红细胞后，检测SARS病毒抗原对照。兔IgG测SARS病毒抗原对照为1∶56，人IgG为1∶2，猴IgG为1∶3。结果见表二。选择兔IgG用于致敏。

表二：不同IgG致敏效果比较

IgG类型 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 结果

人IgG ++ - - - - - - 1∶2

兔IgG ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ - 1∶56

猴IgG ++++ - - - - - - 1∶3

2.比较不同批红细胞IgG的致敏浓度

20030811批、20030923批人“O”型红细胞分别用兔IgG致敏，检测SARS病毒抗原对照，比较最佳致敏浓度。

20030811批红细胞的最佳致敏浓度为0.1mg/ml，20030923批红细胞的最佳致敏浓度为0.2mg/ml，结果见表三。不同批红细胞的最佳SARS抗体致敏浓度不同。不是致敏浓度越大或越小就越好，每批红细胞都有一个最佳致敏浓度。

表三：不同批红细胞IgG的致敏浓度比较

红细胞 IgG致敏浓度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 结果

批号 (Pr：mg/ml)

20030811 0.1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶64

20030923 0.2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + - 1∶56

3.SARS病毒抗原对照

反向间接血凝方法建立过程中，用SARS病毒抗原对照跟踪比较了每一批敏化红细胞。用多批兔IgG敏化红细胞检测SARS病毒抗原对照，结果都在1∶32以上。结果见表四。敏化红细胞检测SARS病毒抗原对照效价在1∶32以上，可确定该批敏化红细胞为合格批。

表四：不同批敏化红细胞检测SARS病毒纯化液结果

敏化红细胞 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 结果

批号

20030816 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - - - 1∶32

20030821 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶128

20030828 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - - 1∶96

20031005 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - - 1∶80

20031009 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - - 1∶64

平均值：1∶56

4.血凝抑制

阳性血清稀释液和阴性血清稀释液同时检测抗原对照、Vero细胞冻融液和Vero蛋白纯化液，并与样品稀释液的检测结果作对比。

样品稀释液检测抗原参比品为1∶32，Vero细胞冻融液为1∶10，Vero蛋白纯化液为阴性。4份阳性血清都能抑制抗原参比品中的SARS病毒抗原，4份阴性血清都不能抑制。4份阳性血清和4份阴性血清对Vero细胞冻融液都未出现抑制。结果见表五和表六。

表五：阴阳性血清抑制SARS病毒纯化液检测结果

血清及浓度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 结果

样品稀释液 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32

STS-D-京05 ++++ - - - - - 1∶3

STS-D-京06 ++++ ++++ - - - - 1∶6

STS-D-张01(2) ++++ ++ - - - - 1∶4

STS-D-张03 ++++ + - - - - 1∶3.5

人阴性血清-1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32

人阴性血清-2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32

人阴性血清-3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶32

人阴性血清-4 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - 1∶40

表六：阴阳性血清抑制Vero细胞冻融液检测结果

血清及浓度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 结果

样品稀释液 ++++ ++++ +++ - - 1∶10

STS-D-京05 ++++ ++++ +++ - - 1∶10

STS-D-京06 ++++ ++++ +++ - - 1∶10

STS-D-张01(2) ++++ ++++ +++ - - 1∶10

STS-D-张03 ++++ ++++ +++ - - 1∶10

人阴性血清-1 ++++ ++++ +++ - - 1∶10

人阴性血清-2 ++++ ++++ +++ - - 1∶10

人阴性血清-3 ++++ ++++ +++ - - 1∶10

人阴性血清-4 ++++ ++++ ++++ - - 1∶12

样品中所含Vero细胞的蛋白量较高时，检测过程中会出现非特异反应，这种非特异反应可通过增加SARS病人恢复期血清的抑制而确定。随着Vero细胞蛋白量的下降，非特异反应消失。

每次检测样品时，增加阳性血清的抑制。样品稀释液检测待检SARS抗原血凝效价≥1∶8，抑制后结果较抑制前低4倍时判定SARS抗原阳性。未出现阳性血清抑制，判定为SARS病毒抗原阴性。

实施例8反向间接血凝方法的应用

1.检测Sino1株和Sino3株毒种制备的SARS灭活疫苗不同工序阶段产品，结果见表七。

表七：不同毒株的工序产品血凝效价

毒种工艺产品 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶12 结果抑制

8 结果

Sino SARS病毒灭活液 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - - 1∶40 1∶4

1株 SARS病毒纯化液 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + - 1∶56 1∶6

SARS病毒纯化二峰 - - - - - - - - -

Sino SARS病毒灭活液 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - - 1∶32 1∶3

3株 SARS病毒纯化液 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶64 1∶8

SARS病毒纯化二峰 - - - - - - - - -

2.检测SARS病毒抗原参比品

20031009批冻干敏化红细胞多次检测SARS病毒抗原参比品，阳性血清对SARS病毒抗原参比品的抑制结果低于抑制前四倍以上，SARS病毒抗原参比品的血凝效价定为1∶75。结果见表八。

表八：SARS病毒抗原参比品血凝效价

1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 结果

++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ - 1∶96

++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - 1∶64

++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - 1∶80

++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + - 1∶56

++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - 1∶80

平均值：1∶75

3.检测SARS疫苗原液

检测20030709批、20030904批、20030906批和20030922批SARS疫苗原液的血凝效价，分别为1∶32、1∶22、1∶3和1∶28。结果见表九。

表九：四批SARS疫苗原液的血凝效价

疫苗原液批号血凝效价(1∶)

20030709批 32

20030904批 22

20030906批 3

20030922批 28

Claims

1.特异性结合SARS病毒抗原的抗体，特别是多克隆抗体，优选IgG，更优选人IgG、猴IgG、兔IgG，最优选兔IgG。

2.制备特异性结合SARS病毒抗原的抗体的方法，包括

(b)从免疫动物采血，分离出血清；

(c)任选的，将血清灭活，例如经56℃，30min灭活；和

(d)任选的，用蛋白A法提取SARS抗体阳性血清中的IgG。

3.制备经抗SARS病毒IgG致敏的红细胞的方法，包括如下步骤：

(a)制备醛化红细胞，优选双醛化红细胞；

(b)将醛化红细胞鞣化；

(c)用抗SARS病毒IgG致敏鞣化红细胞；和

(d)任选地，加入适当的保护剂，冻干。

4.权利要求3的方法，其中，

步骤(a)的红细胞是O型红细胞，依次采用戊二醛和甲醛进行醛化；和/或

步骤(c)还可以包括用1％灭活正常兔血清-PBS洗涤2次，任选地，用0.15mol/L pH7.2的PBS配成1.25％的致敏红细胞；和/或

5.权利要求4的方法，其中，

步骤(c)的IgG优选人IgG、猴IgG或兔IgG，更优选兔IgG；和/或

6.经抗SARS病毒IgG致敏的红细胞。

7.权利要求6的红细胞，其可通过权利要求3-5任意一项的方法制备。

8.用于测定SARS病毒抗原的方法，包括如下步骤：

(a)获得待测样品；和

(b)采用权利要求5的致敏红细胞通过反向间接血凝方法测定所述样品是否存在SARS病毒抗原，优选地，定量测定该样品的血凝效价。

9.权利要求8的方法，还包括用血凝抑制试验测定非特异性反应。

10.权利要求9的方法，其中血凝抑制试验包括：每次检测样品时，增加SARS抗体阳性血清(例如SARS病人恢复期血清)的抑制；当样品稀释液检测待测样品血凝效价≥1∶4，优选≥1∶8，SARS抗体阳性血清抑制后结果较抑制前低至少4倍时判定为SARS抗原阳性；未出现SARS抗体阳性血清抑制，判定为SARS病毒抗原阴性。

11.检测SARS抗原的试剂盒，包含经抗SARS病毒IgG致敏的红细胞和任选的SARS抗体阳性血清。