CN1125826C - 新型戊型肝炎病毒基因序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型戊型肝炎病毒株HEV-T1的核苷酸序列及其编码的蛋白，以及这些核苷酸序列和编码蛋白在肝炎的诊断、预防和治疗上的用途。

Description

新型戊型肝炎病毒基因序列及其应用

本发明涉及肝炎病毒学领域。更具体地，本发明涉及一种新型戊型肝炎病毒株的核苷酸序列及其编码的蛋白，以及这些核苷酸序列和编码蛋白在肝炎的诊断、预防和治疗上的用途。

已经报道，在亚洲、非洲和中美洲有戊型肝炎流行病，一种肠传播的非甲型/非乙型肝炎(Balayan，M.S.(1987)， 苏联医学回顾，章节E，病毒学回顾，Zhdanov，0-V.M.(编辑)，Chur，瑞士： Harwood学术出版社，2卷，235-261；Purcell，R.G.，等人(1988)Zuckerman，A.J.(编辑)，＂病毒性肝炎和肝疾病＂，New York：Alan R.Liss，131-137；Bradley，D.W.(1990)， 英国医 学公告，46：442-461；Ticehurst，J.R.(1991)Hollinger，F.B.，Lemon，S.M.，Margolis，H.S.(编辑)：＂病毒性肝炎和肝疾病＂，Williams和Wilkins，Baltimore，501-513)。在戊型肝炎病毒(HEV)是地方病的国家中，偶发性的肝炎病例(推测是戊型肝炎)占报道肝炎的90％。需要开发在受感染个体的血清中检测出抗-HEV抗体的血清学测试方法是本领域中广泛意识到的，但是从受感染的人或动物中分泌出的HEV的浓度非常低，这使得不可能将这种HEV用作血清学测试的抗原源，尽管有少数在细胞培养中繁殖HEV的成功报道(Huang，R.T.等人，(1992)， 普通病毒学杂志(J.Gen.virol.)，73：1143-1148)，但是目前细胞培养不能有效地产生血清测试所需数量的抗原。

最近，世界范围内的为鉴别出与戊型肝炎关联的病毒基因组序列而进行的主要努力，已经导致克隆出数目有限的HEV株的基因组(Tam，A.W.等人(1991)， 病毒学，185：120-131；Tsarev，S.A.等人(1992)， 美国科学院院报，89：559-563；Fry，K.E.等人(1992)， 病毒 基因，6：173-185)。目前，根据已报道的HEV全序列，将戊型肝炎病毒分为三个基因型，I型为亚洲、非洲型，II型为墨西哥型，III型为美国型。在本发明之前，还没有公开过其他基因型的戊型肝炎病毒。

对DNA序列的分析使研究者假设HEV基因组被分成3个开放阅读框(ORF)，并且假设这些ORF编码完整的HEV蛋白。其中，由ORF2等基因片段所编码的小蛋白已经被用于免疫测定以检测哺乳动物血清中的抗HEV抗体。

来自缅甸(Myanmar)的HEV株的一部分基因组DNA序列公开于Reyes等人，1990， 科学，247：1335-1339。Tam等人(1991)和Reyes等人PCT专利申请WO91/15603(1991年10月17日出版)公开了HEV缅甸株的完整的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。这些作者假设，在该毒株的序列中含有3个正向的开放阅读框(ORF)。

HEV墨西哥株和HEV缅甸株的ORF2的3′区域中所编码的其他蛋白的表达，在Yarbough等人，1991， 病毒学杂志，65：5790-5797中有描述。这篇文章描述分离出来自HEV的2种cDNA克隆。这些克隆编码ORF2的3′区域中的蛋白质。这些克隆在大肠杆菌中以融合蛋白形式表达。

Purdy等人，1992， 病毒学档案，123：335-349和Favorov等人，1992， 医学病毒学杂 志，36：246-250，公开了在大肠杆菌中表达来自缅甸株的更大的ORF2蛋白片段。这些文献以及那些前面讨论的文献都仅公开了用细菌表达体系来表达一部分ORF2基因。

因此，为了更好对付戊型肝炎，本领域需要鉴别出新的戊型肝炎基因型。

本发明涉及一种新的分离出的人戊型肝炎病毒柱HEV-T1。

本发明涉及分离的和基本纯化的人戊型肝炎病毒株HEV-T1的制剂。

本发明还涉及分离的和基本纯化的人戊型肝炎病毒株HEV-T1基因组RNA的制剂。

本发明还涉及人戊型肝炎病毒株HEV-T1的cDNA。

本发明的一个目的是提供能够指导产生重组HEV蛋白的合成的核酸序列，以及等价的天然核酸序列。这种天然的核酸序列可从cDNA或基因组文库中分离出，即从这些文库中鉴别和分离出能指导HEV蛋白合成的基因。较佳地，该核酸编码含有SEQ ID NO：1、2或3所示氨基酸序列的蛋白。出于本申请的目的，核酸序列指RNA、DNA、cDNA或其任何合成的编码蛋白质的变异体。

本发明还涉及一种基于采用衍生自HEV-T1 cDNA的引物而选择性扩增戊型肝炎基因片段，从而在生物样品中检测戊型肝炎的方法。

本发明还涉及使用衍生自HEV-T1 cDNA的单链反义多聚或寡聚核苷酸来抑制戊型肝炎基因的表达。

本发明还涉及分离的和基本纯化的、由HEV-T1的HEV基因组编码的或由合成的核酸序列编码的HEV蛋白或其变异体，尤其涉及由至少一个HEV的完整开放阅读框所编码的重组蛋白。较佳地，该蛋白的序列基本上由选自下组的氨基酸序列所构成：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。

本发明还涉及制备衍生自HEV基因组序列的重组HEV蛋白的方法，它通过克隆核酸和将cDNA插入表达载体，然后在宿主细胞中表达重组蛋白。本发明还涉及相关的载体和宿主细胞。

本发明还涉及将得到的重组HEV蛋白作为诊断剂和疫苗的用途。

本发明还包括在生物样品中检测对戊型肝炎特异的抗体的方法。它包括将该生物样品与对权利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白特异的抗体接触，以便与该戊型肝炎病毒形成复合物；检测是否形成了免疫复合物，形成免疫复合物就表示存在戊型肝炎病毒。这些方法可用于诊断由HEV引起的感染和疾病，还可用于监测疾病的进展情况。这些方法还可用于监测治疗哺乳动物HEV感染和疾病过程中治疗剂的功效。

本发明还涉及用于预防或治疗人戊型肝炎的药物组合物。它含有本发明的HEV蛋白和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的药物组合物。

本发明还涉及一种多肽片段，它具有选自本发明HEV-T1蛋白的连续15-100个氨基酸序列，且该多肽的氨基酸序列与I型、II型、III型戊型肝炎病毒Z的相应序列的同源性小于70％。还涉及一种DNA片段，它具有选自本发明HEV-T1 DNA的连续15-1000个核酸序列，且该DNA片段的氨基酸序列与I型、II型、III型戊型肝炎病毒Z的相应序列的同源性小于70％。

图1是pCR^*II载体的结构图。

图2是HEV基因结构图。其中图2A是HEV I、II和III型的基因结构图；图2B是HEV-T1的基因结构图。MT是甲基转移酶；Pro是半胱氨酸蛋白酶；ORF上的两个突起标志是糖基化位点。

图3是HEV基因进化树。图中，墨西哥株为M1，基因库编号为M74506；缅甸株为B1和B2，基因库编号分别为M73218，D10330；巴基斯坦株为P1，基因库编号为M80581；中国株为C1，C2和C3，基因库编号分别为L25547，M94177，D1 1093；印度株为I1和I2，基因库编号分别为X98292，X99441；美国株为U1和U2，基因库编号分别AF060668，AF060669.

发明详述

本发明涉及分离的和基本纯化的新的戊型肝炎病毒株HEV-T1。本发明还涉及克隆编码HEV蛋白质的病毒基因以及用表达系统表达重组蛋白。更具体地，本发明涉及衍生自HEV-T1的开放阅读框(ORF)的克隆和表达。

本发明涉及分离的HEV蛋白质。本发明的HEV蛋白质较佳地是与天然的HEV蛋白质基本同源，最佳地是与天然HEV蛋白质在生物学上等价。如说明书和权利要求书中所用，“生物学上等价”指组份能够形成病毒样颗粒而且有免疫原性。一旦注射入哺乳动物，本发明的HEV蛋白质还可刺激产生保护性的抗体，这些抗体会保护哺乳动物免受野生型HEV的侵袭。如随后的说明书和权利要求书中所用，“基本同源”指与天然HEV蛋白质氨基酸序列的同源程度。与天然HEV蛋白质的同源程度较佳地为超过70％，更佳地超过90％，特别优选的是同源性超过90％的蛋白质。

较佳的HEV蛋白质是那些由ORF基因编码的蛋白质。特别感兴趣的是由HEV的ORF2基因所编码的蛋白质，最感兴趣的是由HEV HEV-T1株ORF2基因所编码的蛋白质。优选的、由ORF2基因编码的本发明蛋白质可形成病毒样颗粒。ORF-1、ORF2和ORF-3蛋白质的氨基酸序列在下面分别示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

优选的重组HEV蛋白质含有至少一个ORF蛋白质。可以制备其他由一个以上相同或不同ORF蛋白构成的重组蛋白，以改变蛋白质的生物特性。添加、置换或缺失个别氨基酸或个别氨基酸序列可能会提高HEV的生物活性，这也在本发明范围之中。

本发明还涉及一种核酸序列，它能够指导产生上述的HEV蛋白质或与HEV蛋白质基本同源的蛋白质。该核酸序列被称为HEV-T1，它作为SEQ ID NO：4示于下面，并且于1999年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(CGMCC保藏号为0429)。按常规，在一个方向上的序列被称为正链(“+”链)，因为它是RNA病毒的蛋白质编码链，即在SEQ ID NO：4中所示的序列。

HEV-T1全长基因序列为7232个碱基。T、C、A、G的含量分别位27.1％，28.4％，18.6％，25.9％。5′非编码区为25个碱基，3′非编码区为68个碱基。5′和3′非编码区之间有3个开放读码框架(ORF)。

其中，(1)ORF1包括SEQ ID NO：4的26-5149位核苷酸，全长5124个核苷酸。ORF1的序列被单独列于SEQ ID NO：5，编码1707个氨基酸的ORFl蛋白。(2)ORF2包括SEQ ID NO：4的5146-7164位核苷酸，全长2019个核苷酸。ORF2的序列被单独列于SEQ ID NO：6，编码672个氨基酸的ORF2蛋白。(3)ORF3包括SEQ ID NO：4的5174-5512位核苷酸，全长339个氨基酸。ORF3的序列被单独列于SEQ ID NO：7，编码112个氨基酸的ORF3蛋白。

在已报道的HEV中，ORF3分别与ORF1、ORF2重叠1个和328个核苷酸；而在本发明的新戊型肝炎病毒HEV-T1中，ORF3只与ORF2重叠339个核苷酸而与ORF1没有重叠，ORF1和ORF2重叠1个核苷酸，基因结构与其它已报道HEV明显不同(详见表3及图2)。这是由于在戊型肝炎病毒HEV-T1的核苷酸序列中，第5160核苷酸位插入一个“T”，使ORF2的起始密码前移42个核苷酸，ORF3的起始密码后移28个核苷酸，使ORF2和ORF3多肽的氨基端发生了明显的变化，而氨基端主要为信号多肽，通过计算机分析显示，改变后的ORF2和ORF3仍有完整的信号多肽，说明虽然基因结构发生了改变，但仍能保证其正常的功能。通过对同一基因型的另一株病毒进行该片段的基因序列分析，也发现了同样的基因结构，说明这一结构为戊肝病毒IV型的特征性结构。这是在国际上首次发现戊肝病毒IV型，并首次完成该型全基因的克隆及序列的分析。

在构思之中的还有DNA序列的变异体，它们导致产生能够指导产生ORF1、ORF2、和/或ORF3蛋白类似物的DNA序列。如说明书和权利要求书中所用，“ORF蛋白类似物”指氨基酸序列与此处具体给出的SEQ NO：1、2或3序列基本上相同的蛋白质，其中此处所述序列中的一个或多个残基被生物学上等价的残基所替代，这样形成的蛋白质(即“类似物”)能够形成病毒颗粒而且是免疫原性的。应注意，上面给出的DNA序列代表了本发明的一个优选例子。由于遗传密码的简并性，所以可以制备许多种核苷酸，它们都是能够指导合成该ORF蛋白质或其类似物的DNA序列。因此，功能上与上述序列等价的DNA序列，或者功能上与指导合成ORF蛋白质类似物(按照上述的氨基酸序列产生的)的序列等价的DNA序列都被包括在本发明之内。

本发明还涉及一种基于选择性地扩增戊型肝炎基因片段而在生物样品中检测戊型肝炎的方法。较佳地，这种方法采用一对单链引物，这一对引物来自DNA双链片段的相对链的非同源区域，而该DNA双链片段又来自在基因组中含有与SEQ ID NO：4所示的HEV-T1序列同源的区域的戊型肝炎病毒。这些引物可用于扩增选定核酸序列的方法。

本发明还涉及使用衍生自HEV-T1 cDNA的单链反义多聚或寡聚核苷酸来抑制戊型肝炎基因的表达。这些反义的多聚或寡聚核苷酸可以是DNA或RNA。靶序列典型地是信使RNA，更佳地是加工或翻译RNA所需的信号序列。反义的多聚或寡聚核苷酸可偶连于聚阳离子比如聚赖氨酸，如Lemaitre，M.等人(1989)美国科学院院报84：648-652中所公开的那样；然后该偶联物可给哺乳动物施用，用量足以杂交并抑制信使RNA的功能。

本发明还涉及一种重组DNA方法，它用于制备HEV蛋白质，较佳地是含有至少一个ORF蛋白的蛋白质，最佳地是含有至少一个ORF2蛋白的蛋白质。重组的ORF蛋白可以由一个ORF构成，或者由相同或不同的ORF蛋白组合而成。可使用天然的或合成的核酸序列来指导产生HEV蛋白。

在本发明的一个例子中，该方法包括：

(a)制备能够指导宿主有机体产生HEV-T1蛋白质的核酸序列；

(b)将核酸序列克隆入能够转入并在宿主有机体中复制的载体，该载体含有用于该核酸序列的可操作元件；

(c)将含有该核酸和可操作元件的载体转入能够表达蛋白质的宿主有机体；

(d)在适合扩增载体和表达蛋白质的条件下，培养宿主有机体；和

(e)收获蛋白质。

在本发明的另一例子中，公开了一种用重组DNA技术产生蛋白质的方法，其中该蛋白质是HEV-T1核酸序列所编码的蛋白质，较佳地由HEV-T1的至少一个ORF所编码的蛋白质或者相同或不同ORF蛋白质的组合，最佳地由至少一个ORF2核酸序列所编码的蛋白质，该方法包括：

(a)在适合产生蛋白质的条件下，培养转化的或转染的宿主有机体，该宿主有机体含有能够指导宿主有机体产生某蛋白质的核酸序列，该蛋白质与从HEV分离出的，具有SEQID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或其组合的氨基酸序列的天然HEV蛋白质基本同源。

可用于本发明的载体包括任何载体，只要在该载体中可以插入所述的核酸序列，以及任何优选的或所需的可操作元件，并且该载体可以随后被转入宿主有机体并在该有机体中复制。优选的载体是，那些限制性位点已记载清楚而且含有转录核酸序列所需的或优选的可操作元件的载体。

如此处所用，“可操作元件”包括至少一个启动子、至少一个操纵基因、至少一个前导序列、至少一个终止密码子和其他任何对于载体核酸序列的合适转录和随后翻译所必需或优选的DNA序列。尤其是这样的载体：它含有至少一个被宿主有机体识别的复制起始点和至少一个供选择的标记以及至少一个能够引发核酸序列转录的启动子序列。

在构建本发明的克隆载体过程中，还应注意，可在每个载体中插入多拷贝的核酸序列及其可操作元件。在这样的例子中，对于每个载体而言，每个宿主有机体会产生更多的所需HEV蛋白质。可以插入载体的多拷贝DNA序列的数目仅取决于形成的载体的能力，这些能力受其大小、转入以及在合适的宿主微生物中复制和转录等因素的影响。

在另一例子中，将含有HEV蛋白编码序列的限制性消化片段插入合适的、会在原核或真核细胞中起作用的表达载体。“合适的”指载体能够携带和表达为HEV蛋白(较佳地，至少一个完整的ORF蛋白)编码的完整核酸序列。在ORF2的情况下，表达的蛋白质会形成病毒样颗粒。优选的表达载体是那些能在真核细胞中起作用的种类。这类载体的例子包括但并不限于：用于在酵母中表达的载体(如pPIC9载体-Invitrogen)、痘苗病毒载体、腺病毒或疱疹病毒，尤其是杆状病毒转化载体、pBlueBac。

此外，选定的重组表达载体也可被转染入合适的真核细胞系统，以便表达重组蛋白。这种真核细胞系统包括但并不限于：酵母和诸如HeLa、MRC-5或Cv-1之类的细胞系。一种优选的真核细胞系统是SF9昆虫细胞。一种优选的方法涉及使用pBlueBac表达载体，其中通过钙沉淀法用重组pBlueBac和AcMNPV杆状病毒共转染昆虫细胞SF9。

表达的重组蛋白可用本领域中已知的方法进行检测，其中包括考马斯蓝染色法和Western印迹法(使用含有抗HEV抗体的血清)。另一方法是用免疫电子显微镜检测病毒样颗粒。

在另一例子中，由细胞表达的重组蛋白可以粗裂解液形式获得，或者用本领域中已知的标准蛋白质纯化程序加以纯化。纯化方法包括：差示沉淀、分子筛色谱、离子交换、等电聚焦、凝胶电泳、亲和色谱和免疫亲和色谱等。在免疫亲和色谱中，重组蛋白可通过含有树脂的柱而纯化，其中在树脂上结合有对ORF蛋白特异的抗体。

表达的本发明的重组蛋白可被用于免疫分析，以诊断或预后哺乳动物中的戊型肝炎。其中哺乳动物包括但并不限于：人、黑猩猩、其他灵长目动物。在一个优选例子中，免疫分析被用于诊断人的戊型肝炎感染。使用HEV蛋白，尤其是ORF蛋白，特别是ORF2蛋白而进行免疫分析，提供了高特异性的、灵敏的、可重复的、诊断HEV感染的方法，这与采用不完整的ORF蛋白而进行的免疫分析形成了鲜明的对比。本发明的免疫分析可以是放射免疫分析、Western印迹分析、免疫荧光分析、酶免疫分析、化学发光分析、免疫组织化学分析等。本领域中已知的ELISA标准技术在 “免疫诊断方法”(Methods inImmunodiagnosis)，第2版，Rose和Bigazzi编辑，John Wiley和Sons，1980和Campbell等人， “免疫学方法”(Methods of Immunology)，W.A.Benjamin，Inc.，1964中有描述，这两篇文献都在此引用作为参考。这种分析可以是本领域中所述的直接的、间接的、竞争性的或非竞争性的免疫测定。(Oellerich，M.1984. “临床化学临床生物化学杂志”(J.Clin.Chem.Clin.Biochem.)22：895-904)。适用于这种检测分析的生物样品包括但并不限于：组织解剖抽提物、全血、血浆、血清、脑脊液、胸膜液、尿液等。

在一个例子中，测试血清与一固相试剂进行反应，该固相试剂表面结合有作为抗原的重组HEV蛋白，较佳地为ORF蛋白或不同ORF蛋白的组合形式如ORF2和ORF-3、ORF-1和ORF-3等。较佳地，HEV蛋白是会形成病毒样颗粒的ORF2蛋白。可以用已知的将蛋白质结合于固相载体材料的技术制备固相表面试剂。这些结合方法包括：蛋白质与载体的非特异吸附或蛋白质与载体上反应基团的共价结合。在抗原与抗HEV抗体反应之后，通过洗涤而除去未结合的血清组份，然后抗原-抗体复合物再与次级抗体(如标记的抗-人抗体)反应。标记物可以是在合适荧光试剂或生色试剂的存在下孵育固相载体而被检测出的酶。其他的合适标记物也可使用，如放射性标记物或胶体金等。

此外，由含有HEV-T1 ORF2或ORF3序列的重组载体所表达的蛋白被用作特异性结合剂，以检测抗HEV抗体。本发明的蛋白质还能检测出针对不同HEV株而产生的抗体，但是不会检测出针对甲型、乙型、丙型或丁型肝炎而产生的抗体。

HEV蛋白和类似物可以单独地或与其他试剂如次级抗体一起被制成试剂盒形式用于免疫测定。

本发明的重组HEV蛋白，较佳地为ORF蛋白或ORF蛋白的重组蛋白，更佳地为ORF2蛋白和基本同源的蛋白质及类似物，可以被用作疫苗以保护哺乳动物免受戊型肝炎的侵袭。作为免疫原的疫苗，可以是细胞、用重组表达载体转染过的细胞的细胞裂解液或含有表达蛋白的培育上清液。或者免疫原是部分或基本纯化的重组蛋白。尽管可以将免疫原以纯的或基本纯的形式进行施用，但是最好还是以药物组合物、药剂或制剂形式使用。

本发明的药剂可用作兽药或用于人类，它含有上述的免疫原和一种或多种药学上可接受的载体和任选的其他治疗成分。载体必须是“可接受的”，意味着与药剂的其他成分相容而且对接受者无害。药剂可以方便地作为单位剂量形式，并且可用药物领域中公知的方法制备。

所有的方法包括将活性成分与作为一种或多种附属成分的载体混合起来。一般，药剂的制备是通过：将活性成分与液态载体或细分固相载体，或与两者一起均匀地和紧密地混合在一起，然后如果需要将产品制成所需的药剂。

适用于静脉内、肌内、皮下或腹膜内给药的药剂，可以是活性成分与其他溶液(最好与接受者的血液是等渗的溶液)形成的无菌水溶液。这种药剂可以方便地将固体的活性成分溶解在含有生理相容物质如氯化钠(如0.1-2.0M)、甘油等并且具有与生理条件相容的缓冲pH的水中，以产生水溶液，然后使该溶液无菌。它们可以装在单剂量或多剂量容器中如密封的安瓿或小瓶。

本发明的药剂可以加入稳定剂。代表性的稳定剂是聚乙二醇、蛋白质、糖类、氨基酸、无机酸和有机酸，它们可以单独使用或混合使用。这些稳定剂较佳的加入量相对每份重量的免疫原而言为0.11-10,000重量份数。如果使用两种或多种稳定剂，那么它们的重量最好在上述范围之内。这些稳定剂被用于合适浓度和pH下的水溶液中。这种水溶液的比渗透压一般为0.1-3.0渗透压摩尔，较佳地为0.8-1.2渗透压摩尔。水溶液的pH被调节至范围5.0-9.0，较佳地为6-8之内。在配制本发明的免疫原时，可使用抗吸附剂。

还可采用额外的药物学方法来控制作用的持续时间。通过使用聚合物来复合或吸附蛋白质或其衍生物，可以获得控释剂。还可以通过选择合适的大分子(如聚酯、聚氨基酸、乙烯类聚合物、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白)和大分子浓度以及控释的掺入方法，来实施受控的给药。另一种通过控释制剂而控制作用持续时间的可行方法是，将蛋白质、蛋白质类似物或其功能衍生物掺入聚合物材料如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。或者，不将这些试剂掺入聚合物颗粒，而是将这些颗粒截留在例如通过团聚技术或界面聚合反应制备的微囊中，如羟甲基生物素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，或者截留在胶体药物给药系统中如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米级颗粒和纳米级胶囊，或者截留在大乳状液中。

当需要口服制剂时，组合物可以与典型的载体混合，其中有如乳糖、蔗糖、淀粉、滑石硬脂酸镁、结晶纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、甘油、藻酸钠或阿拉伯胶。

本发明的蛋白质可以单独作为试剂盒形式提供，也可以上述的药物组合物的形式提供。

接种疫苗可以用常规方法进行。例如，可以使用在适当稀释剂如盐水或水，或完全或不完全的佐剂中的免疫原。此外，为了使蛋白质有免疫原性，免疫原可以结合或不结合于载体。载体分子的来自包括但并不限于：牛血清白蛋白(BAS)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素等。免疫原可以通过任何适合抗体产品的途径进行给药，如静脉内、腹膜内、肌内、皮下等给药。免疫原可以给药一次或者按固定间隔给药，直至产生大量的抗HEV抗体。抗体可用免疫测定在血清中检测出。

在另一例子中，免疫原是能指导宿主有机体合成HEV ORF蛋白的核酸序列。这种核酸序列可以用本领域技术人员已知的方法插入合适的表达载体。适合在体内产生高效基因转化的表达载体包括但并不限于：反转录病毒、腺病毒和痘苗病毒载体。这些表达载体的可操作元件在本说明书之前已经公开并且为本领域技术人员所知晓。这些表达载体可以静脉内、肌内、皮下、腹膜内或口服施用。

在另一例子中，通过肌内注射例如基于质粒的真核表达载体(该载体含有能指导宿主有机体合成HEV ORF蛋白的核酸序列)而实现直接基因转化。这种方法以前被用过，以便在体内产生乙型肝炎表面抗原并导致了针对表面抗原的抗体应答(Davis，H.L等人(1993)“人类分子遗传学”，2：1847-1851；还参见Davis等人(1993)“人类基因治疗”，4：151-159和733-740)。

当免疫原是部分纯化或基本纯化的重组HEV ORF蛋白时，引发保护性的、针对HEV的抗体应答的有效剂量约为2微克-100微克。更佳的范围约为5微克-70微克，最佳的范围约为10微克-60微克。

对于编码HEV ORF蛋白的核酸序列而言，引发保护性的、针对HEV的抗体应答的有效剂量约为1微克-5000微克。更佳的范围约为300微克-1000微克。

含有能指导宿主有机体合成HEV ORF蛋白的核酸序列的表达载体，可以单独作为试剂盒形式提供，也可以以上述的药物组合物的形式提供。

可以出于预防或治疗目的而施用本发明的免疫原。当预防性地施用时，免疫原是在暴露于HEV之前或在出现HEV感染症状之前施用。预防性施用免疫原起到在哺乳动物体中防止或减轻随后的HEV感染的作用。当治疗性地施用时，免疫原在感染发生时(或发生后不久)，或者在出现HEV感染或疾病的症状时施用。治疗性施用免疫原起到减轻感染或疾病的作用。

一个优选例子是用重组ORF2蛋白制备的疫苗。该重组ORF2蛋白由HEV株HEV-T1的ORF2序列或其等价序列所表达。因为已表明重组ORF2蛋白可与多种HEV阳性血清反应，所以表明可用于防止多种HEV株。

除了用作疫苗之外，可用组合物制备针对HEV病毒样颗粒的抗体。这些抗体可直接用作抗病毒剂。为了制备抗体，用病毒颗粒免疫宿主动物，或者合适的话，将产生在病毒颗粒上的非颗粒抗原结合在载体上，如上对疫苗所述的那样。按适当的时间间隔收集宿主的血清或血浆，从而提供含有与病毒颗粒反应的抗体的组合物。例如通过使用饱和硫酸铵或DEAE Sephadex，或者本领域技术人员知晓的其他技术，可以获得Υ球蛋白或IgG抗体。这些抗体基本上没有那些伴随其他抗病毒剂如药物的不良副作用。

通过减弱潜在的不良的免疫系统应答，可以使抗体组合物与宿主系统更相容。这是通过除去外来物种抗体的全部或部分Fc区，或者使用与宿主动物同物种的抗体(如使用来自人/人杂交瘤的抗体)而实现的。通过用相应的但是无免疫原性的部分来替换抗体的免疫原性部分(即嵌合抗体)，可以产生人源化抗体(即在人体中无免疫原性)。这种嵌合抗体可含有一个物种抗体的活性或抗原结合部分和另一个物种抗体的Fc区(无免疫原性)。这种嵌合抗体的例子包括但并不限于：非人哺乳动物-人嵌合体、啮齿动物-人嵌合体、鼠科动物-人嵌合体和大鼠-人嵌合体(Robinson等人，国际专利申请184,187；Taniguchi M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人，欧洲专利申请173,494；Neuberger等人，PCT申请WO86/01533；Cabilly等人，1987“美国科学院院报”84：3439；Nishimura等人，1987“癌症研究”47：999；Wood等人，1985“自然”314：446；Shaw等人，1988，“国家癌症研究院杂志”(＂J.Natl.Cancer Inst.＂)80：15553，这些文献都在此引用作为参考)。

“人源化”嵌合抗体的总回顾由Morrison S.，1985“科学”229：1202和Oi等人，1986“生物技术”(＂BioTechniques＂)4：214中提供。

合适的“人源化”抗体也可以用CDR或CEA取代法而制备(Jones等人，1986“自然”321：552：Verhoeyan等人，1988“科学”239：1534；Biedler等人，1988，“免疫学杂志”141：4053，这些文献都在此引用作为参考)。

还可通过遗传工程来产生抗体或抗原结合片段。在大肠杆菌中表达重链和轻链基因的技术是PCT专利申请出版号WO901443。WO901443和WO9014424，以及Huse等人，1989“科学”246：1275-1281中的主题。

抗体还可用作增加免疫应答的手段。可以按与其他治疗性地施用抗体时相类似的剂量来施用抗体。例如在其他病毒疾病如狂犬病、麻疹和乙型肝炎的潜伏早期，按0.02-0.1毫升/磅体重施用混合的Υ球蛋白以干扰病毒进入细胞。因此，与HEV病毒颗粒反应的抗体可被动地单独或与其他抗病毒剂一起给受HEV感染的宿主施用，以增加病毒药物的功效。

或者，通过将抗独特型抗体作为免疫原施用，可以诱导出抗HEV抗体。方便地，可以用上述制备的、纯化的抗HEV抗体制剂在宿主动物中诱导抗独特型抗体。将在合适稀释剂中的组合物施用给宿主动物。在施用(通常是重复施用)后，宿主会产生抗独特型抗体。为了消除对Fc区的免疫应答，可使用与宿主动物相同物种产生的抗体，或者将所用抗体的Fc区去除。在宿主动物中诱导抗独特型抗体之后，取出血清或血浆，从而提供抗体组合物。组合物可用上述抗HEV抗体的纯化方法进行纯化，或者使用结合于亲和基质的抗HEV抗体通过亲和色谱而纯化。产生的抗独特型抗体在构象上与真的HEV抗原相似，它可在不使用HEV颗粒抗原的情况下用于制备HEV疫苗。

当用作在动物中诱导抗HEV病毒抗体的手段时，可以用与疫苗一样的方式即肌内、腹膜内、皮下等注射有效浓度的、在生理上合适的稀释剂中的抗体，其中可以有或没有佐剂。进行一次或多次的加强注射是有利的。

本发明的HEV衍生蛋白也可用于产生暴露前或暴露后预防用的抗血清。其中，HEV蛋白或蛋白混合物与合适的佐剂一起配制，然后根据已知方法通过注射给志愿者而进行给药，以便产生人抗血清。在免疫后数周期间，通过定期采集血清样本，用此处所述的免疫测定检测抗HEV血清抗体的存在与否从而监测对注入蛋白质的抗体应答情况。

来自免疫个体的抗血清可作为受接触感染威胁的个体的暴露前预防手段。抗血清还可用于治疗暴露后的个体，这类似于使用高效价的针对乙型肝炎病毒的抗血清进行暴露后预防。当然，本领域的技术人员会轻易地理解，用标准技术从免疫个体的抗血清中纯化出的免疫球蛋白(HEV免疫球蛋白)，可用作暴露前预防措施或用于治疗暴露后的个体。

对于体内使用针对HEV病毒样颗粒和蛋白的抗体和抗独特型抗体以及诊断用途，优选使用单克隆抗体。单克隆抗病毒颗粒的抗体或抗独特型抗体可如下产生。用本领域技术人员知晓的方法，从免疫动物中取出脾或淋巴细胞，并进行使之无限增殖化，或者用于制备杂交瘤(Goding，J.W.1983.“单克隆抗体：原理和实践：(＂Monoclonal Antibodies：Principles和Practice＂)，Pladermic Press，Inc.，NY，NY，pp.56-97)。为了产生人-人杂交瘤，可选择人淋巴细胞供体。已知可被HEV感染的供体(其中通过例如在血液中存在抗病毒抗体或通过病毒培育而表明发生了感染)可作为合适的淋巴细胞供体。淋巴细胞可从外周血样品中分离出，或者如果供体进行脾切除术，那么可使用脾细胞。可用Epstein-Barr病毒(EB病毒)使人淋巴细胞无限增殖化，或者使用人融合配偶物(partner)来产生人-人杂交瘤。用肽进行的原发性体外免疫也可用于产生人单克隆抗体。

可筛选由无限增殖化细胞分泌的抗体，以确定分泌具有所需特异性的抗体的克隆。对于单克隆的抗病毒颗粒抗体，抗体必须结合HEV病毒颗粒。对于单克隆抗独特型抗体，抗体必须结合抗病毒颗粒抗体。选择出产生具有所需特异性的抗体的细胞。

上述的抗体和抗原结合片段可以单独地以试剂盒形式提供，或者作为药物组合物提供，供体内使用。如本文所述，抗体可用于治疗用途、免疫测定中的诊断用途或作为纯化ORF蛋白的免疫亲和剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料及方法

1、病人：来自于一名临床急性肝炎病人，其抗-HAV IgM，HBsAg，抗-Hbc IgM，抗-HCV，HBV DNA，HCV RNA均为阴性.

2、检测用引物设计：

用Oligo 4和5软件，根据引物设计的一般原则进行引物设计。一端参考所得到的两段基因序列设计特异性PCR引物，另一端则参考其它已发表的序列的保守区设计引物，检测全序所用引物如表1所示。

3、粪便样品处理及病毒RNA提取：

取5g粪便样品加PBS 50ml，并彻底震荡使之悬浮，然后4℃条件下3000rpm离心10分钟，取上清并保存在-70℃冰箱中备用.

用QIAamp病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)，按操作说明提取病毒RNA，140ul粪便悬液可获得50ul纯化的病毒RNA液体.

4、反转录

采用二种酶即AMV和Superscript反转录酶，一般情况下，第一轮PCR产品若大于1000bp时，则采用Superscript，若小于1000bp时，则采用AMV反转录酶.(见表2)。

4.1 AMV反转录反应

9ul纯化RNA，50pmol PCR的反义外引物混合。在70℃中加热10分钟，然后冰浴2分钟。再离心后加入4ul 5×AMV缓冲液，1ul 10mM dNTP，0.75ul RNasin(40u/ul)，0.2ul 100mMDTT，然后用DEPC处理过的水调整体积至20ul，并在37℃的条件下反应1小时。

4.2 Superscript反转录反应

9ul纯化RNA，50pmol PCR的反义外引物混合，在70℃中加热10分钟，然后冰浴2分钟，离心后加入4ul 5×Superscript Buffer，1ul 10mM dNTP，0.75ul(40u/ul)的RNasin及2ul100mM DTT，然后用DEPC处理过的水调整体积至20ul，并在42℃的条件下反应1小时。

5、PCR反应

第一轮PCR反应液为10ul反转录液，二个外引物各25ul，5ul 10×PCR反应液，4ul 25mMMgCl₂，及5u Tag酶，并用无菌水调整终体积至50ul，然后加2滴石蜡油，并在PCR扩增仪进行PCR反应，具体反应条件见表2。取第一轮PCR反应产物5ul，25ul内引物及其它与第一轮相同的反应液进行第二轮PCR反应，具体反应条件见表2。

6、末端快速扩增方法(RACE)

6.1、5′RACE

20ul cDNA中加入1ul RNase H，在37℃中反应30分钟，并用QIAEX提取单链cDNA。取10ul纯化的单链cDNA加入20uM dGTP和20单位的末端转移酶，在37℃中反应30分钟，并再次用QIAEX纯化加尾的cDNA.然后用Set1(表2)按方法5进行半套式PCR扩增。

6.2、3′RACE

用16聚合T的引物按方法4作反转录，并用Set17引物按方法5进行半套式PCR扩增。

7、克隆及测序

7.1、克隆

PCR产物用2％的琼脂糖胶电泳检测，将预计大小相当的条带切下，并用德国Qiagen公司的QIAquick II DNA快速提取试剂盒进行纯化，然后取2ul纯化的PCR产物，加T4连接酶缓冲液1ul，pCR^*II vector(图1)1ul，T4连接酶4单位(Weiss单位)，并加水至10ul，然后置14℃过夜。

7.2、感受态细菌的转化：

将5ul的连接液加入100ul试剂盒提供的感受态细菌并置冰浴30min，然后严格在42℃热休克30s，并置37℃摇床以低至200rpm的速度振荡1h：同时将含50ug/ml氨苄青霉素的琼脂平皿置37℃孵箱烘干并加上40ul X-gal涂平，再置37℃孵箱30min，然后将已转化的感受态细菌铺于该琼脂平皿上，37℃过夜。

7.3、克隆后重组质粒的小量制备：

挑选白色菌落并转入5ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃的摇床中以225rpm速度振荡过夜。

按以下方法提取质粒：

(1)取1.5ml细菌并以15000rpm离心2min，然后弃上清。

(2)用100ml TNE(10mM Tris HCl PH 7.5-8，150mM NaCl，1mM EDTA)溶液悬浮沉淀，并加入100ml TNE平衡的酚氯仿混匀。

(3)取一干净的1.5ml离心管，并加入25ul 10M的醋酸氨，备用。

(4)以10000rpm离心B管5min，然后取上清并放置于C管中，混匀，然后加入250ul分析纯的乙醇并混匀，以15000rpm离心12min，弃上清；沉淀于室温干燥后，加入30ul水备用。

7.4、重组质粒的检定：

(1)酶切反应：按以下配方进行酶切反应。

酶反应缓冲液                          1ul

BSA(1mg/ml)                           1ul

RNase(0.5mg/ml)                       0.5ul

EcoRI                                 0.5ul

DNA                                   3ul

加无菌双蒸水至10ul，然后37℃反应1h。

(2)电泳：酶切反应液用2％的琼脂糖电泳进行检定。

7.5、重组质粒的纯化：

用QIAgen公司的QIAGEN tips质粒纯化试剂盒进行纯化，所有操作均按说明书进行。

7.6、测序反应：

所用测序引物为质粒的M13 Reverse和M13(-20)Forward测序引物，其序列分别为：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′和5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′。

其测序反应如下：

(1)质粒DNA                            5ul

测序引物(10pmol/ul)                   2ul

氢氧化钠1M                            1ul

孵育30min。

(2)在以上反应液中加入1M HCl 1ul，1M TrisCl 1ul和5倍的测序反应液2ul，然后置37℃20min。

(3)每套反应各准备G、A、T和C4个管，分别加入相对应的ddNTP混合液2.5ul。

(4)将(2)反应中加入以下试剂：

标记混合液                            2ul

0.1MDTT                               1ul

³⁵S-dATP                              0.5ul

稀释后的测序酶                        2ul

室温放置2.5min。

(5)向含ddNTP混合液的G，A，T，C管中分别加入(3)反应液3.5ul，并在37℃孵育5min。

(6)向每个反应管中加4ul终止液，并放-20℃贮存。

7.7、聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳：

将丙烯酰胺和N、N′-亚甲叉双丙烯酰胺按19∶1配制成40％的储存液；变性工作液浓度为6％，内含尿素46g/100ml，按常规方法灌制胶，并放置过夜使之凝固。

将样品放置85℃变性5min；同时用80W预电泳30min，然后按A、C、G、T的顺序上样，每孔上样量为3ul。

然后以80W功率电泳以至预计的时间。

7.8、胶、压片及冲洗：

用3mm滤纸将凝胶揭下，于干胶仪内80℃真空干燥1h，然后室温压片过夜至3天不等。然后在Koda洗片机内洗片。

7.9、读片：

在X光阅片灯下，有2人轮流阅读、登记，两次结果不一致时，再进行第3次阅片确证。

实施例1

鉴别戊型肝炎病毒HEV-T1基因组的DNA序列

按“材料与方法”中所述，用表1所示的引物和表2所示的RT-PCR条件，对戊型肝炎病毒HEV-T1进行PCR扩增和测序，得出SEQ ID NO：4所示的戊型肝炎病毒HEV-T1的DNA序列。

           表1：HEV-T1全基因序列分析所用的引物

引物	引物序列	产物位置(nt)	产物大小(bp)
				Set1	GGAATTCGCGGCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCC
	CCATCRARRCATGAAGTGCGGTC
					GGCAGWRTACCARCGCTGAACAT	-32--387	419
Set2	CTGGCATYACTACTGCYATTGAGC
					CCATCRARRCATGAAGTGCGGTC
	CTGCCYTKGCGAATGCTGTGG
					GGCAGWRTACCARCGCTGAACAT	102--387	285
Set3	CTGGCATYACTACTGCYATTGAGC
					GTAATCACGGCCTGACTTCTC
	CTGCCYTKGCGAATGCTGTGG
					GGCGTCCTCAGTGGCATTCC	102-1130	1028
Set4	TGCTGCTCCAGGCTTATGAC
					CGGGTGTAAAGTGTGCTCTC
	TTG GTGCCCTTGTCGCTAATG	1103-2133	1030
				Set5	GCAGCAGGTCCACATAGTCT
	CACTCCCAGGCATCAAAACT
					GCAAGGTCGTCTTCCAGTC
	AGCCTCTTTGGGTTATGTTC	1907-2667	760
				Set6	GCAGCAGGTCCACATAGTCT
	AGCCTCTTTGGGTTATGTTC
					GCAAGGTCGTCTTCCAGTC
	CTGGTAGAAGGCATGACAGAGAC	1907-2536	629
				Set7	TCTCTGTCATGCCTTCTACC
	CGTGGCAATAATCGTAGTCTC
					CATTATCCATGCTGTTGCTCC
	CTCAGTGAATGTCGCACCCT	2614-3517	903
				Set8	GCCGTAGGGTTGTCATTGATG
	AGCCTTCTCAATAGCGCGGAACCA

	TGTCGGGCAGAAGCTAGTGTT
					CCGAGACACATCCACGGCTGC	3424-4198	774
Set9	ACATTTGAATTAACAGACATTGTGC
					AGTGGCGGAAGTCATAACAGTG
	CATGGTCGAGAAGGGCCAGGATGG
					GACCGCCATGTTCCAGACAGT	4126-4666	540
Set10	ATCTCTGCGTGGCTTCTGG
					TTGTACTGGCGGCGTAGAAT
	CGGCACCTTATTATGGAACAC
					AGCAGGAGCCACAGCAGTCA	4627-5529	902
Set11	TTGTATGCTGGTGTGGTTGTAG
					TTGTACTGGCGGCGTAGAAT
	GGATGTTGTTTCGCAGGTTTATG
					AGCAGGAGCCACAGCAGTCA	4996-5529	533
Set13	GTGACGGGGTTGATTCTCAG
					CCTCGACGCAATTTGTGAC
	GCTATCGCCTATATTCATC
					CAGCGGTATAAGGTGTATTAG	5335-6047	712
Set14	AA(CT)TATGC(AC)CAGTACCGGGTTG
					CTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATC
	GT(CT)ATG(CT)T(CT)TGCATACATGGCT
					GTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG	6007-6526	519
Set15	AA(CT)TATGC(AC)CAGTACCGGGTTG
					CCCTTATCCTGCTGAGCATTCTC
	GT(CT)ATG(CT)T(CT)TGCATACATGGCT
					AGCCGACGAAAT(CT)AATTCTGTC	6007-6354	347
Set16	GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGG
					CTTGTTCRTGYTGGTTRTCATAATC
	CTYTCTCRGCCAATGGCGAGC
					GTTCRTGYTGGTTRTCATAATCCTG	6382-6526	144
Set17	GACAGAATTRATTTCGTCGGCTGG
					GCTCTAGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT
	CTYTCTCRGCCAATGGCGAGC	6441-7230+29	818

注：Y＝C或T；R＝A或G

^*：指所用引物为HEV-T1特异性序列

                          表2：RT-PCR的反应参数

引物	反转录酶	Taq聚合酶	反应参数
				Set1	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃2分30循环
Set2	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃1分30循环
				Set3	Superscript 200u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃3分30循环
Set4	Superscript 200u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃3分30循环
				Set5	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃(3分)*2.5分30循环
Set6	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃(2.5分)*2分30循环
				Set7	Superscript 200u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃3分30循环
Set8	Superscript 200u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃3分30循环
				Set9	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃(2.5分)*2分30循环
Set10	AMV 10u和Superscript 200u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃3分30循环
				Set11	AMV 10u和Superscript 200u	1.25u(MBI)	#94℃20秒55℃30秒(-0.5℃/循环)72℃1分30循环
Set12	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃2.5分30循环
				Set13	AMV 10u	2 5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃(2.5分)2分30循环
Set14	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃(2.5分)1分30循环
				Set15	AMV 10u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃1分30循环
Set16	Supercript 200u	2.5(Promega)	94℃1分50℃1分72℃3分30循环

“^*”指第一轮PCR和第二轮PCR的延伸时间不同，括号内为第一轮PCR的延伸时间；“#”指PCR扩增仪为PE2400反应管为薄壁。

HEV-T1全长基因序列为7232个碱基。T、C、A、G的含量分别位27.1％，28.4％，18.6％，25.9％。5′非编码区为25个碱基，3′非编码区为68个碱基。5′和3′非编码区之间有3个开放读码框架(ORF)。

其中，(1)ORF1包括SEQ ID NO：4的26到5149位核苷酸，全长5124个核苷酸。ORF1的序列被单独列于SEQ ID NO：5，它编码1707个氨基酸的ORF1蛋白。

(2)ORF2包括SEQ ID NO：4的5146-7164位核苷酸，全长2019个核苷酸。ORF2的序列被单独列于SEQ ID NO：6，它编码672个氨基酸的ORF2蛋白。

(3)ORF3包括SEQ ID NO：4的5174-5512位核苷酸，全长339个氨基酸。ORF3的序列被单独列于SEQ ID NO：7，它编码112个氨基酸的ORF3蛋白。

在已报道的HEV中，ORF3分别与ORF1、ORF2重叠1个和328个核苷酸；而在本发明的新戊型肝炎病毒HEV-T1中，ORF3只与ORF2重叠339个核苷酸而与ORF1没有重叠，ORF1和ORF2重叠1个核苷酸，基因结构与其它已报道HEV明显不同(详见表3及图2)。这是由于在戊型肝炎病毒HEV-T1的核苷酸序列中，第5160核苷酸位插入一个“T”，使ORF2的起始密码前移42个核苷酸，ORF3的起始密码后移28个核苷酸，使ORF2和ORF3多肽的氨基端发生了明显的变化，而氨基端主要为信号多肽，通过计算机分析显示，改变后的ORF2和ORF3仍有完整的信号多肽，说明虽然基因结构发生了改变，但仍能保证其正常的功能。通过对同一基因型的另一株病毒进行该片段的基因序列分析，也发现了同样的基因结构，说明这一结构为戊肝病毒IV型的特征性结构。这表明，戊型肝炎病毒HEV-T1是在国际上首次发现IV型戊肝病毒。

                  表3：各HEV分离株基因结构的比较

名称	长度(nt)	5′非编码区(nt)	ORF1(aa)	ORF2(aa)	ORF3(aa)	3′非编码区(nt)
							B1B2C1C2C3I1I2P1M1U1U2T1	719471947193719471947193719471387170718672517232	272726272726270303525	169416941694169416941694169416931692169917091708	660660660660660660660660659660660672	123123123123123123123123123123123112	656565656565653974727268

注：本表中所用序列为：墨西哥株为M1，基因库编号为M74506；缅甸株为B1和B2，基因库编号分别为M73218，D10330；巴基斯坦株为P1，基因库编号为M80581；中国株为C1，C2和C3，基因库编号分别为L25547，M94177，D11093；印度株为I1和I2，基因库编号分别为X98292，X99441；美国株为U1和U2，基因库编号分别AF060668，AF060669.

实施例2

戊型肝炎病毒HEV-T1全序列与其他已知戊型肝炎病毒的同源性比较

根据已报道的HEV全序列，将戊型肝炎病毒分为三个基因型，I型为亚洲、非洲型，II型为墨西哥型，III型为美国型。其中，I型各株之间的核苷酸同源性为92.0％-98.8％，II型只报道一株墨西哥病毒的全序列，III型之间的同源性为92％。I型和II型之间的核苷酸同源性75.0-76.1％；和III型之间的核苷酸同源性为73.5-74.5％；II型和III型之间的核苷酸同源性73.7-74.5％。本发明的HEV-T1全序列与已报道的I型，II型和III型的同源性分别为74.8-75.5％，74.5％和75.3-76.3％。不同于任何已报道的基因型，因此被确定为HEV IV型。全序列核苷酸同源性比较见表4。

                        表4：HEV全基因序列的核苷酸同源性比较

	U1	U2	B1	B2	I2	C1	C2	P1	C3	I1	M1	T1
													T1	75.3	76.3	75.5	75.5	74.8	75.3	75.1	75.2	75.2	74.8	74.5	100
M1	73.7	74.5	75.9	75.7	75.0	75.9	75.9	76.1	75.7	75.7	100
													11	74.4	74.4	93.5	93.0	92.2	94.0	93.8	93.9	93.5	100
C3	73.7	73.9	94.5	94.1	92.7	97.2	96.8	96.7	100
													P1	74.1	74.1	93.6	92.8	92.0	98.8	98.3	100
C2	74.1	74.3	93.7	93.0	92.0	98.7	100
													C1	74.2	74.3	93.5	93.0	92.0	100
I2	73.5	73.8	96.1	95.4	100
													B2	73.8	74.0	98.5	100
B1	73.9	74.0	100
													U2	92.0	100
U1	100

实施例3

基因进化树分析

采用PHYLIP分析软件(给出文献出处或程序的名称即可)，采用基因进化树对已报道的基因型及本发明克隆的戊型肝炎病毒Z新基因型进行基因进化树分析，结果如图3所示。

从图3可见，亚洲株即I型(C1-C3，B1-B2，I1-I2和P1)形成一个分支：墨西哥株即II型单独形成一个分支；美国株即III型(U1和U2)形成一个分支；所分离的该株病毒(HEV-T1)不同于HEV I型、II型及III型，单独形成一个分支，可定为HEV IV型。

实施例4

ORF1蛋白的同源比较

将本发明戊型肝炎病毒HEV-T1的ORF1蛋白与其他戊型肝炎病毒的ORF1蛋白进行同源比较，结果表5所示。

                 表5：HEV ORF1氨基酸同源性比较

	U1	U2	B1	B2	I2	C1	C2	P1	C3	I1	M1	T1
													T1	88.5	88.7	86.5	86.3	85.0	86.7	85.4	86.5	86.5	86.7	85.0	100
M1	82.0	82.0	83.8	83.4	81.8	83.9	82.8	84.0	83.4	84.2	100
													I1	82.9	82.9	98.1	97.5	95.5	98.4	96.9	98.4	97.8	100
C3	82.5	82.3	98.0	97.6	95.4	99.1	97.4	98.9	100
													P1	83.0	82.9	98 4	97.7	95.9	99.6	98.0	100
C2	81.6	81.5	96.9	96.1	94.4	98.1	100
													C1	82.8	82.6	98.4	97.8	95.9	100

I2	80.7	80.7	96.3	95.7	100
													B2	82.3	82.3	98.6	100
B1	82.4	82.6	100
													U2	97.5	100
U1	100

ORF1编码1708个氨基酸，I型各株之间的ORF1氨基酸同源性为94.4％-99.1％，II型只报道一株墨西哥病毒的全序列，III型之间的同源性为97.5％。I型和II型之间的ORF1氨基酸同源性82.8-84.2％；和III型之间的核苷酸同源性为80.7-82.9％；II型和III型之间的氨基酸同源性82.0％。本发明的HEV-T1与已报道的I型，II型和III型的ORF1氨基酸同源性分别为85.0-86.7％，85.0％和88.5-88.7％(见表5).

实施例5

ORF2蛋白的同源比较

将本发明戊型肝炎病毒HEV-T1的ORF2蛋白与其他戊型肝炎病毒的ORF2蛋白进行同源比较，结果表6所示。

                 表6：HEV ORF2氨基酸同源性比较

	U1	U2	B1	B2	I2	C1	C2	P1	C3	I1	M1	T1
													T1	91.9	93.0	92.1	91.8	91.9	92.4	91.9	92.1	91.6	91.9	90.1	100
M1	90.1	90.6	93.2	92.4	92.9	93.0	92.9	93.3	92.6	93.0	100
													I1	91.1	91.4	98.5	97.7	98.2	98.5	98.2	98.8	98.0	100
C3	90.9	91.2	98.6	98.0	98.4	98.6	98.3	98.9	100
													P1	91.7	92.0	99.4	98.6	99.1	99.4	99.1	100
C2	91.4	91.7	99.1	98.3	98.5	98.8	100
													I2	91.5	91.8	99.1	98.3	100
B2	91.5	91.5	98.9	100
													B1	91.8	91.8	100
U2	98.0	100
													U1	100

ORF2编码672个氨基酸，I型各株之间的ORF2氨基酸同源性为98.0％-99.4％，II型只报道一株墨西哥病毒的全序列，III型之间的同源性为98.0％。I型和II型之间的ORF2氨基酸同源性92.4-93.3％；和III型之间的核苷酸同源性为90.9-91.8；II型和III型之间的氨基酸同源性90.1-90.6％。本发明的HEV-T1与已报道的I型，II型和III型的ORF2氨基酸同源性分别为91.6-92.4％，90.1％和91.9-93.0％(见表6).戊肝病毒ORF2是病毒的壳蛋白，是诱导机体产生免疫反应的主要抗原。将该ORF2与其他戊肝病毒ORF2进行比较，显示免疫位点部位氨基酸变异较大，氨基酸同源性低于90％，因此其抗原性有可能发生改变。

实施例6

ORF3蛋白的同源比较

将本发明戊型肝炎病毒HEV-T1的ORF3蛋白与其他戊型肝炎病毒的ORF3蛋白进行同源比较，结果表7所示。

                 表7：HEV ORF3氨基酸同源性比较

	U1	U2	B1	B2	I2	C1	C2	P1	C3	I1	M1	T1
													T1	83.3	79.6	76.9	76.9	77.8	77.8	77.8	76.9	75.9	76.9	75.0	100
M1	78.7	80.3	87.0	87.0	87.0	85.4	85.4	87.0	85.4	88.6	100
													I1	84.4	84.4	98.4	96.7	98.4	96.7	96.7	98.4	96.7	100
C3	82.8	82.8	98.4	96.7	98.4	97.6	96.7	98.4	100
													P1	84.4	84.4	100	98.4	100	98.4	98.4	100
C2	84.4	82.8	98.4	96.7	98.4	96.7	100
													C1	82.8	82.2	98.4	96.7	98.4	100
I2	84.4	84.4	100	98.4	100
													B2	83.6	83.6	98.4	100
B1	84.4	84.4	100
													U2	96.7	100
U1	100

ORF3编码112个氨基酸，I型各株之间的ORF3氨基酸同源性为96.7-100％，II型只报道一株墨西哥病毒的全序列，III型之间的同源性为96.7％。I型和II型之间的ORF3氨基酸同源性85.4-88.6％；和III型之间的核苷酸同源性为82.2-84.4％；II型和III型之间的氨基酸同源性78.7-80.3％。本发明的HEV-T1与已报道的I型，II型和III型的ORF3氨基酸同源性分别为75.9-77.8％，75.0％和79.6-83.3％(见表7)。

实施例7(1)在大肠杆菌系统的表达：

将ORF2和ORF3基因片段用PCR方法(方法同前，引物为：SW2F：5′-aa ggatccaccatgaataacatgttcttttgctctgtgcatg-3′；SP2F：5′-aa ggatccgccatggctgtggctccggctcctgacactgcacctgt-3′；SP2R：5′gg tctagatcaatactcccgggttttacccacct tcatttt-3′；SW3F：5′-a ggatccttttgctctgtgcatggagatgccaccatg-3′和SW3R：5′-gg tctagattgtactggcggcgtagaatagcaccac-3′.用W2F和P2R扩增全长的ORF2；用P2F和P2R扩增ORF2 3′端的550个氨基酸片段；用W3F和W3R扩增全长的ORF3.)分别扩增出，并将该片段分别连接到大肠杆菌的表达质粒pThioHisA，B和C中，将含ORF2和ORF3基因片段的重组质粒转化到大肠杆菌中(以上使用方法见前)，到细胞长到600mm波长下OD值为0.6时，加入1Mm IPTG进行诱导，然后再在37℃摇床中，培养5小时。收集细胞在5000rpm离心10分钟，收集沉淀，并用裂解液进行裂解，(50mM Tris HCl，pH8.0，1mM EDTA，50Mm NaCl，1mM PMSF)，并在超声波破碎3次，液氮中冻融3次，10000rpm离心10分钟，收集沉淀，并加入8M尿素使包涵体溶解，以作进以步纯化。(2)在昆虫细胞中表达

将ORF2和ORF3基因片段用PCR方法(方法同前，引物为：SW2F：5‘-：aa ggatccaccatgaataacatgttcttttgctctgtgcatg-3′；SP2F：5′-aa ggatccgccatggct gggctccggctcctgacactgcacctgt-3′；SP2R：5′gg tctagatcaatactcccgggttttacccacct tcatttt-3‘；SW3F：5’-aa ggatccttttgctctgtgcatggagatgccaccatg-3′和SW3R：5′-gg tctagattgtactggcggcgtagaatagcaccac-3′.用W2F和P2R扩增全长的ORF2；用P2F和P2R扩增ORF2 3′端的550个氨基酸片段；用W3F和W3R扩增全长的ORF3)分别扩增出，并将该片段分别连接到昆虫细胞的质粒Pfast中，将含目的片段的重组质粒分别转化DH10Bac感受态细胞，转化方法同前。然后提取重组的Bacmid，将5ul重组的Bacmid加入100ul TC100培养基中，最后将以上两种试剂混合，并加入到10个昆虫细胞(SF21，SF9，HF5)室温放置1小时，然后吸出液体，并加入正常培养液28培养3天。然后悬浮细胞，并5000rpm离心收集细胞沉淀，以作进一步纯化。

(3)在酵母细胞系统中表达：

将ORF2和ORF3基因片段用PCR方法分别扩增出(方法同前，引物为：YW2F：5′-atggtca ttacgtaccatgaataacatgttcttttgctctgtgcatg-3′；YP2F：5′-atggtcat tacgta ccatggctgtggctccggctcctgacactgcacctgt-3’；YP2R：5′-aa ggatcctcaatactcccgggt tttacccaccttcatttt-3′；YW3F：5′-atggtcat tacgtattttgctctgtgcatggagatgccaccatg-3′和SW3R：5′-aa ggatccttgtactggcggcgtagaatagcaccac-3′.用YW2F和YP2R扩增全长的ORF2；用YP2F和YP2R扩增ORF2 3′端的550个氨基酸片段；用YW3F和YW3R扩增全长的ORF3.)，并将该片段分别连接到酵母表达性质粒Sequencher^TM，将含目的片段的重组酵母表达性质粒用电转化的方法转染酵母菌，(如RB11，LR9等)，并在选择性YNB培养基(含2.0％葡萄糖，1.8％琼脂)上37℃培养4-5天后，挑选菌落。然后对表达菌进行高密度发酵。收集液体并在5000rpm离心10分钟，收集沉淀，并用玻璃珠的方法对菌体进行破碎，然后5000rpm离心10分钟收集上清以备进一步纯化。

实施例8

重组抗原的纯化

用如下方法对实施例8中获得的重组抗原进行纯化：

(1)气溶胶处理：以上三种表达系统表达后提取的沉淀物用生理盐水溶解，并加入气溶胶(62.5g/l)吸附，4℃过夜，然后20℃4000rpm离心10分钟，弃上清，收集沉淀。并用生理盐水悬浮沉淀。然后加入脱吸附缓冲液(5倍脱吸附缓冲液为硼砂95.35g，EDTA 18.6g，脱氧胆酸62.5g加水至5000ml)，至脱吸附缓冲液的终浓度为22％，并在57℃200rpm摇床中震荡2小时，然后4℃1000rpm离心30分钟，并收集上清。

(2)分子筛层析：选用S200HR基质，上样前至少用5倍柱床体积的层析洗脱液平衡柱子(0.05M磷酸缓冲液)，然后上样，并用洗脱液洗脱，在紫外检测器的检测下收集蛋白峰。

(3)离子交换：选用mono Q柱子，上样前用500ml缓冲液A洗3次，再用缓冲液B将胶平衡。然后上样，并进行梯度洗脱(0-100mM Nacl，10mM Tris Cl pH 8.0)，在紫外检测器的检测下收集蛋白峰，并对蛋白进行检测。

(4)脱盐：用Sephadex G25进行层析脱盐，上样前用5倍柱床体积的生理盐水平衡柱子，然后上样，并用生理盐水洗脱，在紫外检测器的检测下收集蛋白峰。

实施例9

抗HEV诊断试剂的制备

取实施例8中纯化的HEV ORF2和ORF3抗原，用0.1mol/L PH9.6碳酸氢钠缓冲液适当稀释，在酶标板上每孔加100ul，置4℃过夜。弃去包被液，用洗涤液充分洗涤各孔，随之置37℃干燥4小时。干燥的酶标板，迅速用塑料袋包装并封口。用过碘酸钠或其它适宜的方法用辣根过氧化物酶标记抗人IgG，然后加入5％蔗糖和小牛血清等保护剂，适当分装并冻干。

实施例10

戊肝疫苗的制备

配制20mg/ml Al(OH)₃胶体，然后用生理盐水将Al(OH)₃稀释成0.07mg/ml，然后再加入纯化的抗原，使抗原纯浓度达到20ug/ml，并在37℃搅拌2小时。然后在无菌条件下分装，每支1ml。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                              序列表(1)一般信息：

(ii) 发明名称：新型戊型肝炎病毒基因序列及其应用

(iii)序列数目：7(2)SEQ ID N0：1的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：1707氨基酸残基

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：未知

     (D)拓扑结构：未知

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：MEAHQFIKAP GVTTAIEQAA LAAANSALAN AVVVRPFLSR LQTEILINLM  50QPWOLVFRPE VLWNHPIQRV IHNELEQYCR ARAGRCLEEG AHPRSINDDP  100NVLHRCFLKP VGRDVQRWYT APTRGPAANC RRSALRGLPP VDRTYCFDGF  150SGCTFAAETG VALYSLHDLW PADVAEAMAR HGMTRLYAAL HLPPEVLLPP  200GTYHTTSYLL IHDGDRAVIT YEGDSSAGYN HDVSILRAWI RTTKVTGDHP  250LVIERVRAVG CHFVLLLTAA PEPSPMPYVP YPRSTEVYVR SIFGPGGSPS  300LFPSACSTKS TFHAVPVHIW DRLMLFGATL DDQAFCCSRL MTYLRGISYK  350VTVGALVANE GWNASEDALT AVITAAYLTI CHQRYLRTQA ISKGMKRLEL  400EHAQKFITRL YSWLFEKSGR DYIPGRQLQF YAQCRRWLSA GFHLDPRVLV  450FDEAAPCRCR SFLRKAATKF CCFMRWLGQD CTCFLQPIEG RVGEQGYDNE  500AFEGSDIDPA EEATVSIAGS YIVTGSQLQP LYQALGIPSD LAARASRLTA  550TVEVSDADGR LTCKTTMGNK TFSTVFTDGT QLEANGPEQY VLSFDPAKQT  600MAAGPHSLSY TLTSAGLEVH VVSAGLDCKV VFQSGVAAPS AAGEVTAFCS  650ALYRFNRCVQ RHSLIGGLWY HPEGLVGLFP PFSPGHSWES ANPFCGESTL  700YTRTWSVSGF SSCFSPLEPC VPSMPPPAEV NTPVVLDALP SEIMEPAQPP  750ASEPAAPPSD SVDNSFSPTS SGAPIAPPAP ALPVTHLSGP RRRLLHTYPD  800GSKVYAGSLF ESECTWLVNA SNPGHRPGGG LCHAFYQRFP ESFDPAEFIM  850SDGFAAYTLT PRPIIHAVAP DYRVEHNPKR LEAAYRETCS RRGTAAYPLL  900GVGIYRVPVG LSFDAWERNH RPGDELYLTE PAIAWFEANR PTLPALTITE  950DTARTANLAL ELDAATEVGR ACVGCRVEPG VIHYQFTAGV PGSGKSRSVQ  1000QGDVDVIVVP TRELRNSWRR RGFAAYTPHT AVRVTRGRRV VIDEAPSLPP  1050HLLLLHMQRA SSVHLLGDPN QIPAIDFEHA GLVPAIRPEL VPTKWWHLTY  1100RCPADVCELI RGAYPKIQTA SRVLRSLFWE EPPVGQNLVF TQAAKAANPG  1150AITVHEAQGA TFTETTIIAT ADARGLIQSS RAHAIVALTR HTEKCVVVDA  1200PGLLREVGIS DAIVNNFFLS GGQIGQHRPS VIRRGTIDNN VDTLDAFPPS  1250CQFSAYHQLA EELGHRPAPI AAVLPPCPEL EQGLLYMPQE LTTSDSVLTF  1300ELTDIVHCRM AAPSQRRAVL STLVGRYGRR TKLYEAAHTD VRGSLNHFIP  1350ELGPINVTTC ELYELVEAMV EKGQDGSAVL ELDLCSRDVS RITFFQKDCN  1400KFTTGETIAH GKVGQGISAW SKTFCALFGP WFRAIEKEIL AALAPNVFYG  1450DAYEDTVLAA AVAGAPGCKV FENDFSEFDS TQNNFSLGLE CIIMEECGMP  1500QWMIRLYHLV RSAWILQAPK ESLRGFWKKH SGEPGTLLWN TVWNMAVIAH  1550CYEFRDLKVA AFKGDDSVVL CSDYRQSRDA AVLIAGCGLK LKVDFRPIGL  1600YAGVVVAPGL GTLPDVVRFA GRLSEKNWGP GPERAEQLRL AVCDFLRKLT  1650NVAQVCVDVV SQVYGVSPGL VHNLIGMLQT IADGKAHFTE TIKPVLDLTS  1700SIIYRVE                                                 1707(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：672氨基酸残基

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：未知

     (D)拓扑结构：未知

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：MNNMFFCSVH GDATMRSRAL LFLLFVLLPM LPAPPAGQPS GRRRGQAGCG  50GGFWGDRVDS QPFALPYIHP TNPFASDIPA AAGTGARPRQ PIRPLGSAWR  100DQSQRPAAST RRRPAPAGAS PLTAVAPAPD TAPVPDADSR GAILRRQYNL  150STSPLTSTIA TGTNFVLYAA PLSPLLPLQD GTNTHIMATE ASNYAQYRVV  200RATIRYRPLV PNAVGGYAIS ISFWPQTTTT PTSVDMNSIT STDVRILVQP  250GIASELVTPS ERLHYRNQGW RSVETSGVAE EEATSGLVML CIHGSPVNSY  300TNTPYTGALG LLDFALELEF RNLTPGNTNT RVSRYSSSAR HKLRRGPDGT  350AELTTTAATR FMKDLHFTGT NGVGEVGRGI ALTLFNLADT LLGGLPTELI  400SSAGGQLFYS RPVVSANGEL TVKLYTSVEN AQQDKGVAIP HDIDLGESRV  450VIQDYDNQHE QDRPTPSPAP SRPFSVLRAN DVLWLSLTAA EYDQTTYGSS  500TNPMYVSDTV TFVNVATGAQ GVSRSLDWSK VTLDGRPLTT IQQYSKTFYV  550LPLRGKLSFW EAGTTKAGYP YNYNTTASDQ ILIENAAGHR VCISTYTTNL  600GSGPVSVSAV GVLAPHSALA ALEDTADYPA RAHTFDDFCP ECRALGLQGC  650AFQSTVGELQ RLKMKVGKTR EY                                672(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：112氨基酸残基

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：未知

     (D)拓扑结构：未知

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：MEMPPCALGL FCFCSSCFCL CCPRHRPVSR LAVAAGKRGA AVVSGVTGLI  50LSPSPSPIFI QPTPSHLTFQ PPPGLELALG SQSVHSAPLG VTSPSAPPLP  100PVVDLPQLGL RR                                           112(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：7232bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

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(i)序列特征：

     (A)长度：5124bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：ATGGAGGCCC ACCAGTTTAT AAAGGCTCCT GGCGTCACTA CTGCTATTGA GCAGGCAGCT  60CTAGCAGCGG CCAACTCCGC CCTGGCGAAT GCTGTGGTGG TTCGGCCTTT CTTGTCCCGG  120CTTCAGACTG AGATTCTCAT AAATTTGATG CAGCCTTGGC AGCTTGTTTT CCGGCCTGAG  180GTCCTGTGGA ATCACCCAAT CCAGCGTGTG ATCCACAATG AGCTTGAGCA ATATTGCCGA  240GCCCGGGCTG GACGCTGTCT TGAGGAGGGT GCTCATCCAC GTTCCATTAA TGACGACCCT  300AACGTCCTGC ACCGCTGCTT TCTTAAACCT GTTGGCCGTG ATGTTCAGCG GTGGTATACC  360GCTCCTACCC GTGGCCCTGC AGCTAACTGC CGGCGGTCCG CTCTTCGCGG GCTTCCACCT  420GTTGACCGGA CTTACTGCTT TGATGGTTTT TCAGGCTGCA CATTTGCCGC CGAGACGGGG  480GTTGCACTTT ACTCACTGCA CGACCTTTGG CCTGCCGATG TTGCGGAGGC AATGGCCCGC  540CATGGCATGA CTCGGTTGTA TGCAGCCCTC CATCTTCCCC CGGAGGTATT ACTCCCCCCT  600GGCACTTACC ATACCACCTC ATACCTCCTA ATTCATGATG GGGACCGTGC AGTGATTACA  660TACGAGGGGG ATTCTAGTGC CGGGTACAAT CATGATGTGT CCATCTTACG TGCTTGGATC  720CGTACGACCA AAGTCACCGG TGATCACCCG CTGGTGATTG AGCGGGTCCG GGCTGTGGGA  780TGCCATTTTG TACTCCTCCT CACAGCTGCA CCTGAACCGT CGCCGATGCC TTACGTCCCA  840TACCCTCGTT CGACCGAGGT TTATGTTCGT TCTATCTTCG GCCCTGGCGG CTCACCATCC  900CTTTTTCCAT CTGCCTGCTC GACTAAGTCA ACATTTCATG CCGTCCCTGT GCATATATGG  960GACAGGCTTA TGCTTTTTGG AGCGACCCTT GATGACCAGG CCTTCTGCTG CTCCAGGCTT  1020ATGACATATC TCCGTGGCAT TAGTTATAAG GTTACGGTTG GTGCCCTTGT CGCTAATGAA  1080GGTTGGAATG CTTCCGAAGA TGCACTGACT GCTGTAATTA CTGCAGCCTA TTTAACCATT  1140TGTCATCAGA GATACCTCCG CACGCAAGCT ATTTCTAAAG GGATGAAGAG GCTGGAGCTT  1200GAGCATGCAC AAAAGTTCAT AACACGCCTT TACAGTTGGT TATTTGAGAA GTCTGGGCGT  1260GATTACATCC CTGGCCGCCA GTTGCAGTTT TACGCCCAGT GCCGCCGGTG GTTATCTGCC  1320GGCTTCCATC TTGATCCTCG GGTACTTGTA TTTGATGAGG CGGCCCCCTG TCGTTGCCGG  1380AGTTTTCTTC GCAAGGCTGC CACAAAGTTC TGCTGCTTCA TGCGGTGGCT CGGCCAGGAT  1440TGCACCTGTT TCCTCCAGCC CATTGAGGGG AGGGTCGGTG AGCAGGGTTA TGACAATGAG  1500GCATTTGAGG GGTCGGATAT TGACCCCGCT GAAGAAGCCA CCGTGAGTAT CGCTGGGTCA  1560TATATCGTCA CTGGTAGCCA GTTGCAGCCC CTCTACCAAG CACTCGGCAT ACCTTCCGAT  1620CTTGCCGCTC GTGCAAGCCG ACTCACTGCT ACCGTTGAGG TTTCTGATGC TGATGGCCGT  1680CTTACCTGTA AGACTACTAT GGGTAATAAG ACCTTTTCAA CAGTTTTTAC TGATGGCACC  1740CAGCTGGAGG CCAATGGGCC AGAACAATAT GTTTTGTCAT TTGATCCGGC GAAACAAACT  1800ATGGCAGCAG GTCCACATAG TCTTAGTTAC ACTCTGACAT CTGCTGGCCT TGAGGTACAT  1860GTGGTCTCGG CCGGGCTCGA CTGCAAGGTC GTCTTCCAGT CCGGCGTAGC GGCCCCCTCT  1920GCTGCTGGGG AGGTGACCGC TTTCTGCTCG GCCCTGTACA GGTTTAACCG CTGTGTTCAA  1980CGGCATTCTC TTATTGGAGG CCTATGGTAT CACCCTGAGG GGCTTGTTGG CCTGTTCCCA  2040CCGTTCTCCC CCGGCCATAG TTGGGAGTCT GCTAACCCTT TCTGTGGTGA AAGCACCCTT  2100TACACTCGGA CCTGGTCGGT TTCGGGCTTT TCTAGCTGCT TTTCACCGCT CGAACCTTGT  2160GTCCCGAGTA TGCCACCTCC CGCGGAGGTT AATACACCTG TGGTCTTAGA TGCCCTACCT  2220TCAGAGATTA TGGAGCCGGC CCAACCTCCA GCTTCTGAGC CGGCGGCACC TCCATCCGAT  2280TCAGTCGATA ATAGTTTTAG CCCCACCTCA TCCGGTGCTC CCATTGCACC TCCGGCACCG  2340GCGCTGCCTG TAACCCACCT ATCTGGGCCC CGCCGGCGGT TGCTTCATAC TTACCCTGAC  2400GGCTCAAAAG TGTATGCTGG CTCCCTTTTT GAGTCTGAGT GCACCTGGCT GGTTAATGCA  2460TCCAACCCCG GTCACCGCCC CGGTGGCGGT CTCTGTCATG CCTTCTACCA GCGGTTCCCA  2520GAATCGTTTG ATCCCGCCGA GTTTATCATG TCGGACGGGT TTGCAGCCTA CACCCTAACT  2580CCCCGGCCCA TTATCCATGC TGTTGCTCCC GACTATCGGG TTGAACATAA CCCTAAGCGG  2640CTTGAGGCCG CCTATCGGGA GACATGTTCT CGCCGGGGAA CGGCTGCCTA CCCTCTGCTC  2700GGTGTCGGCA TATACCGGGT CCCCGTTGGG TTGAGCTTCG ATGCTTGGGA GCGTAACCAT  2760CGACCTGGGG ATGAACTATA TCTGACTGAG CCAGCCATAG CCTGGTTTGA AGCCAATCGG  2820CCCACCCTCC CTGCCTTGAC TATAACTGAG GATACGGCCC GTACAGCGAA TCTGGCGCTT  2880GAGCTGGATG CGGCCACAGA GGTGGGCCGT GCGTGTGTTG GCTGTCGTGT GGAGCCCGGC  2940GTGATTCACT ATCAATTCAC GGCGGGTGTC CCCGGCTCTG GTAAGTCCAG GTCGGTTCAA  3000CAGGGGGATG TAGATGTGAT AGTGGTGCCA ACCCGCGAGC TGCGTAATTC ATGGCGTCGT  3060CGTGGGTTCG CAGCCTACAC ACCCCACACG GCAGTCCGTG TGACTCGCGG CCGCAGGGTC  3120GTCATTGATG AGGCCCCTTC ACTCCCACCA CATCTGCTTC TGTTGCACAT GCAGCGGGCC  3180TCATCAGTCC ATCTCCTTGG TGATCCTAAC CAAATCCCTG CTATTGATTT TGAGCACGCC  3240GGCCTTGTAC CGGCAATTCG GCCTGAGCTG GTTCCTACAA AGTGGTGGCA TCTTACCTAT  3300AGATGCCCGG CGGATGTCTG TGAGCTAATC CGCGGTGCAT ACCCGAAGAT CCAGACTGCA  3360AGCCGCGTCC TCCGCTCTTT GTTTTGGGAG GAACCCCCTG TGGGTCAAAA CCTCGTATTT  3420ACCCAGGCGG CGAAGGCTGC AAACCCCGGC GCAATCACTG TTCATGAAGC CCAGGGTGCG  3480ACATTCACTG AGACTACGAT TATTGCCACG GCAGACGCTC GTGGGCTGAT CCAGTCATCT  3540AGAGCCCACG CAATCGTGGC CCTGACCCGC CACACGGAGA AGTGCGTGGT GGTCGATGCA  3600CCGGGGCTCC TCCGTGAGGT AGGCATTTCT GATGCCATTG TTAATAATTT TTTCCTTTCT  3660GGTGGTCAGA TCGGCCAGCA CCGTCCATCA GTCATACGGC GTGGCACTAT TGATAACAAT  3720GTTGACACAC TTGATGCCTT CCCGCCCTCT TGCCAGTTTA GTGCTTACCA CCAGTTAGCC  3780GAGGAGCTCG GCCACCGGCC CGCTCCAATT GCTGCTGTTC TGCCTCCCTG CCCGGAGCTT  3840GAACAGGGCC TGCTCTATAT GCCTCAAGAA TTGACAACAT CGGATAGCGT GCTCACTTTT  3900GAGCTCACGG ACATAGTGCA CTGTCGTATG GCGGCGCCCA GCCAGCGCAG AGCAGTCCTG  3960TCAACTCTTG TTGGCAGGTA CGGCCGTCGC ACCAAGTTGT ACGAGGCCGC ACACACAGAT  4020GTTCGTGGGT CCCTGAATCA CTTTATTCCT GAGCTTGGCC CCATTAATGT TACCACCTGT  4080GAGCTTTATG AGCTTGTGGA GGCTATGGTT GAGAAAGGCC AAGACGGTTC TGCGGTTCTG  4140GAGCTTGATC TATGCAGCCG TGATGTGTCT CGGATAACAT TCTTCCAGAA GGATTGTAAT  4200AAGTTTACAA CAGGTGAGAC GATA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(i)序列特征：

     (A)长度：2019bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：ATGAATAACA TGTTCTTTTG CTCCGTGCAT GGAGATGCCA CCATGCGCTC TCGGGCTCTT  60CTGTTTCTGC TCTTCGTGCT TCTGCCTATG TTGCCCGCGC CACCGGCCGG TCAGCCGTCT  120GGCCGTCGCC GCGGGCAAGC GGGGTGCGGC GGTGGTTTCT GGGGTGACCG GGTTGATTCT  180CAGCCCTTCG CCCTCCCCTA TATTCATCCA ACCAACCCCT TCGCATCTGA CATTCCAGCC  240GCCGCCGGGA CTGGAGCTCG CCCTCGGCAG CCAATCCGTC CACTCGGCTC CGCTTGGCGT  300GACCAGTCCC AGCGCCCCGC CGCTTCCACC CGTCGTCGAC CTGCCCCAGC TGGGGCTTCG  360CCGTTGACTG CTGTGGCTCC GGCTCCTGAC ACTGCACCTG TCCCCGATGC TGATTCCCGT  420GGCGCTATTC TACGCCGCCA GTACAATTTG TCCACATCCC CGCTCACGTC CACTATTGCA  480ACTGGCACCA ATTTTGTGCT ATATGCTGCC CCACTTAGTC CCCTGCTACC GCTTCAGGAT  540GGCACCAATA CCCACATCAT GGCTACTGAA GCATCTAATT ATGCCCAGTA TCGTGTTGTT  600CGTGCTACCA TCCGATATCG CCCCTTGGTG CCGAATGCCG TTGGCGGGTA TGCCATATCT  660ATCTCCTTTT GGCCTCAGAC AACGACCACC CCAACGTCTG TTGATATGAA TTCAATTACC  720TCCACTGATG TCCGCATTCT TGTCCAGCCT GGTATAGCTT CTGAGTTGGT AACTCCCAGT  780GAGCGCCTGC ATTATCGAAA TCAAGGATGG CGTTCGGTTG AGACCTCTGG TGTCGCTGAG  840GAAGAAGCGA CCTCTGGCCT TGTTATGCTT TGCATTCATG GGTCACCTGT GAATTCCTAT  900ACTAATACAC CTTATACCGG TGCCCTCGGC TTACTTGACT TTGCACTCGA GCTCGAGTTT  960CGCAATTTGA CACCTGGTAA CACCAATACG CGCGTTTCTC GTTATTCGAG TAGCGCGCGT  1020CACAAACTGC GCCGAGGGCC TGATGGTACT GCTGAGTTGA CTACTACTGC CGCCACACGT  1080TTTATGAAAG ACCTCCATTT TACGGGGACT AATGGTGTTG GTGAGGTCGG TCGTGGTATA  1140GCGTTAACTT TGTTTAATCT TGCTGATACG CTTCTCGGTG GGCTTCCGAC AGAATTGATT  1200TCGTCGGCAG GGGGTCAGTT ATTCTACTCC CGCCCCGTTG TCTCAGCCAA TGGCGAGCTG  1260ACAGTGAAAC TTTACACTTC AGTCGAGAAC GCTCAGCAGG ACAAGGGTGT AGCTATTCCA  1320CATGATATTG ACCTTGGTGA GTCCCGTGTG GTTATTCAGG ATTATGACAA CCAACATGAG  1380CAAGATCGTC CCACTCCCTC CCCTGCTCCC TCTCGTCCAT TTTCTGTTCT TCGTGCTAAT  1440GATGTGCTTT GGCTTTCACT TACTGCTGCT GAGTATGATC AAACGACTTA TGGCTCCTCT  1500ACCAACCCTA TGTATGTTTC TGACACTGTT ACATTTGTTA ACGTAGCGAC TGGTGCCCAG  1560GGGGTTTCGC GCTCTCTGGA TTGGTCTAAG GTCACTCTCG ATGGCCGTCC ACTCACCACC  1620ATCCAGCAGT ATTCTAAGAC TTTCTATGTC TTGCCCCTTC GTGGTAAGCT TTCCTTTTGG  1680GAGGCCGGCA CCACTAAAGC CGGCTACCCT TATAATTATA ACACTACTGC TAGTGACCAG  1740ATCCTGATTG AGAATGCAGC GGGCCACCGA GTTTGCATCT CTACCTACAC TACTAACCTG  1800GGCTCCGGGC CTGTGTCTGT ATCTGCTGTT GGTGTCCTCG CCCCTCACTC TGCGCTGGCT  1860GCTTTGGAGG ATACCGCTGA CTACCCTGCT CGCGCCCATA CTTTTGATGA TTTCTGCCCT  1920GAATGCCGTG CACTCGGCCT TCAGGGTTGT GCCTTCCAAT CTACTGTTGG TGAGTTACAG  1980CGTCTTAAAA TGAAGGTGGG TAAAACCCGG GAGTATTGA                         2019(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

     (A)长度：339bp

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑结构：线性

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：ATGGAGATGC CACCATGCGC TCTCGGGCTC TTCTGTTTCT GCTCTTCGTG CTTCTGCCTA  60TGTTGCCCGC GCCACCGGCC GGTCAGCCGT CTGGCCGTCG CCGCGGGCAA GCGGGGTGCG  120GCGGTGGTTT CTGGGGTGAC CGGGTTGATT CTCAGCCCTT CGCCCTCCCC TATATTCATC  180CAACCAACCC CTTCGCATCT GACATTCCAG CCGCCGCCGG GACTGGAGCT CGCCCTCGGC  240AGCCAATCCG TCCACTCGGC TCCGCTTGGC GTGACCAGTC CCAGCGCCCC GCCGCTTCCA  300CCCGTCGTCG ACCTGCCCCA GCTGGGGCTT CGCCGTTGA                         339

Claims (11)

1.一种分离的戊型肝炎病毒蛋白，其特征在于，其序列具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。

   2.权利要求1所述蛋白，其特征在于，该蛋白的序列由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3构成。

3.一种分离的DNA分子，其特征在于，它具有编码权利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的DNA序列，其特征在于，该序列具有选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。

5.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1的DNA。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的表达载体。

7.一种产生免疫原性的肝炎蛋白的方法，其特征在于，它包括：

在适合表达该蛋白的条件下，培养含有权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。

8.一种体外在生物样品中检测针对戊型肝炎病毒HEV-T1的抗体的方法，其特征在于，该方法包括：将样品与权利要求1所述的戊型肝炎蛋白接触；

检测是否形成了免疫复合物，形成免疫复合物就表示存在戊型肝炎的抗体。

9.一种用于使哺乳动物免疫以抗戊型肝炎感染的疫苗，其特征在于，该疫苗含有权利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白和药学上可接受的载体。

10.一种体外在生物样品中检测戊型肝炎病毒的方法，其特征在于，该方法包括：

将该生物样品与对权利要求1所述的戊型肝炎病毒蛋白特异的抗体接触，以便与该戊型肝炎病毒形成复合物，

检测是否形成了免疫复合物，形成免疫复合物就表示存在戊型肝炎病毒。

11.一种抗体，其特征在于，它对具有权利要求1所述的蛋白有特异的结合亲和力。

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