CN1064891A - 疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供新的基本不分裂形式的gp160，以及
含有gp160或其衍生物，配有3-DMPL佐剂的疫苗
制剂。组合物可用于对HIV传染的免疫治疗的和免
疫预防的处置。
Description
本发明涉及新的疫苗和药用制剂以及涉及其制备和在处置爱滋病中的使用。尤其是本发明涉及使用gp160或其衍生物，包括在疫苗中的新型gp160，配3-D单磷酰基类脂质A佐剂。
反转录病毒，即Retroviridae系内的病毒，是在核结构内具有卷曲病毒粒子和具有RNA作为遗传物质的约150nm的被膜、二十面的病毒的一大系。该系包含致癌病毒，如肉瘤和白血病病毒，某种免疫缺乏病毒和晶状病毒（lentiviruses）。
人类免疫缺乏病毒型Ⅰ（HIV-1）是后天免疫缺乏综合症（也被称爱滋病）的病原。这种反转录病毒有一复杂基因组织，包括长末端重复（LTRS），gag、pol和env基因以及其它基因。这种反转录病毒带有许多病毒抗原，这些病毒抗原是单独的或一起地作为能诱导保护性免疫应答疫苗的潜在候补者。
HIV-1被膜蛋白是作为一种多蛋白前身而合成的，随后它在感染细胞内糖基化而得到分子量为160kDa（gp160）和糖蛋白，它通过蛋白水解而成为gp120外扩蛋白和gp41转膜（transmanbrane）蛋白。
一种原病毒HIV的DNA编码区可以由文献所报导的任何几种免疫缺乏病毒基因克隆来制备。例如参阅Shaw等人，Science 226：1165（1984）;Kramer等人，Science 231：1580（1986）。或者，一种免疫缺乏病毒基因克隆可以由通过标准DNA克隆技术由临床样品中分离的病毒中制备。例如参阅Gallo等人，美国专利US4520113;Montagnier等人，美国专利US4708818。
HIV-BH10-2的原病毒DNA顺序描述于Ratner等人的“Human Retroviruses and AIDS”1989，HIV Sequence Database ed.Gerald Meyers，Los Alamos National Laboratory。顺序是8932 bp长，env基因是位于5580-8150，而其中分裂位点在7088和7112，相当于氨基酸503和511（在这些残基后分裂）（编号按照Los Alamos数据库）
根据本发明，提供了HIV gp160，它已改性以在位置502和510分别提供除赖氨酸或精氨酸外的氨基酸。
赖氨酸的合适置换是亲水性和大小与赖氨酸相类的那些，如组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸。其中，优选的氨基酸是谷氨酸。优选的蛋白是由于突变引入的非分裂的以及能诱出交互中和抗体的，它是取决于蛋白的正确折叠。
本发明提供的发明改性蛋白最好是寡聚形式的。特别是具有相对分子量640kDa。基于分子量gp160单体，这种形式认为是四聚的。这是有利的，因为病毒表面蛋白必然以寡聚物存在，它在体内形成由病毒表面突出的刺突。正如许多中和表位是构象的，很清楚重要的是尽可能接近地模拟抗原形式使用之天然地呈现，因为这将提供最有关的免疫应答。
在优选的实施方案中本发明提供的发明改性蛋白是以寡聚的亚基本纯的形式。
基本纯是指至少75%纯，更优选的应90%纯，最优选的为99%纯。
在另一方面本发明提供了根据本发明制备改性HIV gp160的方法，该方法包括在一重组体真核宿主细胞中表达编码所述改性蛋白的DNA以及回收改性蛋白产品。
DNA聚合物含有编码改性蛋白的核苷酸顺序，它也形成了部分本发明。
本发明的重组体DNA分子可以根据本发明通过将适宜的单-、双-或寡聚核苷酸单元缩合而制备。
制备可以用化学法或酶催化法或用两者相结合的方法，看适宜而定在体内或体外进行。这样，DNA分子可以通过相当的DNA片段的酶促络合形成作用，通过描述于D.M.Roberts等人的Biochemistry 1985，24，5090-5098中的常用方法而制备。
DNA片段可以通过含有核苷酸的必要顺序的DNA用适当限制性内切酶的消化作用，通过化学合成，通过酶催化的聚合作用或通过两者相结合的方法而制得。
用限制性内切酶的消化作用可以在适宜的缓冲液，在20℃-70℃温度下，一般在50μl或更少的体积中用0.1～10μgDNA进行实施。
DNA酶催化的聚合作用可以在体外，使用一种DNA聚合酶，诸如DNA聚合酶Ⅰ（Klenow片段）在一种含有三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP和dTTP（视需要而定）的适宜缓冲液中，在10°～37℃温度下，一般在50μl或更少体积中进行。片段可以使用Taq聚合酶通过聚合酶链反应而聚合和放大（参阅PCR Protocols 1989-aguide to Methods and Applications，Ed.M.A.Innis等人，Acadamic Press）。
DNA片段的酶催化连接可以使用一种如T4 DNA连接酶的DNA连接酶，在适宜的缓冲液中，在4℃～室温的温度下，一般在50μl或更少体积中进行。
DNA分子或片段的化学合成可以通过通常的磷酸三酯、亚磷酸盐或氨基磷酸酯（phosphoramidite）化学，使用固相技术进行实施，这些技术描述于‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual’（ed.H.G.Gassen and A.Lang），Verlag Chemie，Weinheim（1982），或描述于其它科学出版物中，例如，M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.sproat和R.C.Titmas，Nucleic Acids Research，1982，10，6243;B.S.Sporat和W.Bannwarth，Tetrahedron Letters，1983，24，5771;M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters，1980，21，719;M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Journal of the American Chemical Society，1981，103，3185;S.P.Adams等人，Journal of the American Chemical Society，1983，105，661;N.D.Sinha，J.Biernat，J.McMannus，和H.Koester，Nucleic Acids Research，1984，12，4539;和H.W.D.Matthes等人，EMBO Journal，1984，3，801。优选的是使用一种自动DNA合成器。
编码改性蛋白的DNA聚合物可以使用一般方法通过将编码未改性蛋白的cDNA进行位点定向诱变而制备，这些方法描述于G.Winter等人的Nature，1982，299，756-758或Zoller和Smith 1982;Nucl.Acids Res，10，6487-6500。
本发明也涉及含有本发明重组体DNA分子的载体，并涉及含有所述载体的重组体疫苗病毒。
载体的制备可以根据本发明，通过分裂一载体而提供具有完整复制子的线性DNA节片并将所说线性节片与一个或多个DNA分子连接，它们与所述线性节片一起完成本发明的重组体DNA分子。
本发明的重组体宿主细胞可以用本发明的载体转化疫苗病毒而制备。
改性蛋白产品通过蛋白分离和纯化的标准方法而由条件培养基中分离。可以加入去污剂，如Decyl PEG-300，DD Decyl PEG Triton X100，Thesit Deoxycholate，以实施细胞的溶胞作用并由改性蛋白中除去细胞膜物质。其中优选的是Decyl PEG-300和Thesit Deoxycholate，DO Decyl PEG Triton X100改性蛋白可以通过一系列超过滤步骤，超离心步骤、用例如硫酸铵或PEG的选择沉淀，在Cscl或蔗糖或者甲原影酰胺梯度剂的比重梯度离心和/或色谱步骤，如亲合色谱法、优选的是免疫亲合色谱法、HPLC、反相HPLC、阳离子和阴离子交换、颗粒排阻色谱法以及制备等离子聚焦而进行纯化。优选使用免疫亲合色谱法进行纯化。在纯化期间或之后，改性蛋白可以用，例如甲醛、戊三醛成NAE进行处理以加强稳定性或免疫原性。
为制备本发明的寡聚形式，在纯化步骤期间最好使用和缓的条件。特别是，要避免还原剂并在色谱法期间使用非离子去污剂，如Decyl PEG-300（聚乙二醇300单葵基醚）而不是离子型去污剂以使细胞溶胞和增溶。优选的亲合色谱介质是晶状体外源凝集素琼脂糖而优选的免疫亲合色谱介质是一种抗-gp160单克隆抗体例如偶联在合适载体如戊二醛-活化的Trisacryl（IBF）上的178.1（WO 90/06358）。
改性蛋白可以在去污剂辛基吡喃葡糖苷存在下由单克隆抗体中吸附，而辛基吡喃葡糖苷可以用透析法除去。所用去污剂的浓度最好大于基理论临界的胶粒浓度。
根据本发明所产生的改性蛋白对于接触HIV的检测可用作诊断剂。改性蛋白也用于疫苗以防止传染或抑制或阻止疾病的进展。
本发明也涉及含有本发明改性蛋白的疫苗和药物组合物。这种组合物含有免疫保护恒量的本发明改性蛋白并可以用通常技术制备。
在本发明疫苗中可以直接使用蛋白的水溶液。或者，无论预先经过或不经过冻干的蛋白可以与任何各种已知佐剂混合或吸收。这种佐剂包括，但不限于，氢氧化铝、壁胞酰基二肽和皂草苷，如Quil A.3D-MPL（3去酰基化的单磷酰基脂质A），或TDM。其它的选择典型是，蛋白可包裹在微粒如脂质体内。又一个选择典型是，蛋白可结合到免疫刺激大分子，例如死的博德特士杆菌（Bordetella）或破伤风类毒素上。
疫苗的制备一般描述于New Trends and Developments in Vaccines（Voller等人编辑，University Park Press，Baltimore，Marland，U.S.A.1978）中。在脂质体中封装描述于，例如Fullerton的美国专利US4235877。将蛋白结合到大分子上公开于，例如，Likhite的美国专利US4372945和Armor等人的美国专利US4474757中。
在每个疫苗剂量中本发明改性蛋白的用量要这样选择，使得该量诱发免疫保护性应答而在特定疫苗中没有明显的付反应。这种量由所用的特定免疫原以及疫苗有否佐剂配料而不同。一般说来，要求每个剂量含有1～1000μg的改性蛋白，优选的为10～200μg。对特定疫苗的最佳用量可通过包括在主体中观察抗体滴定度和其它应答的标准研究来确定。接着进行初次接种，主体最好在约4星期再接种一次，接着每六个月重复加一次直到有传染危险。
本发明还提供用于接种宿主的本发明改性蛋白以及在疫苗制剂中使用本发明的改性蛋白。
除了易于感染HIV人的接种外，本发明的药物组合物可用于处置、免疫治疗患有HIV传染的病人。
因而，本发明的一个方面是通过施用有效剂量的本文所述的改性gp160提供对易感传或患有HIV传染的病人的处置方法。
与使用所产生的亚单元组成的概念相一致，例如，通过重组体DNA工艺，需要佐剂和/或载体以对宿主免疫体系有效地呈现免疫原，使得产生免疫应答的两种功能（arms）（中和抗体和介于免疫的效应子细胞（DTH））。在本发明的文中（即在HIV传染的予防或治疗处置中），我们发现，除了免疫刺激部分外，3D MPL能激起免疫体系的两种功能。
因而，在本发明的一优选方面，提供了一种药物制剂，它含有gp160或其免疫衍生物和有适宜载体的3D单磷酰基脂质A（3D-MPL）。
在本发明的优选方案中，gp160或其原免疫衍生物和3D-MPL是呈水包油的乳化液。这体系可加强中和活性。
因而在本发明的一个优选方面，提供了一种药物或疫苗制剂，它含有gp160或其免疫衍生物，3D-MPL的水包油的载体，所述载体含有在缓冲盐溶液中四多元醇和无毒性矿物油的乳液。
优选的载体含有聚醚多元醇（Pluronic polyol）如Pluronic L121和角鲨烷或角鲨烯或其它可代谢的油。选用一种乳化剂如吐温80或吐温28，以稳定乳液。
优选的载体仅含有100～400nm之间的亚微粒颗粒。
在最终制剂中的抗原浓度优选的是10μg～150μg/ml之间，更优选的为20μg～100μg/ml之间。
在疫苗中佐剂，3D-MPL的浓度范围优选的为10μg～100μg/ml之间，更优选的为25～50μg/ml之间。
本发明还提供了本文所描述的疫苗制剂，它用于医药，特别是用于对HIV传染，如爱滋病或爱滋病有关的综合症（ARC）的免疫治疗和予防治疗。
在本发明的另一方面，提供了生产含有gp160或其免疫衍生物，有适宜载体的3D单磷酰基脂质A的疫苗的方法，该方法包括用所述载体和用30单磷酰基脂质A与gp160或免疫衍生物的混合。
在一具体方案中，提供了本文所描述的在水包油载体中的疫苗生产方法，其中水包油乳剂是微流化的以使在所述乳液中具有亚微颗粒并与gp160或其免疫衍生物和3D MPL混合。
一般，3D-MPL与乳液予混合然后将抗原混入所得的组合物中。
3D-MPL可以通过在英国专利GB2211502中所公开的方法而制得。
在本文中适宜的载体是水包油型乳液。与常用的含有单独矾作为佐剂（可用于人的唯一佐剂）的疫苗配剂相比较，本发明的制剂加强了中和滴定度。
用于本文的术语免疫衍生物，包括gp160免疫片段。当它与3D单磷酰基脂质A配制对它能提高对HIV-1的中和抗体。象这样的将包括，例如，HIV-1外膜糖蛋白gp120，本文所描述的改性gp160以及天然产生分离的gp160。特别优选的是也能提高DTH应答的那些衍生物。
因此，本发明最优选的提供了寡聚型蛋白的改性型，当在和缓的、水还原条件下纯化时表明它具有600～700kDa 640kd的表观分子量并认为是四聚体。这种四聚体在非还原条件下将蛋白通过SDS胶可以失去稳定，然后给出330kd的二原体和单体。二原体可以在标准还原条件下进一步还原而产生单体。
gp160的全部这些形式都可以用于本发明的制剂中。
gp160或其衍生物可以通过现有技术的已知方法而进行生产。一般这将包括在适宜宿主中将编码gp160的基因克隆和表达。用这种方法制备重组体gp160（rgp160）可以使用描述于Maniatis等人;Molecular Cloning-A Laboratory Manual（Cold Spring Harbour 1982）中的技术进行实施。
各种真核细胞和表达系统是用于重组体DNA分子的表达。其中最多用的是酵母、昆虫和哺乳动物系，虽然本发明不限于这些用途。这种系使用本发明重组体DNA分子，任意地使用一选择标志并在某些情况下，保持例如复制源的功能。
本发明所用的昆虫细胞包括果蝇属（Drosophila）细胞和鳞翅目（Lepidoptera）细胞，有用的果蝇细胞包括S1、S2、S3、KC-O和D.hydei细胞。参阅例如Schneider等人，J.Embryol.Exp.Morph.27：353（1972）;Schulz等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 83：9428（1986）;Sinclair等人，Mol.Cell.Biol.5：3208（1985）。
果蝇细胞是通过标准技术，包括磷酸钙沉淀、细胞融合、电击等以及病毒转染而进行转染的，细胞是在各种营养培育基包括如，M3培养基中，按标准细胞培养方法进行培养，M3培养基含有平衡盐和基本氨基酸。参阅Lindquist，DIS 58：163（1982）。
已知用于果蝇的启动子包括哺乳动物的细胞启动子，如SV40以及果蝇启动子，后者是优选的。有用的果蝇启动子的实例包括果蝇金属硫因启动子，70千道尔顿热休克蛋白启动子（HSP 70）以及COPIA LTR。参阅，例如，DiNocera等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，7095（1983），McGarry等人，Cell 42：903（1985）。
有用的鳞翅目细胞包括由Trichoplusia ni、Spodoptera fruqiperda、Heliothis zea，Autoqraphica Californica、Rachiplusisou、Galleria melonella、Manduca Sexta来的细胞以及其它可用杆状病（Baculoviruses）传染的细胞，包括核多角体病毒（NPV），单核蛋白壳病毒（SNPV）及多核蛋白壳病毒（MNPV）。优选的杆状病毒是NPV或MNPV杆状病毒，因为这些含有在传染细胞中具有高表达的多角体基因启动子。下面特地例举的是由Autoqraphica californica（AcMNPV）得到的MNPV病毒。但是其他MNPV和NPV病毒也能使用蚕病毒如家蚕（Bombyxmori）。鳞翅目细胞是按上面讨论的与含有本发明重组体DNA分子的DNA和与有传染性的杆状病毒的DNA通过标准转染技术而进行共转染。细胞是在各种营养培养基，包括如加有10%胎牛血清（FSA）的TC100（Gibco Europe;Gardiner等人、J.Inverteb.Pathol.25：363（1975））中，按照标准细胞培养技术进行培养。参阅，Miller等人，在Setlow等人编辑的，Genetic Enqineering：Principles and Methods，Volume 8，New York，Plenum，1986，277-298页。
用于鳞翅目细胞的启动子包括由杆状病毒基因组得的启动子。多角体基因的启动子是优选的，因为多角体蛋白与其他杆状病毒蛋白相比是必然过度表达的。由AcNMPV病毒得来的多角体基因启动子是优选的。参阅Summers等人，TAES、Bull、NR1555，五月;1987;Smith等人，EP-A-127，839;Smith等人，proc.Natl.Acad Sci.USA 82;8404（1985）;以及Cochran，EP-A-228，036
为在哺乳动物细胞内表达，将重组体DNA分子同样在克隆载体中克隆并然后用于转染哺乳动物细胞，载体最好含有用于基放大的量外DNA功能。如一种DHFR表达合，而且也可以含有用于选择和/或放大的其它功能，如用于G418选择的抗新霉素合。其它的功能，如用于转录加强也可以使用。但如有必要其它功能也能包括在载体内以稳定游离基的保持，例如，保持牛乳头痛病毒的功能。或者，优选的克隆载体是重组体哺乳动物病毒，如牛痘病毒。
牛痘病毒是一种特别有用的载体，在其重组体中可易于通过外来基因在牛痘DNA的非基本区内的整合而构建，因而保证传染性。当适当设计的蛋白进行合成、处理并输送到传染细胞的膜上，虽然牛痘病毒传染导致细胞死亡，但还有小量的溶胞并且细胞的主要部分还是完整的，易于由传染细胞中提取必要的蛋白。牛痘表达体系已由Barrett等人发展（Aids Research and Human Retroviruses 1989，5：159-171）。
有用的哺乳动物细胞包括用中国仓鼠卵巢（CHO）、NIH3T3、COS-7、CV-I、BHK-21、大鼠或小鼠的骨髓瘤、HAK、Vero、Hela、得来的细胞、人的二倍体细胞，如MRC-5和WI38，或小呜淋巴瘤细胞系，CV-I和BHK-21是优选的。
转染和细胞培养是通过标准技术进行的。在哺乳动物细胞中生产也可以通过在转移基因动物内的表达来实施。
用于在人类细胞系或哺乳动物初生细胞中引发基因表达的调节顺序包括SV40早期或后期基因启动子，金属硫因启动子，如劳氏肉瘤LTR、莫洛尼氏肉瘤病毒（MSV）LTR或小鼠乳房肿瘤病毒（MMTV）LTR之类的病毒LTR的启动子，或腺病毒主要延迟启动子以及杂种启动子如杂种BK病毒和腺病毒主要延迟启动子。控制要素区也能包括下游（down stream）动能如，用于多腺苷酸化的区域或其它如转录增强病毒顺序的功能。
能用于本发明实施的酵母，包括汉逊酵母（Hanensula）、毕赤酵母（Pichia）、Kluveromyces、酵母菌（Schizosaccharomyces、假丝酵母（Candida）和Sacchoromyces的那些。酿酒酵母（Sacchoromyces Cerevisiae）是优选的酵母宿主。有用的启动子包括铜诱导（CUP1）启动子、糖酵解基因启动子，如，TDH3、PGK和ADH以及PHO5和ARG3启动子。参阅，如，Miyanohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80：1（1983）;Mellor等人，Gene 24：1（1983）;Hitzeman等人，Science 219：620（1983）;Cabezon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6594（1984）。
实施例1
（1）改性gp160在CV-I细胞中的表达。
将BH10分子克隆的HIV env基因进行诱变处以制止前体分裂。
为此，在这些顺序中所存在的“分裂顺序”lgs ala lys arg和arg glu.lys arg通过位点直接诱变改性为lys/arg X glu arg。
分裂位点1 分裂位点
（位置502） （位置510）
↓ ↓
BH10 AAG GCA AAG AGA AGA GTG GTG CAG AGA GAA AAA AGA
克隆：LYS ALA LYSARG ARG VAL VAL GLN ARG GIV LYS ARG
诱变为： ↓ ↓
AAG GCA GAG AGA AGA GTG GTG CAG AGA GAA GAA AGA
LYS ALA GLU ARG ARG VAL VAL GLA ARG GLU GLU ARG
将完全诱变的env基因（核苷5802-8478）克隆入牛痘质粒转移载体pGS20[Mackett M.G.Smith L和Moss B（1984）J.Virology 49：857-864]并通过重组作用转入有传染性的牛痘病毒。通过俘获EIA筛送重组体牛痘斑点的env表达并将阳性斑点二次再克隆到CV-1细胞上。通过用重组体牛痘传染的细胞代谢标志之后的RIPA进一步确定在这些细胞系中产生不分裂的gp160。通过使用抗-gp120抗体的完整细胞表面萤光标记肯定细胞表面的表达。
（ⅱ）由锚地依赖细胞纯化改性gp160。
由（ⅰ）得到的HIV gp160被膜蛋白按以下三步纯化、溶解宿主细胞并藉助于去污剂提取抗原，接着通过二次亲合色谱步骤。全部纯化步骤都在4℃条件下进行。
步骤1：溶解CV-1细胞并提取抗原gp160。
解冻后，将相当于20l的细胞悬浮液和微载体珠在2200xg离心15分钟并弃去上清液。将沉淀再悬浮在1l添加有150mM NaCl、10%聚乙二醇300单癸基醚（Decyl PEG）和20meq/ml抑肽酶的pH8的30mM tris/HCl缓冲液中。将细胞在冰上用手随时摇动溶解一小时并在11300xg下离心20分钟。分离上清液后，沉淀用400ml溶胞缓冲液洗涤并在11300xg下离心20分钟。弃去细胞碎片和微载体珠，而将合并的上清液用于进一步纯化。步骤2：在晶状外源凝集素琼脂糖4B上的亲合色谱
将溶胞产物在晶状外源凝集素琼脂糖4B（Pharmacia-LKB）柱（2.5cm×20cm）上进行色谱层析，该柱用加有150mM NaCl和0.1%Decyl PEG的pH8的30mM Tris/HCl缓冲液平衡。按1ml/min流速加入溶胞产物后，用添加有1M NaCl和0.1%Decyl PEG.pH8的30mM Tris/HCl缓冲液洗涤色谱柱。其后，用含有0.5M甲基α-D-甘露吡喃糖苷的平衡缓冲液由柱上洗脱抗原并收集gp160阳性馏分，洗涤和洗脱步骤都是按5.5ml/分流速进行。
步骤3：在178.1-Trisacryl上的免疫亲合色谱
在蛋白G-琼脂糖柱（Pharmacia-LKB）上由腹水流体中纯化抗-gp160单克隆抗体178.1（专利说明书No.WO90/06358），并其后按照厂商指南偶合到戊二醛-活化Trisacryl（IBF）上。直接对着在抗原（V3环）的gp120部分上的表位的抗体已偶合在密度为1.5mg/ml的胶上。
将树脂装入柱（2.5cm×10cm）中并以添加有150mM NaCl和0.1%Decyl PEG、pH8的30mM Tris/HCl缓冲液平衡。
将晶状外源凝集素琼脂糖4B洗脱液装在柱上，按1ml/min流速循环过夜。然后用20个柱体积的加有1M NaCl和1%正辛基β-D-葡糖吡喃糖苷（OGP）pH8的30mM Tris/HCl缓冲液，按3.3ml/min流速洗涤色谱柱。最后，用添加有1%OGP的pH8的0.1M柠檬酸以同样流速洗脱抗原。洗脱部分立即用pH8.8的1M Tris/HCl中和并收集抗原阳性部分。
（ⅲ）蛋白测定
蛋白浓度是通过Bradford（Bradford，1976）方法使用牛血清清蛋白作标准而测定的。
（ⅳ）抗原测定
使用羊抗-gp41作俘获单克隆抗体和鼠抗-gp120作指示单克隆抗体通过室内展开的多层ELISA来测量gp160抗体的量。用经典的生物素化抗-鼠抗体、抗生蛋白链霉素和过氧物酶体系作进一步检测。
（ⅴ）聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹
SDS-板凝胶电脉是根据Laemmli法（Laemmli，1970）在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行的。迁移后，通过在高碘酸氧化后的银染色（Pas staining）（Dubray等人，1982）看到蛋白。
电泳实验是在有或没有还原剂的情况下进行的。蛋白带根据Towkin（Towbin等人，1979）方法在硝基纤维素上的Western印迹进一步被证实，并且直接对着gp160抗原或者对着宿主细胞（CV-1）或牛痘蛋白的抗体进行探测。
（ⅵ）178.1单克隆抗体的渗漏
在纯化的gp160抗体中所存在的单克隆抗体178.1是通过ELISA测量的。抗体由一山羊-抗-鼠抗体俘获并用生物素化的抗-鼠抗体检测。用抗生蛋白链霉素-过氧物酶体系进一步检测。
（ⅶ）纯的env gp160的颗粒排阻色谱
纯化的gp160在TSK4000SW HPLC柱（7.5mm×300mm）上进行色谱层析，该柱用添加有1%OGP的pH7的0.2M磷酸盐缓冲液平衡。流速为0.75ml/min，柱馏分通过ELISA分析抗原。
（ⅷ）纯度测定
在每一步纯化后都在还原条件下用SDS-1聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定其纯度。通过PAS染色观察蛋白带并用Western印迹进一步确定。
结果清楚地表明，抗原在免疫亲合柱上色谱层析后是没有可检出量的污染蛋白。但最终产品可由免疫亲合柱泄漏的痕量单克隆抗体所沾污。因此，通过ELISA在纯gp160中测定178.1抗体量且样品中所存在的蛋白总量是在0.004%-0.02%范围之间。
分析纯化的抗原中所存在的gp160的寡聚形式。寡聚物的形成可反映gp160在病毒中的结构，其中被膜蛋白是在病毒粒子表面按刺突排列。在抗原的原顺序中所存在的半胱氨酸可通过二硫键而形成连结的（均）寡聚物。这是在有或没有β-巯基乙醇存在下通过SDS聚丙烯酰胺凝胶而表明的。没有还原剂，抗原表明，甚至在有去污剂（SDS）存在下，蛋白带的分子量大于160000道。相反，当抗原在有还原剂存在下煮沸时，观察到一个160kDa的单蛋白带。为了测定寡聚结构的大小，抗原通过HPLC颗粒排阻色谱法分析。使用已知分子量的标准由柱上进行校准，大部分洗脱的gp160分子的滞留时间相当于640000Da的分子量。因此，得出结论，在有去污剂而没有还原剂时，大部分HIV gp160 env蛋白集合成四聚体结构。
（ⅸ）分析
最终的产品表明其抗原/蛋白比约为2，该比例符合溶胞产物的ELISA含量（通过ELISA每升培养物有0.8～1.4mg抗原）。
实施例2
改性gp160在BHK-21中的表达以及由培养在悬浮液中的细胞纯化env gp160
使用重组体牛痘病毒通过类似于例1（ⅰ）中所述方法在BHK-21细胞中表达的HIV gp160被膜蛋白除了在溶胞步骤有一些小改变按照例1（ⅱ）中所述方法纯化。
步骤1：BHK-21细胞的溶解并提取抗原gp160
解冻后，将细胞悬浮液（109细胞）在2200xg下离心15分钟并弃去上清液。细胞沉淀再悬浮在50ml添加有150mM NaCl、1%聚乙二醇300单癸基醚（Decgl PEG）和20mcg/ml抑酞酶的pH8的30mM Tris/HCl缓冲液中。将细胞在冰上用手随时摇动溶解一小时，在11300xg下离心15分钟。分离上清液后沉淀用20ml溶胞缓冲液洗涤并在11300xg下离心15分钟。弃去沉淀并将合并的上清液用于进一步纯化。
步骤2和3以及以后的分析都按例1（ⅱ）-（ⅸ）中所述的进行。
实施例3
gp160-3D-MPL疫苗制剂的制备
3（a） rgp160-氢氧化铝加3D-MPL
将由疫苗（例1）中纯化的rgp160（每份剂量100μg或20μg）在pH为6.8的1ml 150mM NaCl.10mM磷酸盐缓冲液中在相当于0.5μg当量Al3+的氢氧化铝（矾）上，在4℃条件下吸附过夜。培养过夜后，将佐剂制剂离心并弃去上清液。然后将含有100μg 3D-MPL的等体积吸附缓冲液加到结合矾的rgp160上。发现大于95%的rgp160是吸附在氢氧化铝上。
3（b）rgp160-3D-MPL的水包油乳化液
载体制备如下。将普卢兰尼克（Pluronic）L121 5%（BASF Wyandotte，New Jersey）（v/v）和10%角鲨烷（Aldrich）加到含有0.4%（V/V）吐温80的磷酸盐缓冲的盐水（PBS）中。然后将这混合物微流化。为了微流化，将乳化液通过一微流化器（Model M110 Microfluidics Corp.Newton.Mass.）循环10次。所得的乳化液仅含有亚微细粒。将一体积的这种乳化液与等体积的二次浓缩rpg160（20μg或100μg）混合并简单地进行涡流以保持组分完全混合。然后将100μg/ml 3D-MPL加到这rgp160 O/W乳化剂中。最终制剂在1ml注射液剂量中含有0.2%吐温80、2.5%Pluronic L121、5%角鲨烷、100μg，3D-MPL和rgp160（100μg或20μg）。
实施例4
在豚鼠中的免疫原性
ELISA和中和滴定度
对5个豚鼠免疫接种按月间隔注射3次在SAF-1（Syntex佐剂制剂-1）/（Byars NE和Allison A.C（1987）Vaccine 5：223-227）中的50μg改性gp160（实施例1）。在豚鼠第二次免疫接种后2星期和一个月以及第三次免疫接种2星期后进行血清测试。结果描述于表2。
基于HIV-1（Ⅲ-B）传染细胞的溶胞产物的俘获酶免疫测定（EIA）是用于测定第一次和第二次免疫接种后的抗血清的ELISA的滴定度。所用的试验是非常类似于Moore等人所发表的[Moore J.P.等人，1989，AIDS 3，155（63）]。
微量培养板中和测试是基于在指示细胞中HIV gag抗原的检测。简言之，SupT1细胞（Hecht等人，1984，Science 226，1445）是用作指示细胞。病毒种菌含有生产淋巴样细胞系的HIV-1（ⅢB）的无细胞上清液。上清液高速离心以除去细胞和细胞碎片，分装在1ml瓶中且在-80℃条件下贮存直到使用。要试验的血清在试验前在56℃条件下失活30分钟。我们的阴性对照含有由预免疫或只接种佐剂的动物的血清（与要测试的血清同一种类）样品。为中和，将750TCID50在37℃用系列二倍稀释的血清培养1小时。然后将SupT1细胞加入（4.104细胞/孔）并在37℃培养4天。细胞病变效应用显微镜监测，将Triton X-100（最终浓度1%）加到每一孔中并冷冻测试板。多层ELISA用于监测在培养基中所产生的病毒抗原的相对量。测试板用抗p55单克隆抗体涂层。上述Triton X-100处理过的样品在板中培养，并通过生物素化的HIV-1+人 IgGs。接着用抗生蛋白链霉素过氧物酶步骤观察gag抗原的存在。对全部测试的血清稀释液测定HIV-1抗原产品相对于对照的降低百分率。通过非线性最小二乘分析画出适合于数据点的曲线，与对照相比较，在抗原产品中降低50%的血清稀释（如任意的）是外推的。
表2列出了第三次免疫接种的中和抗体滴定度。
在第二次接种后所观察到的中和滴定度是超过由传染人所得血清中所发现的。更确切地说我们的对HIV ⅢB分离物的抗血清的中和滴定度是平均四倍高于在1组5个血清阳性WHO对照血清（McKeating等人，1989，J.Gen.Virol.70：3326-3333）中所观察到的。一系列HIV-1分离物的中和（交互中和）是由Dr.Weiss实验室（Chester Beatty Laboratories，U-K）测试的，它使用产生较低灵敏度和滴定度的更约束中和的试验进行的。描述于表3的结果在二个不同流出液的三个场合下都重复并表明各种含有非洲（African）菌株（CBL-4）的HIV-1菌株有良好的交互中和作用（见表3）。
由免疫接种疫苗gp160的豚鼠血清（例1）（01-05）表明在第三次免疫接种后有良好的交互中和滴定度。
由于在三次剂量后观察到强的交互中和应答，认为本发明的疫苗gp160对HIV-1接种有潜在性的用途。
实施例5
不同疫苗制剂对在猕猴中纯化HIV牛痘重组体gp160（ⅢB分离物）的免疫原性影响的研究
在这个研究中，不同疫苗制剂增强纯化牛痘重组体gp160（rgp160）的免疫原性的能力是在猕猴（Macaca mulatta）中检测。所试验的佐剂是结合3D-MPL（实施例2b）（3D单磷酰基脂质A，Ribi）的氢氧化铝（Alhydrogel，Superfos-Denmark）;3D-MPL是水包油乳液（实施例2a）。
猕猴（Macaca mulatta）重3.5～5Kg，随机分成7组，每组有3或4只动物。
各组按下面以不同剂量的rgp160配制成的三种佐剂配方进行免疫接种：
第1组（4只猴）：吸附在氢氧化铝+3D-MPL上的100μg rgp160。
第2组（4只猴）：吸附在氢氧化铝+3D-MPL上的20μg rgp160。
第3组（4只猴）：呈O/W乳化液的100μg rgp160+3D-MPL。
第4组（4只猴）：呈O/W乳化液的20μg rgp160+3D-MPL。
5.1 抗原-佐剂制备
全部rgp160制剂是在使用前制备。每个注射剂量是以1ml体积施药。
在第0天和35天各组猕猴在臂三头肌中肌肉注射各种gp160制剂的1ml剂量。在第二次免疫接种2星期后，将动物放血以测定抗体。
5.2 读出
在第二次注射后二星期从这些动物中取得的血清以ELISA和中和测定进行试验。
5.3 ELISA
使用了一种俘获免疫测定的改进方法，其一般方法描述于Thiriart等人发表的文章（Thiriart等人，1989，J.Immunol.148，6：832-1836）中。这个测定使用了一种商购的单一性抗gp41试剂，由Biochrom购得。将传染BHK21细胞的牛痘gp160的粗制溶胞产物用作抗原。
5.4 中和测定
微量培养板中和测定是基于检测指示细胞中的HIV gag抗原。简言之，将SupT1细胞（Hecht等人，1984，Science 226：1445）用作指示细胞。病毒接种物包括产生淋巴样细胞系的HIV-1（ⅢB）的无细胞的上清液。上清液高速离心以除去细胞和细胞碎片，分装在1ml瓶中，并在-80℃条件下贮存直到使用。要测试的血清在测试前在56℃条件下失活30分钟。阴性对照含有预免疫动物血清的收集物。为中和，将750TCID50在37℃用系列二倍稀释的血清培养1小时。然后将SupT1细胞加入（2.104细胞/孔）并在37℃培养4天。细胞病变效应用显微镜监测，将Triton X-100（最终浓度1%）加到每一孔中并冷冻试验板。使用多层ELISA以监测在培养基中所产生的病毒抗原的相对量。培养板用抗p55单克隆抗体涂层。上述Triton X-100处理过的样品在板中培养，并通过生物素化的HIV-1+人IgGs。接着通过抗生蛋白链霉素过氧物酶步骤看到有gag抗原存在。对全部所测试的血清稀释液测定HIV-1抗原生产相对于对照的降低百分率。通过线性回归分析使用适于数据点的曲线，与对照相比，在抗原生产中降低50%的血清稀释（如任意的）是外推的。
5.5 结果
表4列出了在第二次免疫接种后的ELISA和中和抗体。在3D-MPLO/W中的HIV rgp160的一般免疫原性是很好的。当对动物给药20μg gp160剂量时，在接受在3D-MPL O/W中的rgp160的动物组第4组中所观察到的中和滴定度（NT）和ELISA滴定度都是十分好的。这些数据提出了3D-MPL O/W乳化剂的优良佐剂效果。使用有3D-MPL存在下吸附在矾上的gp160免疫接种的动物的免疫应答虽然有些差，但产生了中和抗体。HIV gp160含有疏水部分，这使分子具有对脂质的高亲合性。对免疫体系HIV rgp160最好是通过使用含有3D-MPL的基于水包油的制剂而提供的。
实施例6
6.1 实验方案
二只黑猩猩（No.1、No.2）用实施例1的纯化牛痘重组体gp160（100μg/剂量）（rgp160）进行免疫接种。
二只黑猩猩（No.3、No.4）用在果蝇施奈德氏细胞（Schneider cells）（rgp120）（Culp等人，Biotechnology，9：173-177，1991）中所表达的纯化重组体gp120（100μg/剂量）进行接种。
重组体蛋白是用在O/W乳化液中的3D MPL（100μg/剂）配制。制剂含有0.2%吐温80、2.5%普卢兰尼克L121、5%角鲨烷、100μg 3D MPL和重组体抗原剂量（100μg rgp160或rgp120）;制成1ml体积的注射液。
在0月、1月和2月在动物腿中肌肉接种
动物在每隔二星期放血以通过ELISA和中和测试测定其抗体（见实施例4.3的Elisa方法）;HIV中和测试稍有改变，描述如下。以下所描述的，也测定了迟发型过微性应答（DTH）的诱导。
6.2 体液免疫的诱导
如表5所示，三次免疫接种后，接种以3D MPL O/W乳化液提供的rgp160或rgp120的黑猩猩产生高的ELISA和中和滴定度。中和活性在二次注射后4个中有3个血清可检出而在再一次注射后则4个中有4个可检出。在第3次免疫接种后观察到中和滴定度的增加。在这次注射后所测得的ELISA和中和滴定度十分类似于用同样rgp160制剂三次免疫接种的猕猴中所得的结果。
6.3 DTH的诱导
第三次免疫接种后二星期进行DTH试验，全部注射是在腹部给药，每次注射为100μl体积。
二只rgp160免疫接种的猩猩和2只rgp120处理的动物用3种不同抗原（rgp160、rgD26，破伤风类毒素）和2个对照缓冲液（rgD 2t对照缓冲液（PBS）和rgp160对照缓冲液）进行皮试。所测试的不同重组体抗原的剂量是：40、20或10μg的rgp160和20、10、或5μg的rgD2t。
以后通过测量皮肤厚度24小时监测DTH应答。结果示于图1-3。
无论用rgp160（图1）或用rgp120（图2）接种的动物中都能观察到对破伤风类毒素和rgp160的特异DTH应答。
这些结果表明，含有3D MPL水包油乳化剂的制剂都能诱导特异的T细胞应答（见表6）。
总之，在黑猩猩中所得结果清楚地表明，含有3D MPL的水包油乳化液的佐剂制剂明显地改进了在灵长类中体液（中和抗体）和居中的效应子细胞（DTH）的免疫应答。
中和测试
微量培养板中和测试是基于通过在指示细胞中HIV1传染而诱导的CPE的肉眼监测。简而言之，将SupT1细胞（Hecht等人，1984，Science 226，1445）用作指示细胞。病毒接种物包括产生淋巴样细胞系的HIV-1（ⅢB）的无细胞上清液。上清液高速离心以除去细胞和细胞碎片，分装在1ml瓶中，并贮存在-80℃条件下直到使用。要测试的血清在测试前在56℃失活30分钟。我们的阴性对照含有预免疫动物血清的收集物。为中和，将750TCID50在37℃条件下用系列二倍稀释的血清培养1小时。然后将SupT1细胞加入（2.104细胞/孔）并在37℃条件下培养4天。在第4天用显微镜监测细胞病变效应，并用眼目测中和滴定度。与预免疫对照相比较，所得的中和滴定度相当于给出80%降低合胞形成的血清稀释的倒数。在第七天通过在每孔中使用由Pauwels等人（J.Virol Method 20：309-321，1988）所描述的MTT测定法测量细胞生活力进一步提出了所目测的滴定度。在这测定中测得的滴定度再现了，与不传染细胞相比，给出80%防护CPE的血清稀释的倒数。由一个测定到另一个测定目测的和MTT测定的滴定度是很重现的，而且MTT测得的滴定度（未示出）都是2-4倍低于目测的结果。表 1 在CV-1和在BHK-21细胞中所表达的 HIV gp160的纯化
| 纯化步骤 | 体积(ml) | 总蛋白(mg) | 蛋白回收(%) | 抗原回收(%) |
| CV-1(1)溶胞晶状外源凝集素免疫亲合 | 140035060 | 20001008 | 10050.4 | 1008065 |
| BHK-21(2)溶胞晶状外源凝集素免疫亲合 | 148049560 | 26881137 | 10040.3 | 1007958 |
（1）：20l培养基作为原料
（2）：14l培养基（2.1×1010细胞）作为原料
表3
0.豚鼠血清对针对同源（Ⅲb）和异源分离物的gp160的中和活性
1.按目测阳性中和效应是90%抑制合胞体的形成
表 4 在猕猴中重组体牛痘gp160的免疫原性
| ELISA和中和滴定度15天 Ⅱ后 | ||||
| 组 | 佐剂／剂量 | 鉴定 | 50％NT* | ELISA**中点滴定度 |
| 1 | 矾3D MPL/100μg | IP 111IP 123IP 151IP 167GMT | 〈 100〈 100〈 100〈 100 | 576301411630460 |
| 2 | 矾3D MPL/20μg | IP 101IP 103IP 105IP 196GMT | 〈 100〈 100〈 100〈 100 | 18711641143794802 |
| 3 | 3D MPLOW100μg | IP 120IP 125IP 150IP 152GMT | 486282285918435 | 904355373981106296789 |
表 4（续） 在猕猴中重组体牛痘gp160的免疫原性
| ELISA和中和滴定度15天 Ⅱ后 | ||||
| 4 | 3D MPLOW20μg | IP 114IP 117IP 118IP 197GMT | 462576〈 100804322 | 54135220252952684404 |
＊与对照相比，相当于给出50%降低抗原产品的血清稀释的倒数。
＊＊相当于给出等于50%最大吸附量值（中点滴定度）的吸附量的血清稀释的倒数。
GMT＝几何平均滴定度
Claims (6)
1、制备改性HIV gp160蛋白的方法，其中在位置502和510分别提供的是除赖氨酸或精氨酸以外的氨基酸，方法包括在重组体真核宿主中表达编码所说蛋白的DNA顺序。
2、权利要求1所申请的方法，其中在位置502和510的氨基酸是选自组氨酸，苏氨酸，丝氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酰胺和谷氨酸。
3、权利要求1或2中任一个所申请的方法，其中在位置502和510上的氨基酸是谷氨酸。
4、改性gp160的寡聚体或二聚体的制备方法，其中在位置502和510上分别提供的是除赖氨酸或精氨酸以外的氨基酸，方法包括由一重组体宿主中分离改性蛋白并在非还原条件下纯化。
5、一种疫苗或药物组合物的制备方法，包括将一种改性gp160，其中在位置502和510分别提供的是除赖氨酸或精氨酸以外的氨基酸，或其寡聚形式，和一种药物可用载体相混合。
6、一种疫苗或药物组合物的制备方法，包括将gp160或其免疫衍生物，3D单磷酰基脂质A和一种药物可用载体相混合。
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