HUT67011A - Derivatives opf gp160 and vaccines based on gp160 or a derivative thereof, containing an adjuvant - Google Patents
Derivatives opf gp160 and vaccines based on gp160 or a derivative thereof, containing an adjuvant Download PDFInfo
- Publication number
- HUT67011A HUT67011A HU9302642A HU264293A HUT67011A HU T67011 A HUT67011 A HU T67011A HU 9302642 A HU9302642 A HU 9302642A HU 264293 A HU264293 A HU 264293A HU T67011 A HUT67011 A HU T67011A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- vaccine
- hiv
- oligomer
- modified
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 48
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 title description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 27
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 21
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 21
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 16
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 34
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 34
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 34
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 17
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 9
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 8
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 8
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 7
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 6
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 6
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 6
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 6
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 4
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 4
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 4
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 4
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 4
- LTSWUFKUZPPYEG-UHFFFAOYSA-N 1-decoxydecane Chemical compound CCCCCCCCCCOCCCCCCCCCC LTSWUFKUZPPYEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710112523 GDP-mannose transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 3
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920002556 Polyethylene Glycol 300 Polymers 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- -1 dTTP nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 229940068886 polyethylene glycol 300 Drugs 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 241000255597 Drosophila hydei Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000255896 Galleria mellonella Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WOMUDRVDJMHTCV-DCAQKATOSA-N Glu-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WOMUDRVDJMHTCV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000957351 Homo sapiens Myc-associated zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O CLBGMWIYPYAZPR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102100038750 Myc-associated zinc finger protein Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000003622 anti-hsv Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- QUSQOXBLTWQHMU-UHFFFAOYSA-H dialuminum hexahydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3].[Al+3] QUSQOXBLTWQHMU-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000003669 immune deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000017960 syncytium formation Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
A találmány tárgya olyan új vakcina és gyógyszerkészítmény, valamint ezek előállítására szolgáló eljárás, amelyek az AIDS kezelésére alkalmazhatók. A találmány közelebbről gpl60-t vagy annak származékát, beleértve a gpl60 új formáit is, és 3D monofoszforil lipid A adjuvánst tartalmazó vakcinákra vonatkozik.
A retrovírusok - azaz a Retroviridiae családba tartozó nagyszámú vírus - burokkal, a mag struktúráján belül feltekeredett nukleokapsziddal rendelkező ikozohedrális, mintegy 150 nm méretű vírusok, amelyek genetikai anyagként RNS-t tartalmaznak. Ebbe a családba tartoznak az onkovírusok, mint pl. a szarkoma és leukémia vírusok, bizonyos immunhiányos betegséget okozó vírusok és a lentivírusok is.
Az 1. típusú humán immunhiányos betegséget okozó vírus (HIV-1) a szerzett immunhiányos szindróma, más néven AIDS kórokozója. E retrovírus komplex genetikai szerveződéssel rendelkezik, beleértve a hosszú terminális ismétlődéseket (LTR-ek) , a gag, pol és env géneket és más géneket. E retrovírus különböző virális antigéneket hordoz, amelyek önmagunkban vagy vakcinák hatóanyagaként képesek lehetnek védő immunválasz kiváltására.
A HIV-1 burokprotein poliprotein prekurzor formájában szintetizálődik, amely a megfertőzött sejten belül később glikozileződik, és így egy 160 kDa molekulatömegű glikoproteint (gpl60) képez, amely proteolízissel gpl20 külső glikoproteinre és gp41 transzmembrán proteinre bomlik.
A provirális HIV-hez tartozó DNS kódoló terület a szakirodalomban ismertetett számos, immunhiányos betegséget okozó vírus genomiális kiónjainak bármelyikéből előállítható. Lásd például Shaw et al., Science, 226, 1165 (1984); Kramer et al., Science, 231, 1580 (1986). Egy immunhiányos betegséget okozó vírus genomiális kiónja klinikai minták vírus- izolátumaiból is előállítható ismert DNS klónozó technikával. Lásd például Gallo et al., 4 520 113 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, Montagnier et al., 4 708 818 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.
A HIV-BH10-2 provirális DNS-szekvenciáját Ratner et al., Hunan Retroviruses and AIDS” 1989, HÍV Sequence Database, kiadó: Gerald Meyers, Los Alános National Laboratory helyen ismertetik. A szekvencia 8932 bp hosszúságú, az env gén az 5580-8150 helynél helyezkedik el, és hasítási helyeket tartalmaz a 7088 és 7112 helynél, amelyek az 503. és 511. aminosavnak felelnek meg (hasítás ezen maradékok után) (a Los Alamos adatbázis szerinti számozás) .
A találmány szerint olyan HÍV gpl60-t állítunk elő, amelynek aminosav-szekvenciáját úgy módosítottuk, hogy az 502. és 510. helynél egymástól függetlenül lizintől, illetve arginintől eltérő aminosavat tartalmazzon.
Lizin helyett előnyösen olyan aminosavakat építünk be, amelyek hidrofilitás és méret szempontjából hasonlóak a lizinhez, ilyenek például a hisztidin, treonin, szerin, aszparagin, aszparaginsav, glutamin és glutaminsav. Ezek közül előnyös a glutaminsav. Az előnyös protein a bevezetett mutációk következtében nem hasítható és keresztreagáló antitest termelését tudja megindítani, ami a protein helyes hajtogatódásától függ.
Közelebbről a találmány szerint módosított proteint állítunk elő oligomer formában, különösen 640 kDa molekulatömeggel rendelkező formában. A gpl60 monomer molekulatömege alapján feltételezhető, hogy ez tetramer forma. Ez előnyös, mivel a vírus felületi proteinek természetes formában oligomerekként léteznek, amelyek in vivő beékelődéseket képeznek, és amelyek kiugranak a vírus felületéről. Minthogy sok semlegesítő epitop egyezik, nyilvánvalóan fontos, hogy a lehető legjobban megközelítsék az antigén természetes formáját, mivel így lehet a legmegfelelőbb immunválaszt nyerni.
A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a találmány szerinti módosított proteint lényegében véve tiszta, oligomer formában állítjuk elő.
A lényegében véve tiszta formán 75 %-os, előnyösen 90 %-os, még előnyösebben 99 %-os tisztaságot értünk.
A találmány tárgya továbbá eljárás módosított HÍV gpl60 előállítására oly módon, hogy az említett módosított proteint kódoló DNS-t egy rekombináns eukarióta gazdasejtben kifejezzük, és a termelt módosított proteint kinyerjük.
A módosított proteint kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmazó DNS-polimer szintén a találmány tárgykörébe tartozik.
A találmány szerinti rekombináns DNS molekula a találmány értelmében úgy állítható elő, hogy a megfelelő mono-, di- és/vagy oligomer nukleotid egységeket kondenzáljuk.
Az előállítást végezhetjük kémiai vagy enzimatikus úton vagy a kettő kombinálásával, in vitro vagy in vivő, * · · · ·
- 5 ahogyan alkalmas. így a DNS molekula előállítható a megfelelő DNS fragmensek enzimes ligálásával, szokásos módszerrel, így például a D.M. Roberts et al., Biochemistry 24, 50905098 (1985) irodalmi helyen ismertetett módszerrel.
A DNS fragmenseket előállíthatjuk a kívánt nukleotid-szekvenciákat tartalmazó DNS alkalmas restrikciós enzimekkel végzett emésztésével, kémiai szintézissel, enzimatikus polimerizációval vagy e módszerek kombinációjával.
A restrikciós enzimekkel végzett emésztést alkalmas pufferben, 20 °C és 70 °C közötti hőmérsékleten, általában 50 μΐ vagy ennél kisebb térfogatban, 0,1-10 μφ DNS alkalmazásával hajtjuk végre.
A DNS enzimatikus polimerizációját DNS-polimeráz, például DNS-polimeráz I (Klenow fragmens) segítségével, a szükséges dATP, dCTP, dGTP és/vagy dTTP nukleozid-trifoszfátokat tartalmazó alkalmas pufferben, 10 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten, általában 50 μΐ vagy ennél kisebb térfogatban in vitro hajtjuk végre. A fragmensek Taq polimeráz segítségével polimeráz láncreakcióval polimerizálhatok és amplifikálhatók [lásd PCR Protocols 1989 - A Guide to Methods and Applications, kiadó: M.A. Innis et al., Academic Press].
A DNS fragmensek enzimatikus ligálását DNS-ligáz, például T4 DNS-ligáz segítségével, alkalmas pufferben, 4 °C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten, általában 50 μΐ vagy ennél kisebb térfogatban végezzük.
Az alkalmas puffer kifejezésen a gyártó vagy forgalmazó cég által javasolt puffért értjük.
A DNS molekula vagy fragmensei kémiai szintézisét szokásos foszfodiészter-, foszfit- vagy foszforamidit-módszerrel, szilárd fázisú technikával végezzük, például a következő irodalmi helyeken ismertetett módszerek valamelyikével: Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (kiadó: H.G. Gassen és A. Láng), Verlag Chemie, Weinheim (1982); M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M.
Singh, B.S. Sproat, R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 10, 6243 (1982); B.S. Sproat és W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 24, 5771 (1983); M.D. Matteucci és M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 21, 719 (1980); M.D. Matteucci és M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 103, 3185 (1981); S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 105, 661 (1983); N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus és H. Koester, Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984); H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 3, 801 (1984). Előnyösen automata DNS-szintetizátort alkalmazunk.
A módosított proteint kódoló DNS polimer a nemmódosított proteint kódoló cDNS helyre irányuló mutagenezisével, szokásos módszerrel állítható elő, így például a következő helyeken ismertett módszerek valamelyikével: G. Winter et al., Natúré, 299, 756-758 (1982); Zoller és Smith, Nucl. Acids. Rés., 10, 6487-6500 (1982).
A találmány tárgykörébe tartozik továbbá a találmány szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazó vektor és az említett vektort tartalmazó vírusból készült rekombináns vakcina.
A vektor a találmány értelmében úgy állítható elő, hogy egy vektort hasítunk, így egy intakt replikont tártál• ·
- 7 mazó lineáris DNS-szegmenst kapunk, majd a kapott lineáris szegmenst és egy vagy több olyan DNS molekulát ligálunk, amely(ek) kiegészítik a találmány szerinti rekombináns DNS molekulát.
A találmány szerinti rekombináns gazdaszervezetet úgy állítjuk elő, hogy egy vakcina vírust egy találmány szerinti vektorral transzformálunk.
A kapott módosított protein terméket a tenyészközegből szokásos protein-izolálási és -tisztítási technikákkal választjuk el. Detergensként például Decyl PEG-300, DO Decyl PEG, Triton X100 valamelyikét alkalmazhatjuk. A sejtek lizálása és a módosított protein sejtmembrán-törmeléktől való megtisztítása érdekében Thesit dezoxikolátot adagolhatunk. Ezek közül a Decyl PEG-300 és a Thesit dezoxikolát előnyös. A módosított proteint azután ultraszűrési, ultracentrifugálási, például ammónium-szulfáttal vagy PEG-gel végzett szelektív kicsapási, CsCl vagy szacharóz vagy metrizamid gradiensen végzett sűrűséggradiens centrifugálási és/vagy kromatograf álási , például affinitás kromatográfiás, előnyösen immunaffinitás kromatográfiás, HPLC, reverz fázisú HPLC, kation- és anioncsere, méretkizárásos kromatográfiás és preparatív izoelektromos fókuszálás! lépések sorozatával tisztíthatjuk. Előnyösen immunaffinitást hasznosító kromatográfiát végzünk. A tisztítás során vagy azt követően a módosított proteint a stabilitás vagy immunogenitás fokozására például formaldehiddel, glutáraldehiddel vagy NAE-val kezelhetjük.
• · · · · * • · ·« ··· · ««««· · ··
A találmány szerinti oligomer forma előállítására a tisztítási lépések során előnyösen enyhe körülményeket alkalmazunk. Különösen redukáló ágensek használatát kell elkerülni, és a sejtlizálás és a kromatográfiás lépések során végzett szolubilizálás során ionos detergensekkel szemben nemionos detergensek, például Decyl PEG 300 [poli(etilénglikol 300)-monodecil—éter] alkalmazása előnyös. Affinitáskromatográfiás közegként előnyösen lencse lektin Sefarose-t, míg immunaf f initás-kromatográf iás közegként előnyösen alkalmas hordozóval, például glutáraldehiddel aktivált Trisacryl-lal (IBF) kapcsolt anti-gpl60 monoklonális antitestet, például 178.1-t (WO 90/06358) alkalmazunk.
A módosított proteint a monoklonális antitesttől oktil-glukopiranozid detergens jelenlétében adszorpcióval választjuk el, a detergens dialízissel eltávolítható. A detergenseket előnyösen elméleti kritikus micella-koncentrációjuknál magasabb koncentrációban alkalmazzuk.
A találmány szerinti eljárással előállított módosított protein alkalmazható diagnosztikai szerként HIV-nek való kitettség detektálására. A módosított protein alkalmazható továbbá vakcinákban a fertőzés megelőzésére vagy a betegség kifejlődésének gátlására vagy megelőzésére.
A találmány továbbá a találmány szerinti módosított proteint tartalmazó vakcinákra és gyógyszerkészítményekre vonatkozik. Az ilyen készítmények a találmány szerinti módosított protein immunprotektív mennyiségét tartalmazhatják és szokásos módszerekkel állíthatók elő.
A találmány szerinti vakcinákban közvetlenül a protein vizes oldatát alkalmazhatjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a proteint - előzetes liofilizálás után vagy anélkül - valamely ismert adjuvánssal keverjük vagy abszorbeálhatjuk. Ilyen adjuvánsok lehetnek például az alumínium-hidroxid, muramil-dipeptid és szaponinok, pl. a Quil A, 3D-MPL (3-dezacetilezett monofoszforil lipid A) és a TDM. Eljárhatunk továbbá úgy is, hogy a proteint mikrorészecskékbe, például liposzómába kapszulázzuk. Egy még további módszer szerint eljárhatunk úgy, hogy a proteint egy immunstimuláló makromolekulával, például elölt Bordetella sejtekkel vagy tetanusz toxoiddal konjugáljuk.
A vakcinák készítésének általános ismertetése található például a New Trends and Developments in Vaccines c. műben (kiadó: Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978) . A liposzómába történő kapszulázást ismerteti például a 4 235 877 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. A proteinek makromolekulákhoz történő konjugálását ismerteti például a 4 372 945 és a 4 474 757 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás .
A találmány szerinti módosított protein vakcina dózisonként alkalmazott mennyiségét úgy választjuk meg, hogy az szignifikáns mértékű káros mellékreakciók indukálása nélkül immunprotektív választ váltson ki. Ez a mennyiség attól függ, milyen adott immunogént alkalmazunk, továbbá a vakcina adjuvált-e vagy sem. Általában dózisonként 1-1000 Mg, előnyösen 10-200 Mg módosított proteint alkalmazunk. Az adott
- 10 vakcinában alkalmazandó optimális mennyiséget szokásos módszerekkel, például antitest-titer és más, a kezelt személyben kiváltott válasz alapján határozhatjuk meg. A kezelt személyeknek a kezdő vakcinálás után kb. négy héttel, majd a fertőzés veszélyének fennállásáig minden hatodik hónapban további emlékeztetőt adhatunk.
A találmány tárgya továbbá a találmány szerinti módosított protein alkalmazása vakcina előállítására, valamint vakcinálásra.
A találmány szerinti gyógyszerkész ítmény ek - amellett, hogy HÍV fertőzésre érzékeny személyek vakcinálására alkalmazzuk - alkalmazhatók HÍV fertőzésben szenvedő betegek immunterápiás kezelésére is.
Ennek megfelelően a találmány tárgya továbbá eljárás HÍV fertőzésre érzékeny vagy abban szenvedő személyek kezelésére, aminek során a találmány szerinti módosított gpl60 hatékony mennyiségét adagoljuk.
A rekombináns DNS technikával előállított alegységkomponensek hasznosításának elképzelésével egybeesőén szükség van olyan adjuvánsokra és/vagy hordozókra, amelyek az immunogéneket hatékonyan képesek a kezelt személy immunrendszerének bemutatni úgy, hogy az immunválaszok mindkét formája (az antitest semlegesítése és az effektor sejtek által közvetített immunitás - DTH) kiváltódjék. A találmány szerinti megoldás (azaz a HÍV fertőzések profilaxisa és terápiás kezelése) kidolgozása kapcsán felismertük, hogy egy immunstimuláló csoport, a 3D-MPL képes az immunrendszer mindkét irányú stimulálására.
Ennek megfelelően a találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint olyan gyógyszerkészítményt: állítunk elő, amely gpl60-t vagy annak immunológiailag egyenértékű származékát és hordozóként 3D monofoszforil lipid A-t (3D-MPL) tartalmaz.
A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a gpl60-t vagy annak immunológiáilag egyenértékű származékát és a 3D-MPL-t olaj-a-vízben emulzió formájában készítjük el. Ez a rendszer fokozott semlegesítő aktivitással rendelkezik.
Ennek megfelelően a találmány értelmében olyan gyógyszerkészítményt, illetve vakcinát állítunk elő, amely gpl60-t vagy annak immuno lóg iái lag egyenértékű származékát és 3D-MPL-t tartalmaz olaj-a-vízben hordozóban, ahol a hordozó egy tetrapoliol és egy nemtoxikus ásványi olaj pufferolt sóoldattal készült emulziója.
A hordozó előnyösen Pluronic poliolt, így például Pluronic L121-t és squalane-t vagy squalene-t vagy más metabolizálható olajat tartalmaz. Az emulzió stabilizálására egy emulgeálőszert, például Tween 80-t vagy Tween 28-t is adagolhatunk.
A hordozó előnyösen csak mikronos méretűnél kisebb, 100 és 400 nm közötti részecskéket tartalmaz.
A végső készítményben az antigén koncentrációja előnyösen 10 Mg/ml és 150 Mg/ml közötti, még előnyösebben 20 Mg/ml és 100 pg/ml közötti.
Az adjuváns koncentrációja a vakcinában előnyösen 10
Mg/ml és 100 Mg/rol közötti, még előnyösebben 25 pg/ml és 50 • · · · *
- 12 ug/ml közötti.
A találmány tárgya továbbá eljárás a vakcinák alkalmazására a gyógyítás terén, különösen HIV-1 fertőzések, AIDS vagy AIDS-szel kapcsolatos komplex betegség (ARC) immunterápiás és profilaktikus kezelésében.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan vakcina előállítására, amely gpl60-t vagy annak immunológiailag egyenértékű származékát, 3D monofoszforil lipid A-t tartalmaz alkalmas hordozó mellett. Az eljárás abban áll, hogy a gpl60-t vagy annak immunológiailag egyenértékű származékát keverjük a hordozóval és 3D monofoszforil lipid A-val.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vakcinát olaj-a-vízben hordozóval állítjuk elő, ahol az olaj-a-vízben emulziót mikrofluidizáljuk, így az emulzió mikronnál kisebb részecskéit állítjuk elő, és ezt gpl60-nal vagy annak immunológiailag egyenértékű származékával és 3D-MPL-lel keverjük.
A 3D-MPL-t rendszerint előre elkeverjük az emulzióval, és az így kapott elegyhez keverjük hozzá az antigént.
A 3D-MPL-t a 2 211 502 sz. nagy-britanniai szabadalmi leírás szerinti módon állítjuk elő.
A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösek az olaj-a-vízben típusú emulziós hordozók. A találmány szerinti készítmények a szokásos vakcinakészítményekhez viszonyítva, amelyek adjuvánsként önmagában csak alumínium-hidroxidot alumot (az egyetlen humán adjuvánsként engedélyezett adjuvánst) tartalmaznak, fokozott semlegesítő titert biztosítanak.
• · « · 4 • 4 ··
4· ·«·· •· · · ,4 444*♦
- 13 A ·'immunológiai lag egyenértékű származék kifejezésen a gpl60 olyan immunogén fragmenseit értjük, amelyek 3D monofoszforil lipid A-val adjuválva képesek HIV-1 elleni semlegesítő antitestek termelésének megindítására. Ilyenek például a HIV-1 külső membrán glikoprotein gpl20, a korábbiakban ismertetett módosított gpl60, valamint a természetben előforduló izolált gpl60. Különösen előnyösek azok a származékok, amelyek DTH választ is képesek kiváltani.
így a találmány legelőnyösebben a protein módosított formájának olígomer formájára vonatkozik, amely enyhe, nemredukáló körülmények között végzett tisztítás után 600-700 kDa, előnyösen 640 kDa látszólagos molekulatömeggel rendelkezik, és amely feltehetően a tetramer forma. A tetramer úgy bontható, hogy a proteint SDS gélen nemredukáló körülmények között futtatjuk, így egy 330 kDa molekulatömegű dimert és monomert kapunk. A dimer azután standard redukáló körülmények között monomerré redukálható.
A gpl60 összes fenti formája alkalmazható a találmány szerinti készítményekben.
A gpl60-t és származékait ismert módon állíthatjuk elő. Rendszerint úgy járunk el, hogy a gp!60-t kódoló gént egy alkalmas gazdaszervezetben klónozzuk és kifejezzük. A rekombináns gpl60 (rgpl60) ilyen előállítását a Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 c. műben ismertetett módon végezzük.
A rekombináns DNS molekulák kifejezésére számos eukariota sejt és expressziós rendszer áll rendelkezésre. Ezek közül a legszélesebb körben az élesztő, rovar és emlős rend14 szereket alkalmazzák, a találmány szerinti megoldást azonban nem kívánjuk ezekre korlátozni. Ezek a rendszerek a találmány szerinti rekombináns DNS molekulát, adott esetben egy szelekciós markert és néhány esetben fenntartási funkciókat, így replikációs origót tartalmaznak.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazható rovarsejtek például a Drosophila és Lepidoptera sejtek. Alkalmas Drosophila sejtek az SÍ, S2, S3, KC-0 és a D. hydei sejtek. Lásd például Schneider et al., J. Embryol. Exp. Morph. , 27, 353 (1972); Schulz et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,
9428 (1986); Sinclair et al., Mól. Cell. Bioi., 5, 3208 (1985) .
A Drosophila sejteket ismert módon, így például kalcium-f oszfátos kicsapásos, sejtfúziós, elektroporációs vagy vírus átfertőzéses módszerrel átfertőzzük. A sejteket ismert sejttenyésztő módszerekkel tápközegen, így például M3 tápközegen tenyésztjük, amely kiegyensúlyozott sókat és esszenciális aminosavakat tartalmaz. Lásd például Lindquist, DIS, 58, 163 (1982).
A Drosophilában alkalmazható promoterek például az emlős sejt promoterek, így az SV4 0, valamint a Drosophila promoterek, ez utóbbiak az előnyösek. Alkalmazható Drosophila promoterek például a Drosophila metallotionein promoter, a 7 0 kDa hősokk protein promoter (HSP70) és a COPIA LTR. Lásd például DiNocera et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 80, 7095 (1983); McGarry et al., Cell, 42, 903 (1985).
Alkalmas Lepidoptera sejtek például a Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda, Heliotis zea, Autographica cali « · * 9 · « · ·· ··· ♦ ··· · · * ·· , «« ««· · fornica, Rachiplusis ou, Galleria melonella, Manduca sexta vagy más olyan sejtek, amelyek Baculovírusokkal, például nukleáris polihedrózis vírussal (NPV), egyszeres nukleokapszid vírussal (SNPV) vagy többszörös nukleokaposzid vírussal (MNPV) fertőzhetők. Előnyös Baculovírusok az NPV és az MNPV, mivel ezek tartalmazzák a polihedrin gén promotert, amely nagymértékben fejeződik ki fertőzött sejtekben. Az alábbiakban részletesen ismertetjük az Autographica californica MNPV vírusát (AcMNPV). Más MNPV vagy NPV vírus is alkalmazható azonban, így a selyemhernyó, Bombyx móri vírusa. A Lepidoptera sejteket a találmány szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazó DNS-sel és fertőző Baculovírus DNS-ével ismert módon átfertőzzük. A sejteket ismert sejttenyésztő módszerekkel különböző tápközegeken, például 10 % borjúembrió-szérummal (FCS) kiegészített TC100 tápközegen [Gibco Europe; Gardiner et al., J. Inverteb. Pathol. 25, 363 (1975)] tenyésztjük. Lásd Miller et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, 8. kötet, 277-298. oldal (kiadó: Setlow et al., New York, Plenum, 1986).
A Lepidoptera sejtekben promoterként Baculovírus genom promoterjeit használhatjuk. Előnyös a polihedrin gén promotere, mivel a polihedrin protein a természetben nagyobb mértékben fejeződik ki, mint más Baculovírus proteinek. Előnyös az AcMNPV vírus polihedrin génjének promotere. Lásd Summers et al., TAES Bull. NR 1555, 1987; EP-A-127 839; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985); és EP-A-228 036.
Emlőssejtekben való kifejezéshez a rekombináns DNS • * · ·
- 16 molekulát hasonlóképpen klónozzuk egy klónozó vektorban, majd az emlőssejtek átfertőzésére használjuk. A vektor előnyösen további DNS funkciókat tartalmaz a gén-amplifikáláshoz, így egy DHFR kazettát, továbbá tartalmazhat további funkciókat a szelekcióhoz és/vagy az amplifikáláshoz, így például egy neoitiicin rezisztencia kazettát a G418 szelekciójához. További funkciókat, így például transzkripciós enhanszert szintén alkalmazhatunk. A vektor kívánt esetben tartalmazhat továbbá más, a stabil episzomális fenntartáshoz szükséges funkciókat is, így például szarvasmarha Papillomavírus fenntartási funkciókat. A klónozó vektor előnyösen egy rekombináns emlős vírus lehet, így például vakcíniavírus.
A vakcíniavírus különösen alkalmas vektor, mivel a rekombinánsok egyszerűen konstruálhatok úgy, hogy az idegen gént a vakcínia DNS-ének nemesszenciális területébe integráljuk, így annak fertőzőképessége megmarad. Ha manipuláció sikeres volt, a proteinek Szintetizálódnak, processzálódnak és a fertőzött sejt membránjához szállítódnak. Bár a vakcíniavírus-fertőzés a sejt pusztulásához vezet, kismértékű lízis következik be, és a sejtek többsége érintetlen marad, ami lehetővé teszi, hogy a kívánt proteint a fertőzött sejtekből könnyen extraháljuk. A vakcínia kifejezőrendszert Barrett és munkatársai dolgozták ki [Aids Research and Humar. Retroviruses, 5, 159-171 (1989)].
Alkalmas emlős sejtek a kínai hörcsög petesejt (CHO), NIH3T3, COS-7, CV-I, BHK-21, egér vagy patkány mieloma, HAK, Verő, HeLa, humán diploid sejtek, így például MRC-5 és WI38, továbbá csirke limfoma sejtvonalak. Előnyös a CV-I <···** · « ·· « · «· *♦» · ····· · · · 9 ·« ···*·
- 17 és a BHK-21.
Az átfertőzést és a sejttenyésztést ismert módszerek szerint végezzük. Az emlős sejtek termelése transzgenikus állatokban történő kifejezéssel is végezhető.
A génkifejeződés emlős sejtvonalakban vagy emlős primer sejtekben történő irányítására használható regulátor szekvenciák például az SV40 korai és késői gén promoterek, a metallotionéin promoter, vírus LTR-ek, így például a Rous szarkoma LTR, a Moloney szarkoma vírus (MSV) LTR vagy az egér emlőtumor vírus (MMTV) LTR, továbbá az adenovírus nagy késői promotere és hibrid promoterek, így például egy hibrid BK vírus és adenovírus nagy késői promoter. A kontrollelem régiók szintén tartalmazhatnak lefelé elhelyezkedő funkciókat, így például poliadenilezési régiókat, vagy más funkciókat, így például transzkripciós enhanszer szekvenciákat.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható élesztők például a Hansenula, Pichia, Kluveromyces, Schizosaccharomyces, Candida és Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztők. Előnyösen Saccharomyces cerevisiaet. alkalmazunk. Alkalmas promoterek a rézzel indukálható (CUP1) promoter, glikolitikus gén promoterek, például TDH3, PGK és ADH, valamint PHO5 és ARG3 promoterek. Lásd Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1 (1983); Mellor et al., Gene, 24, 1 (1983); Hitzeman et al. , Science, 219, 620 (1983); Cabezon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6594 (1984).
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.
·♦··
1. példa (i) Módosított qp!60 kifejezése CV-I sejtekben
A BH10 molekuláris klón HÍV env génjét mutagenizáltuk a prekurzor hasításának megszüntetésére.
E célból a Lys-Alá-Lys-Arg és Arg-Glu-Lys-Arg hasítási szekvenciák-at helyspecifikus mutagenezissei módosítottuk:
1. hasítási hely 2. hasítási hely (502. hely) (510. hely)
| BH10 | AAG | GCA | AAG | AGA | AGA | GTG | GTG | CAG | AGA | GAA | AAA | AGA |
| klón: | Lys | Alá | Lys | Arg | Arg | Val | Val | Gin | Arg | Glu | Lys | Arg |
| mutáltuk: | 1 | 1 | 1 | |||||||||
| AAG | GCA | GAG | AGA | AGA | GTG | GTG | CAG | AGA | GAA | GAA | AGA | |
| Lys | Alá | Glu Arg | Arg | Val | Val | Gin | Arg | Glu | Glu | Arg |
A teljes mutagenizált env gént (5802-8478 nukleotidok) klónoztuk a pGS20 vakcínia plazmid transzfer vektorba [Mackett M.G. , Smith L. és Moss Β. , J. Virology, 49, 857-864 (1984)], és rekombinációval fertőző vakcíniavírusba vittük be. A rekombináns vakcínia plakkokat env-kifejeződésre nézve átvizsgáltuk EIA-val, és a pozitív plakkokat kétszer újraklónoztuk CV-I sejtekben. A nemhasított gpl60 termelését ezekben a sejtvonalakban RIPA-val igazoltuk a rekombináns vakcíniákkal fertőzött sejtek metabolikus jelzésével. A sejtfelületi kifejezést az érintetlen sejtek felületének anti-gpl20 antitestekkel való fluoreszcens jelzésével igazoltuk.
• ·· ·*
- 19 (ii) A módosított gpl60 tisztítása Anchorage-függő sejtekből
Az (i) pont szerinti módon kapott HÍV gpl60 burokproteint egy háromlépéses eljárással tisztítottuk: a gazdasejteket lizáltuk, az antigént egy detergenssel extraháltuk, majd kétszer affinitás-kromatográfiának vetettük alá. A tisztítási lépéseket 4 ’C-on hajtottuk végre.
1. lépés: a CV-1 sejtek lízise és a gp!60 antigén extrakciója
Felolvasztás után 2Q 1 tenyészetnek megfelelő sejtszuszpenziót és mikrohordozó gyöngyöket 2200 g-vel 15 percig centrifugáltunk, és a felülúszót elöntöttük. A csapadékot 1
1, 150 mmol/1 nátrium-kloriddal, 1 tömeg% polietilénglikol 300 monodeciléterrel (Decyl PEG) és 20 Mg/ml aprótinnal kiegészített 30 mmol/l-es Tris-HCl (pH=8) pufferben újraszuszpendáltuk. A sejteket 1 óra hosszat jégen tartva és időnként kézzel felrázva lizáltuk, majd 11 300 g-vel 20 percig centrifugáltuk. A felülúszó elválasztása után a csapadékot 400 ml lizáló pufferrel mostuk, és 11 300 g-vel 20 percig centrifugáltuk. A sejtmaradékokat és a mikrohordozó gyöngyöket eldobtuk, és az összesített felülúszókat tovább tisztítottuk.
2. lépés: affinitás-kromatográfia lencse-lektines Sepharose
4B oszlopon
A fenti lizátumot 150 mmol/1 nátrium-kloriddal és
0,1 tömeg% Decyl PEG-gel kiegészített, 30 mmol/l-es Tris-HCl * ·* ··»· ·· • · · · · * • · ·· ··· · ···· · · · · · • ·· ··· ··
- 20 (pH=8) pufferrel kiegyenlített lencse-lektines Sepharose 4B oszlopon (2,5 cm x 20 cm; Pharmacia-LKB gyártmány) kromatograféltük. Miután a lizátumot 1 ml/perc sebességgel felvittük, az oszlopot 1 mol/l-es nátrium-kloriddal és 0,1 tömeg% Decyl PEG-gel kiegészített, 30 mmol/l-es Tris-HCl (pH=8) pufferrel mostuk. Ezután az antigént az oszlopról 0,5 mol/1 metil-a-D-mannopiranozidot tartalmazó kiegyenlítő pufferrel eluáltuk, és a gpl60-ra nézve pozitív frakciókat összegyűjtöttük. A mosást és eluálást 5,5 ml/perc átfolyási sebességgel végeztük.
3. lépés: irmunaff initás-kromatoqráf ia 178.1-triszakrilon Anti-gpl60 monoklonális antitest 178.1-t (lásd
WO 90/06358 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés) aszciteszből tisztítottuk protein G-Sepharose oszlopon (Pharmacia-LKB gyártmány) , majd glutáraldehiddel aktivált triszakrillái (IBF gyártmány) kapcsoltuk a gyártó cég útmutatása szerint. Az antitestet, amely a V3 hurok antigén gpl20 részén levő epitop ellen irányul, 1,5 mg/ml-gél sűrűségnél kapcsoltuk.
A gyantát egy 2,5 cm x 10 cm méretű oszlopba töltöttük, és 150 mmol/1 nátrium-kloriddal és 0,1 tömeg% Decyl PEG-gel kiegészített 30 mmol/l-es Tris-HCl oldattal kiegyenlítettük.
A lencse-lektines Sepharose 4B oszlopról kapott eluátumot egy éjszakán át 1 ml/perc sebességgel cirkuláltatva az oszlopra töltöttük. Ezután az oszlopot 3,3 ml/perc sebességgel 20 oszloptérfogat mennyiségű 30 mmol/l-es Tris-HCl :
- 21 (pH=S) pufferrel mostuk, a puffért 1 mol/1 nátrium-kloriddal és 1 tömeg% n-oktil-B-D-glükopiranoziddal (OGP) egészítettük ki. Végül az antigént ugyanilyen sebességgel adagolt, 1 tömeg% OGP-vel kiegészített 0,1 mol/l-es citromsav-pufferrel (pH=3,3) eluáltuk. Az eluált frakciókat azonnal semlegesítettük 1 mol/l-es Tris-HCl (pH=8,8) pufferrel, és az antigénre nézve pozitív frakciókat összegyűjtöttük.
( ii i) A protein meghatározása
A protein koncentrációját Bradford módszerével (Bradford, 1976) határoztuk meg, standardként szarvasmarha szénimalbumint alkalmaztunk.
(ív) Az antigén meghatározása
A gpl60 antigén mennyiségét juh anti-gp41-t mint kötő monoklonális antitestet és rágcsáló anti-gpl20-t mint indikátor monoklonális antitestet tartalmazó szendvics ELISA segítségével mértük. A detektálást klasszikus biotinilezett anti-egér antitest - streptavidin - peroxidáz rendszerrel végeztük.
(v) Poliakrilamid-gél elektroforézis és Westernfoltképzés
SDS-gél lapon történő elektroforézist végeztünk %-os poliakrilamid gélen Laemmli módszerével (Laemmli,
1970) . Vándorlás után a proteineket periodikus oxidálás után végzett ezüst-festéssel tettük láthatóvá (PAS-festés) (Dubray et al., 1982).
Az elektroforetikus futtatásokat redukálószer jelenlétében, illetve anélkül végeztük. A protein-foltokat azután nitrocellulózon Western-foltképzéssel, Towbin módszerével azonosítottuk (Towbin et al., 1979), antitest-próbaként vagy gpl60 antigén elleni, vagy a gazdasejt (CV-1) elleni, vagy a vakcínia protein elleni antitesteket alkalmaztunk.
(vi) 178.1 monoklonális antitest átjutása
A 178.1 monoklonális antitest jelenlétét a tisztított gpl60 antigénben ELISA-val mértük. Antitesteket kapcsoltunk kecske-anti-egér antitesttel, és biotinilezett anti-egér antitesttel detektáltuk. A további detektálást streptavidin-peroxidáz rendszerrel végeztük.
(vii) A tiszta env qpl60 méretkizárásos kromatográfiája
A tisztított gpl60-t 1 tömeg% OGP-vel kiegészített, 0,2 mol/l-es foszfátpufferrel kiegyenlített TSK 4000 SW HPLC oszlopon (7,5 m x 300 mm) tisztítottuk. Az átfolyási sebesség 0,75 ml/perc volt, és a frakciókat ELISA-val vizsgáltuk az antigénre nézve.
(viii) A tisztaság meghatározása
A tisztaságot minden tisztítási lépés után meghatároztuk SDS-polakrilamid-gél elektroforézissei, redukáló körülmények között. A proteinfoltokat PÁS festéssel tettük láthatóvá, és Western-foltképzéssel azonosítottuk.
A kapott eredmények világosan mutatták, hogy az antigén immunaffinitás oszlopon végzett kromatografálás után nem tartalmaz detektálható mennyiségű szennyező proteint. A végtermék azonban szennyezve lehet nyomnyi mennyiségű monoklonális antitesttel, amely az immunaffinitás oszlopról távozik. Ezért ELISA-val mértük a 178.1 antitest mennyiségét a tiszta gpl60-ban, és úgy találtuk, hogy ennek mennyisége a minta teljes proteintartalmára vonatkoztatva 0,004-0,02 tömegé.
A tisztított antigént a gpl60 oligomer formáinak jelenlétére nézve is megvizsgáltuk. Az oligomerek képződése a gpl60 vírusban kialakuló szerkezetére utalhat, ahol a burok proteinek a virion felületénél szegek formájában összeszerelődnek. Az antigén primer szekvenciájában jelenlevő ciszteinek lehetővé teszik a (homo) oligomerek képződését diszulfid-hidak kialakulása által. Ezt β-merkaptoetanol jelenlétében vagy anélkül végzett SDS-polakrilamid-gél elektroforézissel mutattuk ki. Redukálószer nélkül az antigén 160 000 Da-nál nagyobb molekulatömegű proteinfoltokat adott, még detergens (SDS) jelenlétében is. Ezzel szemben, ha az antigént redukálószer jelenlétében forraltuk, egyetlen 160 kDa proteinfolt volt megfigyelhető. Az oligomer szerkezetek méretének meghatározására az antigént HPLC méretkizárásos kromatográfiával elemeztük. Az oszlop ismert molekulatömegű standardokkal végzett kalibrálásából az következett, hogy a gpl60 molekulák legtöbbje a 640 000 Da molekulatömegnek megfelelő retenciós idővel eluálódott. Ebből arra következtettünk, hogy detergens jelenlétében, de redukálószer nélkül a HÍV gpl60 burokprotein tetramer formába szerelődik össze.
(ix) Elemzés
A végtermék antigén/protein aránya kb. 2, ami a lizátum ELISA tartalmával egyezik (a tenyészlében literenként 0,8-1,4 mg antigén ELISA-val mérve).
2. példa
Módosított qpl60 kifejezése BHK-21 sejtekben és a
CTP160 burokprotein tisztítása a szuszpenzióban tenyésztett sejtekből
A BHK-21 sejtekben az 1. példa (i) pontja szerinti módon rekonbináns vakcíniavírussal kifejezett HÍV gpl60 burokproteint az 1. példa (ii) pontja szerinti módon tisztítottuk, kisebb módosítással a lizáló lépésben.
1. lépés: BHK-21 sejtek lizálása és a qp!60 antigén extrahálása
Felolvasztás után a sejtszuszpenziót (109 sejt) 2200 g-vel 15 percig centrifugáltunk, és a felülúszót elöntöttük. A csapadékot 50 ml, 150 mmol/1 nátrium-kloriddal, 1 tömeg% polietilénglikol 300 monodeciléterrel (Decyl PEG) és 20 gg/ml aprotinnal kiegészített 30 mmol/l-es Tris-HCl (pH=8) pufferben újraszuszpendáltuk. A sejteket 1 óra hosszat jégen tartva és időnként kézzel felrázva lizáltuk, majd 11 300 g-vel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszó elválasztása után a csapadékot 20 ml lizáló pufferrel mostuk, és 11 300 g-vel 15 percig centrifugáltuk. A csapadékot eldobtuk, és a kombinált felülúszókat tovább tisztítottuk.
2. és 3. lépés: ezeket és az elemzéseket az 1. példa (ii) (ix) lépésének megfelelően végeztük.
3. példa gpl60 - 3D-MPL vakcina készítmények előállítása (a) rpgl60-alumíniun-hidroxid plusz 3D-MPL
Az 1. példa szerinti módon előállított rpgl60-t (dózisonként 100 Mg, illetve 20 Mg) egy éjszakán át 4 °C-on adszorbeáltattunk 0,5 pg-ekvivalens Al+-nak megfelelő alumínium-hidroxidra (alun) 1 ml 150 mmol/1 nátrium-klórid-tartalmú 10 mmol/l-es foszfát-pufferben (pH=6,8). Egy éjszakán át végzett inkubálás után az adjuvált készítményt centrifugáltuk, és a felülúszót eltávolítottuk. Ezután az alumra kötött rgpl60-hoz azonos térfogatú, 100 μς 3D-MPL-t tartalmazó adszorpciós puffért adtunk. Az rgpl60-nak több mint a 95 %-a adszorbeálódott az alumínium-hidroxidra.
3(b) rqpl60 - 3D-MPL olaj-a-vízben umolzió
A hordozóanyagot a következőképpen készítettük. 5 térfogat% Pluronic L121-t (BASF Wyandotte, New Jersey gyártmány) és 10 térfogat% squalane-t (Aldrich gyártmány) hozzáadtunk 0,4 térfogata Tween 80-t tartalmazó, foszfáttal pufferőit sóoldatba (PBS) . Az elegyet mikrofluidizáltuk. A mikrofluidizáláshoz az emulziót tízszer cirkuláltattuk egy mikrofluidizáló berendezésben (M110 model, Microfluidics Corp., Newton, Massachusetts gyártmány) . A kapott emulzió csak mikronnál kisebb részecskéket tartalmazott. Az emulzió egy tér26 fogategységét azonos térfogatú kétszer koncentrált rpgl60nal (vagy 20 pg, vagy 100 pg) kevertük, és rövid ideig örvénykeveréssel kevertük a komponensek teljes elkeveredésének biztosítására. Ezután 100 Mg/ml 3D-MPL-t adtunk ehhez az rpgl60 o/w emulzióhoz. A végtermék 0,2 tömeg% Tween 80-t, 2,5 tömeg% Pluronic L121-t, 5 tömeg% squalane-t, 100 pg
3D-MPL-t és rgpl60-t (100 pg, illetve 20 pg) tartalmazott 1 ml injekciós dózisban.
4. példa
Immunogenitás tengerimalacban
ELISA és semlegesítő titer
Öt tengerimalacot immunizáltunk egyhónapos időközönként 3 injekció 1. példa szerinti módon előállított 50 pg módosított gpl60-nal SAF-l-ben [szintetikus adjuvánskészítmény-1; Byars N.E. és Allison A.C., Vaccine, 5, 223-227 (1987)]. A szérumokat a második immunizálás után 2 héttel, illetve 1 hónappal, valamint a harmadik immunizálás után 2 héttel vizsgáltuk. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze.
A HIV-1 (Illb)-vei fertőzött sejtek lizátumán alapuló kapcsoló enzim immunvizsgálattal (EIA) határoztuk meg az első és második provokálás utáni antiszérumok ELISA titerét. A vizsgálatot a Moore et al. által ismertetetthez [Moore J.P. et al., AIDS, 3, 155 (1989)] hasonló módon végeztük.
A mikrotitráló lemezen végzett semlegesítési teszt a
HÍV gag antigén indikátor sejtekben való detektálásán alap27 szik. Indikátor sejtekként SupTl sejteket [Hecht et al., Science, 226, 1445 (1984)] alkalmaztunk. Virális inokulumként HIV-1 (Illb)-termelő limfoid sejtvonal sejtmentes felülúszóját alkalmaztunk. A felülúszót nagy sebességgel centrifugáltuk a sejtek és a sejttörmelék eltávolítására, 1 ml alikvotokat fioláikba töltöttünk, és felhasználásig -80 °C-on tároltuk. A vizsgálandó szérumokat a vizsgálat előtt 56 °Con 30 percig hőkezelve inaktiváltuk. Negatív kontrollként az állatoktól immunizálás előtt vett, illetve csak adjuvánssal inokulált (a vizsgálattal azonos fajba tartozó) állatok összegyűjtött szérumát használtuk. Semlegesítéshez 750 TCID5Q-t 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáltunk néhányszor kétszeres hígítású szérumokkal. Ezután SupTl sejteket (4.10^ sejt/mélyedés) adtunk hozzá, és négy napig 37 ’C-on inkubáltuk. A citopatikus hatást mikroszkóppal figyeltük meg, 1 térfogat% végső koncentrációig Triton Χ-100-t adtunk minden mélyedéshez, és a lemezt fagyasztottuk. Szendvics ELISA-val figyeltük a tenyészetekben termelt vírus antigén relatív mennyiségét. A lemezekre anti-p55 monokionális antitestet vittünk fel. A fenti, Triton Χ-100-zal kezelt mintákat inkubáltuk, és a gag antigén jelenlétét biotinilezett HIV-1 + humán IgG-k, majd streptavidin és peroxidáz alkalmazásával láthatóvá tettük. Azután a HIV-1 antigén termelésének a kontrolihoz viszonyított százalékos csökkenését minden szérumhígítás esetén kiértékeltük. A kapott adatokhoz a nemlineáris legkisebb négyzetanalízissel illő görbe alapján extrapolálással meghatároztuk a kontrolihoz képest 50 % csökkenést adó szérumhígítást.
A 2. táblázat a harmadik immunizálás után kapott semlegesítő titer értékeket mutatja.
Úgy találtuk, hogy a második provokálás után megfigyelt semlegesítő titerek meghaladják a fertőzött személyek szérumában mértet. Pontosabban a HlV-l(IIIb) izolátumok elleni antiszérumok semlegesítő titere átlagosan négyszer magasabb, mint öt szeropozitív WHO referenciaszérum titere [McKeating et al., J. Gén. Virol., 70, 3326-3333 (1989)]. Egy sorozat HIV-1 izolátum semlegesítését (keresztsemlegesítését) Dr. Weiss laboratóriuma (Chester Beatty Laboratories, Nagy-Britannia) vizsgálta egy szigorúbb semlegesítési teszttel, ami alacsonyabb szenzitivitást és titereket adott. A 3. táblázatban látható eredményeket három alkalommal két különböző tenyészettel ismételtük meg, és jó keresztsemlegesítő reakciót kaptunk különböző HIV-1 törzsekkel, többek között egy afrikai törzzsel (CBL-4) . Lásd a 3. táblázatot.
Az 1. példa szerinti módon előállított gpl60 vakcinával immunizált tengerimalacoktól vett szérumok (01-05) jó keresztsemlegesítő titereket mutattak a harmadik immunizálás után.
A három dózis után megfigyelt erős keresztsemlegesítő válasz alapján a találmány szerinti gpl6O vakcina potenciálisan a HIV-1 elleni vakcinálásra alkalmasnak tekinthető.
5. példa
Különböző vakcina készítményeknek tisztított HÍV vakcínia rekomhináns qpl60 (Illb izolátum) immunogenitására gyakorolt hatásának vizsgálata Rhesus majmok esetén
A vizsgálatban a különböző vakcináknak a tisztított rekombináns gpl60 (rgpl60) immunogenitása fokozására gyakorolt hatását Rhesus majmokban (Macaca mulatta) értékeltük ki. Adjuvánsként alumínium-hidroxidot (Alhydrogel, Superfos, Dánia) alkalmaztunk 3D-MPL-lel (3D monofoszforil lipid A, Ribi gyártmány) kombinálva (2b példa) , 3D-MPL ólaj-a-vízben emulzió formájában (2a példa).
3,5-5 kg testtömegű Rhesus majmokat (Macaca mulatta) véletlenszerűen 3-4 fős csoportokba osztottunk. A. csoportokat három adjuváns készítménnyel kialakított, különböző rgp!60 készítményekkel immunizáltuk a következőképpen:
1.
csoport (4 majom) : 100 rgp!60 plusz 3D-MPL alumínium-hidroxidon abszorbeálva;
csoport (4 majom) : 2 0 Mg rgp!60 plusz 3D-KPL alumínium-hidroxidon abszorbeálva;
3.
csoport (4 majom) : 100 μg rgpl60 plusz 3D-MPL o/w emulzió;
4.
csoport (4 majom) : 20 μg rgp!60 plusz 3D-KPL o/w emulzió.
5.1. Antigén-adiuváns készítmények
Az rgpl60 készítményeket közvetlenül használat előtt készítettük. A dózisokat 1 ml térfogatban injektáltuk. A kü• · · · ·
- 30 lönböző rgpl60-injekciókat intramuszkulárisan adtuk be a háromfejű karizomba a 0. és a 35. napon. A második immunizálás után két héttel az állatoktól vért vettünk az antitest-meghatározáshoz .
5.2. Eredmények
A második injekciózás után két héttel az állatoktól vett szérumot ELISA és semlegesítési vizsgálatokban vizsgáltuk.
5.3. ELISA
A Thiriart et al. által ismertetett [Thiriart et al., J. Immunoi., 6, 1832-1836 (1989)] megkötő immunvizsgálat egy módosított formáját alkalmaztuk. A vizsgálat kereskedelemben kapható monospecifikus gp41 reagenst (Biochrom) hasznosít. Antigénként vakcínia gpl60-nal fertőzött BHK 21 sejtek nyers lizátumát alkalmaztuk.
5.4. Semlegesítési vizsgálat
A mikrotitráló lemezen végzett semlegesítési vizsgálat alapja a HÍV gag antigén detektálása indikátorsejtekben. Indikátorsejtekként SupTl sejteket [Hecht et al., Science, 226, 1445 (1984)] alkalmaztunk. Virális inokulumként HÍV—1 (Illb) -termelő limfoid sejtvonal sejtmentes felülúszóját alkalmaztuk. A felülúszót nagy sebességgel centrifugáltuk a sejtek és a sejttörmelék eltávolítására, 1 ml alikvotokat fiolákba töltöttünk, és felhasználásig -80 °C-on tároltuk. A vizsgálandó szérumokat a vizsgálat előtt 56 °C-on percig hőkezelve inaktiváltuk. Semlegesítéshez 750 TCID5Q-t 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáltunk néhányszor kétszeres hígítású szérumokkal. Ezután SupTl sejteket (2.104 sejt/mélyedés) adtunk hozzá, és négy napig 37 °C-on inkubáltuk. A citopatikus hatást mikroszkóppal figyeltük meg, 1 térfogat% végső koncentrációig Triton Χ-100-t adtunk minden mélyedéshez, és a lemezt fagyasztottuk. Szendvics ELISA-val figyeltük a tenyészetekben termelt vírus antigén relatív mennyiségét. A lemezekre anti-p55 monoklonális antitestet vittünk fel. A fenti, Triton Χ-100-zal kezelt mintákat inkubáltuk, és a'gag antigén jelenlétét biotinilezett HIV-1 + humán IgG-k, majd streptavidin és peroxidáz alkalmazásával láthatóvá tettük. Azután a HIV-1 antigén termelésének a kontrolihoz viszonyított százalékos csökkenését minden szérumhígítás esetén kiértékeltük. A kapott adatokhoz a nemlineáris legkisebb négyzetanalízissel illő görbe alapján extrapolálással meghatároztuk a kontrolihoz képest 50 % csökkenést adó szérumhígítást.
5.5. Eredmények
A 4. táblázatban a második immunizálás után kapott ELISA és semlegesítő titer értékeket foglaltuk össze. A HÍV rgplöO általános immunogenitása 3D-MPL o/w-ben igen jó. Ha az állatoknak 20 Mg gpl60 dózist adtunk, a semlegesítő titer és az ELISA titer különösen jó volt azon állatok csoportjában (4. csoport), amelyeknek rgpl60-t 3D-MPL o/w-ben adagoltunk. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a 3D-MPL o/w emulzió különösen jó adjuváló hatással rendelkezik. Az alu mínium-hidroxidra adszorbeált gpl60-nal immunizált állatok immunválasza 3D-MPL jelenlétében gyenge, bár termelnek némi semlegesítő antitestet. A HÍV gpl60 egy hidrofób csoportot tartalmaz, és ez valószínűleg hozzájárul ahhoz, hogy a molekula nagy affinitást mutat a lipidek iránt. A HÍV gpl60 legjobban úgy mutatható be az immunrendszernek, hogy 3D-MPLt tartalmazó olaj-a-vízben emulzióban adagoljuk.
6. példa
6.1. A kísérlet vázlata
Két csimpánzt (1. és 2. számú állat) az 1. példa szerinti módon előllított tisztított vakcínia rekombináns gpl60-nal (rgpl60) immunizáltunk (100 ^g/dózis).
Két csimpánzt (3. és 4. számú állat) Drosophila Schneider sejtekben kifejezett 100 Mg/dózis tisztított rekombináns gpl20-szal (rgpl20) [Culp et al., Biotechnology, 9, 173-177 (1991) 1 immunizáltunk.
A rekombináns protein készítményeket 3D-MPL-lel (100 Mg/dózis) o/w emulzióban készítettük el. A készítmények 0,2 tömeg% Tween 80-t, 2,5 tömeg% Pluronic L121-t, 5 tömeg% squalane-t, 100 pg 3D-MPL-t és rekombináns antigént (100 μg rgpl60, illetve rgpl20 1 ml injekció-térfogatban) tartalmaztak.
Az állatokat a lábukon intramuszkulárisan immunizáltuk a 0., 1. és 2 . hónapban.
f·»
- 33 Az állatoktól minden második héten vért vettünk, és meghatároztuk az ELISA és semlegesítő titert (ELISA módszert lásd 4.3. példában; a HÍV semlegesítési vizsgálatot kissé módosítottuk, lásd alább). Az elhalasztott típusú hiperszenzitivitási választ (DHT) szintén kiértékeltük az alábbi módon.
6.2. Humorális immunitás indukálása
Amint az 5. táblázatból látható, az rgpl60, illetve rgpl20 3D-MPL o/w emulziójával vakcináit csimpánzok három immunizálás után magas ELISA és semlegesítő titert mutattak. A semlegesítő aktivitás négy szérumból háromban már két injekciózás után, míg további injekciózás után mind a négyben ki volt mutatható. A semlegesítő titer emelkedése a harmadik immunizálás után volt megfigyelhető. Az így mért ELISA és semlegesítő titerek nagyon hasonlóak az rgpl60-nal háromszor immunizált Rhesus-majmok esetén mértekkel.
6.3. DTH indukálása
A DTH-teszteket a harmadik immunizálás után két héttel végeztük. Az injekciókat 100 μΐ mennyiségben a hasba adagoltuk.
Két rgpl60-nal és két rgpl20-szal immunizált állaton három különböző antigénnel (rgpl60, rgD26, tetanusz toxoid) és két kontroll pufferrel (rgD2t kontroll puffer (PBS) és rgpl60 kontroll puffer) bőrpróbát végeztünk. Különböző rekombináns antigén dózisokat vizsgáltunk: rgpl60 esetén 40, 20 és 10 Mg, rgD2t esetén 20, 10 és 5 Mg.
• ·
- 34 A DTH válaszokat 24 órával később értékeltük ki a bőr vastagságának mérésével.
Tetanusz toxoid és rgpl60 elleni specifikus DTH válasz volt megfigyelhető mind az rgpl60-nal, mind az rgpl20-szal vakcinázott állatok esetén.
Ezek az eredmények arra utalnak, hogy o/w emulzióban 3D-MPL-t tartalmazó készítmények specifikus T-sejt választ képesek indukálni (lásd 6. táblázatot).
A csimpánzok esetén kapott eredmények azt mutatják, hogy a 3D-MPL-t olaj-a-vizben típusú emulzióban tartalmazó készítmények szignifikánsan javítják a humorális (semlegesítő antitestek) és effektor sejtek által közvetített (DTH) immunválasz kialakulását emlősökben.
Semlegesítési vizsgálat
A mikrotitráló lemezen végzett semlegesítési vizsgálat az indikátor sejtekben HIV-1 fertőzéssel indukált CPE vizuális kiértékelésén alapszik. Indikátorsejtekként SupTl sejteket [Hecht et al., Science, 226, 1445 (1984)] alkalmaztunk. Virális inokulumként HIV-1 (Illb)-termelő limfoid sejtvonal sejtmentes felülúszóját alkalmaztuk. A felülúszót nagy sebességgel centrifugáltuk a sejtek és a sejttörmelék eltávolítására, 1 ml alikvotokat fiolákba töltöttünk, és felhasználásig -80 °C-on tároltuk. A vizsgálandó szérumokat a vizsgálat előtt 56 °C-on 30 percig hőkezelve inakriváltuk. Negatív kontrollként az állatok immunizálás előtt összegyűjtött vérét alkalmaztuk. Semlegesítéshez 750 TCID5Q-t 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáltunk kétszeres sorozathígítású szé• · «4· · rumokkal. Ezután SupTl sejteket (2.104 sejt/mélyedés) adtunk hozzá, és négy napig 37 °C-on inkubáltuk. A citopatikus hatást mikroszkóppal figyeltük meg a negyedik napon, és a semlegesítési titereket vizuálisan értékeltük ki. Az adott semlegesítő titerek a szincítium-képződésben az immunizálás előtti kontrolihoz képest 80 %-os csökkenést mutató szérumhigítások reciprokának felelnek meg. A vizuálisan megfigyelt titereket a 7. napon tovább pontosítottuk úgy, hogy az egyes mélyedésekben MTT vizsgálattal [Pauwels et al., J. Virol. Methods, 20, 309-321, (1988)] mértük a sejtek életképességét. Az ezen vizsgálatban meghatározott titerek a CPE ellen a nemfertőzött sejtekhez viszonyítva 80 %-os védelmet biztosító szérumhígítások reciprokát jelentik. A vizuálisan és MTT módszerrel meghatározott titerek nagymértékben megfelelnek egymásnak, és az MTT módszerrel mért titerek kétszer-négyszer alacsonyabbak, mint a vizuálisan meghatározottak.
- 36 1. táblázat
| CV-1 és BHK-21 sejtekben kifejeződött | ||||
| HÍV crnl60 tisztítása | ||||
| 1 1 | Tisztítási | 1 | 1 Térfogat | | Ossz- | r | Protein | | 1 Antigén | |
| | lépés | | (ml) | | protein | | kiterm. | | kiterm. | |
| 1 1 | 1 I | (mg) | 1 (%> 1 I I | (%) 1 I |
| | | 1 cv-1 (I) 1 | 1 1 | 1 1 1 1 | 1 1 | |
| | Lízis 1 | 1400 | | 2000 | 1 ιθθ 1 | 100 | |
| | Lencse-lektin | | 350 | | 100 | 1 5 I | 80 | |
| | Immunaffinitás | I 1 | 60 | I | 8 | 1 0,4 | I I | 65 | I |
| 1 1 | BHK-21 (2) | | 1 | 1 1 1 1 | 1 1 | |
| j Lízis 1 | 1480 1 | 2688 | 1 100 1 | íoo | |
| | Lencse-lektin | | 495 | | 113 | 1 4 I | 79 | |
| | Immunaffinitás | 1 1 | 60 | 1 | 7 | 1 0,3 | —1 L | 58 1 1 |
| (1): kiindulási | anyagként | 20 1 tenyészet | ||
| (2): kiindulási | anyagként | 14 1 tenyészet (2,1 | x 1010 sejt) |
- 37 ·· «·<« ·· * « · · «
-4 **·♦ • 49*9 • 4 4*444
2. táblázat
GP160 IMMUNOGENITÁSA TENGERIMALACBAN
| Η | |||
| CQ | Η | ff | |
| Η | Η | (β | > ο ο χτ > σ> |
| Η | C | ο οο η m Γ- | |
| Η | μ | m σ> ιο ο ιο ο | |
| χ-ζ | (Λ | ιη | Ν rl Φ Ν (Ν |
| 0 | γΗ | ||
| μ | (f | ||
| φ | |||
| +J | ----------—. | ||
| •Η | |||
| -μ | |||
| Ό | ο > 'f ιη ο > | ||
| Ό | X! | ο η σι σχ ο η | |
| γΗ | Η rl (*) Η Η Η | ||
| V0 | Η | rH | V V |
| Ν | Η | ||
| •Η | |||
| γΗ | μ | ||
| (0 | ω | ff | |
| μ | ο | <0 | η ιη ιη <-> η σι |
| μ | & | C | co Ό Ί* ιη σ» ν |
| Η Η Μ* (*) Η (Ν | |||
| Φ | ιη | ||
| a | Η | ||
| H | |||
| χ-^ | Η | ff | σ η •u· ν η |
| γΗ | Η | (0 | co > ιη ν m ο |
| C | ιη σι ν η ο ν | ||
| •μ | » σι Η Η > ο | ||
| μ | ω | ιη | η > ιη ό η- χί |
| φ | 0 | rH | Η Η Η rH γΗ |
| -μ | ff | ||
| •Η | |||
| μ | — | — | |
| > > ιη co ο | |||
| Η | Ό | ν σι ν > ιη η | |
| Μ | χ | Μ Ό Π «-Ι Ό 00 | |
| ο 10 Ο ι£> C0 Γ·» | |||
| > | Η | γ-1 | (Ν Η (Ν CM Η |
| Η | Η | ||
| — | — | ||
| 1 | μ | ||
| Ή | ω | ff | οο οο ο ιη >* |
| μ | ο | φ | ιη xj ιη ο · ό |
| C | Cf | C | ιο οο οο σ\ w η- |
| η ν ιη ιη . ιη | |||
| ιη | (Ν <Ν CM 00 C Ν | ||
| γ-Η | |||
| — | — | ||
| 44 | |||
| 0 | |||
| -μ (Ü | Η | ||
| (0 e | Η m οο ιη S | ||
| rH μΌ | ο ο ο ο ο U | ||
| <—1 Ν | |||
| νί ω | |||
| • | |||
| ·«>. | ιη | χ-χ | |
| C | C | (0 · | |
| ιφ * | - νβ | S Η - | |
| tp ω > | Ο ·Η ff θ' ι-Ι | ||
| •Η ·Η 0 | ΙΟ Ο =11 | ||
| +J Ν ΤΙ | Η 44 · tf | ||
| C Ό Ό | ff (β Η Ο < | ||
| < Τ5 <β | tp > ιη w | ||
-P (0 Ό <0 ω υ c •Η
C
Ό <C
4->
Φ 'Φ
P
Q o in o >1 r-1 Φ β Λ φ
Μ Φ > C •Η φ mű -μ ιΗ tP Ή
Μ 'Φ
Ν ω c ο
Ν <0 χ“>
(0 γΗ
C
- 38 3. táblázat gpl60-ra adott tengerimalac szérum semlegesítő. aktivitása homológ (Illb) és heterológ izolátumokra
| 1 1 CBL-4 | 1 1 1 1 | 1 οτ ! 1 - 1 1___1 | Ο rH | ο rH | 1 10 1 Ι___________________1 | 1 οτ 1 1___________________________________________________________________1 | Ο γΗ | Ο rH V Ο γΗ | ο Μ· | 1 10 | 1_____________________________________________________1 | ο 00 | 1 | ||||
| ό) | ο | ||||||||||||||
| N | 1 | I | 1 | I | 1 | 1 | I | 1 | | | ό | I | ||||
| értő | rH | ||||||||||||||
| Ή | |||||||||||||||
| θ' | ο | ||||||||||||||
| Ό | ο | ο | ο | rH | ο | ||||||||||
| rH | 1 | rH | | | 1 | rH | 1 | 1 | rH | 1 | V | 00 | I | |||
| 0 | |||||||||||||||
| L | ο | ||||||||||||||
| Φ | |||||||||||||||
| P | — | ||||||||||||||
| Φ | |||||||||||||||
| K | ο | ||||||||||||||
| CJ | rH | ||||||||||||||
| V | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | |||||
| ω | 00 | Oi | rH | <Ν | (Ν | (Ν | rH | Μ1 | <Ν | 1 | |||||
| ο | cn | ||||||||||||||
| rH | |||||||||||||||
| U) | |||||||||||||||
| σ> 'φ | |||||||||||||||
| Ό | Ν | ||||||||||||||
| rH | <Ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | Ο | Ο | ο | Ο | ο | |||
| Λ | 0 | Ρ | 00 | Μ· | 00 | C0 | 00 | ΙΟ | CM | 4* | Ό | | | |||
| Η | β | Ρ | V | rH | γΗ | ||||||||||
| Η | 0 | φ | |||||||||||||
| Η | X! | <Μ | |||||||||||||
| γΗ | |||||||||||||||
| > | > | ||||||||||||||
| óh | ν-Η | ||||||||||||||
| ο | ο | ο | ο | ο | ο | Ο | ο | ο | Ο | Ρ | Ρ | ||||
| • | σ> | σ\ | ο | σχ | σ' | σι | σι | σι | σι | σι | •Η | 01 | |||
| Q | Ν | θ' | |||||||||||||
| • | ιη | ιη | ΙΛ | ιη | ιη | ιη | ιη | ιη | ιη | ιη | Ο | φ | |||
| Η | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | Λ | β | |||
| — | \ | ||||||||||||||
| tű | οι | (Ν | CN | (Ν | <Ν | Μ* | Μ· | C | β | ||||||
| 4J | ο | Ο | ο | ο | Ο | rH | rH | rH | rH | rH | OJ | Ό1 | |||
| C | § | g | |||||||||||||
| -Η | rH | (Μ | ΓΊ | ιη | Η | CN | cn | xj· | ιη | ρ | |||||
| ο | Ο | ο | ο | ο | Ο | Ο | ο | ο | ο | ÍC | S | ||||
pozitív semlegesítő hatás a vizuálisan megfigyelt szincítium képződés 90 %-os gátlása
• · »· ··· ν ···· * « 9 · · • ·ί ··· *.»
4. táblázat Rekombináns qpl60 vakcina immunoqenitása Rhesus-ma ή mokban
| 1------------------------------------------------------------------------------1--------------------------------------------------------------------------------------------------1 1 1 1 1 1 1 1 . 1 1 | 1! ELISA és semlegesítő titerek | | |||
| | 15 nap 1 | Post II | | |||
| 1 | Csoport 1 1 | | 1 1 | Adj./dózis 1 1 1 1 I I | 1 | Azonosító 1 1 I | | 50 % NT* 1 1 I | | | ELISA** | | középérték | | titer | |
| 1 1 i | 1 1 | Alum 3D | 1 1 IP 111 | 1 | < íoo | 1 1 1 576 1 |
| 1 | | MPL/100 pg | | IP 123 | | < íoo | 1 301 | |
| 1 | 1 1 | IP 151 | | < íoo | 1 411 | |
| 1 | 1 1 | IP 167 | | < íoo | 1 630 | |
| 1 | 1 1 I I | GMT | 1 1 | | 460 | 1 1 |
| 1 1 1 2 | 1 1 1 Alum 3D | | 1 1 IP 101 | 1 | < íoo | 1 1 | 1871 | |
| 1 | 1 MPL/20 pg | IP 103 | | < íoo | 1 1641 | |
| 1 | 1 1 | IP 105 | | < íoo | | 1437 | |
| 1 i | 1 1 | IP 196 | 1 < 100 | 1 94 | |
| 1 1 | 1 1 | GMT | 1 I | 1 802 | I I |
| 1 1 1 3 | 1 1 1 3D MPLOW I | 1 | IP 120 | 1 1 486 | 1 1 | 9043 | |
| 1 , | 1 ioo Mg 1 | IP 125 | 1 282 | 1 5537 | |
| 1 1 | 1 1 | [ IP 150 | | 285 | | 3981 | |
| 1 1 | 1 1 | | IP 152 | | 918 | | 10629 | |
| 1 | 1 1 I I | | GMT I | | 435 I | | 6789 | I I |
| 1 1 1 4 1 | 1 1 | 3D MPLOW | | 1 IP 114 | 1 | 462 | 1 1 | 5413 | |
| 1 1 | | 20 Mg | | IP 117 | 1 576 | | 5220 | |
| 1 | 1 1 | 1 IP 118 | | < 100 | | 2529 | |
| 1 ! | 1 1 | IP 197 | | 804 | | 5268 | |
| 1 1 1 1 | 1 1 1 1 | GMT 1 | | 322 1 | 1 4404 | 1 1 |
* A kontrolihoz viszonyítva 50 % antigéntermelést adó szérumhígítás reciproka ** A maximális abszorbancia érték (középérték titer) %-ának megfelelő abszorbanciát adó szérumhígítás reciproka
GMT: geometrikus átlag titer
5. táblázat
Anti-HIV antitest válasz rgpl60-nal és rqpl20-szal vakcinázott csimpánzok esetén
| Μ | |||||
| Φ | •Η | ||||
| Ρ | Ρ | ||||
| •Η | ΙΛ | C | |||
| μ | Ο | φ | |||
| I | <—ι | ||||
| 14 | <λ» | φ | |||
| >φ | -η | ||||
| μ | Ο | ||||
| μ | 00 | Ρ | |||
| 'φ | -Ή | Ν | |||
| a | C | C | Φ | ||
| 'φ | φ | ο | |||
| 1O | Ν | h | Ρ | \ | |
| rH | :0 | fi | Ρ | Ο | |
| Φ | 14 | φ | Ο | ||
| r-4 | Ν | ω | ΓΜ | ||
| Φ | ω | ||||
| M-l | Φ | fi | r-l | ||
| cn | 14 | ι—1 | >. | 3 | |
| Φ | 0 | (0 | σ> | χφ | |
| fi | μ | > | φ | Ό | |
| Λ 'Φ | ί~| | ||||
| * | •Η | W | Ρ | 'φ | |
| Φ | υ | χφ | ο | η< | |
| c | φ | Ρ | 14 | ||
| χφ | Μ | φ | φ | • | |
| I | Λ | 14 | Ρ | r—1 | |
| ΙΛ | Ο | 0) | Φ | ||
| χφ | (0 | Ρ | Ρ | ||
| o | μ | 3 | α | •*4 | 14 |
| in | χΗ | 14 | Η | Ρ | •Η |
| θ' | •Η | υ | Ό | ||
| 14 | Ή | μ | φ | ο | Φ |
| ό | XS | φ | μ | Ρ | 14 |
| P | e | & | τΗ | Ν | |
| μ | Ρ | Ο | m | Π) | Φ |
| ό | Μ | ρ | νο | φ | >1 |
| φ | 'Φ | •Η | μ | cn | r—1 |
| •H | Ν | υ | Ή | φ | Φ |
| 0 | W | θ' | ^4 | Λ | |
| c | fi | Ή | e | ||
| Φ | Ό | JS | φ | Ρ | |
| Ρ | Ρ | μ | fi | m | Ρ |
| μ | <0 | >Φ | 3 | :0 | |
| o | Ρ | ι-Η | μ | φ | Ν |
| N | 3 | Ο | χφ | :θ | |
| ω | fi | Ν | Ν | > | 14 |
| Λ | •Η | (0 | cn | ||
| φ | Ρ | ο | <Λ | ||
| Χφ | γ4 | ο | Λ | χφ | |
| W | •Η | Ό | Ρ | ||
| •Η | Ο | > | Φ | Ή | |
| <—1 | C | Η | —Η | CP | |
| χφ | <0 | Κ | μ | Ν | χΗ |
| e | Λ | Φ | ι—1 | £! | |
| •Η | μ | Λ | fi | Φ | ε |
| X | ο | Η | r-4 | -τ-> | 3 |
| <0 | Ν | Η | φ | Μ | |
| e | ω | Η | Ό | Ρ | 'Φ |
| Λ | χφ | Ν | Ν | ||
| (0 | <0 | Φ | > | Φ | ω |
| • · | • · | .. | |||
| ρ | Ρ | —_ | |||
| φ | φ | ||||
| Ρ | μ | ||||
| •Η | •Η | ||||
| μ | μ | ||||
| ω | ,—I | ||||
| Η | fi | ||||
| Φ | |||||
| Μ | ω |
hogy a titer 200 és 400 között van
6. táblázat
Anti-HSV antitestválasz vakcinázott csimpánzok esetén
Claims (30)
- Szabadalmi igénypontok1. HÍV gpl60 protein módosított formában, amely az 502. és 510. helyzetben egymástól függetlenül lizintől és arginintől eltérő aminosavakat tartalmaz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti HÍV gpl60 protein, azzal jellemezve, hogy az 502. és 510. helyzetben hisztitidint, treonint, szerint, aszparagint, aszpartinsavat, glutamint vagy glutaminsavat tartalmaz.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti HÍV gpl60 protein, azzal jellemezve, hogy az 502. és 510. helyzetben glutaminsavat tartalmaz.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti HÍV gpl60 protein, azzal jellemezve, hogy oligomer vagy dimer formában van.
- 5. A 4. igénypont szerinti oligomer, azzal jellemezve, hogy relatív molekulatömege mintegy 640 kDa.
- 6. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti Hív gpl60 protein vagy annak oligomer vagy dimer formája, azzal jellemezve, hogy lényegében véve tiszta formában van.
- 7. Vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti proteint vagy annak oligomerjét tartalmaz farmakológiailag elfogadható hordozó mellett.
- 8. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy valamely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti proteint vagy annak oligomerjét tartalmaz farmakológiailag elfogadható hordozó mellett.
- 9. Vakcina- és gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy gpl60-t vagy annak immunológiailag egyenértékű származékát és 3D monofoszforil lipid A-t tartalmaznak alkalmas hordozó mellett.
- 10. A 9. igénypont szerinti vakcina- és gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy gpl60 immunológiailag egyenértékű származékaként valamely az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti proteint vagy oligomert tartalmaznak.
- 11. A 9. vagy 10. igénypont szerinti vakcinakészítmények, azzal jellemezve, hogy hordozóként olaj-a-vízben típusú emulziót tartalmaznak.
- 12. A 11. igénypont szerinti vakcinakészítmények, azzal jellemezve, hogy 10-150 gg/ml gpl60-t tartalmaznak.
- 13. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti HÍV gpl60 protein vagy annak oligomerje gyógyászatban való alkalmazása .
- 14. A 9-12. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény gyógyászatban való alkalmazása.
- 15. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti HÍV gpl60 proteinnek vagy oligomerjének az alkalmazása HIV-1 fertőzés kezelésére szolgáló vakcina előállítására.
- 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás HÍV fertőzések profilaktikus kezelésére.
- 17. Eljárás az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti módosított HÍV gpl60 protein előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett proteint kódoló DNS-szekvenciát egy rekombináns eukarióta gazdasejtben kifejezzük, és a módosí tott proteint kinyerjük.
- 18. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti módosított proteint kódoló DNS-szekvencia.
- 19. Eljárás módosított gpl60 4. vagy 5. igénypont szerinti oligomer és diner formáinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a módosított proteint egy rekombináns eukarióta sejtből izoláljuk, és nemredukáló körülmények között tisztítjuk.
- 20. Eljárás vakcinakészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy gpl60 proteint vagy annak valamely immunológiailag egyenértékű származékát 3D monofoszforil lipid A-val és farmakológiailag elfogadható hordozóval keverve vakcínakészítménnyé alakítunk.
- 21. Eljárás HÍV fertőzésre fogékony személyek profilaktikus kezelésére, azzal jellemezve, hogy valamely az 1-3. igénypont szerinti vegyület hatékony mennyiségét adagoljuk.
- 22. Eljárás HÍV fertőzésre fogékony személyek profilaktikus kezelésére, azzal jellemezve, hogy valamely a 9-12. igénypontok bármelyike szerinti vakcina hatékony mennyiségét adagoljuk.
- 23. Eljárás HÍV fertőzött személyek kezelésére, azzal jellemezve, hogy valamely az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vegyület hatékony mennyiségét adagoljuk.
- 24. A 9. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy immunológiailag egyenértékű származékként gpl20-t tartalmaz.
- 25. A 24. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy ólaj-a-vízben típusú emulzió formájában van.
- 26. A 24. vagy 25. igénypont szerinti vakcinakész ítmény, azzal jellemezve, hogy 10 - 150 ug/ml gpl20-t tartalmaz.
- 27. A 24-26. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény gyógyászatban való alkalmazása.
- 28. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunológiailag egyenértékű származékként gpl20-t alkalmazunk.
- 29. Eljárás HÍV fertőzésre fogékony személyek profilaktikus kezelésére, azzal jellemezve, hogy valamely a 24-2 6. igénypontok bármelyike szerinti vakcina hatékony mennyiségét adagoljuk.
- 30. Eljárás HÍV fertőzött személyek kezelésére, azzal jellemezve, hogy valamely a 24-26. igénypontok bármelyike szerinti vakcina hatékony mennyiségét adagoljuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB919106048A GB9106048D0 (en) | 1991-03-21 | 1991-03-21 | Vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT67011A true HUT67011A (en) | 1995-01-30 |
Family
ID=10691984
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302642A HU9302642D0 (en) | 1991-03-21 | 1991-10-25 | Gp 160-derivatives and vaccine containing them or gp-160 itself |
| HU9302642A HUT67011A (en) | 1991-03-21 | 1991-10-25 | Derivatives opf gp160 and vaccines based on gp160 or a derivative thereof, containing an adjuvant |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302642A HU9302642D0 (en) | 1991-03-21 | 1991-10-25 | Gp 160-derivatives and vaccine containing them or gp-160 itself |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1064891A (hu) |
| AP (1) | AP368A (hu) |
| BR (1) | BR9107294A (hu) |
| CZ (1) | CZ195793A3 (hu) |
| FI (1) | FI934133A (hu) |
| GB (1) | GB9106048D0 (hu) |
| HU (2) | HU9302642D0 (hu) |
| IL (1) | IL99899A0 (hu) |
| MA (1) | MA22381A1 (hu) |
| SK (1) | SK82593A3 (hu) |
| WO (1) | WO1992016556A1 (hu) |
| YU (1) | YU174491A (hu) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9105992D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| US6620414B2 (en) | 1992-03-27 | 2003-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A |
| WO1994021292A1 (en) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a |
| GB9326253D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| GB9706957D0 (en) | 1997-04-05 | 1997-05-21 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
| GB9820525D0 (en) | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
| GB0000891D0 (en) | 2000-01-14 | 2000-03-08 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
| CN1304580C (zh) * | 2004-07-09 | 2007-03-14 | 楼伟 | 重组表达人获得性免疫缺陷病毒I型的表面糖蛋白gp160 |
| ES2355980T3 (es) * | 2004-07-23 | 2011-04-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Polipeptidos para ensamblaje oligomerico de antigenos. |
| KR101359930B1 (ko) | 2004-09-22 | 2014-02-12 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 스태필로코쿠스에 대한 예방접종에 사용하기 위한 면역원성조성물 |
| EP3118221B1 (en) | 2007-02-26 | 2019-08-21 | Oxford BioTherapeutics Ltd | Proteins |
| WO2008104803A2 (en) | 2007-02-26 | 2008-09-04 | Oxford Genome Sciences (Uk) Limited | Proteins |
| WO2010084408A2 (en) | 2009-01-21 | 2010-07-29 | Oxford Biotherapeutics Ltd. | Pta089 protein |
| US20120282177A1 (en) | 2009-11-02 | 2012-11-08 | Christian Rohlff | ROR1 as Therapeutic and Diagnostic Target |
| LT2726094T (lt) | 2011-06-28 | 2017-02-10 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Gydymo ir diagnozavimo objektas |
| GB201213364D0 (en) | 2012-07-27 | 2012-09-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Purification process |
| GB201213652D0 (en) | 2012-08-01 | 2012-09-12 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Therapeutic and diagnostic target |
| GB201302447D0 (en) | 2013-02-12 | 2013-03-27 | Oxford Biotherapeutics Ltd | Therapeutic and diagnostic target |
| US20180071380A1 (en) | 2015-03-20 | 2018-03-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Immunogenic compositions for use in vaccination against bordetella |
| IL299285A (en) | 2016-05-16 | 2023-02-01 | Access To Advanced Health Inst | Formulation containing a TLR agonist and methods of use |
| IL313085A (en) | 2016-05-16 | 2024-07-01 | Access To Advanced Health Inst | Pegylated liposomes and methods of use |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL89567A0 (en) * | 1988-03-28 | 1989-09-10 | Univ Leland Stanford Junior | Mutated hiv envelope protein |
-
1991
- 1991-03-21 GB GB919106048A patent/GB9106048D0/en active Pending
- 1991-10-25 SK SK825-93A patent/SK82593A3/sk unknown
- 1991-10-25 BR BR9107294A patent/BR9107294A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-10-25 WO PCT/EP1991/002047 patent/WO1992016556A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-10-25 HU HU9302642A patent/HU9302642D0/hu unknown
- 1991-10-25 HU HU9302642A patent/HUT67011A/hu unknown
- 1991-10-30 IL IL99899A patent/IL99899A0/xx unknown
- 1991-11-01 YU YU174491A patent/YU174491A/sh unknown
- 1991-11-04 AP APAP/P/1991/000332A patent/AP368A/en active
- 1991-11-09 CN CN91111514.5A patent/CN1064891A/zh active Pending
- 1991-12-30 MA MA22665A patent/MA22381A1/fr unknown
-
1993
- 1993-09-21 FI FI934133A patent/FI934133A/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-10-25 CZ CZ931957A patent/CZ195793A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ195793A3 (en) | 1994-05-18 |
| CN1064891A (zh) | 1992-09-30 |
| FI934133A0 (fi) | 1993-09-21 |
| FI934133A (fi) | 1993-09-21 |
| GB9106048D0 (en) | 1991-05-08 |
| YU174491A (sh) | 1994-06-10 |
| SK82593A3 (en) | 1994-01-12 |
| AP9100332A0 (en) | 1992-01-31 |
| HU9302642D0 (en) | 1994-01-28 |
| MA22381A1 (fr) | 1992-07-01 |
| WO1992016556A1 (en) | 1992-10-01 |
| IL99899A0 (en) | 1992-08-18 |
| BR9107294A (pt) | 1994-06-14 |
| AP368A (en) | 1994-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT67011A (en) | Derivatives opf gp160 and vaccines based on gp160 or a derivative thereof, containing an adjuvant | |
| WAGNER et al. | Construction, expression, and immunogenicity of chimeric HIV-1 virus-like particles | |
| OA12168A (en) | Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against HIV. | |
| WO1996030523A2 (en) | Antigen presentation system based on retrovirus-like particles | |
| HUT65366A (en) | Expression of specific immunogens using viral antigens | |
| SG184188A1 (en) | Hiv vaccine | |
| AU654970B2 (en) | Derivatives of gp160 and vaccines based on gp160 or a derivative thereof, containing an adjuvant | |
| EP0519001B1 (en) | PURIFIED gp120 COMPOSITION RETAINING NATURAL CONFORMATION | |
| EP0565794A1 (en) | Induction of CTL responses | |
| US5876724A (en) | Induction of neutralizing antibody against viral infection by synergy between virus envelope glycoprotein and peptides corresponding to neutralization epitopes of the glycoprotein | |
| AU731706B2 (en) | Recombinant viral pseudo-particles and vaccinal and antitumoral applications thereof | |
| WO2003046137A2 (en) | Hiv envelope v3-ccr5 binding site immunogen | |
| AU651816B2 (en) | Induction of protection against viral infection | |
| US20120039923A1 (en) | Modified HIV-1 Envelope Proteins | |
| AU759220B2 (en) | Gene deleted recombinant FeLV proviral DNA for production of vaccines against FeLV | |
| EP0328390B1 (en) | Peptide treatment of refractory infectious diseases | |
| WO1992000098A1 (en) | Methods of inducing immune response to aids virus | |
| WO2003073984A2 (en) | Tat as an immunogen | |
| WO2010043259A1 (en) | Virus-like particles presenting hiv-1 envelopes, and methods for mucosal and sublingual immunization against hiv-1 using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |