JPH09227588A - 天然のコンホメーションを保持している精製ｇｐ１２０組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 天然のウイルスHIV gp120と実質的に同じタ
ンパク質／タンパク質結合特性を有する糖タンパク質を
提供する。 【解決手段】 組換えHIV gp120の精製方法であって、
粗gp120を含む組成物を（１）イオン交換クロマトグラ
フィー、（２）疎水的相互作用クロマトグラフィーおよ
び（３）サイズ排除濾過を順次使って分画し、そして各
段階においてCD4ペプチドに対する特異的結合親和力を
示す画分を収集することを含んで成る精製方法が提供さ
れる。該方法は、任意のアフィニティー精製段階または
タンパク質と有機溶媒との接触を使う任意の段階の非存
在下で行われる。この方法により得られるタンパク質
は、CD4に対する結合親和力およびHIV感染性を中和する
ことのできる少なくとも１つの抗体に対する結合親和力
といった、HIVウイルス上に提示されるgp120と実質的に
同じタンパク質／タンパク質相互作用特性を有する、精
製された全長の未融合の組換えHIV gp120糖タンパク質
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、タンパク
質の精製の分野に関し、より詳しくはワクチンの生産に
おいて有用なHIV-1由来抗原の精製に関する。

【０００２】

【従来の技術】HIV-1に対するワクチンをつくる試み
は、HIV-1に対して血清陽性であるヒトの免疫応答に類
似するかまたは同等の免疫応答を動物において達成する
という基準により判断すると、制限された成功に直面す
る。従来達成されていない主要な目標は、感染した個体
からのヒト血清中に認められるレベルと複雑性の両方に
達する力価において、試験管内でウイルス中和性である
抗体（すなわち、複数の単離物を中和する能力）の生産
であった。ヒトの中和性抗体はすべて、エンベロープタ
ンパク質、gp160、またはその構成部分（gp120またはgp
41）にマッピングされ、よって大部分のワクチンの努力
はエンベロープタンパク質関連抗原の開発に集中してい
る。

【０００３】このような抗原の５つの型が開発された：
（１）HIV感染した組織培養細胞から誘導された精製gp1
20（本明細書中では「ウイルス由来gp120」と呼称す
る）；（２）組換えウイルス、例えば、ワクシニアまた
はバキュロウイルスに感染した細胞中で作られるgp120
（「生ウイルスベクター由来gp120およびgp160」と呼称
する）；（３）哺乳動物細胞の中で作られた組換えgp12
0（「組換え哺乳動物gp120」、時には不正確に組換え生
来gp120と呼称する）；（４）gp120およびgp41の全部ま
たは種々の部分を表す、組換え変性ポリペプチド（「組
換え変性抗原」）；および（５）gp120およびgp41の小
セグメントを表すペプチド（「ペプチド」）。

【０００４】免疫原性実験はこれらの型の抗原のすべて
に関して完結され、かなり均一な結果が得られている。
一般に、抗原は様々な種においてアジュバント添加する
と高度に抗原性である。それらはHIV-1の相同性単離物
を中和することができる抗体を産生したが、非相同性単
離物を貧弱に中和するかあるいは全く中和しない。中和
のレベルは、また、感染したヒトにおいて見いだされる
中和力価レベルに（一般に）到達しなかった。

【０００５】例えば、ウイルスから精製されたまたは遺
伝子操作された哺乳動物細胞により産生された完全にグ
リコシル化された天然のgp120、酵母中で産生された非
グリコシル化gp120、およびＥ．コリ中で産生されたgp1
20の断片は、すべて、実験動物においてHIV-1中和性抗
体を惹起せしめることができる。大部分について、ウイ
ルス粒子または組換えgp120抗原で免疫処置した動物の
応答は、gp120抗原が由来するウイルス単離物のみを中
和する際に有効である。１つの例外はBermanら（下の参
考文献１）の研究であり、遺伝子操作したチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞により分泌された精製された組換え
HIV-1 gp120がチンパンジーにおいて群特異的中和性抗
体を惹起したことを示す研究である。

【０００６】HIV-1ワクチンを調製する時にとくに困難
であった他の要因は配列多様性である。HIV-1およびHIV
-2は、エンベロープのgp120部分において最も顕著であ
る非常に高レベルの配列多様性を有することによって特
徴づけられる。この配列多様性は、超可変領域として知
られる領域に密集する。種々のHIV単離物から誘導され
た抗原物質を含むワクチンカクテルを使用して、広範囲
の感染源に対する保護を提供することを、多数のグルー
プが提案している。

【０００７】従って、HIV-1ウイルス粒子上に提示され
るとき、gp120の免疫学的および他のタンパク質／タン
パク質結合特性を有する抗原物質が必要とされている。
特に、好ましくは、種々の野外単離物に対して中和抗体
を誘発する単一の根本材料を使用して、中和抗体を誘発
することができる抗原物質が非常に望ましい。

【０００８】（関連文献）次の刊行物はすべて、上述の
５つの型のワクチン候補に関する： （１）Bermanら、“Human Immunodeficiency Virus Typ
e I Challenge of Chimpanzees Immunized with Recomb
inat Envelope Glycoprotein gp120,”Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1988）85：5200-5204; （２）Bermanら、“Expression and Immunogenicity of
the Extracellular Domain of the Human Immunodefic
iency Virus Type I Envelope Glycoprotein,gp160,”J
ounal of Virology（1989）63：3489-3498; （３）Naraら、“Purified Envelope Glycoproteins fr
om Human Immunodeficiency Virus Type I Variance In
duced Individual, Type-Specific Neutralizing Antib
odies,”Jounal of Virology（1988）62：2622-2628; （４）Arthurら、“Serological Responses in Chimpan
zees Inoculated withHuman Immunodeficiency Virus G
lycoprotein（gp120）Subunit Vaccine,”Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA（1987）84：8583-8587; （５）Evansら、“An Engineered Polio Virus Chimaer
a Elicits Broadly Reactive HIV-1 Neutralizing Anti
bodies,”Nature（1989）339：385-388; （６）Barrettら、“Large-Scale Production and Puri
fication of a Vaccinia Recombinant-Derived HIV-1 g
p160 and Analysis of its Immunogenicity,”AIDS Res
earch and Human Retroviruses（1989）5：159-171; （７）Earlら、“Isolate-and Group-Specific Immune
Response to the Envelope Protein of Human Immunode
ficiency Virus Induced by a Live Recombinant Vacci
nia Virus in Macaques,”AIDS Research and Human Re
troviruses（1989）5：23-32; （８）Putneyら、“HTLV-III/LAV-Neutralizing Antibo
dies to an E.coli-prduced Fragment of the Virus En
velope,”Science（1986）234：1392-1395; （９）Steimerら、“Genetically Engineered Human Im
munodeficiency Envelope Glycoprotein gp120 Produce
d in Yeast is the Target of Neutralizing Antibodie
s,”Vaccines 87（1987）236-241; （１０）Steimerら、“Recombinant env and gag Polyp
eptides in Characterizing HIV-1-Neutralizing Antib
odies,”Vaccines 88（1988）347-355; （１１）Hoら、“Human Immunodeficiency Virus Neutr
alizing Antibodies Recognize Several Conserved Dom
ains on the Envelope Glycoproteins,”Jounal of Vir
ology（1987）61：2024-2028；および （１２）Palkerら、“Type-Specific Neutralization o
f the Human Immunodeficiency Virus with Antibodies
to env-Encoded Synthetic Peptides,”Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA（1988）85：1932-1936。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、天然
のウイルスHIV gp120と実質的に同じタンパク質／タン
パク質結合特性を有する糖ペプチドを提供するようなHI
V gp120の精製方法を提供することである。

【００１０】本発明の目的はまた、精製された全長の
（組換え体ならば非融合の）HIV gp120糖タンパク質を
含んで成り、その分子の大部分がHIVウイルス上に提示
されるgp120と実質的に同じのタンパク質／タンパク質
相互作用特性を有する、組成物を提供することである。

【００１１】本発明の他の目的は、多数のHIV単離物に
よる感染を中和することができる抗体の形成を刺激する
方法を提供することである。

【００１２】本発明の更に他の目的は、哺乳動物被検体
に投与した時、種々の源からHIVウイルスによる感染に
対するその被検体の感受性を減少させるワクチン組成物
を提供することである。

【００１３】本発明の更なる目的は、HIV-1に感染した
哺乳動物被検体に投与した時に治療効果を有するワクチ
ン組成物を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明のこれらおよび他
の目的は、以後一層明らかとなるように、１つの実施態
様では、全長の非融合のグリコシル化gp120タンパク質
を含有する媒質からgp120を精製する方法であって、
（１）イオン交換クロマトグラフィー、（２）疎水的相
互作用クロマトグラフィー、および（３）サイズ排除濾
過（サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロ
マトグラフィー）を使ってgp120含有媒質を順次分画
し、各段階においてCD4ペプチドに対して特異的結合親
和力を示す画分を集めることを含んで成る方法により達
成される。これらの技術から精製段階を選択しそしてア
フィニティークロマトグラフィーおよび逆相HPLCを回避
することによって、変性されていないか、あるいは苛酷
な溶媒条件、例えば、gp120に対して高い特異的親和力
を有する抗体または他の結合性分子を使用するアフィニ
ティークロマトグラフィーにおいて起こるであろう溶媒
条件に暴露されていない、精製gp120分子を得ることが
可能である。本発明のgp120は、コンホメーション保持
されたgp120と呼び、ウイルス粒子により提示されたと
き、従来入手可能であったよりも天然のgp120に一層密
接に類似するCD4レセプターへの結合特性を保持してい
る。よって、本発明の他の実施態様は、gp120の大部分
がコンホメーション保持されたgp120である、gp120を含
んで成る組成物である。本発明の追加の実施態様は、免
疫学的方法、例えば、抗HIV抗体についてのイムノアッ
セイ、抗HIV抗血清の生産およびワクチンにおける、改
良されたgp120組成物の利用を包含する。

【００１５】

【発明の実施の形態】

（精製の一般原理）本発明は、一部分、従来の精製技術
からアフィニティークロマトグラフィーを排除すると、
より優れたCD4結合特性をもつgp120糖ペプチドが生成す
ることを実証した本発明者らの実験室における研究から
端を発した。アフィニティー精製は、従来、高純度が要
求されるワクチンに使用するgp120の精製において必須
であると考えられていた。

【００１６】アフィニティークロマトグラフィーおよび
他の型のアフィニティー分離技術は、あるタンパク質が
見い出される媒質中に存在する他の分子からそのタンパ
ク質を分離するために、抗体とタンパク質との間（また
はレクチンと糖タンパク質との間）の強力で且つ特異的
な結合相互作用に頼る。次いで、適当な技術、例えば、
溶出媒質のイオン強度またはpHの変化を使用してタンパ
ク質から抗体を解離させ、こうして抗体が取り付けられ
たカラムまたは他の支持材料から他の汚染タンパク質を
洗浄除去した後、精製されたタンパク質を得ることがで
きる。アフィニティークロマトグラフィーは生化学分野
において20年以上の間利用されているが、その使用は19
70年代の初期に高特異性のモノクローナル抗体の出現と
共に急激に増加した。この技術の概観については、Frei
felder, Physical Biochemistry:Applications to Bioc
hemistry and Molecular Biology, 第２版，W.H.Freema
n& Co.,サンフランシスコ，1982,pp.257-262を参照のこ
と。

【００１７】しかしながら、本発明者らは、gp120分子
の精製にアフィニティークロマトグラフィーを使用する
と、明らかなコンホメーション変化が結合／除去の２段
階法において起こり、その結果生ずるgp120タンパク質
は精製されるが、抗体形成を誘発することまたはタンパ
ク質／タンパク質結合相互作用、例えばCD4分子との結
合を行うことについてウイルスgp120分子と同じエピト
ープを提示しないことを発見した。こうして、アフィニ
ティー精製されたgp120は、ウイルス粒子により提示さ
れると、このように精製されたタンパク質を、例えば効
率的なワクチンにおいて望ましい程度の中和抗体の誘発
に使用できるようにするのに十分な程はgp120に類似し
ない。

【００１８】認識されるように、特定の性質、例えば、
CD4へ結合する能力または無能力を有するとしてgp120の
特定組成物を論ずることは、全体としての組成物であっ
て、分子レベルで組成物中の各gp120分子それぞれの性
質を意味するのではない。例えば、発表された技術を使
って精製されたgp120の組成物は、HIV-1ウイルス上に提
示されると、天然gp120のCD4結合能力の例えば10％を有
するとして、gp120の組成物を言及することができる。
このことは、各分子の結合親和力は90％減少されている
が、幾つかの分子はそれらのもとのコンホメーションお
よび結合親和性を保持し、分子の大部分は何らかの方法
で変更されており（例えば、コンホメーションが変化し
ている）、その結果それらはそれらの結合親和力の全部
または一部分を損失している可能性が多いことを意味し
得る。従って、異なる性質を有する種々のgp120分子がg
p120組成物中に存在するようであり、そして天然の結合
特性を保持する際の精製技術の有効性は全体としての組
成物の結合特性により最もよく判断される。

【００１９】本発明者らは、HIV gp120を精製して、天
然のウイルスHIV gp120と実質的に同じタンパク質／タ
ンパク質結合特性（特にCD4結合）を有する糖ペプチド
組成物を提供できることを発見した。本発明の組成物で
は、分子の50％以上、好ましくは80％以上、最も好まし
くは90％以上がCD4分子への結合を可能にするコンホメ
ーションを有するが、これに対して、いくつかの発表さ
れた技術により生成された未精製の組成物では、その比
率はgp120の約10％以下である。

【００２０】本発明の方法は、gp120源、例えば、gp120
分子がその中に分泌されている細胞培地または細胞もし
くはウイルス溶解物を使って開始する。本発明は、細胞
培地中に分泌された全長の非融合のグリコシル化組換え
gp120タンパク質を、天然のコンホメーションを保持し
ている純粋な形態で提供するために、および精製するた
めに、特に有用である。ここで「組換えgp120タンパク
質」とは、トランスフェクション、染色体挿入、プラス
ミドの保持、またはタンパク質を発現する他の手段の結
果として、細胞が適当なgp120遺伝子を含有するかどう
かにかかわらず、非HIV感染細胞により生産されるタン
パク質を意味する。しかしながら、ウイルス源からのgp
120も使用することができる。gp120を含有するもとの粗
組成物の調製は本発明のより広い観点の一部分ではな
い。なぜなら、gp120は組換えおよびウイルス源の両方
から以前に調製されているからである。従って、gp120
源の説明は、本発明の好ましい実施態様を説明する本明
細書の後の章まで延長する。

【００２１】アフィニティークロマトグラフィー（およ
び逆相HPLCまたは有機溶媒を使用する他の技術）を、gp
120分子の所望のコンホメーションを破壊しない分離技
術で置き換えることが必要である。驚くべきことに、疎
水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、イオン
交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフ
ィーと組み合わせて使用すると、所望の精製を提供する
ことが発見された。この発見は予期せざることであっ
た。なぜなら、gp120は22個の既知のグリコシル化部位
をもつ糖タンパク質であって高度に親水性（疎水性とい
うよりも）であると予想されるからである。gp120は、
ＨＩＣ精製段階を使って汚染物からの良好な分離を可能
にするのに十分な少なくとも１つの疎水性領域を有する
ことが発見された。例えば、ほぼ10倍の精製がフェニル
ＨＩＣカラムにより達成された。図１８のＡは、gp120
がこのカラムから溶出する最後の画分であったことを示
す。アミノ酸配列中に疎水性領域が存在することは従来
知られている（疎水性プロットから）が、ＨＩＣを使用
してgp120を他のタンパク質から分離することを可能に
するのに十分な疎水性がグリコシル化後に保持されるこ
とは知られていなかったし示唆されていなかった。

【００２２】精製方法の各段階を下に詳細に記載する。
一般に、精製方法は、典型的には水および他の小さい分
子を除去することにより、細胞培地または他のgp120源
を濃縮してgp120の濃度を増加させ、；濃縮された細胞
培地をイオン交換材料により分画し、そしてCD4ペプチ
ドに対する特異的結合親和力を示す画分を集め；この第
１分画を疎水的相互作用クロマトグラフィー（好ましく
は２つのＨＩＣ段階）により分画して、適切なCD4結合
親和力を示す第２画分を提供し；そして第２分画をサイ
ズ排除濾過またはクロマトグラフィーにより分画して所
望の精製されたタンパク質を提供することを含んで成
る。この説明は、一般に、細胞培地が最も普通の源であ
るので、細胞培地をgp120源と呼ぶ。しかしながら、gp1
20の他の源を細胞培地と互換的に使用することができ
る。

【００２３】濃縮段階は、種々の源から多数のタンパク
質を精製する、すなわち、細胞培地から水および他の小
さい分子を除去することによって次の精製段階を比較的
少量の材料上で実施できるようにするのに使用される通
常の最初の段階である。従って、種々のサイズ分画技術
のいずれも使用することができる。透析および限外濾過
が好ましい技術である。最初の濃縮段階は、単に水また
は他の小分子、例えば1,000以下の分子量を有する分子
を除去することができるか、あるいはgp120分子より小
さい分子の一部または実質的に全部を除去する技術を使
用することができる。例えば、種々のカットオフ値、例
えば10,000、20,000、30,000、50,000または100,000の
分子量カットオフ値を有する膜を使って限外濾過を実施
することができる。10,000〜50,000の範囲、好ましくは
約30,000の分子量カットオフが好ましい。

【００２４】細胞培地を濃縮して小分子を排除した後、
カットオフサイズより大きい分子を含有する濃縮された
細胞培地をイオン交換材料により分画する。異なる源か
らのペプチドは、電荷が異なるために、イオン交換分画
時に異なって挙動することがある。例えば、HIV-SF2単
離物から本来分離された遺伝物質を使って得られたgp12
0はDEAEセファデックス（Sephadex）カラム上に0.1M Na
Cl中pH８において保持されないが、単離物HIV-HTLV-III
Bからのgp120は同一条件下でカラムに結合し、そして0.
1〜0.5M NaClの塩勾配で溶出させることができる。しか
しながら、特定のgp120分子がカラムへ付くかどうか重
要ではない。なぜなら、溶離を包含するイオン交換工程
は免疫学的または他のタンパク質／タンパク質結合特性
に悪影響を及ぼさないように思えるからである。

【００２５】イオン交換段階は単一段階であるかまたは
２以上の段階に分割することができる。アニオン交換樹
脂での処理は少なくとも１つの副段階に（あるいは唯一
のイオン交換段階として）好ましい。アニオン交換体
は、典型的には芳香族または脂肪族アミノ基を含み、そ
してDEAE-SEPHADEX（これはジエチルアミノエチル置換
デキストランである）、またはAG-3（これはエポキシア
ミン樹脂上に第３アミノ置換基を有する）を包含する。
これらの弱塩基性物質の代替物として、完全な正電荷を
示す第四アンモニウムイオンおよび他の交換体、例えば
Q-SEPHAROSE-HP（セファロースカラムに結合した第四ア
ンモニウムイオンを有するPharmaciaの製品）を使用す
ることができる。アニオン交換段階には、典型的にはpH
７〜９範囲、好ましくは約pH８の緩衝液が使われる。典
型的な緩衝液の例は、0.02M Trisである。イオン強度は
通常約0.05〜0.2M（NaClとして表示）の範囲、好ましく
は約0.1Mである。制御すべき他の条件としては、温度
（例えば、約０〜25℃）、カラムに適用する物質の総伝
導度（例えば、約15mS−cm）、およびタンパク質負荷容
量／樹脂容量の比（例えば、約15〜20g／L）が挙げられ
る。これらの値はDEAE-SEPHADEXカラムについて好まし
い値であり、製造業者の指示に従い他のカラム材料につ
いて変化させることができる。

【００２６】あるいは、細胞培地は、弱または強酸性交
換基、例えばそれぞれカルボン酸またはスルホン酸の基
を使ったカチオン交換クロマトグラフィーにより、精製
することができるが、このような分離はアニオン交換体
の使用より好ましくない。典型的な強酸性系、例えばス
ルホプロピルイオン交換樹脂、例えばSP-SEPHADEXを使
用することができる。gp120を含有する細胞培地を添加
し、そして典型的にはpH約６〜約８の範囲、好ましくは
pH約７において溶離する。他の条件はアニオン交換カラ
ムについて使用条件に類似する。

【００２７】所望のgp120分子を含有する画分は、gp120
を同定する多数の既知技術、例えば抗体による認識、CD
4ペプチドによる結合、またはＳＤＳゲル電気泳動のい
ずれによっても同定することができる。gp120分子を含
有する画分は、各画分から取ったアリコートにおいて分
析を行うことによって同定することができる。分画パタ
ーンを確立した後、試験しないで画分を集めることがで
きるようにイオン交換操作を十分に反復する。本発明の
各新規段階をこの方法に組み込むとき、CD4結合を、そ
の各段階についてチェックし、そしてCD4結合を使用し
て、本明細書中に記載する特定の好ましい条件からの任
意の変更（例えば、カラム支持材料、温度、緩衝液など
を変える）が本発明の範囲内のgp120組成物を提供する
かどうかを確かめることができる。CD4とgp120の間の結
合の測定についての追加の詳細を、本明細書の後の節に
記載する。

【００２８】gp120について最も明確な試験はCD4ペプチ
ドの結合である。CD4ペプチドへの結合は、典型的に
は、下の実施例に記載するような放射性免疫沈澱または
ゲル濾過ＨＰＬＣにより確かめることができる。gp120
物質を含有する画分を、個々にまたは画分を一緒にした
後に精製し、後の精製段階に使用するプールした材料を
提供することができる。

【００２９】特定の画分中のCD4ペプチドに結合するgp1
20分子の能力について一般に言及するが、このような言
語の使用はCD4ペプチドについての実際の結合アッセイ
を各段階において実施することを意味しない。むしろ、
この言語は、この段階か異なる段階についてかいずれに
せよ、CD4ペプチドに結合するgp120の能力が分離技術の
いずれかの段階において損失されないようにその状態が
維持されることを指摘するために用いられる。

【００３０】次の精製段階は疎水的相互作用クロマトグ
ラフィーを包含し、この場合、カラムを通る分子の通過
はカラム支持材料（または支持材料に結合した物質）と
分画されている分子との間の疎水的相互作用により遅延
される。このような分画方法の典型的な例は、疎水性カ
ラムを使う高性能液体クロマトグラフィー法である。典
型的なカラムはエーテルＨＩＣカラムまたはフェニルＨ
ＩＣカラムである。エーテルＨＩＣカラムはカラム支持
体にエーテル結合により結合した脂肪族基を含有し、フ
ェニルＨＩＣカラムは支持体に結合したフェニル基を含
有する。ＨＩＣ技術の当業者が理解するように、カラム
への試料の添加および溶離は、該カラムに使用する樹脂
表面に、分離されている物質を「粘着（stick）」させ
るのに十分なイオン強度（ある分子にはゼロであっても
よい）を有する溶液を使って行われる。溶離液のイオン
強度を下げる（すなわち、溶離液中の塩濃度を下げる）
と、疎水性物質がカラムにより保持される傾向が減少す
る。

【００３１】典型的なgp120の精製では、イオン交換ク
ロマトグラフィーにより得られた画分を硫酸アンモニウ
ム中35〜45％、好ましくは約40％飽和にし、そして不溶
物を遠心により除去した後、上清をＨＩＣカラムに適用
する。例えば、40％飽和硫酸アンモニウムでイオン交換
クロマトグラフィー画分を処理することは、該方法のこ
の時点で多少の汚染タンパク質を沈澱させるのに有用で
あるが、それは要求されない。gp120分子それ自体は、
今日まで試験した単離物の全ての株および突然変異体に
ついて、40％飽和硫酸アンモニウム中で沈澱しない。他
の単離物からのgp120が万一40％硫酸アンモニウムで沈
澱するならば、gp120を沈澱させるのに必要なものより
低いがgp120をＨＩＣカラムに結合させるイオン強度を
与える程十分に高い濃度を選択することができる。必要
に応じて、他の塩を硫酸アンモニウムの代わりに使用す
ることができる。この節において説明する塩濃度は例示
であり、この分野で知られているように、流速、温度お
よび溶出時間を変化させることによって他の塩および塩
濃度を使用することができる。硫酸アンモニウムは、高
濃度で存在するとタンパク質構造を安定化するので、好
ましい。

【００３２】種々の疎水的相互作用クロマトグラフィー
を使用することができ、そして本発明は特定の樹脂に限
定されない。典型的なＨＩＣカラムの例としては、ブチ
ル（butyl Foyo Perl, Toyo Soda）、オクチル（octyl
Sepharose, Pharmacia）およびフェニル（Phenyl Sepha
rose, Pharmacia）が挙げられる。イオン交換クロマト
グラフィーと同様、疎水的相互作用に基づく分離はタン
パク質のコンホメーションに悪影響を及ぼすとは思われ
ない。

【００３３】それらのカラムを使用する条件は、当業界
において知られているように特定のカラムによって変化
する。典型的な条件としては次のものが挙げられる：pH
約５〜約７（例えば、0.02M酢酸ナトリウム、pH5.0）；
約0.05〜2.0M（NaClとして表示）、好ましくは0.1Mのイ
オン強度；および40％硫酸アンモニウム（または前述の
ような種々の初期濃度）から０％硫酸アンモニウムまで
減少する勾配を使った溶出。

【００３４】単一ＨＩＣ段階を使用することができる
が、少なくとも２つのＨＩＣ副段階が好ましく、好まし
くは異なるＨＩＣ支持体（例えば、フェニルＨＩＣカラ
ム上での分離に次いでエーテルＨＩＣカラム上での分
離）を使用する。しかしながら、同一カラム（例えば、
フェニルＨＩＣカラム）上での２回の分離を使用するこ
とができる。既知の技術を使って条件を調節して、所望
の活性を有するタンパク質のピークをイオン交換クロマ
トグラフィーにより精製された画分中になお存在する別
のタンパク質含有ピークから分離するのに備えることが
できる。上記と同様、所望の活性を含有する画分を集
め、そしてそのような活性を含まない画分から分離す
る。

【００３５】疎水的相互作用クロマトグラフィーから得
られた所望の活性を含有する画分を、ゲル濾過（ゲル浸
透クロマトグラフィーとしても知られており、ゲル濾過
ＨＰＬＣ技術を包含する）にかける。純度がＨＩＣ後十
分である場合、最後のＨＩＣカラムからの溶出液をゲル
濾過カラムに直接適用することができる。純度はゲル電
気泳動およびクーマシーブルー染色により測定され、そ
して少なくとも５％、好ましくは少なくとも50％（存在
するタンパク質の重量による）であるべきである。しか
しながら、所望のレベルの純度がこの段階で達成されな
い場合、ＨＩＣ溶出液をゲル濾過前にイオン交換クロマ
トグラフィーにかけることによって本発明の方法を実施
することができる。非効率的な発現系を使用した結果初
期の細胞培地が他のタンパク質と比較して比較的少量の
gp120を含有する場合、この段階において低純度が時折
見られる。アンモニウムイオン側基をもつ支持体を使用
するＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーは、高い効
能のアニオン交換樹脂を用いるイオン交換または中圧ク
ロマトグラフィー、例えばPharmaciaのＱ−セファロー
ス高性能クロマトグラフィーがこの段階において必要で
ある場合、特に好ましい。

【００３６】精製工程のこの時点において（すなわち、
ＨＩＣおよび、必要ならば第２イオン交換段階後）、除
去され得る不純物は大部分が低分子量不純物である。同
じく、使用する特定の材料および条件は特に制限されな
い。デキストラン、ポリアクリルアミドまたはアガロー
スゲルはすべて使用することができる。10K〜500K、好
ましくは50K〜200Kの分子量分画範囲を典型的には選択
する。ＨＰＬＣとともに使われる特に好ましいカラムは
SUPERDEX 200（Pharmacia）である。それの使用条件
は、典型的には0.1Mのリン酸ナトリウム、pH6.7であ
る。ゲル排除クロマトグラフィーは、中和抗体の形成の
誘発に必要なエピトープの提示に悪影響を及ぼすとは思
われない。

【００３７】プロテインＧのアフィニティー精製は、本
法の任意の段階において、例えばイオン交換クロマトグ
ラフィー後およびＨＩＣ前に実施して、当業界において
知られているようにＩｇＧ汚染を減少または排除するこ
とができる。プロテインＧのアフィニティー精製を実施
する適当な方法は当業界において知られており、そして
アフィニティーカラム、例えばプロテインＧセファロー
スファーストフロー（Fast Flow）、Pharmaciaなどの使
用を包含する。非限定的例により、0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液pH７を使用することができるが、任意の常用の
緩衝液を使用することができる。

【００３８】前述の精製段階のすべてにおいて、分離段
階により生成した画分の収集および取り扱いの間を包含
する、変性を最小にするように条件を維持すべきであ
る。したがって、すべての溶液のpHは約４〜約９、好ま
しくは５〜８の範囲であるべきである。イオン強度は、
前述したようにより高いことがある硫酸アンモニウムを
除外して、0.02〜0.5M（NaCl当量）、好ましくは0.05〜
0.3Mであるべきである。温度は０〜25℃、好ましくは２
〜８℃であるべきである。洗浄剤および有機溶媒は完全
に回避すべきである。

【００３９】上記段階のいずれかにより得られた画分
は、所望により限外濾過または他の濃縮技術により濃縮
して溶媒および他の小分子を除去することができる。こ
のような限外濾過は、一般に、gp120ピークが数画分に
わたって広がる時に起こり得るように、分画工程がgp12
0含有画分を希釈することがない限り、要求されない。

【００４０】要約すると、前述の精製手順は、CD4結合
が低下しないことを保証するために各新規段階後に試験
することによって達せられた。タンパク質を変性条件、
例えば逆相および免疫アフィニティークロマトグラフィ
ーに暴露しうる段階は回避された。精製の多くは、硫酸
アンモニウムの存在下での２つの異なる疎水性樹脂への
gp120の強い結合を活用することによって達成された。
さらに、精製されたタンパク質は、0.1M NaCl中で中性p
Hにおいて疎水的様式で、名目上のゲル濾過樹脂であるS
uperose^R 12に強く結合した。この挙動は、炭水化物の
親水性およびgp120が50重量％以上炭水化物であるとい
う事実から見て幾分驚くべきことであった。

【００４１】生産手順は、ここに記載するように、40L
スケール（40Lの培養上清を使用して出発する）で反復
して実施した。この手順は、0.4Lから少なくとも200Lの
細胞培養上清の範囲の適当な大きさのカラムを使用す
る、より小スケールおよびより大スケールでも使用し
た。生産物の収率および純度はこの範囲のスケールに渡
りほぼ一定であった。最近、細胞の生産は連続懸濁培養
において実施されている。この改良はgp120の大量生産
を容易にする。出発材料として回転瓶または連続培養上
清を使った時、ロット間での生産物の挙動の有意な差は
検出されなかった。

【００４２】実際の精製方法の詳細な説明は下の実施例
に記載する。本発明はその特定の実施例に限定されない
が、その実施例は本発明の範囲内に含まれる完全な分離
のための特定のパラメーターを示すことによって追加の
手引を提供する。

【００４３】（精製方法により生成されたgp120の特
徴）本発明の方法により生成されたgp120糖タンパク質
は、クーマシーブルー染色を使用するＳＤＳゲル電気泳
動により評価すると純粋であり、そしてCD4結合アッセ
イにおいて完全な活性を保持する。ほぼ95％の純度のレ
ベルが推定される。ここで純度とは他のタンパク質の不
存在を意味する。なぜなら、純粋なgp120は、異なるgp1
20分子で炭水化物含量に差があるために、不均質組成物
であるからである。本発明の精製方法の生産物は、ウイ
ルス源から得られるgp120の天然のコンホメーションと
区別することができないように思われる。精製されたgp
120が本発明において得られる物質のコンホメーション
を有するかどうかを決定するために使用できるアッセイ
の特定の例は、下の実施例に記載されている。一般に、
これらの試験は、CD4結合、ゲル濾過ＨＰＬＣ（酸化条
件下と還元条件下の両方）、およびgp120特異的抗血清
との反応を包含する。

【００４４】他の研究者らは、ここに特定する以外の種
々の技術により精製された組換えgp120がCD4レセプター
への結合親和力の減少を示すことを報告している。この
結合親和力の減少の理由は確実には知られていないが、
それは精製の間の分子のコンホメーションの変化を表す
と思われる。例えば、本発明者らがgp120について最初
に試みた１つの精製計画はアフィニティークロマトグラ
フィーおよび逆相ＨＰＬＣを使用した。その手順により
精製された物質はほぼ80％の純度であり、そしてgp120
に特異的なモノクローナル抗体を使ったＥＬＩＳＡアッ
セイにおいて期待した反応性レベルを示した。しかしな
がら、試験管内で測定したCD4レセプターに対する結合
活性はほぼ１／10に下落した。本発明の系は、従来入手
可能なgp120と同程度の高さであるかあるいはそれより
高い純度であると同時に完全なCD4結合活性を保持して
いるgp120を提供する。さらに、この精製技術は穏当な
収率の生産物を提供し、そしてgp120の大量生産（数100
mgまたはそれ以上の範囲における）に適当である。アフ
ィニティークロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣのい
ずれも必要とせず、従ってそれらの精製に関連するコン
ホメーション変化（高イオン強度および有機溶媒との接
触により引き起こされる）を排除する。完全な活性はＥ
ＬＩＳＡおよびCD4レセプター結合アッセイにおいて観
測された。精製された物質は、本明細書中「コンホメー
ション保持されたgp120の天然コンホメーション」と表
示し、ウイルス粒子上に提示されるとgp120と識別不可
能であるように見える。

【００４５】例えば、HIV-SF2から望まれるコンフォメ
ーション保持した組換えgp120は、ウイルスのHIV-SF2 g
p120と識別不可能であった。該タンパク質はＳＤＳゲル
上で非常によく似た移動度を有した。それらは、アッセ
イしたすべての血清に関して、免疫沈澱、ウエスタンブ
ロット、および固相捕捉アッセイにおいて同等の免疫反
応性を示した。

【００４６】精製されたタンパク質は還元または非還元
ＳＤＳゲルにおいて120Kの分子量を示した；よってポリ
ペプチド鎖は完全である。中性pHの非変性緩衝液中での
ゲル濾過ＨＰＬＣは130Kの分子量推定値を与え、精製さ
れたタンパク質がこれらの条件下では凝集する傾向が少
ないことを示した。このタンパク質は、いくつかのカラ
ム上での挙動により明らかなように、驚くべき疎水性の
性質を有した。

【００４７】CD4への組換えgp120の結合をゲル濾過ＨＰ
ＬＣアッセイにおいて直接研究した。ウイルスgp120と
同様、gp120はCD4に高親和力および１：１の化学量論で
結合した。このアッセイにより測定すると、精製された
gp120分子の少なくとも90％がCD4に結合することができ
た。最後に、精製されたタンパク質はCD4についてH6.9n
MのK_dを有する。この値はウイルスのgp120および他の精
製された調製物のＣＤ４レセプターへの結合について測
定された親和力の範囲内にある（Ｓｍｉｔｈら、Scienc
e（1987）238：1704およびLaskyら、Cell（1987）50：9
75参照）。

【００４８】（精製のためのgp120源）本発明の広い局
面は、gp120分子を含有する源媒質を調製する段階を包
含する。組換え技術によるgp120の調製はどこかに記載
されており、例えば本明細書の背景の項目において挙げ
た刊行物およびそれらの中に引用された刊行物中に記載
されている。本発明の技術は、異なるgp120分子を生産
する異なるHIV単離物からの遺伝物質を含有する、種々
の細胞系からのgp120順化培地に適用された。非組換え
源からのgp120を使用することもできる（例えば、ウイ
ルスに感染した細胞系）。gp120の特定の源を下の実施
例において同定し、そしてgp120の発現のための細胞培
養の一般的説明を下記に記載するが、本発明はこのよう
な源に限定されない。

【００４９】SF2-gp120は、本発明の精製方法を開発す
るためのモデルとして働いた。幾つかの他のクローン化
gp120遺伝子は、HIV-1の他の単離物並びにgp120遺伝子
の試験管内突然変異誘発により作られた幾つかの変形に
ついて入手可能である。例えば、15の異なるHIV-1単離
物（ＳＦ２，ＨＸＢ２，ＢＲＵ，ＭＮ，ＳＣ，ＮＹ５，
ＣＤＣ４，ＷＭＪ２，ＲＦ，ＭＡＬ，ＥＬＩ，Ｚ９６，
Ｚ３，Ｚ３２１，およびＪＹ１）からのクローン化遺伝
子によりコードされるアミノ酸の完全配列は、Myers
ら、Human Retroviruses and Aids,1990 (1990), Los A
lamos, New Mexco:Los Alamos National Laboratoryに
報告されており、その開示全体をここに引用によって加
える。７つの配列（それらのうちの６つは90／02568に
示されるものと異なる）は、Modrowら、J.Virol.(198
7）61：570-578に示されている。Srinivasanら、Gener
（1987）52：71-82は、ザイールにおいて単離された追
加のHIV-1単離物の配列を報告している。これらの刊行
物の両者もここに引用によって加える。今日までの本発
明者らの経験は、配列およびアミノ酸組成がSF2-gp120
とかなり異なることがあるけれども、本明細書に記載の
方法が他の単離物からのgp120タンパク質並びに該遺伝
子の突然変異形に使用できることを示した。

【００５０】組換え源に加えて、gp120の天然ウイルス
源を使用することができる。HIVを保有する細胞系は、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（the
American Type Culture Collection）（米国メリーラン
ド州ロックビル）から入手可能である（ATCC CRL854
3）。この細胞系は米国特許4,520,113号に記載されてい
る。他のウイルス単離物は、Tersmetteら、J.Virol.(19
88）62：2206-2032およびPopovicら、Science（1984）2
24：497-500に記載されている。

【００５１】組換え源は、生産が容易であり且つ活性HI
V-1ウイルスによる感染の危険を回避するので好まし
い。全長の組換えgp120は、多数の既知発現系のいずれ
かを使用して調製することができる。すべてのこのよう
な系は成熟gp120のアミノ酸のすべてをコードする指令
を含有するであろう（例えば、SF2中のenv遺伝子のアミ
ノ酸30または31〜509）。

【００５２】HIV gp120核酸配列は、組換えＤＮＡ法に
より、例えばｍＲＮＡの逆転写物をスクリーニングする
ことにより、あるいは任意の細胞からのゲノムライブラ
リーをスクリーニングすることにより得ることができ
る。該ＤＮＡは、発表された配列から常用技術およびＤ
ＮＡ合成装置を使ってＤＮＡを合成することにより得る
ことができる。ユニーク制限部位をＤＮＡの調製時に導
入することができ、それによってそうでなければ天然源
中に存在しない制限部位を含有するベクター中での遺伝
子の使用を促進するため、合成が有利であろう。さら
に、ＤＮＡ中の任意の所望の部位の修飾を、突然変異誘
発によりＤＮＡを更に修飾する必要なしに、合成により
導入することができる。

【００５３】一般に、新規株からのHIV gp120ポリペプ
チドをコードするＤＮＡは、野外または実験室単離物か
ら得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製
し、そして（１）ｃＤＮＡライブラリー中の相同配列を
含有するクローンを検出するために、エンベロープタン
パク質の部分をコードする標識ＤＮＡプローブを用いて
スクリーニングし、あるいは（２）ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）を使用してｃＤＮＡを増幅し、そして標識
ＤＮＡプローブを用いてサブクローニングおよびスクリ
ーニングすることにより得ることができる。次いで、ク
ローンを制限酵素分析および核酸配列決定により分析し
て全長のクローンを同定し、全長のクローンが該ライブ
ラリーの中に存在しない場合には、適当な断片を種々の
クローンから回収し、そしてクローンに共通の制限部位
でそれらを連結して、全長の分子をコードするクローン
を構築する。ＤＮＡプローブは、付随の実施例に記載す
る遺伝物質から調製することができる。HIV gp120 ｃＤ
ＮＡの5'末端から失われている配列は、鋳型としてｍＲ
ＮＡを使用してHIV gp120配列に相補的な合成オリゴヌ
クレオチドの3'伸長（いわゆるプライマー伸長）により
得ることができ、あるいは相同性配列を既知のｃＤＮＡ
から供給することができる。

【００５４】本発明の方法による精製のためのgp120の
生産は、特記しない限り、当業者の技術の範囲内の従来
の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を使用
するであろう。このような技術は文献中に詳細に記載さ
れている。例えば、Maniatis,Fritsch & Sambrook,“Mo
lecular Cloning：A Laboratory Manual”第２版(198
9);“DNA Clonig：A Practical Approach,”Vol.Ｉおよ
びII（D.N.Glover編、1985);“Oligonucleotide Synthe
sis”(M.J.Gait編、1984);“Nucleic Acid Hybridizati
on”(B.D.Hames & S.J.Higgins編、1985);“Transcript
ion And Translation”(B.D.Hames & S.J.Higgins編、1
984);“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney編、198
6);“Immobilized Cells And Enzymes”(IRL Press,198
6);B.Perbal,“A Practical Guide To Molecular Cloni
ng”(1984)を参照のこと。

【００５５】本発明の方法による精製のための組換えgp
120の調製に使用する遺伝物質の説明において、次の用
語を下に記載する定義に従い使用する。

【００５６】「レプリコン」は、生体内の自己ＤＮＡ複
製単位として機能する、すなわち、それ自身の支配下で
複製することができる、遺伝要素（例えば、プラスミ
ド、染色体、ウイルス）である。

【００５７】「ベクター」は、他のＤＮＡセグメントを
取り付けて、取り付けられたセグメントの複製を引き起
こすことができるレプリコン、例えばプラスミド、ファ
ージまたはコスミドである。

【００５８】「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二本
鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グア
ニン、チミジンおよび／またはシトシン）の重合形態を
言う。この用語は分子の一次および二次構造のみに対し
て言及し、それを特定の三次形態に限定しない。従っ
て、この用語は、特に直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限
断片）、ウイルス、プラスミドおよび染色体の中に見い
だされる二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ
分子の構造を論じる際には、配列はＤＮＡの非転写鎖
（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿
って5'→3'方向において配列を与える通常の慣習に従い
記載することができる。

【００５９】ＤＮＡ「コード配列」は、適当な調節配列
の支配下に置かれたとき、生体内で転写されポリペプチ
ドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の
境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カル
ボキシ）末端の翻訳終結コドンにより決定される。コー
ド配列は次のものを包含することができるが、これらに
限定されない：原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡか
らのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）のＤＮＡか
らのゲノムＤＮＡ配列、ウイルスＤＮＡ、および更には
合成ＤＮＡ配列。ポリアデニル化シグナルおよび転写終
結配列は、通常、コード配列の3'側に位置するであろ
う。

【００６０】転写および翻訳調節配列は、ＤＮＡ調節配
列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル
化シグナル、ターミネーターなどであり、これらは宿主
細胞におけるコード配列の発現に備える。

【００６１】「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡ
ポリメラーゼと結合し、そして下流（3'方向）のコード
配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域で
ある。本発明を定義する目的上、プロモーター配列は３
末端では転写開始部位に境を接しており（包含的に）そ
して上流（5'方向）には、バックグラウンドより上の検
出可能なレベルにおいて転写を開始するために必要な最
小の数の塩基または要素を包含する。プロモーター配列
内には、転写開始部位（便利には、ヌクレアーゼＳ１で
マッピングすることによって定められる）、並びにＲＮ
Ａポリメラーゼ結合の原因となるタンパク質結合領域
（共通配列）が見いだされるだろう。真核プロモーター
は、常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックス
および「ＣＡＴ」ボックスを含む。

【００６２】コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコー
ド配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこれがコード配列に
よりコードされるタンパク質に翻訳される時、細胞中で
転写および翻訳調節配列の「支配下に」ある。

【００６３】「シグナル配列」は、コード配列の前に含
まれることができる。この配列は、ポリペプチドのＮ末
端にあるシグナルペプチドをコードし、このシグナルペ
プチドは宿主細胞と共同してポリペプチドを細胞表面に
差し向けるかまたはポリペプチドを媒質中に分泌させ、
そしてこのシグナルペプチドはタンパク質が細胞を離れ
る前に宿主細胞により切り取られる。シグナル配列は原
核生物および真核生物に生来ある種々のタンパク質と関
連して発見することができる。例えば、生来の酵母菌タ
ンパク質であるα因子は酵母菌から分泌され、そしてそ
のシグナル配列は媒質中に分泌させようとする異種タン
パク質に取り付けることができる（米国特許第4,546,08
2号、EPO O 116 201号、1983年１月12日公開）。さら
に、α因子およびその類似体は、種々の酵母菌、例えば
サッカロミセス（Saccharomyces）およびクルイベロミ
セス（Kluyberomyces）から異種タンパク質を分泌させ
ることが発見されている（EPO 8831206.9号、1988年12
月23日出願；EPO 0 324 274号、およびEPO公開番号0 30
1 669号、1989年２月１日公開）。哺乳動物細胞におけ
る使用例は、第VIIIc因子軽鎖の発現に使用するｔＰＡ
シグナルである。

【００６４】外因性または異種ＤＮＡが細胞の内側に導
入されたとき、細胞はこのようなＤＮＡにより「形質転
換」されている。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノム
を構成する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合され
る）ても組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物で
は、形質転換するＤＮＡはエピソーム要素、例えばプラ
スミドまたはウイルスのベクター上に維持され得る。Ｂ
ＰＶにより形質転換された細胞は安定であり、そしてエ
ピソームのままである。真核細胞については、安定に形
質転換された細胞は、形質転換するＤＮＡが染色体の複
製を通して娘細胞により遺伝されるように染色体中に組
み込まれるようになる細胞である。この安定性は、形質
転換するＤＮＡを含有する娘細胞の集団から構成された
細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力により
実証される。「クローン」は、単一細胞または共通の祖
先からの有糸分裂により誘導される細胞の集団である。

【００６５】「細胞系」は、多数の世代に渡り試験管内
で安定に増殖することができる一次細胞のクローンであ
る。

【００６６】２つのＤＮＡ配列が、ヌクレオチドの少な
くとも約85％（好ましくは少なくとも約90％、最も好ま
しくは少なくとも約95％）がＤＮＡ配列の定められた長
さにわたって合致するとき、「実質的に相同」である。
実質的に相同である配列は、例えば特定の系について定
められたような緊縮条件下で、サザンハイブリダイゼー
ション実験において同定することができる。適当なハイ
ブリダイゼーション条件を定めることは当業者の技量の
範囲内である。例えば、Maniatisら、前掲；DNA Clonin
g,Vol.Ｉ&II, 前掲；Nucleic Acid Hybridization, 前
掲を参照のこと。

【００６７】ＤＮＡ構成物の「異種」領域は、天然では
大分子に関連して見いだされないような、より大きいＤ
ＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。異
種領域が哺乳動物遺伝子をコードするとき、該遺伝子は
通常、起源生物のゲノム中では哺乳動物ゲノムＤＮＡを
隣接しないＤＮＡによって隣接されるだろう。異種コー
ド配列の他の例は、コード配列それ自体が天然に見いだ
されない構成物（例えば、ゲノムコード配列がイントロ
ンを含有するｃＤＮＡ、または生来の遺伝子と異なるコ
ドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異型また
は天然に存在する突然変異の現象は、ここに定義するＤ
ＮＡの異種領域を引き起こさない。

【００６８】「Ａ」を含んで成る組成物（ここで「Ａ」
は単一のタンパク質、ＤＮＡ分子、ベクターなどであ
る）は「Ｂ」（ここで「Ｂ」は１または複数の汚染タン
パク質、ＤＮＡ分子、ベクターなどである）を実質的に
含有しない時には、組成物の中のタンパク質、ＤＮＡ、
ベクター（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーに依存す
る）の少なくとも約75％が「Ａ」である。好ましくは、
「Ａ」は組成物中においてＡ＋Ｂ種の少なくとも約90重
量％、最も好ましくは少なくとも99重量％である。ま
た、汚染物質を実質的に含有しない組成物は、着目の種
の活性または特性を有する単一分子量種（糖タンパク質
のポリペプチド部分、例えば、gp120に関して）のみを
含有することが好ましい。

【００６９】「抗体」は特異的エピトープに結合する任
意の免疫グロブリンであり、抗体およびその断片を包含
する。この用語は、なかでも、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体およびキメラ抗体を包含する。キメラ
抗体については、米国特許第4,816,397号および米国特
許第4,816,567号を参照のこと。

【００７０】それ以上のプロセシング用の大量のＤＮＡ
の調製（クローニングベクター）またはHIV gp120遺伝
子ポリペプチドの発現（発現ベクター）のため、HIV gp
120遺伝子ポリペプチドをコードするＤＮＡの操作を簡
素化するのにベクターが使われる。ベクターは、プラス
ミド、ウイルス（ファージを包含する）、および組み込
み可能なＤＮＡ断片、すなわち組換えにより宿主ゲノム
中に組み込まれる断片を含む。クローニングベクターは
発現調節配列を含む必要はない。しかしながら、発現ベ
クター中の調節配列は、転写および翻訳調節配列、例え
ば、転写プロモーター、適当なリボソーム結合部位をコ
ードする配列、および転写および翻訳終結の調節配列を
含む。発現ベクターは、好ましくはHIV gp120遺伝子の
安定な発現を促進するためおよび／または形質転換体を
同定するため選択遺伝子を含むであろう。しかしなが
ら、発現を維持するための選択遺伝子は、真核宿主細胞
を使った同時形質転換方式において別個のベクターによ
り供給することができる。

【００７１】適当なベクターは、一般に、レプリコン
（複製開始点、非組込み型ベクターにおいて使用する）
および意図する発現宿主と適合性である種から誘導され
た調節配列を含有するであろう。用語「複製可能な」ベ
クターとは、本明細書中で使用するとき、そのようなレ
プリコンを含有するベクター並びに宿主ゲノムの中への
組み込みにより複製されるベクターを包含することを意
図する。形質転換された宿主細胞は、HIV gp120遺伝子
をコードするＤＮＡを含有するベクターにより形質転換
またはトランスフェクションされた細胞である。発現さ
れたHIV gp120は、発現されるペプチド中の適当なプロ
セシングシグナル、例えば同種または異種シグナル配列
の支配下で、培養上清中に分泌されるであろう。分泌さ
れたタンパク質のみが完全にグリコシル化され、そして
完全にCD4結合を行うことができる。Fennieら、J.Viro
l.(1989）63：639-646参照。

【００７２】宿主細胞のための発現ベクターは、通常、
複製開始点、HIV gp120遺伝子コード配列の上流に置か
れたプロモーター、並びにリボソーム結合部位、ポリア
デニル化部位、および転写停止配列を含む。当業者は、
これらの配列のあるものがある種の宿主中での発現には
必要でないことを認識するだろう。微生物と共に使用す
る発現ベクターは、宿主により認識される複製開始点、
宿主中で機能するプロモーター、および選択遺伝子を含
有することのみを必要とする。

【００７３】汎用されるプロモーターは、ポリオーマ、
ウシ乳頭腫ウイルス、ＣＭＶ（ウシまたはヒトのいずれ
かのサイトメガロウイルス）、ラウス肉腫ウイルス、ア
デノウイルス、およびシミアンウイルス40（SV40）に由
来する。他の調節配列（例えば、ターミネーター、ポリ
Ａ、エンハンサーまたは増幅配列）を使用することもで
きる。

【００７４】発現ベクターは、HIV gp120遺伝子コード
配列が適当な調節配列と共にベクター中に置かれるよう
に作製され、調節配列に関するコード配列の位置および
向きは、コード配列が調節配列の「支配」下に転写およ
び翻訳されるようなものである（すなわち、調節配列の
ところで該ＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼが
コード配列を転写する）。調節配列は、ベクター、例え
ば前述のクローニングベクター中への挿入の前に、コー
ド配列に連結せしめることができる。あるいは、調節配
列および適当な制限部位を既に含有する発現ベクターの
中にコード配列を直接クローニングすることができる。
選択した宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、調節配列
はHIV gp120遺伝子コード配列に対して同種または異種
であることができ、そしてコード配列はイントロンを含
有するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができ
る。

【００７５】高等真核細胞を脊椎動物または無脊椎動物
細胞（昆虫を含む）のいずれにせよ使用することがで
き、そしてそれらの増殖方法は知られている。例えば、
TissueCulture, Academic Press, KruseおよびPatterso
n編（1973）を参照のこと。

【００７６】高等真核生物中でHIV gp120遺伝子を発現
せしめるのに適当な宿主細胞としては、次のものが揚げ
られる：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ
系（COS-7,ATCC CRL 1651)；ベビーハムスター腎臓細胞
（BHK,ATCC CRL10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞
−DHFR（UrlaubおよびChasin, PNAS（USA）77：4216(19
80)に記載されている）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ
４；Mather,J.P.,Biol.Reprod.23：243-251(1980)）；
サル腎臓細胞（ＣＶＩ ATCC CCL 70）；アフリカミドリ
サル腎臓細胞（VERO76,ATCC CRL-1587）；ヒト子宮頸癌
細胞（HELA,ATCCCCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK,ATCC CC
L34)；バッファロラット肝細胞（BRL3A,ATCC CRL144
2）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL75）；ヒト肝細胞（H
ep G2,HB8065)；マウス乳癌（MMT 060652,ATCC CCL 5
1）；ラット肝癌細胞(HTC,Ml；54、Baumann,M.ら、J.Ce
le Biol.85：1-8(1980)）およびＴＲＩ細胞（Mather,J.
P.ら、Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68（1982））。 哺乳動物組織中で発現される時、組換えHIV gp120遺伝
子産物がグリコシル化のためにより高い分子量を有する
ことがあることは理解されるであろう。したがって、12
0kDと多少異なる分子量を有するHIV gp120の部分的また
は完全なグリコシル化形態は本発明の範囲内にある。

【００７７】他の好ましい発現ベクターは真核系におい
て使われるものである。真核発現系の例は、この分野に
おいてよく知られているワクシニアウイルスを使用する
系である。例えば、Macketら（1984）J.Viro.49：857;
“DNA Cloning,”Vol.II,pp.191-211,前掲；PCT公開番
号WO86/07593を参照のこと。酵母発現ベクターは当業界
において周知である。例えば、米国特許第4,446,235
号、米国特許第4,443,539号；米国特許第4,430,428号；
欧州特許公開番号103,409号；同100,561号；同96,491号
を参照のこと。他の好ましい発現系は、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞を形質転換するベクターｐＨＳｌであ
る。PCT公開番号WO87/02062号を参照のこと。哺乳動物
組織は選択可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（DHFR）またはチミジンキナーゼをコードするＤ
ＮＡとHIV gp120をコードするＤＮＡとで同時形質転換
せしめることができる。野生型DHFR遺伝子を使用する場
合、DHFR欠損であって従ってヒポキサンチン、グリシン
およびチミジンを欠くｈｇｔ培地中での好結果のトラン
スフェクションのためのマーカーとしてDHFRコード配列
の使用を可能にするような宿主細胞を選択することは好
ましい。この場合において適当な宿主細胞はDHFR活性を
欠損するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系
であり、これはUrlaubおよびChasin, 1980, Proc.Natl.
Acad.Sci.(USA）77：4216に記載されているようにして
調製されそして増殖される。

【００７８】選択した発現系および宿主に依存して、HI
V gp120は、外因性または異種のＤＮＡ構成物、例えば
前述の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、
HIVgp120タンパク質が発現される条件下で増殖させるこ
とによって生産される。次いで、HIV gp120を宿主細胞
から分離し、そして精製する。発現系がHIV gp120遺伝
子を増殖培地中に分泌する場合、前述したように無細胞
培地からタンパク質を直接精製することができる。適当
な増殖条件および初期の粗製物回収法の選択は、当業者
の技量の範囲内である。

【００７９】HIV gp120のコード配列がいったん調製ま
たは単離されれば、それを任意の適当なベクターの中に
クローニングし、これによりHIV gp120遺伝子コード配
列を含有しない細胞を実質的に含まない（例えば、他の
ライブラリークローンを含まない）細胞の組成物中で維
持することができる。多数のクローニングベクターが当
業者に既知である。クローニング用の組換えＤＮＡベク
ターおよびそれらが形質転換することができる宿主細胞
としては、種々のバクテリオファージλベクター（Ｅ．
コリ）、pBR322（Ｅ．コリ）、pACYC177（Ｅ．コリ）、
pKT230（グラム陰性菌）、pGV1106（グラム陰性菌）、p
LAFR1（グラム陰性菌）、pME290（非Ｅ．コリグラム陰
性菌）、pHV14〔Ｅ．コリおよびバシラス・ザブチリス
（Bacillus subtilis)〕、pBD9（バシラス）、pIJ61
〔ストレプトマイセス（Streptomyces)〕、pUC6（スト
レプトマイセス）、アクチノファージ、fC31（ストレプ
トマイセス）、YIpS（サッカロミセス）、YCp19(サッカ
ロミセス）、およびウシ乳頭腫ウイルス（哺乳動物細
胞）が挙げられる。一般に、DNA Cloning:Vol.Ｉ&II,
前掲；T.Maniatisら、前掲；B.Perbal, 前掲を参照のこ
と。

【００８０】開裂部位の挿入のための部位特異的突然変
異誘発（必要な時）は、所望の突然変異を示す限定され
たミスマッチ以外は、突然変異誘発しようとする一本鎖
ファージＤＮＡに相補的である合成オリゴヌクレオチド
からなるプライマーを使って行われる。簡単に述べる
と、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し
てファージに相補的な鎖の合成を指令し、そして生じた
二本鎖ＤＮＡをファージ保持宿主細菌中に形質転換せし
める。形質転換された細菌の培養物をトップアガー中に
塗抹し、ファージを収容する単一細胞からのブラーク形
成を可能にする。

【００８１】理論的には、新しいプラークの50％は、一
本鎖として、変異形態を有するファージを含むであろ
う；50％はもとの配列を有するであろう。得られたプラ
ークを、正確な合致のハイブリダイゼーションを可能に
するが、もとの鎖との不一致がハイブリダイゼーション
を防ぐのに十分である温度で、リン酸化された合成プラ
イマーとハイブリダイズせしめる。次いで、プローブと
ハイブリダイズするプラークを取り上げ、培養し、そし
てＤＮＡを回収する。

【００８２】タンパク質の中への非天然アミノ酸の部位
特異的組り込みのための一般的方法は、Christopher J.
Noren,Spencer J.Anthony-Cahill, Michael C.Griffit
h,Peter G.Schultz（1989年４月), Science, 244巻、18
2-188頁に記載されている。この方法を使用して、非天
然アミノ酸をもつ類似体をつくることができる。

【００８３】本発明の精製方法は、哺乳動物細胞の増殖
に典型的に使用される、ウシ胎児血清を含有する細胞培
地上で実施することができるけれども、比較的少量のＦ
ＣＳを含有する細胞培地を使用することが好ましい。例
えば、gp120遺伝子を含有するプラスミド構成物により
トランスフェクトされたＣＯＳ細胞をgp120源として使
用することができる。このようなgp120を一時的に発現
する細胞は、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、グルタ
ミンおよび１％（通常の５〜６％の代わりに）のウシ胎
児血清を含有するかまたは含有しないダルベッコ改良必
須培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させることができる。トラ
ンスフェクション後様々な時間間隔からプールした細胞
培地を本発明の精製方法にかけることができる。

【００８４】gp120の発現のために本発明者らが実験的
に使用した発現系は、1987年12月24日出願の米国特許出
願第138,894号（その開示をここに引用によって加え
る）に詳しく記載されている。使用した特定のベクター
はpCMV6a120-SF2（米国特許出願第138,894号ではpCMV6A
RV120tpaと呼ばれている）およびAd-dhfrと表示する。
それらのベクターを使用してＣＨＯ細胞系をトランスフ
ェクトせしめ、CHO-A-6a120-145-0.1-22と命名されたgp
120生産者を得た。他の技術により調製される他のgp120
産生物を上回る利点は、この細胞系の使用において認め
られない。

【００８５】粗製形態のgp120の産生に使用される、特
定の方法、細胞系、または遺伝単離物は任意の他の技術
よりも好ましいと思われないことを認識すべきである。
本発明の精製技術は、全長のグリコシル化された非融合
gp120を含有する任意の源から、コンホメーション保持
されたgp120を生産するであろうことが期待される。下
の実施例の項目におけるgp120生産に関する特定の実施
例は、多くの場合便宜のためにのみなされた決定から生
ずる。特定の遺伝物質、細胞系、増殖条件などは、発明
者らに最も良く知られておりかつ容易に入手可能である
ものから選択され、そして本発明者らは特定の文献に記
載されているかまたは後で開発される任意のgp120源を
本発明の精製方法の実施において等しく良好に使用でき
ると思う。

【００８６】（gp120/CD4結合の標準物として使用され
るCD4ペプチド源）gp120組成物が本明細書に記載の結合
特性を有するかどうかを試験するために有用であるCD4
分子は、天然源からの分離を包含する種々の方法で、お
よび遺伝子操作の技術により調製することができる。gp
120分子に結合することができる可溶性ヒトCD4断片は、
PCT出願第8903222号（1989年４月20日公開および1988年
10月５日出願）に記載されている。gp120結合を示す修
飾されたCD4分子は、ＰＣＴ出願第8902922号（1989年４
月６日公開および1988年10月３日出願）に記載されてい
る。下の実施例において使用するCD4の調製において源
として使用する細胞系に類似したCD4分泌細胞系は、Ｅ
ＲＣバイオサービス・コーポレーション（BioService C
orporation）、米国メリーランド州20850ロックビル、
ロフトランドレーン649Aから入手することができ、そし
てAIDS Research and Reference Reagent Program Cata
logue、1990年１月版、U.S.D.H.H.S.のNational Instit
utes of Health発行に、細胞系ＣＨＯ ＳＴ４．２とし
て記載されている。CD4の他の源および精製技術は、例
えば、Smithら、Science（1987）238：1704-1707；Lask
yら、Cell（1987）50：975-985；Maddonら、Cell（198
5）42：93-104;およびLittmanら、Nature（1987）325：
453-455に記載されている。細胞培地からのCD4の精製
は、典型的には、固体支持体、例えばセファロース４Ｂ
にカップリングしたコンカナバリンＡへのCD4（および
他の炭水化物含有分子）の結合に次いでイオン交換クロ
マトグラフィーを包含する。CD4分子特異的なモノクロ
ーナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィ
ーによる更なる精製を所望により実施することができ
る。gp120とは異なり、CD4を精製するのにアフィニティ
ークロマトグラフィーを使用する際に問題は全くない。

【００８７】（本発明のgp120の用途）本発明のコンホ
メーション保持されたgp120の重要な用途の１つはワク
チンとしてであるが、多数の他の利用法もまた存在す
る。例えば、コンホメーション保持されたgp120は、CD4
分子に対するgp120分子上の結合部位がぴったり合う抗
ｉｄ抗体の調製においてとくに有用である。他の用途と
しては、HIV-1ウイルス粒子の存在についての競争結合
アッセイにおける標準物としての用途が挙げられる。事
実、本発明のgp120糖タンパク質は、従来入手可能なgp1
20分子が使用されている任意の方法において使用するこ
とができるが、それがウイルス粒子中に天然に見いださ
れる形態のgp120とより近似しているだろう。

【００８８】本発明のgp120組成物の１つの明らかな有
用性は、HIVポリペプチドに対する抗HIV抗体、特に抗gp
120抗体およびウイルスgp120についてのイムノアッセイ
における有用性である。イムノアッセイの設計はこの分
野においてかなりの変形を受ける。従って次の説明は単
に例示であり、限定的ではない。しかしながら、一般的
には、米国特許第4,743,678号、米国特許第4,661,445号
および米国特許第4,753,873号並びにEPO公開第181,150
号およびEPO公開第216,191号を参照のこと。

【００８９】ウイルスgp120についてのイムノアッセイ
は、例えば、ウイルスのエピトープに対して向けられた
モノクローナル抗体、ウイルスgp120のエピトープに対
して向けられたモノクローナル抗体の組み合わせ、ウイ
ルスgp120のエピトープに対して向けられたポリクロー
ナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル
抗体との組み合わせを使用することができる。

【００９０】イムノアッセイのプロトコルは、例えば、
組成、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づ
くことができる。プロトコルはまた、例えば、不均一で
あって固体の支持体を使用することができ、あるいは均
一であって溶液中の免疫反応を伴うことができる。大部
分のアッセイは標識された抗体またはポリペプチドの使
用を伴った。標識は、例えば、蛍光性、化学発光性、放
射性、または染色性の分子であることができる。プロー
ブからのシグナルを増幅するアッセイも知られている。
そのようなアッセイの例は、ビオチンとアビジンを利用
するもの、並びに酵素標識および酵素媒介イムノアッセ
イ、例えばＥＬＩＳＡアッセイである。

【００９１】典型的には、抗HIV抗体のイムノアッセイ
は、試験試料、例えば生物学的試料を選択および調製
し、次いでそれを本発明のgp120組成物と共に、抗原−
抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベート
することを包含するであろう。そのような条件は当業者
で公知である。例えば、不均一形式では、gp120を固体
支持体に結合させ、インキュベーション後の試料とポリ
ペプチドとの分離を促進する。使用できる固体支持体の
例としては、膜またはマイクロタイターウエルの形態の
ニトロセルロース、シートまたはマイクロタイターウエ
ルの形態のポリ塩化ビニル、ビーズまたはマイクロタイ
タープレートの形態のポリスチレンラテックス、Immobu
lon^Rとして知られているポリフッ化ビニリデン、ジアゾ
化紙、ナイロン膜、活性ビーズ、およびプロテインＡビ
ーズが挙げられる。最も好ましくは、ダイナテック社の
Immulon^R１マイクロタイタープレートまたはPrecision
Plastic Ballにより仕上げられた0.25インチのポリスチ
レンビーズであるSpecが不均一形式において使われる。
典型的には、固体支持体を試験試料から分離後に洗浄す
る。他方、均一形式では、試験試料を溶液中でgp120抗
原と共に、当業界で知られているように、形成される抗
原−抗体複合体を沈澱させるような条件下でインキュベ
ートする。次いで、沈澱した複合体を例えば遠心により
試験試料から分離する。次いで、抗HIV抗体を含む複合
体を任意の数の技術により検出する。形式に依存して、
複合体は標識した抗異種間Ｉｇで検出することができ、
あるいは、競合形式を使用する場合には、結合した標識
競合抗体量を測定することにより検出することができ
る。

【００９２】ウイルスgp120ポリペプチドが分析物であ
るイムノアッセイでは、試験試料、典型的には生物学試
料を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下で、
抗gp120抗体と共にインキュベートする。種々の形式、
例えば「サンドイッチ」アッセイを使用することができ
る。このサンドイッチアッセイでは、固体支持体に結合
させた抗体を試験試料と共にインキュベートし、洗浄
し、該分析物に対する第２の標識抗体と共にインキュベ
ートし、そして支持体を再び洗浄する。第２抗体が支持
体に結合するかどうかを決定することによって分析物を
検出する。競争形式では通常（不均一または均一である
ことができる）、試験試料を抗体および標識競争抗原と
共に、順次または同時にインキュベートする。

【００９３】ワクチンにおいて使用するとき、本発明の
gp120糖タンパク質は、しばしば「サブユニット」ワク
チンと呼ばれる。なぜなら、gp120はHIVウイルスのサブ
ユニットであるからである。それ自体、本発明のgp120
糖タンパク質は生産の安全性およびコストの点から従来
のワクチンを上回る有意な利点を有する；しかしなが
ら、サブユニットワクチンは全ウイルスワクチンより免
疫原性がしばしば低く、そして病気の予防においてそれ
らの完全な効力に到達するために、有意な免疫刺激能力
をもつアジュバントが必要であると予想される。しかし
ながら、今日までに試験した全アジュバントが、本発明
のコンホメーション保持されたgp120と共に使用する
と、多種単離物中和抗体の形成を誘発する能力を示すの
で、特定のアジュバントは本発明のより広い面の部分を
構成しない。しかしながら、ある種のアジュバントは、
それら自身のもつ有利な性質のために好ましい。

【００９４】現在、米国においてヒトへの使用が認可さ
れている唯一のアジュバントはアルミニウム塩（明礬）
である。それらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリ
ア、ポリオ、狂犬病およびインフルエンザを包含する幾
つかのワクチンに有用である。

【００９５】完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）
は、実験的基準において多数の抗原とともに好結果に使
用されている強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは、鉱
油、乳化剤、例えばArlacel A、および死ミコバクテリ
ア、例えば、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculos
is）から構成されている。水性抗原溶液をこれらの成分
と混合して油中水型乳剤をつくる。しかしながら、ＣＦ
Ａは深刻な副作用、例えば痛み、膿瘍形成および熱を引
き起こし、このためヒトまたは獣医学用ワクチンにおい
てその使用が妨げられる。副作用は主としてＣＦＡのミ
コバクテリア成分に対する患者の反応のためである。

【００９６】不完全フロイドアジュバント（ＩＦＡ）は
細菌成分をもたないＣＦＡに類似する。米国では使用が
認可されていないが、ＩＦＡは他国で幾つかの型のワク
チンに利用されている。ＩＦＡはヒトのインフルエンザ
およびポリオワクチンで、並びに幾つかの動物ワクチ
ン、例えば、狂犬病、イヌのジステンパーおよび口蹄疫
ワクチンで好結果に使用されている。ＩＦＡ中に使用さ
れる油および乳化剤は共にマウスにおいて腫瘍を引き起
こすことが実験から明らかになり、ヒトへの使用には代
替アジュバントが良い選択であることを指摘している。

【００９７】ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、ＣＦＡ
を使って観察されるアジュバント活性を発生する、ミコ
バクテリアの細胞壁複合体の最小単位を表す〔Ellouzら
（1984）Biochem.Biophys.Res.Comm.,59：1317を参照の
こと〕。ＭＤＰの多数の合成類似体が作製されており、
これらは広範囲のアジュバント効力および副作用を示す
〔Chedidら（1978）Prog.Allergy,25：63に概説されて
いる〕。ワクチンアジュバントとして特に有用であるだ
ろう３つの類似体は、ＭＤＰのスレオニル誘導体〔Byar
sら（1987）Vaccine,5：223参照〕、ＭＤＰのｎ−ブチ
ル誘導体〔Chedidら（1982）Infect. and Immun.,35：4
17参照〕、およびムラミルトリペプチドの親油性誘導体
〔Gislerら（1981）Immunomodulations of Microbial P
roductsand Related Synthetic Compounds, Ｙ．ヤマム
ラおよびＳ．コタニ編、Excerpta Medica,アムステルダ
ム, p.167参照〕である。これらの化合物は、体液性お
よび細胞性免疫を効果的に刺激し、そして低レベルの毒
性を示す。

【００９８】ＭＤＰの１つの有望な親油性誘導体は、N-
アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミル-L-ア
ラニン-2-〔1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-(ヒド
ロキシホスホリルオキシ)〕エチルアミド（MTP-PE）で
ある。このムラミルペプチドは該分子の疎水性部分と脂
性環境との会合を可能にするリン脂質テールを有する一
方、ムラミルペプチド部分は水性環境と会合する。よっ
て、MTP-PEそれ自体は、安定な水中油型乳剤を生成する
乳化剤として作用することができる。

【００９９】マウスにおける実験では、MTP-PEは単純ヘ
ルペス（Herpes Simplex）ウイルスgD抗原に対する抗HS
V gD抗体価を刺激するアジュバントとして有効であるこ
とが示されており、そしてMTP-PEおよびgDが水溶液より
むしろ油（ＩＦＡ）中で供給された場合、その効力が大
幅に改良された。ＩＦＡはヒトへの使用が許可されない
ので、MTP-PEおよび抗原のための他の油供給系が研究さ
れている。４％スクアレン、0.008％Tween80およびHSVg
Dの乳剤は、モルモットにおいて非常にすぐれた結果を
与えた。この製剤MTP-PE-LO（低油分）を皮下注射針に
通過させて乳化すると非常に不安定であった。それにも
かかわらず、MTP-PE-LOはモルモットにおいて高い抗体
価、および免疫処置モルモットのHSVチャレンジにおい
て優れた保護を与えた〔Sanchez-Pescadorら（1988）J.
Immunology, 141：1720-1727およびTechnological Adva
nces in Vaccine Development（1988）Laskyら編、Alan
R.Liss,Inc.,p.445-469を参照のこと〕。MTP-PE-LO製
剤は、モルモットにおいて酵母生産HIVエンベロープタ
ンパク質に対する免疫反応を刺激するのにも有効であっ
た。ＥＬＩＳＡ抗体価およびウイルス中和抗体価の両者
が、MTP-PE製剤で高レベルに刺激された。しかしなが
ら、同製剤を大型の動物、例えばヤギおよびヒヒにおい
て試験すると、この組成物はそれほど有効でなかった。
それにもかかわらず、この系はgp120抗原と共に使用さ
れる有効なアジュバントを意味する。

【０１００】代謝可能な油と乳化剤を含んで成り、油お
よび乳化剤が油滴を有する水中型乳剤の形態で存在し、
実質的に全ての油滴が１ミクロンより小さい直径を有す
るアジュバント組成物は、ワクチンの効能を増加するた
めの有効なアジュバント組成物であることが実験から実
証された。このようなアジュバント組成物は、油滴が有
意に大きい油および乳化剤を含有するアジュバント組成
物よりも驚くほど優れているアジュバント組成物である
ことが研究から示された。これらの優れたアジュバント
組成物は別の特許出願EPO 0 399 843号刊行物の主題で
あり、その開示をここに引用によって加える。

【０１０１】アジュバント製剤は、一般にアジュバント
とgp120抗原とを混合する前に前述の成分から調製され
る。gp120抗原は、動物の組織に接近すると、特異的抗
体の形成を刺激し、そして生体内または試験管内でこの
ような抗体と特異的に反応する。そのうえ、抗原はその
抗原のためのレセプターをもつＴ−リンパ球の増殖を刺
激し、そしてリンパ球と反応して細胞性免疫と呼ばれる
応答の系列を開始することができる。

【０１０２】本発明のワクチン製剤は有効量のgp120抗
原を使用するであろう。すなわち、アジュバントと組み
合わせると、被検体に特異的で且つ十分な免疫応答を生
じさせ、HIVウイルスへのその後の暴露からの被検体の
保護を付与するであろう量の抗原を含む。

【０１０３】１つの好ましいアジュバント製剤は、MF-5
9と称し、0.40μg／mlのMTP-PEを含有するMTP-PE溶液中
の0.5％Tween-80、0.5％Span、5.0％スクアレンからな
る。この乳剤成物を微流動化装置（Microfluidizer）に
10,000psiで０℃において10回通過させる。生じた物質
を0.2ミクロンのフィルターに通過させ、４℃において
アルゴン雰囲気下で貯蔵する。

【０１０４】ワクチンとして使用できる各gp120製剤に
ついて特別の手引を提供するような単一投与量を指定す
ることはできない。抗原の有効量はその固有の活性およ
び純度の関数であり、単離物毎に変化するであろう。ワ
クチン製剤の成分の初期比率についての手引は実施例の
項目から得られ、この実施例の項目は中和抗体の刺激に
有効であることが証明された種々の製剤を示す。これら
の比率は、当業者において公知であるように、天然のコ
ンホメーション保持されたgp120の個々の調製物につい
て調整されるであろう。

【０１０５】本発明のワクチン組成物はHIV-1感染の予
防に有用である。HIV-1に苦しむことがある全ての動物
はこの方法で処置することができるが、本発明は、もち
ろん特にヒトへの本発明のワクチンの予防的および治療
的利用に向けられる。しばしば、所望の予防または治療
効果を引き起こすのに複数の投与が要求される；正確な
プロトコル（投与量および頻度）は標準臨床的手順によ
り確立することができる。ワクチン組成物は、ワクチン
を動物中に導入する任意の常法、通常は注射により投与
される。経口投与のために、ワクチン組成物は他のタン
パク様物質、例えばインスリンの経口投与に使われるも
のと同様な形式で投与することができる。前述したよう
に、予防および治療に使用する正確な量および製剤は、
抗原の固有の純度および活性、追加の成分または担体、
投与方法などの状況に応じて変化することがある。非限
定的例示により、投与されるワクチンの用量は、典型的
にはgp120抗原に関して、約0.1mg／投与の最小量、より
典型的には約１mg／投与の最小量、およびしばしば約10
mg／投与の最小量であろう。最大量は典型的には重要で
ない。しかしながら、通常、用量は約１mg／投与以下、
典型的には500mg／投与以下、しばしば250mg／投与以下
であろう。これらの用量は、該用量を担持するのに十分
な容量の任意の適当な医薬賦形剤または担体の中に懸濁
させることができる。一般に、最終容量は、担体、アジ
ュバントなどを包含して、少なくとも0.1ml、典型的に
は少なくとも約0.2mlであろう。上限は実際に投与すべ
き量により左右され、一般に約0.5ml〜約1.0ml以下であ
る。

【０１０６】上記から、本発明は、動物におけるHIV-1
感染の予防のための本発明のワクチン組成物の使用方
法、およびHIV-1に既に感染した動物の治療的処置のた
めの本発明のワクチン組成物の使用方法を包含する。動
物は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばチンパンジー、
ヒヒおよびヒトを包含する。

【０１０７】本発明をここで全体的に説明したが、本発
明は次の詳細な実施例を参照することによってより良く
理解されるであろう。これらの実施例は例示のみを目的
とし、そして特記しない限り、本発明を限定するものと
見なすべきでない。

【０１０８】

【実施例】

（実施例１） 哺乳動物細胞中でのHIV gp120の突然変異誘発および発
現 HIV-SF2のgp160をコードするエンベロープ遺伝子を、gp
120天然gp41プロセシング部位のArg509の後ろに停止コ
ドンを導入することによって、gp120配列の発現のため
に操作した。この遺伝子の5'末端を修飾して、Glu31を
コードする配列の5'側にNheI制限エンドヌクレアーゼ部
位を挿入し、こうして天然のシグナル配列を他のシグナ
ル配列で置換して、哺乳動物細胞からの改良された分泌
について試験することができるようにした。哺乳動物細
胞中で分泌糖タンパク質としてgp120を生産するため
に、HIVシグナル配列および5'非翻訳配列を、ｔＰＡシ
グナルＤＮＡの3'末端付近にNheI部位を配置してAla Se
rをコードするように突然変異誘発したヒトｔ−ＰＡの
ものと置き換えた。得られた遺伝子構成物を１系列のプ
ロモーターに融合せしめた。ＣＯＳ−７細胞中へ発現ベ
クターをトランスフェクションせしめそして分泌された
gp120のレベルをヤギ捕捉ＥＬＩＳＡ（下に記載する）
およびウェスタンブロットにより比較した後、gp120の
一時的発現を評価した。発現の最高レベルは、ＣＭＶ
ＩＥ−１プロモーターを使った時に見られ、ＳＶ４０の
初期プロモーターを使った時より少なくとも50倍高かっ
た。永久細胞系の作製のために、発現プラスミドpCMV6a
120-SF2（図１）をdhfr発現プラスミドと共に、CHOdhfr
^- 細胞（dg44；下記参照）中へリン酸カルシウム共沈法
により同時トランスフェクトせしめた。生じた細胞系
を、クローンをgp120ヤギ−捕捉ＥＬＩＳＡでスクリー
ニングすることによって特徴づけた。最大発現細胞系を
プール中のメトトレキセートの中で増幅させた。クロー
ンを0.1mMレベルで単離した。標準として精製タンパク
質を使用して、細胞系はＴフラスコレベルにおいて５mg
／リットルの範囲でgp120を分泌することが示された。

【０１０９】gp120遺伝子の発現に使用した細胞は、本
来、チロン・コーポレーションのLeslie Rall博士から1
985年９月にほぼ100継代において入手した。これらの細
胞は、ニューヨークのコロンビア大学Gail Urlaub博士
およびLawrence Chasin博士により最初に単離され、そ
してUrlaubら、Cell（1983）33：45に記載されている。
これらの細胞をＤＧ４４と命名した。それらは、二重欠
失によりジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（dhfr^-)にした
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ−１細胞から
誘導した。

【０１１０】ＣＨＯ dhfr^-細胞を次の培地中で連続培
養した：１０％透析済ウシ胎児血清、200mg／mlのスト
レプトマイシンが補足されたＨａｍｓ Ｆ−１２培地。
この培地および血清はカリフォルニア州サンフランシス
コのカリフォルニア大学、サンフランシスコ・セルカル
チャー・ファシリティ(San Francisco Cell CultureFac
ility)から入手した。すべての他の成分はシグマ・ケミ
カル・カンパニー（Sigma Chemical Co.ミズーリ州セン
トルイス）により供給された。細胞は週２回Ｔ−７５フ
ラスコ中で１：10分割で継代培養することによって維持
した。

【０１１１】貯蔵のために、細胞のアリコートをウシ胎
児血清（ＦＣＳ）、10％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）の中で凍結し、そして液体窒素の気相中で−８０Ｒ
Ｃにおいて貯蔵した。この目的で、Ｔ−７５フラスコの
細胞を集密まで増殖させた（約10⁷細胞／Ｔ−７５フラ
スコ）。細胞をトリプシン処理し、遠心し、そして氷冷
ＦＣＳ中10％ＤＭＳＯに約５×10⁶細胞／mlの濃度で再
懸濁した。１mlアリコートを凍結保存用バイアルに移し
た。細胞を必要とするとき、アリコートを３７ＲＣ水浴
中で解凍し、そして連続培養および継代のために細胞を
Ｔ−７５中に接種した。

【０１１２】HIV-1エンベロープ関連抗原を検出するた
め上述のように使う２つのアッセイを次の方法で実施し
た。両アッセイには、精製されたＣＨＯ由来gp120を標
準として、200ng／ml〜0.195ng／mlの倍々希釈で使用し
た。

【０１１３】（ａ）ヤギ捕捉ＥＬＩＳＡ：このアッセイ
のための捕捉試薬は、下に記載する精製env-2-3(SF2)(H
IV-SF2ウイルス単離物のgp120のアミノ酸配列に相当す
る酵母中で生産された非グリコシル化ポリペプチド）で
高度免疫処置したヤギからのプロテインＡ−セファロー
ス−アフィニティー精製免疫グロブリンであった。捕捉
された抗原の検出に使用した試薬は、同一抗原に対して
ウサギ中で惹起せしめたポリクローナル抗血清であっ
た。プレートを５mg／mlのenv-2-3(SF2)に対するヤギ免
疫グロブリンでコーティングし、ウイルス溶解物または
哺乳動物由来gp120抗原の希釈液とインキュベートし、
次いで補足された抗原を1/100に希釈したenv-2-3(SF2)
に対するウサギポリクローナル抗血清、次いで接合体お
よびABTS基質により検出した。

【０１１４】（ｂ）ヒト捕捉ＥＬＩＳＡ：このアッセイ
は前述の「ヤギ捕捉ＥＬＩＳＡ」と同一であるが、ただ
し捕捉試薬はHIV-1血清陽性血液提供者から入手したヒ
ト血清からのプロテインＡ−セファロース−精製免疫グ
ロブリンであった。

【０１１５】（実施例２） 細胞の生産 実施例１に記載のように得られた１つの細胞系、CHO-A-
6a120-145-0.1-22を、回転瓶中での低血清および無メト
トレキセート培地中での生産のために選択した。回転瓶
培養物（850cm²）を確立し、そして６％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）が補足された培地（ダルベッコ改良イーグル
培地およびハムＦ−１２，１：１）中で集密まで増殖さ
せた。生産のために、補足物を１％ＦＣＳおよび0.03％
ＨＢ−ＣＨＯ（Hana Biologics, カリフォルニア州）に
切り替えた。順化培地（200ml）を24〜48毎に集め、２
〜８℃で貯蔵し、プールし、そして0.45ミクロンのカプ
セルフィルター（Gelman）を通して濾過することによっ
て清浄した。細胞は２回の生産実験の各々において２ヵ
月以上維持され、gp120の生産の明白な低下はなかっ
た。発現レベルは５〜20mg／lであった。

【０１１６】（実施例３） 精製 （１）濃縮：実施例２からの細胞培養上清（40リット
ル）の濃縮は、行きどまり濾過（0.45ミクロンのカプセ
ルフィルター、Gelman）および30Kカットオフの中空繊
維限外濾過器（AG Technology #UFP-30-C-6;6ft²および
0.5mmの繊維内径）を使用し容量形ポンプ（Waukesha #1
8）により駆動される交差流限外濾過を使用して実施し
た。透過速度は、ほぼ12リットル／分の再循環速度およ
び26psiの圧力においてほぼ150ml／分であった。保持液
容量が１〜２リットルに到達するまで濾過を続けた。濾
過工程は低温室内で２〜８℃において実施した。限外濾
過濃縮物は褐色の透明な液体であった。

【０１１７】（２）ＤＥＡＥクロマトグラフィー：ＤＥ
ＡＥセファデックスＡ−５０（Pharmacia）を詰めたイ
オン交換カラム（直径11.4cm×15cm）を緩衝液（0.02M
Tris-Cl, pH8.0，0.1M NaCl）中平衝化し、次いで35ml
／分の流速で室温において濃縮物をカラムに適用した。
限外濾過濃縮物を２リットルの体積にし、そして塩化ナ
トリウム（4M原溶液）の添加により1.4mSの伝導度にし
た。生産物を含有する未吸着の画分を25ml画分でＩｓｃ
ｏ Ｆｏｘｙ^Rフラクションコレクターにより集めた。
血清アルブミン、他のタンパク質および褐色物質の大半
はカラムに結合し、そして１M NaClの段階的勾配で溶出
された。これらの画分は少ないが、可変量の生産物を含
有した；結合画分からの生産物の回収は試みなかった。
ＤＥＡＥセファデックスＡ−５０樹脂を各使用後廃棄し
た。素通り画分はＥＬＩＳＡアッセイにより大半の生産
物を含有することが示された。この段階では、ＳＤＳゲ
ル上の拡散gp120バンドを位置づけることは困難であっ
た。

【０１１８】（３）フェニル疎水的相互作用クロマトグ
ラフィー：ＤＥＡＥ画分を、固体の硫酸アンモニウムの
添加により、硫酸アンモニウム中40％飽和にした。よく
混合した後、少量の沈澱物を遠心により除去した。ＴＳ
Ｋフェニル−５ＰＷ ＨＩＣカラム（直径5.5cm×20c
m）を少なくとも２容積の水でＧｉｌｓｏｎ分取用ＨＰ
ＬＣにより洗浄した。次いで、カラムを２以上の容積の
緩衝液Ａ（0.02M酢酸ナトリウム、pH5.0、40％飽和硫酸
アンモニウム）で平衡化した。カラムの平衡は流出液の
伝導度測定により確かめた。硫酸アンモニウムの添加後
の上清画分をポンプＡを通して30ml／分で供給すること
によってカラムに適用し、次いでカラムをベースライン
が安定化するまで（通常約15〜20分）緩衝液Ａで洗浄し
た。勾配をかけて40分間に渡り0.02M酢酸ナトリウム、p
H5.0にして生産物を溶出させた。ＯＤピークの下の画分
をＳＤＳゲル電気泳動によりPharmaciaのPhast^Rシステ
ムを使ってアッセイし、生産物を位置決定した。この純
度段階において、gp120バンドは明瞭に判別することが
できた。生産物を含有する画分を次の段階のクロマトグ
ラフィーのためにプールした（図１８のＡ参照）。

【０１１９】（４）エーテル疎水的相互作用クロマトグ
ラフィー：第２のＨＩＣ段階を、ＴＳＫエーテル−５Ｐ
Ｗ ＨＰＬＣカラム（直径5.5cm×20cm）上で、フェニ
ルＨＩＣカラムについて使用したのと同一の手順に従い
実施した。このカラムを少なくとも２カラム容積の水で
洗浄し、次いで緩衝液Ａ（40％飽和硫酸アンモニウム、
0.02M酢酸ナトリウム、pH5.0）で平衡化した。フェニル
カラムからの生産物プールを硫酸アンモニウムの添加に
より165S／cmの伝導度にし、次いで12,000rpmにおいて1
0分間遠心した。この試料を負荷し、そして100％緩衝液
Ａから100％緩衝液Ｂまでの40分間の勾配を使って前述
したように溶離した。生産物を含有する画分（図１８の
Ｂ参照）をＰｈａｓｔ^R系のＳＤＳゲル電気泳動により
位置決定し、次いでゲル濾過クロマトグラフィーのため
にプールした。エーテルカラムからのgp120ピークは主
としてgp120であり、少量の低分子量汚染物を含んだ。
これらの汚染物はゲル濾過クロマトグラフィー（下）に
より分離された。

【０１２０】（５）ゲル濾過クロマトグラフィー：エー
テルＨＩＣ画分を限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−３
０）で濃縮して、0.6の吸光係数＝１mg／mlと仮定して
Ａ−２８０により測定した時ほぼ10mg／mlのタンパク質
濃度にし、次いで少なくとも５容の0.1Mリン酸ナトリウ
ム、pH6.9に対して透析した。試料をゲル濾過カラム（S
uperdex^R 200，Pharmacia，直径1.6cm×60cm）にカラム
容積の４％以下の量で10mg／ml以下の総タンパク質濃度
で適用し、そして0.1Mリン酸ナトリウム、pH6.9で溶出
させた。１mlの画分を集め、ＳＤＳゲル電気泳動にか
け、クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ３５０により
Ｐｈａｓｔ系で染色し、そしてデュポンＧＦ−４５０カ
ラム上でのゲル濾過ＨＰＬＣ（展開緩衝液：0.2Mリン酸
ナトリウム、pH6.7、１ml／分）にかけて２量体を含有
する画分を探し、次いでプールした。gp120ピークのリ
ーディング端は純粋なgp120を含有したが、テーリング
端をゲル濾過カラム上で再クロマトグラフィーにかけ
た。生産物のプールをＡｍｉｃｏｎ ＹＭ−３０膜で濃
縮し、５容の蒸留水に対して透析濾過し、そして10ミク
ロンより低い圧力において少なくとも２日間凍結乾燥し
た。

【０１２１】（６）精製結果の要約：表１は、40リット
ルの細胞培養上清を使って出発した典型的な精製の結果
を要約する。これらのデータが示すように、250倍の精
製が20〜25％の収率で達成される。生産物はＳＤＳゲル
においてＨ１２０ ＫＤで移動する幅広のバンドとして
現れた。デンシトメトリーは、染色強度の80〜90％がgp
120のバンドに存在することを明らかにした。多分これ
は、gp120結合の染色が弱いので、この調製物の純度の
最小評価値を表す。ＢＳＡと比較してほぼ７／１のクー
マシーブリリアントブルーがタンパク質１mg当りに結合
した。ゲルのバンドの出現は、試料を２−メルカプトエ
タノールまたはジチオスレイトールで前処理することに
よって変更せず、タンパク質は内部で切断しないことが
示された。高温における逆相ＨＰＬＣ分析は、また、産
生物の純度が90％を越えることを示唆した。

【０１２２】

【表１】

【０１２３】（実施例４） （１）精製ＳＦ−２rgp120とウイルスgp120との比較：
精製gp120をＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動
にかけてサイズと純度を評価した。該タンパク質は、糖
タンパク質の幅広の染色バンド特性をもつ120Kタンパク
質の予測位置で移動した。この幅広のバンドは、他の単
離物について記載されている、22個の推定Ｎ−結合グリ
コシル化部位において予想される炭水化物不均一性と一
致する。組換えgp120をウイルス粒子中に見いだされる
ものと比較するために、HIV-SF2感染HUT-78細胞の溶解
物を調製し、そしてHIV陽性ヒトおよびgp120特異的動物
血清を使用するウエスタンブロットにより検査した。観
察されるパターンは保存されたコンホメーションと一致
した。

【０１２４】（２）Ｎ末端配列決定：アミノ末端のアミ
ノ酸配列を自動エドマン分解により決定した。観察され
た配列および推定された配列は次の通りであった： 観察された配列 ＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷ
Ｋ．．． 推定された配列 ＴＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷ
Ｋ．．． この配列は、異種シグナルがシグナルペプチドにより該
シグナルのセリンの後で正しくプロセシングされ、そし
てタンパク質がいずれの追加のアミノ酸にも融合しない
ことを示す。この配列はＨＴＬＶIIIＢ単離物からのウ
イルスgp120上に見いだされるＮ末端スレオニンを欠く
（Robyら、PNAS（1986）83：7023-7027）。Ｎ末端アミ
ノ酸配列は、この単離物のＤＮＡ配列から推定されるHI
V-SF2エンベロープ配列と、少なくとも最初の15アミノ
酸について合致する。

【０１２５】（３）アミノ酸組成：実施例３に記載のよ
うに精製したgp120の５つのロットにおいてアミノ酸分
析を実施した。それらの値の平均は、ＤＮＡ配列から予
想される組成と、ile（観察値33.5対予想値39）およびs
er（観察値32.7対予想値24）を除く全てのアミノ酸につ
いて実験誤差の範囲内で一致した。ｓｅｒ値は５ロット
内で変動性であり、そしてこれは多分セリンに富んだ汚
染物を意味する。

【０１２６】（４）未変性ゲル電気泳動およびＩＥＦ：
gp120の電荷不均質性は、等電点電気泳動及び未変性ゲ
ル電気泳動において明白であった。等電点電気泳動は、
エンベロープpH５〜７内で複数のバンドの存在を明らか
にした。このタンパク質は未変性ポリアクリルアミドゲ
ルでは単一の幅広のバンドとして移動した。

【０１２７】（５）ゲル濾過ＨＰＬＣ：組換えgp120の
分子量はＳＤＳの存在下で120Kであった；ＳＤＳの不存
在下の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣにより測定した。中イ
オン強度緩衝液中で中性pHでは、精製gp120は単一の主
ピークとして溶出され、保持容量はH130Kの分子量に相
当した。少量の２量体も存在した；２量体の画分は溶液
中で貯蔵すると合計gp120の10〜20に増加した。２量体
画分をゲル濾過段階において単離し、そして別々に分析
した。この画分は、還元剤の存在下でＳＤＳゲル電気泳
動により分析すると単量体として移動したが、還元剤
（2-メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール）
の不存在下では２量体として移動したので、それは多分
ジスルフィドド結合により結合していた。２量体画分の
アミノ酸組成は単量体画分のそれと区別できなかった。
２量体画分はまた、放射線免疫沈澱アッセイにより試験
するとCD4を結合した。gp120ゲル濾過ＨＰＬＣピーク
は、この分子量のタンパク質について予想されるより広
かった。gp120について得られた余分のピーク幅は、炭
水化物成分の不均一性に帰することができる。存在する
不純物に関してgp120の分子量が高いことは、フェニル
ＨＩＣ段階後の精製アッセイとしてゲル濾過ＨＰＬＣの
使用を可能にする。それは生産物のプールからgp120 ２
量体含有画分を排除するためのゲル濾過段階におけるア
ッセイとして日常的に使われた。

【０１２８】（６）CD4結合：この実施例において使用
するCD4は、外部領域全体をコードする発現プラスミド
によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系から誘導さ
れた組換えの可溶性CD4であった。結合標準として使用
するCD4の生産についての詳細は実施例５に記載されて
いる。結合実験はゲル濾過ＨＰＬＣによる放射線免疫沈
澱により実施した。

【０１２９】（ａ）放射線免疫沈澱の一般技術：（例え
ば）gp120を生産する細胞の集密的単層を、システイン
とメチオニンを含まないダルベッコ改良イーグル培地
（cys−met−DME）中で標識した。100mCi／mlの各³⁵S m
etおよびcysを有する５mlのcys−met−DMEを各Ｔ７５フ
ラスコに６〜８時間の間添加した。標識された試料を収
得し、遠心して細胞を除去し、そして使用するまで−80
℃で貯蔵した。沈澱を行う試料を１×溶解緩衝液〔0.1M
NaCl、0.02M Tris pH7.5、１mM ＥＤＴＡ、0.5％ＮＰ
４０、0.5％デオキシコール酸塩、0.1％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、１mMフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド（ＰＭＳＦ）、17mg／mlのアプロチニン〕に調整
した。試料を１／10容の正常ヤギ血清で４℃にて30分間
予備浄化し、次いでプロテインＡセファロース（ＰＡ
Ｓ）（１／２容の20％懸濁液）で４ＲＣにて30分間沈澱
させた。高度免疫処置動物またはHIV陽性ヒト血清試料
からの免疫グロブリンを、標準技術によりＰＡＳを使用
してアフィニティー精製した。血清を最良のシグナル／
ノイズ比について滴定した；大部分の免疫グロブリン画
分を５〜10mg／試料で使用した。免疫沈澱は４Ｃにおい
て１〜12時間であった。すべての試料を実験中同容量に
調整した。ＰＡＳをＢＳＡ不含有溶解緩衝液で洗浄し、
次いで0.12M Tris pH７で洗浄し、そしてペレットを１
ランムリー試料緩衝液中で可溶化し、沸騰させ、そして
ゲルに適用した。ゲルをＥｎ³ Ｈａｎｃｅ^Rで処理し、
乾燥し、そして蛍光光度測定した。

【０１３０】（ｂ）放射線免疫沈澱によるCD4結合：CD4
を前述したように³⁵Ｓで標識し、そしてCD4の濃度を、C
D4に対して惹起されたモノクローナル抗体およびポリク
ローナルウサギ血清を使用する捕捉ＥＬＩＳＡにより決
定した。共沈実験のために、CD4を増加する量で固定量
のgp120（１mg）に添加して飽和量を決定し、次いで抗g
p120抗血清で共沈させた。この量のCD4をgp120滴定実験
に使用した。標識したCD4を前述したように正常血清で
予備浄化した。標識成分を予備浄化した後、CD4およびg
p120を４Ｃにおいて１時間の間複合体形成せしめ、次い
で未標識の成分に対する抗体を４ＲＣにおいて１時間の
間添加した（10mg／試料）。ＯＫＴ４はOrth Diagnosti
csから購入した。ＰＡＳを４ＲＣにおいて１時間添加
し、そして複合体を浄化し、前述したように電気泳動用
に調製した。

【０１３１】精製前および精製後のgp120は、等量の添
加したgp120に対するバンド強度が同等であることによ
り示されるように、このアッセイによるCD4への結合に
おいて両方とも有効であった。酵母中で生産されたgp12
0の非グリコシル化類似体（ｅｎｖ２−３；米国特許出
願第138,894号、1987年12月24日出願）は、このアッセ
イにおいてCD4に結合することができなかった。Superde
x^R 200カラムから単離されたgp120の２量体形は、この
アッセイにより同じくCD4に結合した。結合の飽和はグ
ラフで決定した。１／２飽和レベルから、6.9nMのＫｄ
が測定された。

【０１３２】（ｃ）ゲル濾過ＨＰＬＣによるCD4結合：
精製gp120および未標準のCD4を、0.3Mリン酸カリウムpH
6.8を含む60ml中で混合した。混合後、試料の一部分（4
5ml）をデュポンＧＦ−４５０ゲル濾過ＨＰＬＣ上に、
ウォーターズＷＩＳＰ ７１２試料インジェクターを使
って注入し、0.4Ｍリン酸カリウム、6.8中で１ml／分の
流速で展開した。光学濃度を215nmにおいてモニター
し、そしてデータをウォーターズのMaxima 820^Rクロマ
トグラフィーソフトウェアを使って記録した。

【０１３３】CD4およびgp120をゲル濾過ＨＰＬＣカラム
に別々に適用したとき、各成分は予想される溶出時間の
ところで単一ピークを与えた（図１９参照；トレースＡ
はCD4のみ、トレースＢはgp120のみである）。成分をク
ロマトグラフィー前に一緒に混合したとき、160Kに相当
する溶出時間に新しいピークが現れ、そして120Kおよび
40Kのところのピークは減少した（図１９；トレース
Ｃ）。この結果はCD4とgp120との間の１：１複合体の形
成の直接的物証を提供する。CD4とgp120の比を変えてそ
して反応体の異なる濃度で追加の実験を実施した。これ
らの実験の結果は、CD4の１分子とgp120の１分子との間
の高親和性複合体の存在を支持した。

【０１３４】（実施例５）ＣＨＯ細胞をＡＤ−ｄｈｆｒ
と可溶性組換えヒトCD4（完全な外部領域）をコードす
る発現プラスミドとを用いて同時トランスフェクトせし
めた。発現ベクターは、CD4をコードする配列（ＵＣＳ
ＦのD. Littman博士から入手した）をｐＣＭＶ６ａ（gp
120コード配列を欠くｐＣＭＶ６ａ１２０−ＳＦ２）中
にクローニングすることによって作製した。可溶性CD4
を分泌する細胞系を単離したＣＨＯＳＴ４．２と表示す
る得られた細胞系は前述したように一般に入手可能であ
る。クローニングした遺伝子ＳＴ４．２は、経膜境界ま
での４つの細胞外領域に相当する380アミノ酸をコード
する。このタンパク質の精製工程は２つのカラムを必要
とする。まず、ＣＨＯ細胞の上清をＳ．セファロースカ
チオン交換カラム上に負荷し、そしてそれから溶出せし
めた。１リットルのＣＨＯ上清を再蒸留水で15リットル
に希釈し、そして0.2×ＰＢＳ／2.5mM ＥＤＴＡ，pH7.0
（伝導度3.6ohm^-1cm^-1）中で平衡化した300mlの膨潤樹
脂上に3.6リットル／時の負荷速度で室温において負荷
した。このカラムを500mlの0.2×ＰＢＳ／2.5mM ＥＤＴ
Ａおよび200mlのNaCl 0.2×ＰＢＳ 12.5mM ＥＤＴＡで
洗浄した。１リットルの200mM NaCl 10.2×ＰＢＳ 12.5
mM ＥＤＴＡを用いて溶出を行った。次いで、このＳ．
セファロースカラムからの溶出液をモノクローナル抗体
アフィニティーカラム上に流した。この精製に使用した
モノクローナル抗体（２５−１０−Ｆ５．５Ｃｌ；以後
２５−１０−Ｆ５と呼ぶ）は、CD4の細胞外領域のアミ
ノ末端半分（最初の２つの免疫グロブリン様ドメイン
内）の中のコンホメーションエピトープを認識する。同
一領域内のエピトープに対する特異性をもつ他の抗体も
同じく有効であろう。このＳ．セファロース溶出液を濾
過し（0.45ミクロン）そして１ml／分またはそれより小
さい流速でアフィニティーカラム上に負荷した。負荷し
たカラムを蒸留水（25×樹脂容量）で洗浄し、そして５
mMギ酸トリエチルアミンを用いて10ml溶出緩衝液／４mg
ゲル樹脂で溶出せしめた。ｍＡｂ溶出液のpHを１M Tris
（pH8.0）でpH７に調整した。アフィニティーカラムか
ら溶出された画分を透析し、そして濃縮した。表２は精
製手順の各段階における収率を示す。

【０１３５】

【表２】

【０１３６】種々の画分中の活性CD4のレベルは、捕捉
ＥＬＩＳＡにより、捕捉試薬としてモノクローナル抗体
２５−１０−Ｆ５および検出試薬として精製ＳＴ４．２
に対して惹起されたウサギボリクローナル抗血清を使用
して決定した。各カラムからの画分および洗浄液を最初
の上清および既知のCD4標準物と比較した。これによ
り、どれだけ多くの活性CD4が各段階において回収され
たかを定量することができた。それはまた、精製の各段
階後の純度の増加を評価することができた。これは、Ｅ
ＬＩＳＡにより決定した活性CD4の合計量（mg）を、Pie
rceタンパク質微量アッセイにより決定したタンパク質
の合計ミリグラム数と比較することによって行った。こ
れらの技術を使用して、Ｓ．セファロースカラムについ
ての収率は76％であり、そしてアフィニティーカラムは
74％であり、56％の全体収率が得られた。Ｓ．セファロ
ースカラムは、単独で31倍精製をもたらし、第１段階直
後に93％CD4である溶液を与えることに注目すべきであ
る。アフィニティーカラムはＳ．セファロースカラム溶
出液の純度を本質的に均質にまで増加させた。

【０１３７】これらの最後の画分の純度を２つの方法で
分析した。まず、タンパク質を12％ＳＤＳゲル上で展開
し、そしてクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色し
た。この視的分析は、タンパク質が高度に精製されたこ
とを示した；最終生成物の少なくとも95％はCD4であっ
た。アミノ酸分析をこのプロトコルに従い精製したＳＴ
４．２試料において実施すると、この物質が高度に精製
されたことが示された。

【０１３８】精製ＳＴ４．２のgp120結合能力を、ＥＬ
ＩＳＡおよびgp120カラムの両者により分析した。ＳＴ
４．２はマイクロタイタープレート上にコーティングす
ることができ、そしてgp120結合活性を保持するであろ
う。CD4の種々のロットのgp120結合を試験するために、
マイクロタイタープレートを各ロットからの様々な濃度
のCD4と共にインキュベートし、次いで一定濃度のgp120
を全てのウエルに添加した。結合したgp120を、gp120に
対するウサギポリクローナル抗血清（Rb抗env2-3血清）
を使って検出した。プレート上にコーティングされたＳ
Ｔ４．２の量が減少するにつれて、力価決定される強い
シグナルが見られた。gp120結合は、精製ＳＴ４．２をg
p120のアフィニティーカラム上に流すことによって、２
つのロットについて評価した。各画分のCD4含量は、前
述のＳＴ４．２に対するポリクローナルウサギ抗血清を
使った種々の画分のイムノブロット分析により決定し
た。これらの結果は、CD4免疫反応性物質の100％近くが
カラム母材上のgp120に吸着され、そして特定のピーク
として溶出されることを示した。

【０１３９】未変性および変性ＳＴ４．２をマイクロタ
イタープレート上にコーティングし、そして種々のCD4
特異的免疫試薬が該タンパク質の２形態を認識する能力
を比較した。精製ＳＴ４．２で免疫処置することによっ
て調製されたウサギポリクローナル血清は、CD4の未変
性および変性形態の両者を認識した；コンホメーション
エピトープを認識することが知られているＯＫＴ４Ａ
は、未変性CD4と明瞭に反応したが、変性されているタ
ンパク質とは反応しなかった。モノクローナル抗体２５
−１０−Ｆ５はＯＫＴ４Ａに類似した反応性パターンを
示した。

【０１４０】精製ＳＴ４．２の調製物を−80℃および４
℃において貯蔵し、そして（１）未変性および変性CD4
の両者を認識するウサギポリクローナル抗血清との免疫
反応性、（２）未変性CD4とのみ反応するＯＫＴ４Ａお
よび２５−１０−Ｆ５による認識、並びに（３）gp120
結合について周期的に試験した。ＯＫＴ４Ａおよび２５
−１０−Ｆ５モノクローナル抗体並びにgp120により評
価された活性の有意な低下が４℃での貯蔵時に観察され
た。しかしながら、−80℃で貯蔵した物質は完全な活性
を保持した。さらに、精製ＳＴ４．２は反復して凍結お
よび解凍すると活性を損失することも認められた。

【０１４１】（実施例６）免疫処置実験を実施して、コ
ンホメーションが保持される本発明のgp120組成物を使
った中和抗体の生産を、コンホメーションが変わること
が知られている他のgp120分子のものと比較した。酵母
中で調製され、変性されておりそしてグリコシル化され
ていないgp120類似体（env2-3）を比較抗原として使用
した。両者のgp120物質は同一遺伝子源であるHIV-ISF-2
単離物から誘導した。抗体産生をヒヒにおいて表３に示
す免疫処置スケジュールを使用して測定した。

【０１４２】

【表３】

【０１４３】免疫原は次の方法で調製した： （１）グループ１および２：１部の抗原（gp120またはe
nv2-3）を２部の不完全フロインドアジュバント（ＩＣ
ＦＡ）に添加し、注射器により混合し、そして500ml／
動物を注射した。

【０１４４】（２）グループ３および４：抗原／MTP-PE
アジュバントのバイアルを室温に加温し、１分間渦動撹
拌し、そして500ml／動物を30分以内に注射した（必要
に応じて再混合した）。

【０１４５】（３）グループ５および６：抗原／ミョウ
バンのバイアルを室温に加温し、１分間渦動撹拌し、そ
して500ml／動物を30分以内に注射した（必要に応じて
再混合した）。

【０１４６】免疫処置は実験の開始時並びに実験開始後
４，８，12および20週目に実施した。血液試料を実験の
開始時（採血前）および結果を報告する表（下）に示す
時間に採取した。

【０１４７】結果を添付した表４および表５に要約す
る。env2-3で免疫処置した動物は、全てのアジュバント
群において相同単離物HIV-SF-2に対して中和活性を示
し、そして１つのアジュバント群（ＩＦＡ−ＭＴＰ）に
おいてHIV-MNに対する中和を示す（７匹の動物のうちの
３匹）。この抗原でHIV-HTLV-IIIBに対して検出可能な
中和を示す動物は１匹である。

【０１４８】対照的に、gp120で免疫処置した動物のす
べてが、４回および５回の免疫処置後、３つのアジュバ
ント群全てにおいてHIV-SF2およびHIV-MNに対する中和
活性を示す。８匹のgp120免疫処置動物のうちの６匹
は、HIV-HTLBIIIBに対しても有意な中和活性を有し、そ
して該動物は３つのアジュバント群全てからのものであ
る。

【０１４９】

【表４】

【０１５０】

【表５】

【０１５１】若い成体（雄／雌）のヒヒ（Papio）を２
つのアジュバントの１つの中に配合した55mgのgp120で
免疫処置した：水酸化アルミニウム（ミョウバン、0.8m
g／投与）；または不完全フロインドアジュバント＋250
mgのムラミルトリペプチド（ＩＦＡ−ＭＴＰ）。動物を
ほぼ４週毎に免疫処置し、そして血清をエンベロープ特
異的力価の損失についてモニターした。この標準におけ
る各動物についての抗原特異的応答を要約するデータを
表６および表７に記載する。エンベロープ特異的力価は
各追加免疫後にピークとなり、次いで下降した。ミョウ
バンおよびＩＦＡ−ＭＴＰの力価はほぼ10倍異なること
に注目すべきである。ベースライン力価は休止の６ヵ月
後に到達し、次いで動物を１月の間隔で再追加免疫し
た。ウイルスの中和におけるエンベロープ抗体の有効性
をを測定するために、血清を、試験管内中和アッセイに
おいて、相同HIV-SF2および異種ウイルス単離物の両者
に対して試験した。血清は既知の高エンベロープウイル
ス中和力価の時点、10週目（３回の免疫化後）、休止前
23週目（５回の免疫化後）、および休止後の追加免疫後
５７週目（６回の免疫化後）において試験した。次の２
つのウイルス中和アッセイを使用した：ｐ２４ｇａｇ阻
害アッセイ〔Haigwoodら、AIDS Res.Hum.Retrov.(199
0）6：855-869およびSteimerら、Vaccine (1988)、H.Gi
msbergら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、p
347-355に記載されている〕および感染性中心阻害アッ
セイ〔Naraら、AIDS Res.Hum.Retrov.(1987) 3：238-30
2〕。表６に示すように、HIV-SF2およびHIV-Mnに対して
有効な中和抗体は、両者のアジュバント群において、３
回の免疫処置後のみにおいて発生し、そして力価はそれ
以上の追加免疫後に維持されるか、あるいは増加した。
表７において、HIV-BRUおよびHIV-HTLVIIIB特異的中和
抗体は５回および６回の免疫化後に再現的に観察され
た；６回の免疫処置後、HIV-ZR6に対する力価は観察さ
れなかった。全体的に、相同ＳＦ２および異種の中和力
価は、ミョウバンの動物よりIFA-MTP において高かっ
た。

【０１５２】

【表６】

【０１５３】

【表７】

【０１５４】６回の免疫処置後最高に応答するgp120免
疫処置ヒヒから集めた血清を、さらに、追加の単離物HI
V-SF2、HIV-MN、HIV-RF、HIV-CC、HIV-ZR6およびHIV-ND
Kを中和する能力について試験した（表８のａ）。HIV-S
F2中和力価はｐ２４ｇａｇ阻害アッセイにより決定した
が、HIV-MN中和はNaraらの感染中心プロトコルによりア
ッセイしたことに注意すべきである。こうして、これら
の２つの単離物の中和における顕著な差は、一部分、使
用した２つの異なるアッセイにより説明することができ
る。

【０１５５】このデータが実証するように、物質のコン
ホメーションを保持するgp120タンパク質は、天然のコ
ンホメションを保持しない形態よりも、交差中和抗体の
産生においていっそう有望である。

【０１５６】（実施例７）ヒヒのＩＦＡ−ＭＴＰ群の反
復した免疫処置を実施して、組換えの天然のグリコシル
化gp120への追加の繰返し暴露がなお広範囲の単離物の
中和において有効な抗体を生じうるかどうかを決定し
た。繰返し免疫処置は、HIV-SF2、HIV-MN、HIV-RF、ま
たはHIV-CCに対する中和抗体の力価を著しく変更しなか
った。しかしながら、繰返し免疫処置は、アフリカ単離
物HIV-ZR6およびHIV-NDKに対する低力価の中和抗体の出
現を引き起こした（表８のｂ）。HIV-ZR6中和の一時的
発生は、組換えの天然のグリコシル化gp120で０，５，
６，７，８および９回免疫処置した後に分析したヒヒ29
64の血清からのウイスル中和データ（図２０）をグラフ
にすることによって検査した。

【０１５７】実験の血清を含有するウェル中の合胞体形
成単位／ml（sfu／ml）の数（Ｖｎ、二重反復実験のウ
ェルの平均）を測定し、そしてこの数をsfu／mlのウイ
ルス単独（Ｖｏ、８つの複製ウェルの平均）で割ること
によって、中和を記録した。この分数Ｖｎ／Ｖｏを血清
試料の希釈に対してプロットし、そしてＶｎの90％の減
少、すなわち、Ｖｎ／Ｖｏ＝０．１を可能にする血清希
釈を認めることによって中和を記録した。試料は右の凡
例により示し、ここで数は採血に対応する。採血０は採
血前であり、これはウイルス中和を示さない。採血１２
は５回の免疫処置後；採血２２は６回の免疫処置後；採
血２４は７回の免疫処置後；採血２７は８回の免疫処置
後；採血２２は９回の免疫処置後である。

【０１５８】図２０において明らかなように、繰り返し
追加免疫は中和曲線の傾斜をシフトし、こうして中和は
採血３２（９回の免疫処置後）に検出された。これらの
結果が実証するように、抗体産生性クローンについて選
択した繰返し追加免疫はより広い特異性を有する。

【０１５９】

【表８】

【０１６０】（実施例８）３頭の個々のヒヒ2964および
2958からのすべての血清試料の分析を、組み換え変性し
た、比グリコシル化タンパク質および組み換え自然、グ
リコシル化（gp120）免疫化動物における差を線描写し
た（図２１）。ヒヒ2964を組み換え自然グリコシル化タ
ンパク質でワクチン接種し、そしてヒヒ2958を組み換
え、変性、非グリコシル化タンパク質でワクチン接種し
た。HIV-SF2の中和は、Higwood et al.,AIDS.Res. and
Hum.Retrov.(1990) 6：855-869に記載されているｐ２５
ｇａｇ阻害アッセイによりアッセイした。すべての他の
分離物は感染性癌の阻害アッセイによりアッセイした。
各採血からの血清をHIV-SF2、HIV-MNおよびHIV-HYLVIII
Bに対してウイルス中和活性についてアッセイした。変
性、非グリコシル化タンパク質を使用するそれ以上の促
進は抗体または中和力価を週１０で測定したレベルを越
えて増加させず、そしてHIV-HYLVIIIBの検出可能な中和
は存在しなかった。gp120免疫化動物において、HIV-SF
2、HIV-MNおよびHIV-HTLIIIB力価は各促進後増加し、最
大の増加は休止後に観測された。中和する活性のパター
ンはすべての３つのウイルスについて類似するが、応答
の大きさは異なった。HIV-HTLIIIBの中和の出現は他の
２つの分離物に関して遅延した。下の実施例９に記載す
るヒヒにおける追加の実験において、MF59中で配合した
組み換え変性、非グリコシル化タンパク質はHIV-MNまた
はHIV-BRUの中和活性に対して中和を誘発することがで
きないことをわれわれは実証した（データは示されてい
ない）；gp120血清はこれらの３つの分離物ならびにHIV
-ZR6を反復した促進後中和した（表９）。

【０１６１】図２１は、変性、非グリコシル化gp120で
免疫化したヒヒ2958、および自然、グリコシル化gp120
で免疫化したヒヒ2964からのすべての血清試料の中和力
価を示す、１組のグラフである。これらの動物の免疫化
は実施例６に記載されている。

【０１６２】（実施例９）ヒヒは次のものと配合した55
mgのgp120で免疫化した：ムラミルトリペプチド−ホス
ファチジルエタノールアミン、100mg、を含有するミク
ロ流動化乳濁液（MF59）；または不完全フロインドアジ
ュバント（ＩＦＡ）。MF59の処方は水中の５％のスクア
レン、0.5％のTween-80、0.5％のSpan-85および内因性M
TP-PE 0.4mg／mlであり、これをマイクロフラッダイザ
ーで乳化し、そしてアルゴン雰囲気下に使用するまで貯
蔵した。次いで、それを抗原と震盪により混合し、そし
て注射した。ヒヒについての抗原特異的応答を要約する
データを表９に示す。gp120特異的力価は、また、この
研究において各促進後、ピークとなり、次いで傾斜し
た。より高い力価はＩＦＡよりMF59を使用して達成され
た。ウイルスの中和はウイルスの相同性または異種の分
離物について試験し、週10、24および38、それぞれ、
３，４および５回の免疫化後において決定した。これら
のアッセイの結果を表９に要約する。この研究におい
て、MF59群の動物は、ＩＦＡ群より、高い力価およびそ
の群において陽性の動物の大きい比率を有した。HIV-SF
2およびHIV-MNに対して有効な中和力価は３回の免疫化
後に、そしてHIV-HTLIIIBおよびHIV-ZR6に対して５回の
免疫化後に観測された。MF59中の組み換え自然、グリコ
シル化gp120で免疫化した動物は、５回のみの免疫化後H
IV-BRUおよびHIV-ZR6の中和において有効な抗体で応答
した。前の研究において、アフリカの分離物の中和は８
回（HIV-NDK)または９回（HIV-ZR6)の免疫化後にのみ達
成された。さらに、実施例９においてアジュバントMF59
中の組み換え自然、グリコシル化gp120でHIV-ZR6に対し
て達成された力価はより高かった。また、HIV-BRUおよ
びHIV-ZR6に対して有効な中和性抗体の出現は、前述の
実施例６と対照的に、この研究において同時であった。
この結果はアジュバントまたは免疫化の養生法のためで
あり、これは実施例６における単一の長い休止期間と比
較して、実施例９において２つのより短い休止期間を可
能とした。

【０１６３】

【表９】

【０１６４】（実施例１０）ヒヒについて前述した手順
に類似する手順に従い、４頭のチンパンジー（Pantrogl
odytes)を５５mgのgp120＋アジュバント2XMF59（２頭の
動物）、アジュバント単独（１頭の動物）で免疫処置す
るか、あるいは免疫処置しないで、この種の霊長類、人
間に最も近い生存動物におけるタンパク質の免疫原性を
決定した。実験計画は図２２に記載する。図２２におい
て、陰影を付したバーは３つの研究の各についての時間
線（免疫処置スケジュール）を表す：実施例６のヒヒ
（上部の線）、実施例９のヒヒ（中央の線）、および実
施例１０のチンバンジー（下の線）。時間の目盛り
（週）はこの図面の下に示されている。免疫処置は垂直
線により示し、上の番号は注射の時間の線上の位置にお
いて免疫処置の数を示す。実施例６におけるヒヒは第
０，４，８，12，21，55，59，65および80週において免
疫化したが、ただしヒヒ2964は第80週の代わりに第82週
に免疫処置した。実施例９におけるヒヒは第０，４，
８，22および36週に免疫処置した。チンパンジーは第
０，４，８および28週に免疫処置した。2XMF59の処方は
10％スクアレン、１％Tween-80、１％Span-85および内
因性MTP-PE（0.4mg／ml）であり、これを微流動化装置
で乳化し、そしてアルゴン雰囲気下に使用するまで貯蔵
した。次いで、それを振盪により抗原と混合し、そして
注射した。動物を１ヶ月の間隔で筋肉内注射し、そして
血清を各免疫処置後の採血のエンベロープ特異的力価お
よびウイルス中和抗体について分析した。組換えの天然
グリコシル化で免疫処置した２頭のチンパンジーについ
てのデータを表１０に要約する。他方の対照のチアンパ
ンジーはgp120特異的抗体または中和抗体のいずれも発
生しなかった（データは示されていない）。組換え天然
グリコシル化タンパク質で免疫処置した両者の動物は免
疫処置抗原に対してすぐれた応答を示し、そして両者の
動物はHIV-SF2およびHIV-MNに対して有効なウイルス中
和抗体を有する。チンパンジーの１つからの血清は、ま
た、３回の免疫処置後HIV-HTLVIIIBを中和した。チンパ
ンジーを６ヵ月の休止期間後に追加免疫し、そして血清
をこの免疫処置に分析する。HIV-SF2に対するウイルス
中和力価が十分に高いとき、動物はHIV-SF2のチンパン
ジー力価測定ストックでチャレンジする。チンパンジー
をチャレンジの２週前に再免疫処置する。異種単離物に
対して有効な中和抗体の存在を仮定すれば、これらの同
一動物において異種ウイルスチャレンジに対する可能性
も存在する。

【０１６５】

【表１０】

【０１６６】本発明を今まで十分に記載したが、多数の
変更および改良を添付の請求の範囲の精神および範囲か
ら逸脱しないで行うことができることは当業者にとって
明白であろう。

【０１６７】（生物学的材料の寄託）次の代表的材料
は、1990年11月７日に、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（the American Type Culture Collec
tion，米国メリーランド州ロックビル）に寄託され、そ
して指摘のように命名された。これらの寄託物は、特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約の規定に従って維持されるであろう。

【０１６８】寄託物 ＡＴＣＣ番号 寄託日 チャイニーズハムスター卵巣細胞 CHO-6a120-145-0.1-22CRL 10379 1990年３月９日 チャイニーズハムスター卵巣細胞 CHO-DG44 CRL 10378 1990年３月８日 Ｅ．コリ HB101(pCMV6a120-SF2)68249 1990年３月８日 これらの寄託物は当業者にとって単に便宜性のために提
供され、そして寄託物が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２の下に
要求されるという許可ではない。これらのプラスミドの
該酸配列、並びにそれらによりコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列はここに参考として加えられ、そして
本明細書の記載と予盾する場合には照らし合わせてい
る。寄託物を製造、使用、または販売するためにはライ
センスが要求され、そしてこのようなライセンスはここ
で許されていない。

【０１６９】

【発明の効果】本発明は、本明細書の部分である図面と
組み合わせて次の特定の実施態様の説明を参照すること
によって、より一層理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、組換えHIV-1 gp120（rgp120）の生産
のための例示的発現プラスミドの略図である。

【図２】図２は、指摘した定常（Ｃ）および可変（Ｄ）
領域をもつ種々のHIV-1単離物についての整列されたア
ミノ酸配列の表である。HXB2配列についての潜在的Ｎ−
結合グリコシル化部位のみを［］により示す；システイ
ン残基はこの図面においてそれらの上に＊を有する。こ
の配列データは、Human Retroviruses and AIDS1988, A
Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amin
o Acid Sequences,Gerald Myersら、Theoretical Biolo
gy and Biophysics Group発行、T-10、メイルストップK
710、ロスアラモスナショナルラボラトリーズ、ロスア
ラモス、ニューメキシコ、87545。同じ発行元により発
行された1989年版も存在する。

【図３】図２の続きである。

【図４】図３の続きである。

【図５】図４の続きである。

【図６】図５の続きである。

【図７】図６の続きである。

【図８】図７の続きである。

【図９】図８の続きである。

【図１０】図９の続きである。

【図１１】図１０の続きである。

【図１２】図１１の続きである。

【図１３】図１２の続きである。

【図１４】図１３の続きである。

【図１５】図１４の続きである。

【図１６】図１５の続きである。

【図１７】図１６の続きである。

【図１８】図１８のＡは、精製段階においてフェニルＨ
ＩＣカラムを使って得られた生成物画分を示すグラフで
ある。図１８のＢは、精製段階においてエーテルＨＩＣ
カラムを使って得られた生成物画分を示すグラフであ
る。図１８のＣは、精製段階においてゲル濾過クロマト
グラフィーを使って得られた生成物画分を示すグラフで
ある。

【図１９】図１９は、ゲル濾過HPLCを使ったCD4-gp120
複合体の形成を示すグラフである。

【図２０】図２０は、０，５，６，７，８および９回の
gp120での免疫処置後に分析した、ヒヒ2964血清からのH
IV-ZR6中和データを示すグラフである。

【図２１】図２１は、実施例６の免疫処理ヒヒ2958およ
びgp120免疫処置ヒヒ2964からの全血清試料の中和力価
を示す１組のグラフである。

【図２２】図２２は、霊長類の中断された免疫処置計画
の略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 HIV gp120を精製して、天然のウイルスH
   IV gp120と実質的に同じタンパク質／タンパク質結合特
   性を有する精製されたgp120糖ペプチドを調製する方法
   であって、 ａ．全長のグリコシル化gp120を含有する粗gp120調製物
   をイオン交換クロマトグラフィーにより分画して、第１
   画分収集物を提供し、 ｂ．前記第１収集物から、CD4ペプチドに対して特異的
   結合親和力を示す画分を選択し、これにより第１の分画
   された物質を生成せしめ、 ｃ．前記第１の分画された物質を疎水的相互作用クロマ
   トグラフィーにより分画して、第２画分収集物を提供
   し、 ｄ．前記第２収集物から、CD4ペプチドに対して特異的
   結合親和力を示す画分を選択し、これにより第２の分画
   された物質を生成せしめ、 ｅ．前記第２の分画された物質をサイズ排除クロマトグ
   ラフィーにより分画して、第３画分収集物を形成せし
   め、そして ｆ．前記第３収集物から、CD4ペプチドに対して特異的
   結合親和力を示す画分を選択し、これにより前記精製さ
   れたgp120を提供する、ことを含んで成る方法。