CZ195793A3 - Derivatives gp160 and vaccine based on gp160 or on a derivative of said substance, containing an auxiliary component - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká derivátu gpl60 a vakcíny na bázi těchto látek. Tyto materiály jsou určeny pro použití při léčení AIDS. Vynález se zvláště týká nových typů uvedené vakcíny, která obsahuje jako pomocný prostředek 3-D monofosforyllipid A

Dosavadní stav techniky

Retroviry, to znamená viry z čeledi Retroviridae jsou velkou skupinou ikosohedrálních virů s vyvinutým obalem, s velikostí přibližně 15 0 nm, tyto viry mají spirálový nukleokapsid ve struktuře jádra a jako genetický materiál obsahují RNA. Tato čeled obsahuje onkoviry, například virus sarkomu a leukemie, některé viry imunodeficience a lentiviry.

Virus lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1, je etiologickým původcem získaného syndromu imunodeficience, který se obvykle označuje AIDS. Tento retrovirus má složitou genetickou organizaci, zahrnující dlouhé koncové opakující se řetězce (LTR), geny gag, pol, a snv a další geny. Tento retrovirus nese celou řadu virových antigenu, které by mohly být schopné bud jednotlivě nebo ve skupině vyvolat po zařazení do vakcíny ochrannou imunologickou odpověd.

Obalová bílkovina HIV-1 je syntetizována ve formě polyproteinového prekursoru, který je pak v infikované buňce glykosylován za vzniku glykoproteinu s molekulovou hmotností 160 000 (cpl60), tento glykoprotein je pak zpracován proteolýzou na vnější glykoprotein gpl20 a transmembránový protein gp41.

Kódová oblast DMA pro viros HIV může byt připravena z jakéhokoliv klonu cencmu viru imunodeficience, tak jak jsou uvedeny v literatuře, například v publikacích Shaw a další, Science, 226 : 1165 (1984) a Kramer a další, Science, 231 : 1580 (1936). Genomový klon viru imunodeficience je možno připravit také z viru, izolovaného z klinických vzorků běžným klonováním DMA, například podle US patentového spisu č. 4 520 113 (Gallo a další), nebo podle US patentového spisu č. 4 703 813 (Montagnier a další).

Pro^virový řetězec DNA pro HIV-BH10-2 byl popsán v publikaci Ratner a další, Human Retroviruses and AIDS, 1989, HIV Sequence Database ed. Gerald Meyers, Los Alamos National Laboratory. Délka řetězce je 8932 párů baží, gen env je uložen mezi bázemi 5580-8150 a místo štěpení v tomto genu v polohách 7083 a 7112 odpovídají aminokyselinám 503 a 511 (ke štěpení dochází za těmito zbytky), číslování je podle databaze Los Alamos.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří gpl6C HIV, který byl modifikován tak, že obsahuje nezávisle odlišné aminokyseliny od lysí nu nebo argininu v polohách 502 a 510.

Vhodnými náhradami lysinu jsou zbytky, které jsou lysinu podobné svou hydrofilností a rozměrem, například histidin, threonin, serin, asparagin, kyselina asparagová, glutami.n a kyselina glutamová. Z těchto aminokyselin je výhodná zejména kyselina glutamová. Výhodná bílkovina je neštěpitelr vzhledem k zavedeným mutacím a mimoto je schopna vyvolávat tvorbu zkřížených neutralizačních protilátek, která je závis lá na správné konfiguraci bílkoviny.

Ve vvhocném orovecení nežne oodle vynáleze získat .zrnovanou o;

•elativní mols.-c. 1 > ·. τ í χ í n 3 s ϋ i o 4 0 j u 0. v zavěs· colSO ~de oatrně o v 1 á ;

Ί - :

tetramerni zormu. To ;e vsítí vynodně vzh_edem k ternu, zs i pžerozené sa povrchové bílkoviny virů vyskytují jako oi-cc.Tsry, které in vivo vytvářejí hroty, vyčnívající z povrch·, viru. Vzhledem k tomu, ža ja nutno zachovat neutralizační epitopv, je zapotřebí co nejvíce zachovat přirozenou formu a.ntigenu pro dosažení odpovídající imunologičtí odpovědi.

Ve výhodném provedení je možno získat modifikovanou bílkovinu pjíie vynálezu v oligomerní a v podstatě čisté formě.

Pod pojmem v podstatě čistá forma” se rozumí čistota alespoň 75 %, s výhodou alespoň 90 % a zvláště 99 %.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob výroby modifikovaného gplSO HIV, tento postup spočívá v tom, že se dosáhne exprese kódové DNA pro tuto modifikovanou bílkovinu v rekombinantní eukaryctické hostitelské buňce a modifikovaná bílkovina se izoluje.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž polymerní DNA s obsahem nukleotidovéno řetězce, který je kódovým řetězcem pro modifikovanou bílkovinu.

Rekombinantní molekulu DNA podle vynálezu je možno způsobem podle vynálezu připravit kondenzací příslušných mono-, di- nebo oligomerních nukleotidových jednotek.

Tento postup je možno uskutečnit chemicky, enzymaticky nebo kombinací těchto dvou metod, in vivo nebo in vitro podle ootřeby. Molekula DNA může být připravena enzymatickou vazbou příslušných fragmentů DNA běžným způsobem, například podle publikace D. M. Roberts a další, Biochemistry 1985, 24, 5090 - 5098.

acmentv DNA .ne ne získat rozštěpením DNA, cbsar.u~ící požadované řetězce nukleotidů oůsobením restrikčních

e.'ií.7.tiZ, wne.ai^Kou syntezCV, enzy.uatrcKOU polymeraci ncoo ucm-* , ** Ů

X . j O * A S—

Štěpení restrikČními enzymy je možno provést v příslušnem pufru pri teplotě 20 až 70 C, obvykle v objemu 50 mikrolitrů nebo mžší^při použití 0,1 až 10 mikrogramů DNA.

Enzymatickou polymeraci DNA je možno uskutečnit in vitro při použití DNA-polymerázy, například DNA-polymerázy I íKlenowův fragment) ve vhodném pufru, obsahujícím nukleosidtrifosfáty dATP, dCTP, dGTP a dTTP při teplotě 10 až 37 °C, obvykle v objemu 50 mikrolitrů nebo nižším. Fragmenty je možno polymerovat a amplifikovat pomocí PCP-reakce při použití Tac-polymerázy (například podle PCR Protocols 1389, a guide to Methods and Applications, Ed. M. A. Innis a další, Academie Press).

Enzymatickou vazbu fragmentů DNA je možno uskutečnit při použití DNA ligázy, například T4 DNA ligázy v příslušném pufru při teplotě 4 °C až teplotě místnosti, obvykla v objemu 50 mikrolitrů nebo nižším.

Chemická syntéza molekuly DNA nebo jejích fragmentů se provádí běžným způsobem při použití fosfotriesterů, fosfitů nebo fosforamiditů na pevné fázi, například podle publikace Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual, ed. H. G. Gassen a A. Lang, Verlag Chemie, Weinheim, 1982, nebo podle dalších vědeckých publikací, například M. J. Gait, H.M.D- Matthes, M. Singh, B. S. Sproat, a R. C. .Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10,

5243, B. S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771, M. D. Matteucci a Μ. H. Caruthers, Tetrahedron

Letters, 1980, 21, 719, M. D. Matteucci a Μ. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185,

S. ?. Adams a další, Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661, N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, a H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539, a H.W.D. Matthes a další, EMBO Journal, 1934, 3, 801. Ξ výhodou se užívá automatického zařízení na syntézu DNA.

Polymer DNA, který je kódem pro modifikovanou bílkovinu, je možno připravit cílenou mutagenesou cDNA, která je kódem pro nemodifikovanou bílkovinu, s použitím běžných postupů, například podle publikací G. Winter a další, Nátuře 1982, 299, 756 - 758 nebo Zoller a Smith 1982, Nucl. Acids Res., 10, 6487 - 6500.

Vynález se rovněž týká vektoru, obsahujícího rekombinantní molekulu DNA podle vynálezu a rekombinantního vakcinačního viru s obsahem tohoto vektoru.

Uvedený vektor je možno připravit podle vynálezu tak, žs se získá štěpením lineární segment DNA s obsahem neporušeného raplikonu a tento lineární segment se naváže na jednu nebo větší počet molekul DNA, které vytvoří s lineárním segmentem úplnou rekombinantní molekulu DNA podle vynálezu.

Rekombinantní hostitelská buňka podle vynálezu může být připravena transformací vakcinačního viru při použití vektoru podle vynálezu.

Modifikovaný bílkovinný produkt je možno z prostředí izolovat běžnými postupy pro izolaci a čistění bílkovin.

Je možno přidat smáčedla, jako Decyl PEG-300, DO Decvl PEG

Triton X100. Je možno přidat také deoxycholát k rozštěpení buněk a uvolnění modifikované bílkoviny z materiálu buněčné membrány. Z těchto látek, jsou výhodné zejména prostředky Decyl PEG-300 a Thesit Deoxycholate a také DO Decyl PLG Triton X100. Modifikovanou bílkovinu jc pak možno čistit několikastupňovou ultrafiltraoí, odstředěním v ultraodstředivce, selektivním srážením například při použití síranu amonného nebo polyethylenglykolu PEG, odstředěním za použití hustotního gradientu v CsGl nebo sacharcse nebo při použití gradientu metrizamidu a/nebo chromatograficky, například při použití afinitní chromatografie, s výhodou imunoafinitní chromatografie, HPLC, HPLC v reverzní fázi, chromatografie na kationtoměniči nebo aniontomšniči, chromatografie s omezením rozměru eluovaných molekul a pomocí isoelektrického bodu. Výhodné je čištění s použitím imunoafinitní chromatografie. V průběhu čištění nebo po něm je možno modifikovanou bílkovinu zpracovat například působením formaldehydu, glutaraldehydu nebo NAE ke zvýšení stability nebo ke zvýšení imunologické odpovědi.

Pro přípravu oligomerních forem je vhodné užít v průběhu čištění mírných podmínek. Zvláště je nutno se vyvarovat použití redukčního činidla, výhodné je použití neiontových smáčedsl, jako je Decyl PEG-300 (polyethylenglykol 300 monodacylether) k rozrušení buněk a solubilisaci v průběhu chromatografie. Výhodným prostředím pro afinitní chromatografii je prostředek Sepharose s lektinem z čočky a výhodným prostředím k provádění imunoafinitní chromatografie je prostředí s moncklonální protilátkou proti golOO, například protilátkou 173.1 (170 20/06353), vázanou na vhodný nosič, například na Trisacryl (I3P), aktivovaný glutaraldehydem.

Modifikovanou bílkovinu je možno adsorbovat 2 rnono:lonální protilátky v přítomnosti oktylglukopyranosidu jako imáčedla, tuto látku je pak možno odstranit čialýzou. Smáčeda se s výhodou užijí v koncentraci vyšší než je jejich teoetická kritická micelová koncentrace.

Modifikovanou bílkovinu, získanou způsobem podle vynálezu je možno použit jako diagnostické činidlo oro detekci vystavení viru HIV. Modifikovanou bílkovinu je však možno použít také pro výrobu vakoí.n pro prevenci infekce nebo pro inhibici nebo prevenci progrese onemocnění.

Vynález se rovněž týká vakcíny a farmaceutických prostředků, obsahujících modifikovanou bílkovinu podle vynálezu. Tyto prostředky obsahují imunoprotektivní množství modifikované bílkoviny podle vynálezu a je možno je připravit běžnými postupy.

V očkovací látce podle vynálezu je možno přímo použít vodný roztok uvedené bílkoviny. Je možno postupovat také tak, že se bílkovina, popřípadě po předchozí lycfilizaci smísí nebo se absorbuje na jakýkoliv známý pomocný prostředek. Takovými prostředky jsou například hydroxid hlinitý, muramyldipeptid a některé saponiny, například Quil A, 3D-MPL (3deacylovaný monofosforyllipid A), nebo TDM. Js také možno postupovat tak, že se bílkovina zapouzdří do mikročástic, například liposomu. Ještě další možností je konjugace bílkoviny s imunostimulační makromolekulou, například s usmrcenými bakteriemi Bordetella nebe s tetanovým toxoidem.

Příprava očkovacích látek je všeobecně popsána v publikaci New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do liposomu bylo popsáno například v US patentovém spisu č. 4 235 377 (Pullerton). Konjugace bílkovin s makromolekulami byla popsána například v US patentovém spisu Č. 4 372 945 (Likhite) a v US patentovém spisu č.

474 757 (Armor a další).

Množszví modifikované bílkoviny podle vynálezu v každé dávce vakciny se volí jako množní.í, vyvolávající imuno8 protektivní odpověč bez podstatných nepříznivých vedlejších účinků. Teto množství se bude měnit v závislosti na použití speoozj_OKe zmunogennu. latKy a tane na tom/ zca ocxovacz lat ka obsahuje nebo neobsahuje pomocný grestředek. Obvykle bude každá dávka obsahovat patrně 1 až 1000 mikrogramů modifikované bílkoviny, s výhodou půjde o množství 10 až 200 mikroeramů. Opeimúiní množství pro danou očkovací látku je možno ověřit běžnými pokusy včetně pozorování ticr.. protilátek a dalších odpovědí. ?o počáteční vakcinaci bude patrně podávána v průběhu 4 týdnů další dávka k dosažení zvýšené tvorby protilátek a pak další dávky každých 6 měsíců tak dlouho, pokud trvá riziko infekce.

Kodifikovanou bílkovinu podle vynálezu je tedy možno použít k očkování možného hostitele a k přípravě očkovacích látek.

Kromě vakcinace osob, u nichž by mohlo dojít k infekci HIV, je možno užít farmaceutické prostředky podle vynálezu k léčení nemocných, trpících infekcí HIV imunotherapií

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou tedy určeny také k léčení osob, trpících infekcí HIV, těmto osobám se podává účinné množství modifikované bílkoviny gpl60, tak jak byla svrchu popsána.

Současně s myšlenkou využití některých složek materiálu, například rekombinantní technologií může dojít také k nutnosti využití pomocných prostředků a/nebo nosičů pro imunogenní látky, tak, aby bylo možno dosáhnout obou typů obvyklé imunologické odpovědi, to znamená tvorby neutralizačních protilátek a vzniku imunity, zprostředkované afektorovými buňkami (DTH). Bylo prokázáno, že při použití materiálů podle vynálezu k profylaxi nebo léčení infekce

HIV je při použití 3D MPL jako pomocného prostředku možno dosáhnout obojího typu imunologické odpovědi.

Podle výhodného provedení tedy farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahuje gpl60 nebo jeho imunologický derivát a 3D monofosforyllipid A (3D-MPL) spolu s vhodným nosičem.

V dalším výhodném provedení vynálezu obsahuje farmaceutický prostředek g?160 nebo jeho imunologický derivát a 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě. Tento systém má zvýšenou účinnost.

Podle výhodného provedení vynálezu tedy obsahuje farmaceutický prostředek nebo očkovací látka gp-160 nebo jeho imunologický derivát a 3D-MPL v nosiči typu olej ve vodě, přičemž tento nosič je tvořen emulzí tetrapolyolu a netoxického minerálního oleje ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s obsahem pufru.

Nosič s výhodou obsahuje polyol typu Pluronic, například Pluronic L121, squalan nebo squalen nebo jakýkoliv jiný metabolizovaný olej. Ke stabilizaci emulze se s výhodou užije emulgátor, například Tween 30 nebo Tween 28.

Nosič s výhodou obsahuje pouze částice menší než 1 mikrometr, například částice s velikostí v rozmezí 100 až 400 nm.

Koncentrace antigenu v konečném farmaceutickém prostředku se S'výhodou pohybuje v rozmezí 10 až 150 a zvláště 20 aŽ 100 mikrogramú/ml.

Pomocný prostředek 3D-MPL je v očkovací látce s výhodou obsažen v koncentraci 10 až 100 a zvláště v koncentraci 25 až 50 mikrogramú/ml.

Podstatu vynálezu tvoří očkovací látka pro použití v lékařství, zejména pro použití při imunotherapii a profylaxi infekce HIV-1, například syndromu AIDS nebo komplexu, spojeného s touto chorobou, ARC.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob výroby očkovací látky, obsahující gpl60 nebo jeho imunologický derivát, 3D-monofosforyllipid A a vhodný nosič, postup spočívá v tom, že se gploO nebo jeho imunologický derivát smísí s uvedeným nosičem a s 3D monořosforyllipiaem A.

Tento postup je možno uskutečnit například tak, že se užije nosíc typu olej ve vodě, přičemž tato emulze se zpracovává k dosažení velikosti částic menší než 1 mikrometr, načež se emulze mísí s gplSO nebo jeho imunologickým derivátem a s 3D MPL.

Při typickém provádění tohoto postupu se nejprve 3D-MPL smísí s emulzí a k výsledné směsi se pak přidá antigen.

3D-MPL je možno získat způsobem podle britského patentového spisu č. 2 211 502.

Vhodnými nosiči pro toto použití jsou emulze typu olej ve vodě. Prostředky podle vynálezu mohou zajistit výhodnější neutralizační titr při srovnání s použitím běžných vakcín, které obsahují jako pomocný prostředek pouze alum (jediný pomocný prostředek, povolený pro použití v lidském lékařství).

Pod pojmem imunologické deriváty se rozumí imunogenní fragmenty bílkoviny gpl60, které jsou v přítomnosti pomocného prostředku 3D-MPL schopné vyvolat tvorbu neutra11 lizačních protilátek proti .HIV-1. Vzhledem k torno, že tyto deriváty zahrnují například také glykoprotein gpl20 zevní membrány HIV-1, zahrnují imunologické deriváty také přírodně se vyskytující izoláz gpl60. Zvláště výhodné jsou ty deriváty, při jejichž použití je možno vyvolat také odoověá DTH.

Ve velmi výhodném provedení je tedy podle vynálezu možno získat modifikovanou formu bílkoviny v oligomerní formě, která při čištění za mírných, neredukčních podmínek má zjevnou molekulovou hmotnost v rozmezí 600 až 700 000, s výhodou 640 000, jde patrně o tetramer, který je možno destabilizovat chromatografií na SDS-gelu za neredukčních podmínek, čímž se získá dimer s molekulovou hmotností 330 000 a monomer. Dimer je možno dále redukovat za běžných redukčních podmínek za vzniku monomeru.

Všechny uvedené formy . gploO, je možno ušít v prostředcích podle vynálezu.

Bílkovinu gplSO nebo její deriváty je možno získat známými postupy. V typických případech půjde o klonování a expresi genu pro gpl60 ve vhodném hostiteli. Rekombinantní gplóQ (rgp ISO) je možno získat podle publikace Maniatis a další, ΐ-Solecular Cloning - A laboratory Manual, Colč Spring Harbour 1932.

Pro expresi rekombinantních molekul DNA je možno použít celou řadu eukaryotických buněk a systémů pro expresi. NejpouŽívanejšími systémy jsou kvasinky a hmyzí a savčí buňky, přestože vynález nemá být na tyto systémy omezen.

V těchto systémech se užívá rekombinantní molekula DNA podle vynálezu, popřípadě spolu s označením pro selekci a popřípadě například s počátkem pro replikaci.

Použitelnými hmyzími buňkami jsou například buňky Drosophila a Lepidoptera. Použitelnými buňkami Drosophila jsou například buňky Sl, S2, 53, KC-0 a D. hydei, které byly popsány například v publikacích Schneider a další,

J. Embryol. Exp. Morph., 27 ; 353, (1972), Schulz a další, Proč. Nati.Acad. Sci., USA, 33 : 9423 (1986), Sinclair a další, Mol. Cell. Biol., 5 : 3208 (1935).

Transfekci buněk Drosophila je možno uskutečnit běžnými postupy, například srážením fosforečnanem vápenatým, ÍÚ.ZG buněk; DO2TÚ £ O Σ33Π i ΖΪ1 5 1 SXtX Z CKStlO OGOGCi/J. 3

Vir*. *5UnXV £5 ΖΏ&ΠίνϊΠΧ DO“ stupy v celé řadě živných prostředí, včetně prostředí 143, které obsahuje vyváženou směs solí a základních aminokyselin a bylo popsáno v publikaci Li.ndquist, DIS, 58 : 163 (1982) .

Promotory, které je možno použít u Drosophila, jscu například promotory z buněk savců, jako SV40 a také promotory z buněk Drosophila, které jsou výhodnější. Příkladem použitelných promotorů z buněk Drosophila může být metallothioneinový promotor, promotor KSP70 pro tvorbu bílkoviny v případě tepelného šoku s molekulovou hmotností 70 000 a promotor CCPIA LTR, popsané například v publikacích DiNocera a další, Proč. Kati. Acad. Sci., USA, 80 : 7095 (1983), McGarry a další, Cell 42 : 903 (1935).

Použitelné buňky Lepidoptera zahrnují buňky Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda, Helithis 2ea, Autographica californica, Rachiplusis ou, Galieria melonslla, Manduca sexta nebo další buňky, které je možno infikovat baculoviry, včetně viru nukleární polynedrosy (NPV), virů s obsahem jednoho nucleocapsidu (SNPV) a virů s obsahem většího počtu nucleocapsidů (MNPV). Výhodnými baculoviry jsou NPV nebo MNPV vzhledem k tomu, že obsahují promotor polyhedrinového genu, k jehož vysoké expresi dochází v infikovaných buňkách. Jako příklad je možno uvést virus MNPV z Autographica californica (AcMNPV). Je však možno užít i jiné viry MNPV a NPV, jako virus bource morušového, Bombyx moři. Buňky Lepitootera mohou být podrobeny současné transfekci rekombinantní molekulou DNA podle vynálezu a DNA infekčního baculoviru běžným způsobem. Buňky sa pak pěstují obvyklým způsobem při použití celé řady živných prostředí, například v prostředí TC100 (Gibco Europe), popsaném v Gardi.ner a další, J. Inverteb. Pathol., 25 : 353 (1975 ) a doplněném 10¾ fatálním telecím šerem FCS podle publikace Miller a další, v Setlow a další, eds., Genetis Engineering: Pri.nciples and Methods, sv. 8, New York, Plenům, 1985, str.

277 až 233.

Promotory pro použití u buněk Lepidoptera zahrnují promotory z genomu baculoviru. Výhodný je zejména promotor polyhedrinového genu vzhledem k tomu, že u této bílkoviny obvykle dochází k vyšší úrovni exprese ve srovnání s ostatními bí.nevinami baculoviru. Výhodný je zejména promotor polyhedrinového genu z viru AcMNP.*, popsaný v publikacích Summers a další, JAES Bull. NR 1555, kviten 1937, Smith a další, EP. 127 839, Smith a další, Proč. Lati. Acad. Sci., USA 82:3404 (1985) a Cochran, EP-A-228 035.

Pro expresi v buňkách savců je možno klonovat rekombinantní molekulu DNA ve vektoru pro klonování a pak ji užít k transfekci buněk savců. Vektor obvykla obsahuje další funkce pro amplifikaci genu, například kazetu pro expresi DHFR a může obsahovat ještě přídatné funkce pro selekci a/nebo pro amplifikaci, například kazetu pro odolnost proti neomyoinu pro selekci G413. Je možno užít ještě další funkce, například pro usnadnění transkripce. Mimoto je možno užít ještě funkce pro udržení stálosti episomů, jako funkce z viru papillornu skotu. S výhodou se jako vektoru pro klonování užije rekombinantní virus savců, například virus planých neštovic, vacoinia virus.

Tento virus je zvláště vhodným vektorem z toho důvodu, že rekombinaci je možno snadno provést integrací cizorodého cenu do nepodstatných oblastí jeho DNA za udržení infekčnosti viru. Při pečlivě voleném postupu je možno bílkoviny syntetizovat, zpracovat a přenést do membrány infikovaných buněk. Přesto, že infekce tímto virem vede k uhynutí buněk, malé míře k rozrušení buněk a většina buněk zůstává neporušená, což dovoluje snadnou izolaci požadované bílkoviny z infikovaných buněk. Uvedený systém pro expresi bvi popsán v publikaci Barrett a další, Aids Research and Human Retroviruses 1989, 5 : 159 - 171.

Použitelné buňky savců zahrnují buňky z vaječníků čínského křečka (CHO), buňky NIH3T3, COS-7, CV-I, BHK-21, buňky myelomu myši nebo krysy, buňky KAK, Věro, HeLa, lidské diploid.ní buňky, jako MRC-5 a WI38, nebo buněčné linie lymfomu kuřete CV-I a BHK-21, které jsou zvláště výhodné.

Pěstování buněk při transfekci i následující pěstování se provádí běžným způsobem. Produkci bílkovin v buňkách savců je možno uskutečnit také expresí u transgenických živočichů.

Řídící řetězce, vhodné pro dosažení exprese genu v buněčných liniích savců nebo v primárních buňkách savců zahrnují promotory SV 40, metallothioneinový promotor,

LTR virů, například LTR Rousova sarkomu, LTR viru Moloneyova sarkomu (MSV) a LTR viru nádoru mléčné žlázy myši MMTV nebo promotor adenoviru a také hybridní promotory, například promotor hybridního viru 3K a promotor adenoviru. Ohlase řídících prvku může také zahrnovat takové funkce, jako oblasti pro polyadenylaci nebo další funkce, například řetězce pro usnadnění transkripce.

Z kvasinek, které je možno použít při provádění vynálezu je možno uvést zejména rody Hanensula, Pichia, Kluveromyoes, Schizosaccharomycss, Candida a Saccharomyces. Výhodným hostitelem z této skupiny je Saccharomises cerevisiae. Použitelné promotory zahrnují promotor, indukovatelný působením mědi (CUP1), promotory glykolytického genu, například TDH3, PGK a ADH a promotory PHO5 a ARG3, tyto promotory byly popsány v publikacích Miyanohara a další, Proč. Natl.Acad. Sci., USA, 80 : 1 (1983), Mellor a další. Gene, 24 : 1 (1983), Hitzeman a další, Science 219 : S20 (1983), Cabezon a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81 : 6594 (1984).

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

i) Exprese modifikovaného gplSO v buňkách CV-1

Gen HIV env molekulárního klonu BH10 byl podroben muta genese tak, aby nedošlo k rozštěpení prekursoru.

X tomuto účelu byly místa štěpení” lys-ala-lys-arg a arg-glu-lys-arg, přítomná v těchto řetězcích modifikováno cílenou mutagenesou za vzniku lys/arg a glu/arg.

místo štěpení 1 ooloha 502 místo Štěpení 2 ooloha 510 klon EK10: AAG GCA AAG AGA AGA GTG GTG CAG AGA GAA ΑΛΑ AGA

LYS ALA LYS ARG ARG VAL VAL GLN ARG GLU LYS ARG mutovaný

AAG GCA GAG AGA AGA GTC GTG CAG AGA GAA GAA AGA

LYS ALA GLU ARG ARG VAL VAL GLN ARG GLU GLU ARG

Úplný mutagenisovaný gen env (nukleotidy 5902 - 8478) byl klonován ve vektoru pro přenos pGS20 (Mackatt M. G., Smith L. a Moss B., (1934), J. Virology, 49:857-854) pro použití u viru vaccinia a byl přenesen do tohoto infekčního viru rekombinaoí. Plaky rekombinantního viru pak byly sledovány na expresi genu env pomocí ΕΙΛ a positivní plaky byly dvakrát reklonovány v buňkách CV-i. Produkce nerozštěpeného gplSO v těchto buněčných liniích byla dále ověřena pomocí RIPA po metabolickém označení buněk, infikovaných rekombinantním virem. Exprese povrchového antige.nu byla potvrzena fluorescenčním značením neporušeného buněčného povrchu při použití protilátek proti gpl20.

ii) Čištění modifikovaného gpl5U z buněk

Obalová bílkovina HIV gplSO ze stupně i) byla čištěna ve třech stupních. Hostitelské buňky byly rozrušeny a antigen bvl extrahován pomocí smáčedla, načež byly užity dva stupně afinitní chromatografie. Celé čištění bylo prováděno při teolotě 4 °C.

Stupeň 1; Rozrušení buněk CV-Í a excrakce anticenu gpl60

Po rozmražení se suspenze buněk a mikrokuličky nosiče, odpovídající 20 litrům kultury odstředí 15 minut při 2200 g a supernatant se odloží. Sraženina se znovu uvede do suspenze v 1 litru 30 mM tris/HCl o pH 8, doplněném 150 mM NaCl, % polyethylenglykol 300 monodecyletheru (Decyl PEG) a 20 mikrogramy/ml aprotininu. Buňky byly rozrušeny 1 hodinu v ledu za občasného protřepání rukou a pak byly 20 minut odstřelovány při 11300 g. Po oddělení supernata.ntu byla usazenina promyta 400 ml pufru, užitého pro rozrušení buněk a pak byl materiál znovu odstřelován 20 minut při 11300 g. Buněčná drt a mikrokuličky nosiče byly odloženy a supernatanty byly spojeny a užity pro další čištění.

Stupeň 2: Afinitní chromatografie na Sepharose 43 s lektinem z čočky

Lysát byl chromatografován na sloupci s rozměrem 2,5 x 20 cm s obsahem Sepharose 43 s lektinem z čočky (?harmacia-LX3), v rovnovážném stavu v pufru 30 mM tris/HCl o pH 8, doplněném 150 míi NaCl a 0,1 % Decyl PEG. Po nanesení lysátu při rychlosti průtoku 1 ml/min byl sloupec promyt pufrem 30 mM tris/HCl o pH 3, doplněným 1 M NaCl a 0,1 % Decyl PEG. Pak byl antigen ze sloupce vymýván s použitím 0,5 M methyl-alfa-D-mannopyranosidu v tomtéž pufru a frakce, obsahující gpl50 byly spojeny. Promytí sloupce a jeho eluce byly prováděny při rychlosti průtoku 5,5 ml/min.

Stupeň- 3: Imunoafinitní chromatografie na 178.l-Trisacryl

Monoklonální protilátka 178.1 proti gploQ, popsaná ve zveřejněné patentové přihlášce NO 90/0G358 byla čištěna z ascitické tekutiny na sloupci prostředku protein-G-Sepharose (Pharmacia-LK3) a pak Pyl materiál navázán na prostře dek Trisacryl, aktivovaný clutaraldehydem (13?) podle navo du výrobce. Pak byla protilátka, zaměřená proti epitopu na skupině gpl20 antigenu (smyčka V-) navázána v množství 1,5 mg/ml gelu.

Pryskyřice byla vložena do sloupce s rozměrem 2,5 x x 10 cm a uvedena do rovnovážného stavu v pufru 30 mM tris/HCl o pří 3, doplněném 150 mM NaCl a 0,1 % Decyl PEG.

Eluát ze Sepharose 4B s lektinem z čočky byl na slou pec nanesen a nechal se opakovaně projít sloupcem přes noc rychlostí 1 ml/min. Pak byl sloupec promyt při rychlosti průtoku 3,3 ml/min 20 objemy sloupce pufru 30 mM tris/HCl o pH 3, doplněného 1 M NaCl a 1 % n-oktvl-beta-D-glukopyrancsidu OGP. Nakonec byl antigen vymýván při téže tychlosti průtoku a při použití pufru s obsahem 0,1 M kyseliny citrónové o ρΗ 3,3, doplněným 1 % OGP. Frakce byly okam žitě neutralizovány přidáním pufru 1 M tris/HCl o pH 8,3 a frakce s obsahem antigenu byly spojeny.

iii) Stanovaní bílkoviny

Koncentrace bílkoviny byly stanoveny způsobem podle Bradforda (Eradford, 1975), při použití sérového albuminu sketu jako standardu.

iv) Stanovení antigenu

Množství antigenu gp!60 bylo měřeno vlastním sandwichovým testem ELISA při použití ovčí protilátky proti gp41 k vazbě monoklonální protilátky a myší protilátky proti g?120 jako indikátoru monoklonální protilátky. Další detekce tyla pr ováděna protilátky prcci myším vého systému.

při použití klasické biotinylované tkáním, streptavidinu a peroxidázov)

Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu a metoda íJestern blott

Elektroforéza na desce SDS-gelu byla prováděna při použití 10% polyakrylamidového gelu způsobem podle éasmolího (Laemmli, 1270). Po ukončené migraci byly bílkoviny barveny stříbrem po oxidaci kyselinou jodistou (barvení Pas,

Dubray a další, 1932).

Elektrodoréza byla prováděna v přítomnosti redukčního činidla. Pásy ideaciěi ; „ /dny metodou Western blott sobem podle Powbina (.'owbin a daló_, užity protilátky proti antigenu golSO ská. buňce CV-1 nebo trati bílkovinám pří cennosti a v nebílkoviny byly dále na nitrocelulose zpú1972) jako sonda byly nebo proti hostitelviru vaocinia.

vi) Průkaz protilátek 171.1

Přítomnost monokle.;íi._;í protilátky 171.1 v čištěném antigenu gplóO byla měřena zkouškou ELI5A. Protilátky byly zachyceny na kozí protilátku proti myším tkáním, detekce byla prováděna biotinylovanou protilátkou proti myším tkáním. Další detekce byla provedena systémem streptavidin-perexidáza.

vii) Chromatografie čistého env gplSO při použití materiálu oro tříděni molekul oodle velikosti

Čištěný antigan gpI60 byl chromatografován na sloupci ΤΞΚ 4000 3W HPLC s rozměrem 7,5 x 300 mm v rovnovážném stavu v 0,2 M fosfátovém pufru o pH 7, doplněném 1 % CG?. Rychlost průtoku byla 0,75 ml/min, frakce byly analyzovány na přitomn c 3 z. 3.n^ícsnu zΧοιίΞkou Ηί-ΣΞΑ.

viii) Stanovení čistoty

Čistota byla stanovena po každém stupni čištění elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu za redukčních podmínek. Pásy bílkoviny byly visualisovány barvením PAS a bílkovina byla dále identifikována metodou Western blott.

Výsledky jasně ukazovaly, že antigen je prostý zjistitelných bílkovinných nečistot po chromatografií na imunoafinitním sloupci. Výsledný produkt by vsak mohl být znečištěn stopovým množstvím monoklonální protilátky, uvolněné z imuno afinitního sloupce. 2 tohoto důvodu byl měřen obsah monoklonální protilátky 178.1 v čistem gpl60 metodou ELISA a byl prokázán obsah 0,004 až 0,02 % v celkovém množství bílkoviny v získaných vzorcích.

Čištěný antigen byl analyzován na přítomnost oligomerních forem gplfiO. Tvorba oligomerů by mohla odrážet strukturu gploO ve viru, v němž je obalová bílkovina uspořádána ve formě hrotů na povrchu virionu. Přítomnost cysteinových zbyt ků v primárním řetězci antigenů dovoluje tvorbu (homo)-oligo merů, spojených disulfidovými můstky. Tuto skutečnost bylo možno prokázat elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu v přítomnosti a v nepřítomnosti beta-merkaptoethanolu. Bez přítomnosti redukčního činidla byla molekulová hmotnost antí genu v pásech bílkoviny vyšší než 160 000 i v přítomnosti smáčedla SDS. Avšak v případě, že byl antigen povařen v přítomnosti redukčního činidla, bylo možno pozorovat pouze jediný pás bílkoviny s molekulovou hmotností 160 000. Aby bylo možno stanovit velikost oligomerních struktur, byl antigen analyzován HPLC chromatografií s tříděním podle velikosti molekul. 2 kalibrace sloupce pomocí standardů se známou molekulovou hmotností vyplývalo, že většina molekul gp!60 vycházela ze sloupce s dobou retence, odpovídající molekulové hmotnosti 640 000. Je tedy zřejmé, že v přítomnosti smáčedla, avšak bez přítomnosti redukčního činidla se většina bílkoviny gpl£0 seskupovala do tetramerních struktur.

ix) Analýza

Výsledný produkt má poměr antigen/bílkovina přibližně 2, což odpovídá obsahu antigenu, který byl zjištěn zkouškou ELISA v lyzátu buněk, tj. 0,8 až 1,4 mg antigenu na 1 litr kultury.

Příklad 2

Exprese modifikovaného gpl60 v BKX-21 a čištění obalového antigenu gpl60 z buněk, pěstovaných v suspenzi

Obalová bílkovina HIV gplóO, k jejíž expresi došlo v buňkách BHK-21 analogickým způsobem jako v příkladu 1 i) při použití rekombinantního viru vaccinia byla čištěna způsobem podle příkladu 1 ii) s výjimkou některých malých modifikací při rozrušování buněk.

Stupeň 1: Rozrušení buněk BHK-21 a extrakce antigenu gpl60

Po rozmražení byla suspenze buněk s obsahem 10 buněk odstředěna 15 minut při 2200 g a supernatant byl odložen. Usazenina buněk byla znovu uvedena do suspenze v 50 ml 30 mí-J tris/HCl o pH 8 při doplnění 150 mi-1 NaCl, 1 % polyethylenglykol 300 monodecyletheru (Decyl PEG) a 20 mikrogramů/ml aprotininu, Buňky byly rozrušovány 1 hodinu v ledu za občasného ručního orotřepání a pak byly odstředěny 15 minut při 11300 g. Po oddělení supernatanou byla usazenina promyta 20 ml pufru, užitého k rozrušení buněk a pak znovu 15 minut odstřelována při 11300 g. Pak byla usazenina odložena a supernatanty byly spojeny a ušity pro následující čistění.

Stupeň 2 a 3

Stupně 2 a 3 a následující analýza byly provedeny Xtejným způsobem jako v příkladu 1 ii) - ix).

Příklad 3 výroba očkovací látky gplSQ - 3D-MPL

3(a) rgplSO-hydroxid hlinitý s 3D-’iPL

Čištěný rgplOO (vždy 100 nebo 20 mikrogramů v jedné dávce) z-viru vaccinia 2 příkladu 1 byl adsorbován přes oři 4 C no'byna hydroxid hlinitý (alum) v množství, odpovídajícím 0,5 mikrogramům Al ' v 1 ml pufru s obsahem 150 ml-I NaCl a 10 mil fosfátu o pH 6,3. Po inkubaci přes noc byla směs odstředěna a supernatant byl odstraněn. Pak byl k rgplSO, vázanému na alum přidán stejný objem absorpčního pufru, obsahujícího 100 mikrogramů 3D-ÍIPL. Svlo prokázáno, že více než 95 % rgplSO bylo adsorbováno na hydroxid hlinitý.

(b) rgplSO 3D-I1PL v emulzi typu olej ve vodě

Nosné prostředí bylo připraveno následujícím způsobem: Pluronio L121 (SASF Nyandotte, New Jersey) s koncentrací 5 % objemových a 10 % scualanu (Aldrich) bylo přidáno k fyziologickému roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem PSS s obsahem 0,4 % objemových prostředku Tween 30. Tato směs se pak desetkrát nechá projít mikrofluidisačním zařízením (Model MllO Hicrofluidics Corp., Newton, Mass.). Výsledná emulze obsahovala pouze částice menší než 1 mikrometr. Jeden objem této emulze se smísí se stejným objemem dvakrát koncentrovaného rpgl60 (bufi 20 nebo 100 mikrogramú) a směs se krátce promíchá k zajištění důkladného promíse.ní složek. Pak se přidá k emulzi rgplóO typu olej ve vodě 100 mikrogramů/ml 3D-MPL. Výsledný prostředek obsahoval 0,2 % Tween 80, 2,5 % Pluronic L121, 5 % scualanu, 100 mikrogramú 3D-MPL a 100 nebo 20 mikrogramú rgplSO v 1 ml očkovacího materiálu pro injekční podání.

Příklad 4

Imunogenita u morčat

ELISA a neutralisační titry

Pět morčat bylo imunizováno třemi injekcemi po 50 mikro gramech modifikovaného gplSO z příkladu 1 v SAE-1 (pomocný prostředek Syntex), který byl popsán v publikaci Byars NE a Allison A. C. (1987) Vaccine 5, 223 - 227. Injekce byly podávány v měsíčních intervalech. Séra byla podrobena zkouškám dva týdny a jeden měsíc po sekundární imunisaoi a dva týdny po terciární imunisaci morčat. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Ke stanovení titru ELISA v antiséru po první a ^Jruhé podpůrné injekci byla užita inz^řmatická imunologická zkouška EIA při použití rozrušených buněk, infikovaných HIV-1 (IIIB). Použitá zkouška je velmi podobná testu, který byl popsán v publikaci Moora J. P. a další, 1989, AIDS 3, 155, (63) .

Neutralizační zkoušky na mikroplctnách jsou založeny na detekci antigenu HIV gag v indikátorových buňkách. Jako indikátorové buňxy se užijí buňky SupTi, popsané v publikaci neone a další, 1984, Science 225:1445. Virový očkovací materiál je tvořen, bezbuněč.oým supernatantem HIV-1 (III3) z lymfoidní buněčné linie. Tento supernatant se odstředí při vysoké rychlosti k odstranění buněk a buněčné drti, rozdělí , * o se do lahviček po podílech 1 ml a uschová při teplete -30 C až do použití. Zkoumané vzorky sér se před zkouškou inaktivují zahřátím na 30 minut na teplotu 56 C. Negativní kontrola byla tvořena směsí sér z neimunizovaných živočichů nebo živočichů, kterým byl podán pouze pomocný prostředek, šlo o živočichy téhož druhu jako v případě zkoumaných sér. Při neutralizaci se inkubuje 750 TCID^ se zředovací řadou sér jednu hodinu pri teplete 37 C. Pak se přidají buňky SupTl v množství 4 x 10*' ouněk na vyhloubení a materiál se inkubuje 4 dny při teplotě 37 C. Cytopachický účinek s= sleduje mikroskopicky, do každého vyhloubení se přidá Triton X-100 v konec.í koncentraci 1 % a plotna se zmrazí, ke sledování relativního množství virového antigenu, produkovaného v kultuře se užije sandwichova metoda ELISA. Pak se plotny opaaří ptvlakem monoklonální protilátky proti pS5. Vzorky s Tritonem X-100 se v plotně inxubují a přítomnost antigenu gag se vizualizuje směsí biotinylovaného HIV-1 a IgG člověka, pak následuje působení streptavidinperoxidázy. Pak se vyhodnotí. _t.ro všechna ředění vire snížení produkce antigenu HIV-1 v procentech ve srovnání s kontrolou. Při použití křivky, odpovídající údajům oři nelineární analýze nejmenších čtverců je možno dosáhnout extrapolace toho ředění séra, které vede k 50¾ snížení produkce antigenu ve srovnání s kontrolou v případě, že k takovému snížení dochází.

V tabulce 2 je shrnut titr neutralizačních protilátek po terciární imunizaci.

Neutralizační titry pozorované po druhé podpůrné injekci, to znamená po terciární imunizaci jsou vyšší než titry, které je možno prokázat u infikovaných lidí. Neutralizační titr těchto antisér proti izolátu HIV IIIB je v průměru čtyřikrát vyšší než titr, který dyl pozorován pro skupinu pěti seropositivních referenčních sér WHO podle publikace McXeating a další, 1989, J. Gen. Virol. 70:3326-3333. Neutralizace řady izolátů HIV-1 (zkřížená neutralizace) byla zkoušena v laboratoři Dr. Weisse (Chester Beatty Laboratories, U.K.) při použití neutralizačního testu s vymezenějšími podmínkami, kterým je možno prokázat nižší citlivost a titr. Výsledky, které jsou shrnuty v tabulce 3, byly reprodukovány ve třech případech při dvou odlišných odběrech krve a vykazují dobrou zkříženou neutralizaci pro různé kmeny HIV-1 včetně afrického kmene CBL-4, jak je zřejmé z tabulky 3.

Séra morčat, imunizovaných gpl60, produkovaným virem vaccinia podle příkladu 1 (01-05) vykazují dobré titry pro zkříženou neutralizaci po terciární imunizaci.

Vzhledem k silné zkřížené neutralizační odpovědi, kterou bylo možno pozorovat po třech dávkách, je možno považovat g?160 z viru vaccinia za vhodný pro potenciální použití k očkování proti HIV-1.

Příklad 5

Sledování účinku různých vakcín na imunogenitu čištěného gpl50 HIV z vaccinia (izolát IIIB) u opic Rhesus

Při těchto zkouškách byla vyhodnocena schopnost různých vakcín zvýšit imunogenitu čištěného rekombinantního gploO, rgplSO u opic Rhesus (Macaca mulatta). Pomocné pro26 středky, které byly zkoušeny, byly hydroxid hlinitý (Alhydrogeí, Superfos, Dánsko) v kombinaci s 3D-MPL z přikladu 2b) ( 3D Moncphosahoryi Lipid A, Ribi), nebo 3D-MPL v emulsi typu olej ve vodě z příkladu 2a).

Opice Rhesus (llacaca mulatta) s hmotností 3,5 až 5 kg byly náhodně rozděleny do sedmi skupin po třech nebo čtyřech zvířatech ve skupině.

Jednotlivé skupiny byly imunizovány různými dávkami rgpl60 ve třech prostředcích s obsahem pomocného prostředku následujícím způsobem!

Skupina 1 (4 opice):

100 mikrogramů rgpl60, adsorbovaného na směs hydroxidu hlinitého a 3D-MPL.

Skupina 2 (4 opice):

mikrogramů rgpl60, adsorbovaného na směs hydroxidu hlinitého a 3D-IÍPL.

Skupina 3 (4 opice):

100 mikrogramů rgpl60 a 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě.

Skupina 4 {4 opice):

mikrogramů rgpi60 a 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě.

5.1. Prostředky s obsahem antigenu a pomocného prostředku

Všechny prostředky s obsahem rgplSO byly připraveny těsně před použitím, každá injekce byla podána v objemu 1 ml

Skupinám opic Rhesus byiv injekčně pocánv nitrosvalově do trojhlavého pažního svalu dávky 1 ml různých prostředků s obsahem gp!60 ve dnech 0 a 35. Dva týdny ρο druhé imunizaci byla zvířatům odebrána ktev pro stanovení protilátky.

5.2. Způsob vyhodnocení

Séra, odebraná uvedeným zvířatům injekci byla podrobena zkoušce ELISA a zkouškám.

dva týdny po druhé neutralizačním

5.3. ELISA

Byla užita modifikace imunologické zkoušky, popsané v publikaci Thiriart a další, 1989, J. Immunol. 145, 6:832836. Při této zkoušce se užívá obchodně dodávaného reakčního činidla, monospecifického proti gp41 (Biochrom). Jako antigen byl ušit surový lysat buněk BHK 21, infikovaných vacoinia gplSO.

5.4. Neutralizační zkouška

Neutralisační zkouška na mikroplotnáoh je založena na detekci antigenu HIV gag v indikátorových buňkách. Jako indikátorové buňky se ušijí buňky SupTl podle publikace Hecht a další, 1984, Science 226:1455. Virový očkovací materiál byl tvořen bezbuněč.ným supernatantem lymfoidní buněčné linie, produkující HIV-1 (IIIB). Supernatant byl odstředěn vysokou rychlostí k odstranění buněk a buněčné drti, rozdělen do lahviček po-podílech 1 ml a uložen při teplotě -30 °C do následujícího použití. Zkoumaná séra byla před provedením zkoušky i.naktivována 30 minut při teplotě 56 °C. Pro neutralizaci se inkubuje 750 TCID_5Q se zředovací řadou séra hodinu při teplotě 37 °c. Cytopathický účinek se sleduje mikroskopicky, do každého vyhloubeni se přidá Triton X-1QQ do konečné koncentrace 1 % a olotna se zmrazí, X průkazu relativního množství virového antigenu, produkovaného v kultuře se užije sanchwichová zkouška ELISA.

Plotny se opatří povlakem moncklonální protilátky proti p55. Vzorky po působení Tritonu X-100 se inkubují na plotně a přítomnost antigenu gag se vizualizuje přidáním biotinylovaného HIV-1 a IgG člověka, pak následuje stupeň s použitím streptavidinperoxydá2y. Pak se pro všechna zředění séra vyhodnotí snížení produkce antigenu HIV-1 v procentech ve srovnání s kontrolami. Při použití křivky, odpovídající údajům při lineární analýze regresů se extrapoluje to ředění séra, jímž je možno dosáhnout 50¾ snížení produkce antigenu ve srovnání s kontrolami v případě, že taková koncentrace existuje.

5.5. Výsledky

V tabulce 4 jsou shrnuty výsledky zkoušky ELISA a titr neutralizačních protilátek po druhé imunizaci. Obecně je možno uvést, že imunogenita rgploO HIV v 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě, je velmi dobrá. V případě, že byla zvířatům podána dávka 20 mikrogramů gpl60, bylo dosaženo velmi dobrých titrů neutralizačních protilátek (IJT) a titrů ELISA ve skupině zvířat, jímž byl podán rgplSO v 3D-MPL v suspenzi typu olej ve vodě (skupina 4). Tyto údaje potvrzují velmi dobrý pomocný účinek 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě. Imunologická odpověč zvířat imunizovaných gpl60, adsorbovaným na Alum v přítomnosti 3D-MPL je velmi nízká, přesto že dochází k produkci určitého množství neutralizačních protilátek. HIV gpl60 obsahuje hydrofobní skupinu, která patrně způsobuje vysokou afinitu molekuly k lipidům. 2 tohoto důvodu je patrný vhodným prostředím pro HIV rgplóO při přívodu této látky do imunologického systému oros obsahující 3D-.‘-i?L v emulzi typu olej ve vodě.

ece.<,

Příklad 6

ó.l. Provedení pokusu

Dva šimpanzi č.l a č. 2 byly imunizováni čištěným rekombinantním gplSO z vaccinia v dávce 100 mikrogramů, použit byl materiál z příkladu 1.

Další dva šimpanzi č. 3 a č. 4 byli imunizováni dávkou 100 mikrogramů čištěného rekombinantního gpl20, k jehož expresi došlo v buňkách Drosophila Schneider podle publikace Culp a další, Biotechnology, 9:173-177, 1991.

Rekombinantní bílkoviny byly zpracovány na očkovací látku spolu s 3D MPL v množství 100 mikrogramů v jedné dáv ce v emulzi typu olej ve vodě. Prostředek obsahoval 0,2 % Tween 30, 2,5 % Pluronic L121, 5 % scualanu, 100 mikrogramů 3D-MPL a dávku rekombinantního antigenu 100 mikrogramů v případě rgplóO nebo rgpl20 v injekčním obejmu 1 ml.

Zvířata byla imunizována nitrosvalově do dolní končetiny v měsíci 0, 1 a 2.

Zvířatům byla odebrána každé dva týdny krev pro stanovení titru protilátek zkouškou ELISA a pro stanovení titru neutralizačních protilátek (způsob provedení zkoušky ELISA je veden v příkladu 4.3), zkouška na neutralizační protilátky HIV byla poněkud modifikována, jak bude dála uvedeno. 3vl vyhodnocen také vznik zpožděné hyparsensitivní odpovědi (DTH), jak bude rovněž dále uvedeno.

6.2. Vvvoléní humorální imurm

Jak je zřejmé z tabulky 5, bylo možno u šimpanzu, očxova nýc.n ryploC nebo rgpl20 spolu s pomocným prostředkem 3D M?L v emulzi typu olej ve vodě pozorovat vysoký titr protilátek při zkoušce ELISA i vysoký titr neutralizačních protilátek po :n munižacích. Neutralizační protilátky bylo možno proká2a* ve czjcn vzorcích sera ze čtyř zkoumaných vzorku po podaní ďcu injekcí a u všech čtyřech .norků po další injekci. Zvýšení titru neutralizačních protilátek bylo mošno pozorovat po třetí imunizaci. Titry protilátek při zkoušce ELISA i ne- -Ί “! 7 ~ -* ·»*-·- · . 1» -U r* zj 1· ·. -1-1 ·. 1 “7 m ,-- -1 — í* -*·, , Ί ' h -w

Ui k_ J_ ti _L X i. *1 _!_ . · V 1 >· w Λ v — 4_ „ X — ·*» 1-i* * — — - -- J w * ~ V — ·//' dobné titrúm, získaným u opic Rhesus, imunizovaných třikrát tímtéž prostředkem s obsahem rgplSO.

5.3. Vyvoláni DTH

Zkoušky na DTH byly provedeny nizaci. Všechny injekce byly podány 100 mikrolitrů pro jednu injekci.

dva týdny po třetí imudo ořic.i-a u uuje.au

Dva šimpanzi, imunizovaní rgplSO a oba šimpanzi, imunizovaní rgp!20 byli podrobeni kožním zkouškám při použití tří různých antígenu (rgplSO, rgD25 a tetanový toxoid) a dvou kontrolních pufrů {kontrolní pufr Ρ3Ξ pro rgD2t a kontrolní pufr pro rgplSO). Byly zkoušeny různé dávky rekombinantního antígsnu, a to 40, 20 nebo 10 mikrogramů v prípado rgplSO a 20, 10 nebo 5 mikrogramů v případe rgD2t.

Odpověá DTH byla sledována po dalších 24 hodinách měřením tlouštky pokožky. Výsledky jsou znázorněny na obr.1 až 3.

Specifickou odpověa DTH proti tetanovému toxoidu a proti rgplSO bylo možno pozorovat u zvířat, imunizovaných rgplSO nebo rgpl20.

Výsledky prokazují, Se prostředky, které obsahují 30 v emulzí typu olej ve vodě, jsou schopné vyvolat specifickou odpověa T-buněk, jak je zřejmé z tabulky 6.

Je tedy možno uzavřít, že výsledky, získané u šimpanzu jasně prokazují, že prostředky, které jako pomocný prostředek obsahují 3D KPL v emulzi typu olej ve vodě, významně zlepšují humorální oapověd, to znamená titr neutralizačních protilátek a také buněčně zprostředkovanou imuno logickou odpověď (DTH) u primátu.

Zkouška na neutralizační protilátky

Zkouška na neutralizační protilátky, provedená na mikroplotnách je založena na vizuálním vyhodnocení CPE po vyvolání infekcí HIV-1 v indikátorových buňkách. Jako indikátorové buňky bňlň užity buňky SupTl podle publikace Hecht a další, 1984, Science 225:1445. Virový očkovací materiál byl tvořen bezbunečným supernatantem lymfoid.ní buněčné linie, produkující HIV-1 (III3). Supernatant byl odstředěn při vysoké rychlosti k odstranění buněk a buněčné drti, byl rozdělen do lahviček po podílech 1 ml a uležen při teplotě -20 °C až do dalšího použití. Zkoumaná séra byla před provedením zkoušky 3G minut inaktivována při tep lote 56 °C. Jako negativní kontrola byla užita směs sér, odebraná od týchž zvířat před imunizací. Při provádění neutralizační zkoušky se inkubuje 750 TCID^q se zředovací řadou zkoumaných vzorků sér 1 hodinu při teplotě 37 °C.

Pak se přidají buňky SupTl v množství 2 χ 10^-1 buněk/vyhloubení a vzorek se inkubuje 4 dny při teplotě 37 °C. Cytcpathický účinek se hodnotí mikroskopicky ve dni 4 a titr neutralizačních protilátek se stanoví vizuálně. Daný titr neutralizačních protilátek odpovídá převrácené hodnotě toho ředění zkoumaného séra, při jehož použití je mož32 no dosáhnout 80¾ snížení tvorby syncytií ve srovnání s kontrolními vzorky, které byly odebrány před imunizací. Vizuálně stanovené titry so dálo cojauvirnó hodnotí ve dm 7 měřením životaschopnosti buněk v každém vyhloubení při použití zkoušky MTT, popsané v publikaci Pauwels a další,

J. Virol. Methods 20:309-321, 1983. Titry, stanovené při provádění této zkoušky jsou převrácenou hodnotou toho ředění séra, které poskytuje 30¾ ochranu proti C?E ve srovnání s neinfikovanými buňkami. Titry, stanovené vizuálně nebo stanovené MTT jsou velmi reprodukovatelné v průběhu dalších zkoušek, přičemž neznázorněné, zkouškou MTT stanovené titry jsou dvakrát až čtyřikrát nižší než titry, stanovené vizuálně.

Tabulka 1

Čištění KIV gplSO uo jeho expresi v buňkách CV-1 a BKK-21

Způsob čištění	objem (ml)	c b	elková ílkovina (mg)	výtěžek bí lkovir (%)	výtěžek íy antioenu (%)
CV-1 (1)
rozrušení buněk	1400		2000	100	100
lektán z čočky	350		100	5	80
imunoafinitní chromatografie	60		3	0,4	6 5
BHX-21 (2)
rozrušení buněk	1480		253G	100	100
lektán z čočky	495		113	4	79
imunoafinitní chromatografie	60		7	0,3	58
(1) 20 litrů	nul tury	jako	výchozí ma	teriál.
(2) 14 litrů	kul aury	(2,1	x 10^θ bun	ěk) jako	výchozí

materiál.

±J

	O	o			z\
	ΟΊ	m	ΓΟ	fx.	fX
oj	co		O	>	c
OJ			<N

>0

Γ3 ϋ

N

H	cn	x-·	Γ-	«r	un
r—*	>o	O	i-H		σ	o	»—1
d μ	c !—1	r—í 7	H		i-H	i-H Ny

U l-H —’ o

C CL

LT)

Z

CJ

Ό

m	Ifí	LO	ΓΊ	m	Ci
co	O	'T	U>	ro	OJ
	Γ—I		Γ-Ί		OJ

(N d

i a

*c (O r-l i □ n

d r-( t—!

z o o > CLO

H o

•Η Ή

J 0)

O >CJ

Sj Ξ

CL H

H *—I <c

H 0 ω Lli

Ή !j jJ Z

H D

ΓΗ Ό

C	i—i
w	O'	LO
LO	σι	OJ
σ	σ»	i—!
LO	Γ*	lO
r-l	r-!	f-|

*r

OJ		Γί
rH	co	o
f-J	=0	OJ
O	r>	o
j—1	r*

r-		Γ
C)	σ	ΓΝ
n	o	n
o	Ό	o
(N	r-í	(N

ro	X	O
in		o
<0	n	ro
	(N	m
OJ	(N	OJ

tn
o*	x>	o
fJ	If)	Γ0
	o
OJ	Í0	>

ď)
O		Ό
σ		>
in	o	m
η		OJ

o η

jj >

Jť (Λ a

'CJ u

o

JJ a

d

Cj '0 tn

Iinunoyeni ta gp!60 u morčat >y o

>u a

CJ

Ό '> O Z 'U O JJ 0 Ώ e o o u CL CL d

a >

'd σ»

Ή rH

I u, <

en

X o

ďl d

z

H O CJ o a d <L>Li > ? c.

z >rj

CJ >L d

jj o

z o

'd o

u 'd >

,u n

V z z	;rek 2.0.	lilo homologní zkouška	heterologní	zkouška RF	C3L-4
S?2	:ir:
01	02/05/90	SO	10/<10	-	-	-
02	02/05/90	<40	80	10	-	10
03	02/05/90	80	20	-	-	10
04	02/05/90	40	10	-	-	10
05	02/05/90	SO	40	10	-	10
01	14/05/90	40	20	-	-	10
02	14/05/90	30	20	-	-	10
03	14/05/90	150	20	10	-	10/410
04	14/05/90	20	10	-	-	40
05	14/05/90	40	40	0/<10		10
pos	itivní u člověka^	15 0	320	30	150	30
negativní u člověka		—			“

Positivní neutralizační účinek znamená 30¾ inhibici tvorby syncitií pri vizuálním hodnocení.

Tabulka 3 srovnává neutralizační účinnost mcroaoího séra proti gplSO k homologním (Illb) a heterologním izolátům.

- 36 Tabulka

Imuno	pěnitá rekombi	nantního cpi 60 z vacci	nia u opic Rhesus
		titr ELISA a neutrál	icační titr
		Gen 15	po II
5 Λ J	pomocný	identifikace 50 % NT	T T T 7 A *k v L L i m Λ
pí na	orostrecex/		střední titr
	dávka
i	ALUM 3D	I? 111 ^-100	576
	MPL/100 .ug	IP 123 <100	301
	/	I? 151 <100	411
		IP 167 <100	630
		GMT	460

2	ALUM 30	I?	101	<100	1371
	MPL/20 ug	I?	103	< 100	1541
	I?	105	<10 0	1437
		I?	195	<100	94
			GMT		302

3	“3Γ\ _/ **!· ÍjVi.	I?	120	435	9043
	100 ,ug	IP	125	232	5537
	z	I?	150	235	3931
		I?	152	913	10G2S
			i	435	5739

4	30 MPLOM	IP	114	462	5413
	20 ,ug	I?	117	573	5220
	/	I?	113	<100	2529
		IP	197	203	t .iv 3
			GMT	322	Λ 4 Γ» .· Sí U ‘j

r	Odpovídá převrácené hodnotě ředění séra, jímž	Οθ	možno
	zajistit 50¾ snížení tvorby antigenů ve srovná	ní	s kcn-
	trolou.
x:í	Odpovídá převrácené hodnotě ředění séra, jímž	03	mož.no
	dosáhnout absorbance v hodnotě 50 % maximální	ho	dnoty.
GMT	= geometrický průměr ti tru.

- 3D-MPL v emulsi typu olej ve vodě.

3d-m?lcm

Protilátky proti HIV u šimpanzů po valtcinaci ryplGO a rgp!20

Claims (22)

1. PATENTOVĚ N A R O

   1. Deriváty gplSO HIV, které byly obsahují v polohách 502 a 510 nezávisle modifikovány tak, ža aminokyselinu, odlišnou od lysinu nebo argininu.
2. 2. Deriváty podle nároku 1, v nichž se zbytek aminokyseliny v polohách 502 a 510 volí ze skupiny histidin, threonin, serin, asparagin, kyselina asparagová, glutamin a kyselina glutamová.
3. 3. Deriváty podle nároku 1 nebo 2, v nichž je zbytkem aminokyseliny v poloze 502 a 510 zbytek kyseliny glutamová,
4. 4. Oligomer nebo dimer derivátu gplGO HIV podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
5. 5. Cligomer podle nároku 4, jehož relativní molekulová hmotnost je přibližně 540 000.

   5. Derivát gplGO HIV nebo oligomer nebo dimer podle nároků 1 až
6. 6, ve v podstatě čisté formě.
7. 7. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje bílkovinný derivát nebo oligomer podle nároku 1 až 5 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem.
8. 8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje bílkovinný derivát nebo oligomer podle nároků 1 až 5 spolu s farmaceutickým nosičem.

   3. Vakcína nebo farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje gplGO nebo jeho imuno40 logický derivát a pomocný prost A spolu s vhodným nosičem.

   ek 3D Mor.oohosphoryl lipid
9. 10. Vakcma něho farmaceutický prostředek modle nároku 9, vyznačující se tím, že imunologickým derivátem gploO je bílkovina nebo oligorr.er podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.
10. 11.

    s e

    Vakcína t í m podle nároků 9 nebo 10, že jako nosiče obsahuje vyznačujíemulzi typu olej
11. 12. Vakcína podle nároku 11, vyznačující se tím, že se koncentrace gplSO pohybuje v rozmezí 10 až 150 mikrogramů/ml.
12. 13. Bílkovina HIV gplSO nebo její oligomer podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, pro použití v lékařství.
13. 14. Vakcína podle kteréhokoliv nároku S až 12 pro použití v lékařství.
14. 15. Použití bílkoviny HIV gploO nebo jejího oligomeru podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro výrobu vakcíny pro léčení infakca HIV-I.

    15. Použití podle nároku 15 pro profylaxi infekce HIV.
15. 17. Způsob výroby modifikované bílkoviny HIV gplSO podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se t í m , že se dosáhne exprese kódového řetězce DNA pro tuto bílkovinu v rekombinantní eukaryotické hostitelské buňce a modifikovaná bílkovina se izoluje.

    13. Řetězec DNA, který je kódovým řetězcem pro modifikovanou bílkovinu todle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
16. 19. Ztúsob vvrobv oliccmeru neb:

    nažeru mociz i .< ovaneho cti50 oodle nároků 4 neoc o, vyznačující se t i m , žs se izoluje modifikovaná bílkovina z rekombinantního eukaryotického hostiosle a tak se čistí za nerednkč.ních podmínek.
17. 20. Způsob výroby vakciny s obsahem gpl60 nebo jeho imunologického derivátu, 3D monofosforyllipidu A a farmaceuticky přijatelného nosiče, vyznačující se tím, že se smísí gplSQ nebo jeho imunologický derivát, 3D monofosforyllipid A a nosič.
18. 21. Vakcina nebo farmaceutický prostředek podle nároku 9,vyznačující se tím, že jako imunologický derivát obsahuje gpl2O.
19. 22. Vakcina podle nároku 21, vyznačující se t í , že jako nosič obsahuje emulzi typu olej ve vodě.
20. 23. Vakcina podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že obsahuje gpl2O v koncentraci 10 až 150 mikrogramů/ml.
21. 24. Vakcina podle kteréhokoliv z nároku 21 až 23 pro použití v lékařství.
22. 25. Způsob výroby vakciny podle nároku 20, vyznačující se tím, že se jako imunologický derivát přidá gpl2O.