CN1041326C - 制备cav核酸序列或氨基酸序列的方法 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
本发明涉及一种包含小鸡贫血病毒(CAV)的遣传信息的核酸序列。特别是，鉴定了编码病毒多肽的三个基因区域。所述的区域或多肽可以被用于抗CAV感染疫苗的制备或诊断目的。
本发明也涉及于检测CAV感染的小鸡的检测药盒。
Description
本发明涉及编码小鸡贫血病毒相关多肽的核酸序列，一种含上述核酸序列的重组核酸分子，一种含所述核酸序列的载体病毒，一种用上述核酸序列转化的宿主细胞，一种鸡贫血病毒的相关多肽和与之发生反应的抗体，一种鸡贫血病毒的突变体和一种抗鸡贫血病毒传染的疫苗。
本发明也涉及一种免疫化学试剂和一套含所述试剂的检测药盒。
小鸡贫血病毒(CAV)在小鸡中引起传染性贫血。尽管CAV显而易见地能传染所有年龄的鸡，但是据报道只在年轻的鸡中有发病的迹象。CAV也是免疫抑制性的。在正常健康的鸡中，胸腺在年轻的鸡中产生T-细胞，法氏腔上囊产生B-细胞，骨髓除产生红细胞外，还产生白细胞。当鸡受到CAV感染时，上述细胞发生毁坏。在7-14天内会发生机能衰退，贫血和免疫抑制。特别是几周龄的小鸡会表现严重的贫血和免疫抑制。在自然感染的小鸡群中死亡率一般达到30％，并且幸存的通常在感染后经24-32天完全恢复。
二次感染，特别是病毒和细菌感染是常见的，并且加重了由CAV引起的症状，在这种情况下的死亡率上升超过30％。较大的鸡可以被感染但不会发病，但是这些未表现出的临床迹象被认为是小鸡功能活动下降的原因。
血清学资料表明，90％以上的测试种鸡群中当时或曾经出现循环的CAV抗体，由此证明感染上了病毒，CAV的普遍存在已有充分的报告。
显而易见地，能够横向地和垂直地(从母体到卵中小鸡)传播CAV。病毒颗粒是很稳定的，并且不被各种化合物，如氯仿或加热到60℃持续30分钟所破坏。已经描述CAV是一种直径为24nm的裸露的，球形病毒，并包含一个约2300bp的环状单链DNA基因组。
由于CAV的普遍存在与幼龄鸡的死亡率和较大鸡的功能活动下降有关，因此需要一种安全有效的疫苗来防止CAV感染或发病。
传统疫苗包括用化学方法失活的病毒疫苗或修饰过的活病毒疫苗。但是，失活的疫苗需要另外进行免疫接种，不利之处是含有佐剂，生产费用昂贵，并且使用麻烦。进一步说，一些感染性的病毒颗粒在失活过种中可能幸存，给动物服用后可以引起疾病。
通常，减弱的活病毒疫苗是优选的，因为它们可激活常以体液和细胞反应为基础的免疫应答。到目前为止，上述的以CAV菌株为基础的疫苗只能通过在组织培养基中有毒性菌株的连续传代培养制备。但是，由于这种处理将不可控制的突变引入病毒基因组，而导致大量病毒颗粒在其毒性和免疫特性方面的异源性。另外，公知上述传统的减弱活病毒疫苗能够恢复其毒性，从而导致接种的动物患病，并可能将病原体传播给其它动物。可以根据重组DNA技术构建一种改进的疫苗，这种疫苗只包含能激发抗CAV病原体免疫应答所必需和相关的CAV致免疫性物质，或编码所述物质的遗传信息，并且没有活的或失活疫苗的上述缺点。
根据本发明，提供一种编码CAV相关多肽的核酸序列，它能用于家禽抗CAV免疫疫苗的制备以及用于诊断测试品的制备。
本文中所用的“核酸序列”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包括核糖核酸序列和脱氧核糖核酸序列。在理论上，该术语涉及分子的一级结构。因此，这一术语包括双链的和单链DNA，也包括双链和单链RNA，以及其修饰物。
通常，术语“多肽”是指-有生物活性的氨基酸分子链，而不是指产物的特定长度，如果需要这种多肽可以在体内或体外被修饰，例如通过糖基化作用，酰胺化作用，羧化作用或磷酸化作用进行修饰；因此，除了其它的以外，特别是多肽，单肽和蛋白质都包括在其中。
特别是，根据本发明，已经识别和特征化了三个核酸序列，这三个序列各含有一个编码区，它能编码分别被命名为ORF1-3的CAV相关多肽。
编码ORF-1多肽的区域位于从核苷酸876到2225(SEQ ID NO：1，图2)并编码长度为约449个氨基酸的多肽。由ORF-1基因编码的多肽的氨基酸序列表示在SEQID NO：2，在核苷酸1657和2185探测到一些序列的异源。这些序列变化导致保留氨基酸改变，因此不认为能显著地影响多肽的生物活性。
编码ORF-2多肽的区域位于基因组第二阅读框架上从核苷酸101到502(SEQ ID NO：1，图2)，并编码长度为约133个氨基酸的多肽。由ORF-2基因编码的多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO：3表示。
编码ORF-3多肽的区域位于基因组第三阅读框架上从核苷酸403到1053(SEQ ID NO：1图2)，并编码长度为约216个氨基酸的多肽，由ORF-3基因编码的多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO：4表示。
因此，本发明提供了一种编码ORF-1多肽，CRF-2多肽或ORF-3多肽的核酸序列，上述三种多肽分别有以SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列。
在现有技术中已知，通常不是基因组的每个部分都存在于被转录的成熟的mRNA中。可以在体内通过RNA拼接的方法将数个ORFS的片断结合在一起得到成熟的有生物功能的蛋白质。在准备转录的成熟mRNA产生之前，可能在RNA水平进行修饰的例子是在小病毒(Parvoviridea)中对RNA转录本进行处理。如由Berns等人(J.Gen.Virol.68，601-614，1987)综述的，小病毒(Parvoviridea)在其结构方面与CAV相似，都是很小的，无被膜的，单链的DNA病毒。需要对RNA进行处理，以便对由数个翻译框架中的数个ORFs所编码的细小病毒壳蛋白和非结构蛋白进行装配。
为了绘制基因组转录区域的位置图谱，要使用数个常规技术(如Maniatis等人所述，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，U.S.A，1989)，例如：制备分离CAV mRNA的cDNA，在体外操作CAV-mRNA的翻译，转录定位的几种方法，象S1，核酸酶保护测定试验以及引物延长分析。
这些技术使CAV基因组的转录图谱的构建成为可能，并使人们对于转录的相对丰度有所了解，这种方法能够将编码CAV相关多肽的实际基因定位。
所以，含有从不同的ORFs衍生的核苷酸序列的核酸序列也在本发明的范围之内。
编码与所述ORF-1，ORF-2或ORF-3多肽有相同免疫学特性的该多肽功能等同物核酸序列也在本发明的范围之内。
应当指出的是对于本文所包括的从26P4CAV菌株得到的特定ORF1-3多肽来说，因鸡贫血病毒的菌株和个体病毒不同而有变化。这些变异可以通过在全部序列中一个或几个氨基酸的差异或通过在所述序列中一个或几个氨基酸的缺失，取代，插入，倒位或增加证明。已经对被认为基本上不改变生物和免疫活性的氨基酸取代有所描述。在相关氨基的之间的取代或在进化中经常发生的取代，除其他取代外，特别是Ser/Ala，Ser/Gly，Asp/Gly.Asp/Asn，Ile/Val(见Dayhof，M.D.，Atlas of Protein Sequence and structure，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，Vol.5，Suppl.3)。以这一资料为基础，Lipman和Pearson建立了一种迅速而敏感的蛋白质比较方法(Science 227，1435-1441，1985)和测定在同源多肽间功能相似的方法。编码这种同源的功能等同物的核酸序列包括在本发明的范围内。此外，人们还可以使用重组DNA技术制备编码这种各种功能等同物的核酸序列。
根据本发明可以从CAV菌株如Cuxhaven-1，TK-5803或Gifu-1的分离物中得到核酸序列。
根据以SEQ ID NO：1-4提供的资料，可以使本领域熟练技术人员分离和识别那些能编码上述与本文公开的ORF1-3多肽有相应免疫特性的各种功能等同物的核酸序列。为了达到上述目的，通常使用Southern印迹分析技术或菌落杂交(Experiments in Molecular Biology ed，R.J.Slater，Clifton，U.S.A.，1986；Siger-Sam，J.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.80，802-806，1983；Maniatis T.et al.，Molecular Cloning，A laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA，1989)。例如，将限制酶消化的得自特定CAV菌株的DNA进行电泳，之后，将其转移或“点样”在一张硝化纤维滤纸上。这样在能够使探针与滤纸上的同源DNA序列杂交的特定盐浓度和温度条件，通过在滤纸上与确定的标记DNA片段或“探针”杂交则能够认别CAV相关序列。其中所说的探针是一种含有以SEQID NO：2-4所示氨基酸序列推断的序列的合成寡聚核苷酸。冲洗滤纸后，可以通过放射自显影技术检测出已杂交的物质。现在则能够从琼脂糖凝胶上洗脱相应的DNA限制片段，并用来合成与在SEQ ID NO：2-4中公开的多肽功能上等同的多肽。
例如，pCA1，pCA3或其片段应该包含一与CAV的其它菌株基因组相比高度保留的序列结构，并被用在杂交实验中。以这种方法获得有关动物或特定物质的CAV感染情况的定量及定性资料。所要检查的样品是血液(特别是淋巴细胞)，器官组织(如肝，肾)，胚匀浆，或与这些样品中的一种保温培养的MDCC-MSB1细胞(Akigama等人，Biken J.17，105-117，1974)。根据标准方法(Berger and Kimmel，eds；Methods in Enzymology 152，181，1987)做粗DNA制品。在硝化纤维膜上印迹每种样品的系列稀释液，并用标记的pCA1，pCA3或其片断探测(Maniatis等人，1989，ibid)。探测后，通过与由同样实验中的标准量CAVDAN系列稀释液得到的信号相比进行信号定量，用通常不超过每ml CAV DNA2皮摩尔的检测限度检测，那些没有(可检测出的)信号标志的是负样品。
用另一种方法，CAV相关的DNA可以克隆到λgt11噬菌体中并在细菌宿主中表达。然后，可以用抗纯ORF1-3多肽的多克隆血清筛选重组噬菌体，确定变异多肽的相应免疫区域的存在。本文所用的抗ORF1-3的多克隆血清的生产在下文描述。
正如本领域中所公知的，遗传密码的简并可以使一个密码子中的碱基发生取代，产生另一个密码子，但它仍编码同一氨基酸，例如，谷氨酸的密码子是GAT和GAA。结果，很清楚，为了表达一种带有SEQ ID NO：2-4所示氨基酸序列的多肽，可以使一种具有与所述的SEQ ID所示核酸序列不同的这种可变性密码子组成的衍生核酸序列(功能等同物)。
根据本发明，提供一种含有CAV基因组或其片段的核酸序列。
根据本发明，优选的核酸序列的特征是，该序列至少包含SEQID NO：1表示的一部分脱氧核糖核酸序列。
所说脱氧核糖核酸序列的特别有用片段是那些编码多肽的片段。
特别是，本发明包括一种含有至少部分以SEQ ID NO.1表示的定位在CAV基因组位置816到2225，101到502或403到1053的ORF的核酸序列。
另外，定位在与核苷酸1到870相连的病毒基因组中的2230到2298位的核苷酸包含一控制顺序，当异源基因置于该顺序控制之下时，该顺序可以用来控制异源基因的表达。进一步说，本发明也包括编码ORF1-3多肽或其上述的功能等同物的核酸序列片段。
本文中所用的术语“片段”意思是含有本发明的一个核酸序列或多肽的亚序列的DNA或氨基酸序列。所述片段是，编码一种多肽，该多肽具有CAV相关的多肽的一个或多个免疫反应性和/或抗原决定簇，也即有一个或多个能在小鸡中激发免疫应答和/或能够特异地结合到互补抗体上的抗原决定簇。测定有用多肽片段的方法在下文描述。除了其它方法外，还可以通过前体分子的酶切割来生产片段，对DNA用限制性核酸内切酶而对多肽则使用蛋白酶。其它方法包括片段的化学合成法或者通过DNA片段的多肽片段表达。
只要ORF-1，ORF-2或ORF-3多肽的免疫特性在本质上保持不变，则产生ORF1-3多肽的这种功能等同物的全部修饰物都包括在本发明的范围之内。
根据本发明，一种核酸序列还含有在体外合成的或者经例如PCR技术得到的核酸序列。
根据本发明的一种核酸序列能够连接到在自然界中与之不相联系或连接的各种能有效复制的DNA序列上，该DNA序列还可以包含编码融合蛋白序列，如B一半乳糖苷酶的部分DNA，得到一种能用于转化合适宿主的所谓重组核酸分子。上述的杂交DNA分子优选地得自，如质粒，或来源于噬菌体，粘性质粒或病毒中的核酸序列，能够用于克隆本发明的核酸序列的特异性载体在本领域中是已知的，并包括特别是质粒载体如PBR322，各种PUC，PGMM和Bluescript质粒，噬菌体，如λgt-Wes-λB，Charon 28及M13衍生的噬菌体，或者病毒载体例如SV40，腺病毒或多形瘤病毒(也见Rodriquez，R.L.和D.T.Denhardt，ed，Vector：A Survey of molecularcloning vectors and their uses，Butterworths，1988；Lenstra J.A.et al，Arch.Virol.1101-24 1990)。
用于构建本发明的重组核酸分子的方法对于本领域的普通熟练技术人员是已知的，并且，特别是在Maniatis，T.等人发表的文章中有记载(Molecular Cloning A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory1982)。例如，当用与制备互补DNA末端所用的相同限制酶切割基因和所需的克隆载体时，就很容易插入到一小克隆载体中。
或者说，修饰限制性位点产生平整末端是必需的，要么通过消化单链DNA，要么通过在单链末端用一种适当的DNA聚合酶填平产生。随后，用一种酶如T4DNA连接酶可以完成平整末端连接。
如果需要，通过将连接接头连接到DNA末端上可以产生任何限制性位点。上述连接接头可以含有编码限制性位点序列的特异性寡核苷酸序列。也可以通过同聚物加尾修饰限制酶切割的载体和核酸序列。
在本文所用的“转化”是指不论使用何种方法，如直接加入或转导，将异源核酸序列导入宿主细胞中，异源核酸序列也可以结合到宿主基因组中。如果需要，重组DNA分子可装有与所说的宿主相容的控制序列，该序列能调节插入的核酸序列的表达。
本发明的优选重组核酸分子包含一个或更多的可以用于筛选所需的转化体的标记活性成份，如：pBR322中的抗氨苄青霉素和抗四环素成份，pUC8中的抗氨苄青霉素成份和β-半乳糖苷酶活性成分。
合适的宿主细胞是一种能够被编码一种多肽的核酸序列或者含有上述核酸序列的重组核酸分子所转化的细胞，如果需要该细胞可以用来表达由所述核酸序列编码的多肽，宿主细胞可以是原核的，如细菌，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和假单孢杆菌属；或者真核的，如酵母，如啤酒酵母或较高的真核细胞，如昆虫、植物或哺乳动物细胞，包括Hela细胞和中国仓鼠(CHO)细胞。昆虫细胞包括Spodoptera，frugiperda的Sf9细胞系(Luckowet al。Bio-teehnology 6，47-55 1988)。关于本发明的核酸序列在真核克隆系统中的克隆和表达的资料见Esser，K.等人(Plasmids of EukaryotesSpring-verlag，1986)。
为获得一定量的CAV编码的多肽，可以在象杆状病毒表达系统(BVES)类似的表达系统中表达CAV基因组或其片段。在此系统中，象Spodoptera frugiperda(sf：IPLB-sf21)细胞这样的昆虫细胞可以在细胞培养基中进行培养，以用作杆状病毒，如Autographa califorica核多角体病毒(AcNPV)的宿主。AcNPV中的一些基因被高水平的表达，但对病毒感染环来说并不是必需的。这些基因是转染细胞中杆状一转换质粒如PAcAS3和野生型(wt)AcNPV DNA之间同源重组的靶目标。在pAcAS3中(J.Vlak等人，Virology 179，P312-320，1990)异源基因是插入到p10启动子的下游以代替非必需的p10基因。被作用于重组过程的wt AcNPV的序列包围。为了便于重组体的筛选，pAcAS3也包含LacZ基因，致使当X-半乳糖加到介质上时，重组斑变兰。
特别是，用rul消化从MSB1感染细胞中分离的CAV基因组DNA。
我们将Bam HI人工接头连到2.3kb的分子末端，并且将它再连到Bam HI消化的、脱磷酸的pAcAS3质粒中。我们用新构建的pAcAS3转化DH 5α感受态大肠杆菌细胞挑选出单个菌落，测试并培养到100ml。我们通过CsCl梯度密度离心分离纯化质粒DNA，并以1μg/ml的浓度在TE缓冲液中于4℃保存纯化的DNA。我们用在100μl水中的2μgwt AcNPV和30μg的Lipofectin试剂(BRL，Bethesda，Maryland，USA)与10μg的pAcA3结合。在一个装有5ml无血清的培养基的6cm培养盘中，向此混合物中加入5×106个sf21细胞。在37℃培养3小时后，加入新鲜培养基，并在37℃培养。次日，用1.5％的低熔琼脂糖在培养基中复盖细胞。并在37℃培养5天。加入新的琼脂糖，使X-半乳糖的最后浓度为200μg/ml。在重组病毒的原料被生产前，兰斑块须经三次斑块纯化。
筛选感染细胞并由此培养上清液，以通过Western印迹法用重组的杆状病毒进行重组CAV多肽的表达。选择重组CAV多肽表达的最高水平的斑块，和/或在Weste印迹试验中最易认别的多肽，以生产用于制备疫苗的CAV多肽。
一般地说最好选用原核生物用于构建本发明所用载体过程中DNA序列的克隆。例如，大肠杆菌K12是最有用的。其它可用的微生物菌株包括E.coli菌株，例如DH 5α或TM101。
为了进行表达，将本发明的核酸序列人工操作连接到表达控制序列上。上述控制序列可以含有启动子，增强子，操纵子，诱导物，核糖体结合位点等。
当宿主细胞是细菌时，有代表性的有用表达控制序列包括Trp启动子和操纵子(Goeddel，等人，Nucl.Acids Res.84057，1980)；Lac启动子和操纵子(chang等人，Nature275，615，1978)；外膜蛋白启动子(Nakamura，K.和Inouge，M.，EMBOJ，1，771-775，1982)；噬菌体λ启动子和操纵子(Remut，E.等人，Nucl.Acid Res.11 4677-4688，1983)；α-淀粉酶(B.Subtilis)启动子和操纵子，终止序列和其他与选择的宿主细胞相容的表达增强和控制序列。当宿主细胞是酵母时，有代表性的有用表达控制序列包括，如：α-接合因子。对于昆虫细胞可用杆状病毒的多角蛋白(polyhedin)或p10启动子(smith，G.E.等人，Mol.Cell.Biol.3，2156-65，1983)。当宿主细胞是哺乳动物细胞时，有代表性的有用表达控制序列包括，如SV-40启动子(Berman，P.W.等人，Science 222 524-527，1983)或如金属硫因(metallothionein)启动子(Brinster，R.L.，Nature 296，39-421982)或热休克启动子(Voellmy et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 4949-53，1985)。另外，也可以使用CAV中的表达控制序列，特别是那些调节ORF1-3表达的控制序列，对于最大程度的基因表达，也参见Roberts和Larer的文章(Methods in Enzymology 68，473，1979)。
本发明还包括一种表现出CAV相关抗原之免疫特性的多肽，也即，该多肽含有一种或多种CAV相关抗原的免疫反应性和/或抗原决定簇，本质上与整个病毒或其它通常联系在一起的蛋白质是游离的。
尤其是，本发明提供一些含有至少部分ORF-1，ORF-2或者ORF-3的多肽，ORF-1，ORF-2或ORF-3分别有以SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列。
当然，在本质上表现出同样的免疫特性的所述氨基酸的衍生物，即，免疫学等同物也包括在本发明的范围之内。
另外，本发明也包括一种含有ORF1-3多肽片段或其功能等同物的多肽，该多肽能用于免疫家禽以抵抗CAV感染或用于诊断目的。用于探测这种已知氨基酸序列中的有用多肽片段的各种方法是已知。可以通过以所谓的肽扫描方法为基础的，描述在专利申请WC86/06487和Geysen，H.M.等人(Prod.Natl.Acad.Sci.81 3998-4002，1984)，Geysen，H.M.等人(J.Immunol.Meth.102 259-274，1987)文章中的方法寻找到有一个或几个抗原决定簇的本发明多肽的合适免疫化学活性多肽片段，并且合成一系列与所考虑的完整多肽的部分序列相应的部分重叠多肽，并研究其与抗体的反应活性。
另外根据理论上的推论和其结构上与已知抗原决定簇的一致性，可以将一些具有所述氨基酸序列的多肽区命名为抗原决定簇。根据Hopp和Woods的亲水性标准(Proc.Natl.Acad.Sei.78，3824-3828，1981)以及chou和Fasman(Advances in Enzymology47，45-148，1987)的二级结构理论来确定这些区域。
也可以借助Berzofsky′s的亲水脂标准(Science235，1059-62，1987)根据理论基础得到必需的T-细胞抗原决定簇。
在本发明的另一实施例中，使用了一个具有被上述核酸序列编码的氨基酸序列的多肽。
可以通过给动物使用一种本发明的多肽而达到家禽抗CAV感染的免疫，这种多肽是作为所谓的亚单位疫苗在免疫相关过程中使用的。本发明的亚单位疫苗可以含有一种纯的多肽，也可以含有一种药物学上可接受的载体。多肽也可以与非相关蛋白共价结合，最好是融合产物的纯化形式。有代表性的是β-半乳糖苷酶，蛋白质A，凝乳酶原，血液凝集因子Xa，等。
在某些情况下，产生抗这些多肽本身的中和抗体的能力并不高。为了升高其免疫原性，最好将小片段连接到载体分子上。适合于这种目的的载体是大分子，例如天然多聚物(蛋白质，如主孔形血兰蛋白，清蛋白，毒素)，合成多聚物如聚氨基酸(聚赖氨酸，聚丙氨酸)，或亲水脂化合物的分子团如皂苷。换句话说，这些片段可以制成其多聚物，优选的是线性多聚物。
用在上述亚单位疫苗中的多肽可以通过本领域已知的方法制备，如从CAV中分离所说的多肽，通过重组DNA技术或化学合成方法。
如果需要，根据本发明用在疫苗中的多肽可以在体外或体内被修饰，例如，通过糖基化作用，酰胺化作用，羧化作用，磷酸化作用进行修饰。
另一种亚单位疫苗是活载体疫苗。通过重组DNA技术将本发明的核酸序列导入微生物内(如：细菌或病毒)，以致于重组的微生物由此仍能通过表达由插入的核酸序列编码的多肽而进行复制。
例如可以使用体内同源重组技术将异源的核酸序列，如：本发明的核酸序列导入到载体微生物的基因组内。
首先，根据标准重组DNA技术，将一个相应于载体基因组插入区域的DNA片段，即一个能够用于异源序列的掺入而不影响那些感染或复制所必需的载体的主要功能区域，插入到克隆载体中。已有大量的有关微生物插入区域的报告(如：EP80,806，EP110,385，EP83,286，EP314,569，WO88/02022和WO88/07088)。
其次，如果需要，可以在从第一步中得到的重组DNA分子的插入区域中导入一个缺失。可以通过例如对第一步得到的重组DNA分子进行适当的核酸外切酶III消化或限制酶处理而完成这一步骤。
第三，将异源核酸序列插入到第一步的重组DNA分子中的插入区域中或代替从所述的重组DNA分子缺失的DNA。插入区域的DNA序列应有适当的长度以便允许与载体基因组发生同源重组。此后，可以在含有插入序列的重组DNA分子存在的条件下，用载体基因DNA转化适当的细胞，在该插入序列两侧有适当的载体DNA序列，从而，在重组DNA分子和载体基因组的相应区域之间发生重组。可以在细胞培养基中生产重组载体子代并可以根据基因和表型挑选，例如，通过杂交，检测由一个与异源核酸序列整合的基因编码的酶活性，或者通过免疫方法检测由重组载体表达的抗原异源多肽。
下一步，给小鸡服用该重组微生物进行免疫，此后，它保持一段时间，或者甚至在接种动物体内复制。在体内表达由本发明的插入核酸序列编码的多肽，从而激发了接种动物的免疫系统适用于掺入本发明核酸序列的载体可以得自病毒，如(鸟类的)痘病毒，如，牛痘病毒或鸟痘病毒(EP314,569和WO88/02022)，疱疹病毒如HVT(WO88/07088)，腺病毒，或流感病毒，或者细菌的，如E.Coli或特殊的沙门氏菌属。有这种类型的重组微生物，在宿主细胞内合成的多肽可以作为表面抗原显露。在这个意义上，所述多肽与OMP蛋白，或E.coli的毛蛋白或可被有机体识别的锚序列和信号的合成物进行融合是可能的。所说的免疫原性多肽，如果需要也可以以整体的一部分在被免疫的动物体内释放。在所有这些的情况下，一种或多种免疫产物还可以进行表达，该表达产生抗各种病原体和/或抗各种所给病原体抗原的保护作用。
根据本发明，可以通过培养用一种载体病毒感染的宿主细胞而制备一种疫苗，该载体病毒含有一种本发明核酸序列，此后，收集含病毒的细胞和/或在细胞中生长的载体病毒，也可以以纯的形式收集，并形成一种疫苗，或者制备成冻干形成的疫苗。
也可以在利于由所述核酸序列编码的多肽表达的条件下培养含有本发明核酸序列的上述宿主细胞。虽然在另一实施例中可以根据它的用途由更纯化的本发明多肽制成疫苗，但也可以使用粗培养物的样品，宿主细胞的溶胞产物或宿主细胞提取物制备疫苗。为了纯化些产的多肽，将包含本发明核酸序列的宿主细胞进行足量的培养，并以上述细胞中或者如果分泌蛋白质就以培养基中分离所产生的多肽。分泌到培养基中的多肽可以通过标准技术分离和纯化，如盐分级分离，离心，超过滤，层析，凝胶过滤或免疫亲合层析，相对而言，分离细胞内的多肽，首先收集所述细胞，破碎细胞，如通过声处理或其它如Frech压力法等机械破碎方法，跟着将多肽与其它胞内组分分离并将多肽制成一种疫苗。也可以通过化学法(如EDTA处理)或者酶法如溶菌酶消化而破碎细胞。
如前所述，传统的减弱病毒的方法有一些缺点。常规地是通过导入特异的突变体完成，可以通过化学物质处理或在异源宿主动物或组织培养液中的连续传代培养而完成，在病毒基因组中发生的不规则突变是这些技术的一个重要方面，在自然回复突变体发生的情况下，很难将突变定位或重复。随着重组DNA技术的发展，有可能以很精确的方法控制病毒基因组。如由Murphy等人描述的(Immunization against viruses，in：Fields，B.N.等人eds，Virology 2nd ed.RavenPress，N.Y.1990)通过其基因组的突变在减弱病毒方面数个可能性，例如在非必需基因或其一部分中进行缺失，插入或者取代，或者在调节区域插入，取代或缺失等。
下面描述了一个使用重组DNA技术制备一种自然界中不存在的减毒CAV突变体的典型方法。
首先，确定突变可定位的CAV基因区域。这些可以是编码或非编码区域，例如在调节区域中，或编码部分病毒粘着蛋白的区域，或者是确定宿主特异的因子。
其次，为建立重组载体，根据上述方法，可以将突变，如缺失和/或插入和/或取代导入病毒基因组。
因此，通过重组DNA技术在其基因组中导入突变的且在自然界中不存在的一种减毒CAV也包括在本发明的范围之内。
本发明的多肽的抗体或抗血清在被动免疫疗法，诊断免疫测定法和制备抗个体基因型抗体方面有潜在的用途。
上述的CAV相关多肽ORF1-3可用于生产多克隆的单特异的和单克隆的抗体。如果需要多克隆抗体，生产和加工多克隆血清技术是本领域已知的(如，Mayer和Walter，eds，Immunochemical Methods in Cell andMoleculav Biology，Academil Press，London，1987)。简言之，用上述一种免疫原给所选的哺乳动物，如兔子多次注射，每次免疫接种约20μg到80μg蛋白。与一种可接受的佐剂一起，进行免疫接种，通常免疫原与佐剂的用量相同。可接受的佐剂包括Freund′s完全佐剂，Freund′s非完全佐剂，明矾沉淀剂或油包水乳剂，Freund′s完全佐剂对于初免疫接种是优选的。Freund′s非完全佐剂对于全部加强免疫接种是优选的。初免疫接种包括在兔的背部上多处皮下位点注射1ml的乳剂。用等体积的免疫原在大约一个月后进行加强免疫接种，且一直持续到在个体兔血清中的抗体达到足够的水平。收集血液并通过本领域已知的方法分离血清。
对每个免疫原的单特异性抗体是通过改进的Hall等人的方法(Nature 311，379-387；1984)从通过用上述纯蛋白免疫兔子而制备的多特异性抗血清中亲和纯化的。本文所用的单特异性抗体定义为与相关抗原具有同源结合特性的单抗体类或多抗体类物质。本文所用的同源结合是指抗体物质与特异性抗原或抗原决定簇结合的能力。
抗每一CAV免疫原的单克隆抗体可以通过用适当的蛋白质免疫近亲交配的小鼠，优选是Bal b/c而制备。用与可接受佐剂等体积的每0.5ml约100ng到约10ng的免疫原腹膜内免疫小鼠。上述可接受的佐剂包括：Freund′s完全佐剂，Freund′s非完全佐剂，明矾沉淀剂和油包水的乳剂。初次免疫接种后约14，21和63天时，给小鼠静脉注射不含佐剂的等量的免疫原以进行免疫强化。在最后一次强化免疫接种之后三天，检测个体小鼠血清中的抗免疫原抗体。从产生抗体的小鼠中分离脾细胞，并通过本领域已知的技术(Kohler和Milstein，Nature 256；495-497，1975)与鼠骨髓瘤细胞融合，通过在含有次黄嘌呤、胸苷和氨喋呤的适合的细胞培养基如Dulbecco′s ModifiedEagle′s培养基(DMEM)中生长挑选杂交瘤细胞。克隆产生抗体的杂交瘤，优选的是使用Macpherson的软琼脂技术(Soft Agar Techniques，Tissue CultureMethods and Applications，Kruse andPaterson，eds，Academic Press，276，1973)，为了在适当的培养基中培养，将分散的菌落转移到培养盘的各个并孔中，通过用适当的免疫原筛选来识别产生抗体的细胞。通过本领域已知的技术保存免疫原阳性杂交瘤细胞。通过在体外培养杂交瘤或通过现有技术已知的方法注射杂交瘤后在小鼠中制备腹水而生产特异的抗一单克隆抗体。
抗一个体基因型的抗体是一种免疫球蛋白，它携带有所要保护予防的病原体抗原的“内部图像”并且在疫苗中可用作免疫原(Breesman等人J.Infect.Disease 151，761，1985)。制备抗个体基因型抗体的技术是本领域已知(MacNamara等人，Science 226，1325，1984)。
可以以传统的活性免疫程序使用本发明的疫苗：以一种与剂量配方相匹配的方式单一的或重复的给药，上述给药剂量是在予防和/或治疗上是有效的，并且是免疫性的。疫苗给药可以通过如：真皮下，表皮下，肌肉内，腹膜内，静脉内或鼻内给药。另外，疫苗也可以包含一种液体介质或含水的悬浮液，常常与其它成分混合使用，例如，以便提高活性和/或延长贮存期限。这些成分可以是盐，PH缓冲液，稳定剂(如脱脂牛奶或酪蛋白水解产物)，提高免疫应答的乳化佐剂(如：油，胞壁酰二肽，氢氧化铝，皂苷，聚阴离子和两亲性的物质)和防腐剂。
显然，根据本发明的疫苗也可以包含与其它家禽病源体相关的免疫原或可以包含编码这些免疫原的核酸序列，这些免疫源可以是产生多价疫苗的传染性支气管炎病毒，新城病病毒，传染性粘液囊病病毒或鸡马立克(Marek′s)病病毒的抗原。
本发明也涉及一种“免疫化学试剂”，该试剂至少含有一种根据本发明的多肽或其抗原片段。
术语“免疫化学试剂”表示本发明的多肽已经与一种合适的支持物相结合或者已经与标记物一起被提供。
可以用的支持物是，例如：微小试验孔或小杯，试管或毛细管的内壁，膜，滤纸，试验片条或颗粒的表面，如，乳胶颗粒，红血球，着色溶胶，金属溶胶或制成溶胶颗粒的金属化合物。
可以用的标记物是，尤其是，放射性同位素，荧光性化合物，酶，着色溶胶，金属溶胶或制成溶胶颗粒的金属化合物。
本发明的核酸序列可用于设计特异性探针，该探针是用于杂交试验，以探测在任意组织中的CAV相关核酸序列。
本发明也提供了一种含有用于诊断CAV感染的所述核酸序列的实验药盒。
本发明还涉及一种免疫测定中所用的探测药盒，该检测药盒含有至少一种本发明的免疫化学试剂。
使用检测药盒所发生的免疫化学反应优选的是夹层反应，凝集反应，竞争反应或抑制反应。
为了完成夹层反应，该检测药盒可以含有例如，结合到固体支持物，例如微小试验孔内壁上的多肽，以及本发明的标记多肽或者标记的抗-抗体。
实施例1CAV菌种26P4的来源
在Interet America(Millsboro，DEL)将8月龄的前哨SPE小鸡(对CAV是血清阴性的)与对CAV感染有血清转换迹象的鸡放在一起。两周后，在这些前哨鸡肝的RPMI中制备20％v/v的匀浆液，并用0.2μm的过滤器进行过滤。该滤物与MDCC-MSB1细胞(Akiyama等人，Biken J.17，105-117，1974)一起在组织培养瓶中保温培养，这种MDCC-MSB1对CAV来说是适宜的宿主细胞(Goryo等人Avian Pathology 16，149-163，1987)。根据由USDA提供的阳性抗-CAV-血清表现出的阳性免疫荧光和CPE，一种标为26P4的分离物被识别为CAV。26P4的培养
根据现有技术的说明(Goryo等人，ibid)，在组织培养瓶中的MDCC-MSB1上进行26P4的培养。病毒基因组的克隆：
为了分离CAV的26P4菌株的复制型(RF)病毒DNA，制备500ml的浓度为106细胞/ml的MSB1细胞培养物并用约106TCID50/ml的病毒滴定度感染。使用标准的Hirt提取法制备病毒DNA(McMaster等人，J.Virol.38，317-326，1981)。感染后进行了30个小时的周期实验，找到了感染后获得最大量RF病毒DNA的时间点。
在0.8％的琼脂糖/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡凝胶上分析来自感染细胞的DNA，并且根据标准技术(Maniatis等人，1989，ibid)使用NA45DEAE膜(Schleicher and Schull)从琼脂凝胶上分离代表环状病毒RF DNA的1.7kb带。
用25μl的20U的Hind III或者Bam HI限制核酸内切酶消化5.00ng的病DNA，也用Hind III或Bam HI消化2μg的细菌质粒PGEM7zf+(Promega Corp.)使之去磷酸化，并与蛋白酶K一起保温培养(Maniatis等人，1989，ibid)。用苯酚/氯仿提取载体和插入DNA制备物，并用2体积的96％的乙醇和1/10体积的PH为6.0的3M乙酸钠沉淀。根据标准方法用T4 DNA连接酶进行载体和插入DNA的连接(Maniatis等人1989，ibid)，用连接的混合物转化E.coli DH 5α的活性细胞(Clontech corp.)，然后放在含100μg/ml氨苄青霉素(AP)的LB-琼脂培养盘中。从抗AP的菌落分离质粒DNA，用限制酶分析法筛选2.3kb的插入物。
识别出了两个质粒：pCA1，含Hind III消化的2.3kbCAV RF DNA，和pCA3，它具有Bam HI消化的，与pCA1相比在相反方向插入的CAV RF DNA。两个质粒都描述在图1中，给出了它们的限制方式。
实施例2DNA序列分析
为了确定CAV基因组的DNA序列，根据Henikoff(Gene 28，351，1984)生产累积缺失片段：5μg的pCA1和5μg pCA3与SphI一起保温培养，并且然后与Cla I限制酶一起培养。与蛋白酶K培养后，苯酚/氯仿处理，并乙醇沉淀，样品与核酸外切酶III一起以逐渐增加的时间间隔保温保养。用S1核酸酶和Klenow聚合酶将DNA片段做成平整末端，并且最后用T4 DNA连接酶成环，转化到E.coli DH 5α的感受态细胞中并放在氨苄青霉素盘上。分析来自抗性菌落的质粒DNA的插入序列的大小。
如由Sanger等人发表的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463，1977)，进行DNA序列分析。在小制备物的双链质粒DNA上直接使用双脱氧链末端技术。使用T7和SP6启动子引物，直接杂交在PGEM7zf+多克隆位点的上游和下游。
收集序列数据并使用Gene Master程序在IBM PC上分析和装配。
实施例3将含有ORF1的CAV DNA插入到火鸡疤疹病毒(HVT)的病毒基因组中：
如实施例1中所述，分离CAV RF DNA。为了制备ORF1以便插入到HVT中并有效表达，特别是在第一ATG密码子之前的序列得修饰到一最小的前导序列。因此，用限制酶Apa I和Mro I消化2μg的CAV RF DNA，得到一线性的CAV RF DNA分子，ORF1在其中部，并且ORF1的第一ATG密码子在Mro I位点的边上。失活后，苯酚提取并乙醇沉淀，将这些片段与核酸外切酶III一起以增加的时间间隔保温培养，并产生平整末端，如在实施例2中所述，由于核酸外切酶不能消化3′具垂位点，如来自APaI的，因此，从Mro I位点，以ORF1的第一ATG的方向消化RFCNA片段。平整片段通过T4连接酶与已磷酸化的超过50倍摩尔的EcoRV人工接头(B.Mannheim Corp.)连接，所有这些均按照标准方法进行。人工接头连接混合物用EcoR V消化，并在65℃失活10分钟。该混合物与500ng的EccR V消化的和脱磷酸化的pGEM5zf+载体(Promega Corp.)连接。该连接混合物转化到E.coli DH 5α的感受态细胞并放在AP盘上。分析抗性菌落的微量DNA分离物中APa I和Spe I两次消化后插入质粒的大小。通过限制分析研究约1.9kb大小的插入物的方向，并用Sp6或T7引物。通过Sanger序列分析法检测。
通过这种方法建立的质粒pCA4，有-1.9kb的CAV插入物。该插入物由以SEQ ID NO：1表达的，并在1到475中继续从核苷酸860到2298的序列组成，它被连接到EcoR V人工接头上，并插入到EcoR V消化的pGEM5zf+中。特别是通过Sanger分析法被证实在插入序列的第一ATG之前的短前导序列中不包含任何其它的ATG密码子。
以由Igarashi T.等人发表的(Virology157，351，1987)HVT的基因组结构为基础，选择病毒的唯一的短序列单位(us)中的一个区域用来插入外源基因。从通过部分的消化来自HVT感染的CEF的全部DNA而构建的λEMBL3基因库中筛选出相应的DNA片段。以不存在任何Bam HI限制位点为特征的λ-分离物之一的插入物被命名为λHVT04，并详细地通过物理图谱(图3)分析。在17.5kb插入片段中的序列代表了包括部分颠倒重复结构在内的US区域的主要部分(Igarashi，T.等人，1987，ibid)来自λHVTO4的一个1.2kbXho I限制片段被次克隆在用Sat I消化的pGEM3Z中，产生了质粒pMD07，该质粒包含唯一的在DNA片段的插入中可以应用的Bgl II位点。
从劳氏肉瘤病毒(RSV)的LTR序列中选出一个强的启动子，该启动子在外源基因插入到HVT病毒的基因组后，可以直接控制外源基因的表达。已经在来自pRSVcat的580bp的Nde I/Hind III限制片段上作出了该启动子的图谱(Gorman等人，Proc.Natl.A cad.Sei.79，6777，1982)并通过在片段的两个位点上双链人工接头将其插入到PGEM3Z(Promega)的Hind III和Pst I位点之间。来自载体pGEM3Z的Hind III位点和带有LTR′启动子的RSV片段的Nde I位点之间的连接是用一个30bp的人工接头完成的，该人工工接头含有与一方的Hind III，和与另一位置的Neke I相匹配的粘性末端。但是，由于6个碱基对识别序列的外核苷酸中的予先修饰，所以在连接之后，两个限制位点不会复原。另外，除了这两个位点的消除，在相应的位置产生了一个新的在人工接头自身内的限制性位点(Bam HI)。合成第二个连接来自LTR片段的Hind III位点和来自pGEM3Z的Pst I位点的20bp的人工接头，在这种情况下，在两个末端的任一个上都没有识别序列的破坏，并且把3个有利的唯一限制性位点Bgl II，Xho I和EcoR V加到已经在pGEM3Z的多人工接头中存在的那些位点上，如Pst I，Sal I，Xho I和Bam HI，所得的pGEM3Z衍生物，称为pVECO1，因此包含一携带LTR启动子顺序的650bp限制性片段，之后紧接着是可用于插入外源基因的七个限制位点。
650bp的片段在两侧带有Bam HI限制位点，并已经被转移到来自pMD07的1.2kb HVT插入物中的唯一Bgl II位点上。通过这两种酶产生的粘性末端是相容的，但是连接后不会恢复到任何一个Bgl II或Bam HI的原始识别序列。一种在朝TRS的方向上带LTR的所得结构，被命名为PVEC04，并用限制性
图谱(图4)检查。该全部HVT重组载体的结构允许外源基因正好插入到LTR启动子的下游，并随后通过体内重组将完全的表达盒整合到HVT基因组中。对LTR下游不同限制位点的位置特别是BglII，XhoI，和EcoRV酶的那些位置进行设计以致至使得甚至多基因的插入也是可以设想的。
通过EcoRV消化从质粒中除去来自PCA4的CAV DNA插入物，并插入到EcoRV消化的和去磷酸化的PVECO4中。再次检查插入片段的方向，则有正确方向的质粒命名为PCA5。
将来自PCA5的线性化DNA与从HVT感染细胞制备的全部DNA一起，通过以依据Graham，F.和V.d.Eb，A.的磷酸钙DNA沉淀法(Virology 52，456，1973)，为基础的方法导入CEF中。来自该结构的2微克质粒DNA与来自HVT线些感染细胞的15微克DNA，在最后约体积560μl的水中混合，并加入到750μl的HBSP中(20mM，Kcl，560mM NaCl，24mM果糖，3mMNa2HPO4，100mM HEPES，PH.7.0)，通过缓慢加入190μl的1MCaCl2溶液形成沉淀，并在室温保温培养混合物30分钟。同时，以每m15×105个细胞的浓度，将15ml来源于10天龄胚胎的第二CEF培养基6/B8悬浮液在直径10cm的平盘中接种，6/B8培养基的组成是以Glasgow′s修改的Eagle′s最低限度基本培养基为基础，另加有2％的胎牛血清。将磷酸钙沉淀的DNA缓慢加到细胞悬浮液中，并将盘在含5％CO2的潮湿空气的保温箱中于37℃保温培养。5小时后，除去培养基，并将含等体积HBSP和30％甘油的10ml的溶液覆盖在细胞上层，在1到2分钟培养后，除去溶液，用培养基6/B8冲洗细胞并用新鲜的培养基将盘保温培养3到5天，直到有病毒CPE产生。通过使用特异性单价或多价的抗这些CAV抗原的血清进行免病荧光染色来检测表达CAV相关多肽的HVT重组体的存在。
图注图1：
代表质粒pCA1和pCA3的核酸内切酶图谱。
A：质粒pCA1是通过Hind III消化而线性化的分子。
B：质粒pCA3是通过Bam HI消化而线性化的分子。图2：
阴影部分代表存在于CAV26P4菌株RF DNA的DNA
序列中的开放阅读框架(ORF)。ORFs从上到下编号为
ORF1，ORF2和ORF3。
CAV RF DNA是由Dra I消化而线性化的分子。图3：
基本上相应于HVT基因组的Us区域的DNA片段的限制酶图
谱，指明了位于其间的由四个开放阅读框架和非编码序列组成的插
入区的相对位置。图4：
pVECO4的限制酶图谱，表明了LTR启动子被插入到来自
pMDO7的1.2kb Xho I HVT片段的唯一
Bgl II位点上。
序列目录(1)一般资料：(i)申请人
A，名称：AKZO NV
B，街道：VelPerweg 76
C，城市：Arnhem
E，国家：荷兰
F，邮政编码：(ZIP)：6824BM(ii)发明题目：鸡贫血病毒疫苗和诊断(iii)序列数量：4(v)计算机可读形式：不适用的。(2)有关序列1的资料：(i)序列特征：
A，长度：2298碱基对
B，类型：核酸
C，链：单链
D，结构：环状(ii)分子类型：DNA(基因组的)(vi)来源：
A，机体：鸡贫血病毒
C，个体分离：26P4(ix)特征：
A，名称/关键词：CDS
B，定位：876--2225
D，其它资料：/标记＝ORF1(ix)特征
A，名称/关键词：CDS
B，定位：101--502
D，其它资料：/标记＝ORF2(ix)特征：
A，名称/关键词：CDS
B，定位：403--1053
D，其它资料：标记＝ORF3(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：AAATAGCACT CAATAAACGC AGCAAATGGC TTAATCGCAC AATCGCATTC CGAGTGGTTA 60CTATTCCATC ACCATTCTAG CCTGTACACA GAAAGTCAAG ATGGACGAAT CGCGAGACTT 120CGCTCGCGAT TCGTCGAAGG CGGGGGGCCG GAGGCCCCCC GGTGGCCCCC CTCCAACGAG 180TGGAGCATGT ACAGGGGGGT ACGTCATCCG TACAGGGGGG TACGTCACAA AGAGGCGTTA 240CCGTACAGGG GGGTACGTCA CGCGTACAGG GGGGTACGTC ACAGCCAATC AGAAGCTGCC 300ACGTTGCGAA AGTGACGTTT CGAAAATGGG CGGCGCGAGC CTCTCTATAT ATTGCGCGCA 360CATACCGGTC GGCAGTAGGT ATACGCAAGG CGGTCCGGGT GGATGCACGG GAACGGCGGA 420CAACCGGCCG CTGGGGGCAG TGAATCGGCG CTTAGCCGAG AGGGGCAACC TGGGCCCAGC 480GGAGCCGCGC AGGGGCAAGT AATTTCAAAT GAACGCTCTC CAAGAAGATA CTCCACCCGG 540ACCATCAACG GTGTTCAGGC CACCAACAAG TTCACGGCCG TTGGAAACCC CTCACTGCAG 600AGAGATCCGG ATTGGTATCG CTGGAATTAC AATCACTCTA TCGCTGTGTG GCTGCGCGAA 660TGCTCGCGCT CCCACGCTAA GATCTGCAAC TGCGGACAGT TCAGAAAGCA CTGGTTTCAA 720GAATGCGCCG GACTTGAGGA CCGATCAACC CAAGCCTCCC TCGAAGAAGC GATCCTGCGA 780CCCCTCCGAG TACAGGGTAA GCGAGCTAAA AGAAAACTTG ATTACCACTA CTCCCAGCCG 840ACCCCGAACC GCAAGAAGGT GTATAAGACT GTAAGATGGC AAGACGAGCT CGCAGACCGA 900GAGGCCGATT TTACGCCTTC AGAAGAGGAC GGTGGCACCA CCTCAAGCGA CTTCGACGGA 960GATATAAATT TCGACATCGG AGGAGACAGC GGTATCGTAG ACGAGCTTTT AGGAAGGCCT 1020TTCACAACCC CCGCCCCGGT ACGTATAGTG TGAGGCTGCC GAACCCCCAA TCTACTATGA 1080CTATCCGATT CCAAGGAGTC ATCTTTCTCA CGGAAGGACT CATTCTGCCT AAAAACAGCA 1140CAGCGGGGGG CTATGCAGAC CACATGTACG GGGCGAGAGT CGCCAAGATC TCTGTAAACC 1200TGAAAGAGTT CCTGCTAGCG TCAATGAACC TGACATACGT GAGCAAAATC GGAGGACCCA 1260TCGCCGGTGA GTTGATTGCG GACGGGTCTA AATCACAAGC CGCGGAGAAT TGGCCTAATT 1320GCTGGCTGCC GCTAGATAAT AACATGCCCT CCGCGACACC ATCGGCATGG TGGAGATGGG 1380CCTTAATGAT GATGCAGCCC ACGGACTCTT GCCGGTTCTT TAATCACCCT AAGCAGATGA 1440CCCTGCAAGA CATGGGTCGC ATGTTTGGGG GCTGGCACCT GTTCCGACAC ATTGAAACCC 1500GCTTTCAGCT CCTTGCCACT AAGAATGAGG GATCCTTCAG CCCCGTGGCG AGTCTTCTCT 1560CCCAGGGAGA GTACCTTACG CGTCGGGACG ATGTTAAGTA CAGCAGCGAT CACCAGAACC 1620GGTGGCGAAA AGGCGGACAA CCGATGACGG GGGGTATTGC TTATGCGACC GGGAAAATGA 1680GACCCGACGA GCAACAGTAC CCTGCTATGC CCCCAGACCC CCCGATCATC ACCACTACTA 1740CAGCCCAAGG CACGCAAGTC CGCTGCATGA ATAGCACGCA AGCTTGGTGG TCATGGGACA 1800CATATATGAG CTTTGCAACA CTCACAGCAC TCGGTGCACA ATGGTCTTTT CCTCCAGGGC 1860AACGTTCAGT TTCTAGACGG TCCTTCAACC ACCACAAGGC GAGAGGAGCC GGGGACCCCA 1920AAGGCCAGAG ATGGCACACG CTGGTGCCCC TGGGCACGGA GACCATCACC GACAGCTACA 1980TGAGTGCACC CGCATCAGAG CTGGACACTA ATTTCTTTAC GCTTTACGTA GCGCAAGGCA 2040CAAATAAGTC GCAGCAGTAC AAGTTCGGCA CAGCTACATA CGCGCTAAAG GAGCCGGTAA 2100TGAAAAGCGA TGCATGGGCA GTGGTACGCG TCCAGTCGGT CTGGCAGCTG GGTAACAGGC 2160AGAGGCCATA CCCATGGGAC GTCAACTGGG CCAACAGCAC CATGTACTGG GAGACGCAGC 2220CCTGAAAAGG GGGGGGGGCT AAAGCCCCCC CCCCTTGAAC CCCCCCCTGG GGGGGATTCC 2280CCCCCAGCCC CCCCCTTT 2298(2)有关SEQ ID NO：2的资料：i)序列特征：
A)长度：449个氨基酸
B)类型：氨基酸
D)结构：线性的ii)分子类型：蛋白质xi)序列说明：SEQ ID NO：2Met Ala Arg Arg Ala Arg Arg Pro Arg Gly Arg Phe Tyr Ala Phe Arg1 5 10 15Arg Gly Arg Trp His His Leu Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Lys Phe
20 25 30Arg His Arg Arg Arg Gln Arg Tyr Arg Arg Arg Ala Phe Arg Lys Ala
35 40 45Phe His Asn Pro Arg Pro Gly Thr Tyr Ser Val Arg Leu Pro Asn Pro
50 55 60Gln Ser Thr Met Thr Ile Arg Phe Gln Gly Val Ile Phe Leu Thr Glu65 70 75 80Gly Leu Ile Leu Pro Lys Asn Ser Thr Ala Gly Gly Tyr Ala Asp His
85 90 95Met Tyr Gly Ala Arg Val Ala Lys Ile Ser Val Asn Leu Lys Glu Phe
100 105 110Leu Leu Ala Ser Met Asn Leu Thr Tyr Val Ser Lys Ile Gly Gly Pro
115 120 125Ile Ala Gly Glu Leu Ile Ala Asp Gly Ser Lys Ser Gln Ala Ala Glu
130 135 140Asn Trp Pro Asn Cys Trp Leu Pro Leu Asp Asn Asn Met Pro Ser Ala145 150 155 160Thr Pro Ser Ala Trp Trp Arg Trp Ala Leu Met Met Met Gln Pro Thr
165 170 175Asp Ser Cys Arg Phe Phe Asn His Pro Lys Gln Met Thr Leu Gln Asp
180 185 190Met Gly Arg Met Phe Gly Gly Trp His Leu Phe Arg His Ile Glu Thr
195 200 205Arg Phe Gln Leu Leu Ala Thr Lys Asn Glu Gly Ser Phe Ser Pro Val
210 215 220Ala Ser Leu Leu Ser Gln Gly Glu Tyr Leu Thr Arg Arg Asp Asp Val225 230 235 240Lys Tyr Ser Ser Asp His Gln Asn Arg Trp Arg Lys Gly Gly Gln Pro
245 250 255Met Thr Gly Gly Ile Ala Tyr Ala Thr Gly Lys Met Arg Pro Asp Glu
260 265 270Gln Gln Tyr Pro Ala Met Pro Pro Asp Pro Pro Ile Ile Thr Thr Thr
275 280 285Thr Ala Gln Gly Thr Gln Val Arg Cys Met Asn Ser Thr Gln Ala Trp
290 295 300Trp Ser Trp Asp Thr Tyr Met Ser Phe Ala Thr Leu Thr Ala Leu Gly305 310 315 320Ala Gln Trp Ser Phe Pro Pro Gly Gln Arg Ser Val Ser Arg Arg Ser
325 330 335Phe Asn His His Lys Ala Arg Gly Ala Gly Asp Pro Lys Gly Gln Arg
340 345 350Trp His Thr Leu Val Pro Leu Gly Thr Glu Thr Ile Thr Asp Ser Tyr
355 360 365Met Ser Ala Pro Ala Ser Glu Leu Asp Thr Asn Phe Phe Thr Leu Tyr
370 375 380Val Ala Gln Gly Thr Asn Lys Ser Gln Gln Tyr Lys Phe Gly Thr Ala385 390 395 400Thr Tyr Ala Leu Lys Glu Pro Val Met Lys Ser Asp Ala Trp Ala Val
405 410 415Val Arg Val Gln Ser Val Trp Gln Leu Gly Asn Arg Gln Arg Pro Tyr
420 425 430Pro Trp Asp Val Asn Trp Ala Asn Ser Thr Met Tyr Trp Glu Thr Gln
435 440 445Pro449(2)有关SEQ ID NO：3的资料：i)序列特征：
A)长度：133氨基酸
B)类型：氨基酸
D)结构：线性的ii)分子类型：蛋白质xi)序列说明：SEQ ID NO：3Met Asp Glu Ser Arg Asp Phe Ala Arg Asp Ser Ser Lys Ala Gly Gly1 5 10 15Arg Arg Pro Pro Gly Gly Pro Pro Pro Thr Ser Gly Ala Cys Thr Gly
20 25 30Gly Tyr Val Ile Arg Thr Gly Gly Tyr Val Thr Lys Arg Arg Tyr Arg
35 40 45Thr Gly Gly Tyr Val Thr Arg Thr Gly Gly Tyr Val Thr Ala Asn Gln
50 55 60Lys Leu Pro Arg Cys Glu Ser Asp Val Ser Lys Met Gly Gly Ala Ser65 70 75 80Leu Ser Ile Tyr Cys Ala His Ile Pro Val Gly Ser Arg Tyr Thr Gln
85 90 95Gly Gly Pro Gly Gly Cys Thr Gly Thr Ala Asp Asn Arg Pro Leu Gly
100 105 110Ala Val Asn Arg Arg Leu Ala Glu Arg Gly Asn Leu Gly Pro Ala Glu
115 120 125Pro Arg Arg Gly Lys.
130(2)有关SEQ ID NO：4的资料i)序列特征：
(A)长度：216个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)结构：线性ii)分子类型：蛋白质xi)序列说明：SEQ ID NO：4：Met His Gly Asn Gly Gly Gln Pro Ala Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ala1 5 10 15Leu Ser Arg Glu Gly Gln Pro Gly Pro Ser Gly Ala Ala Gln Gly Gln
20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Arg Ser Pro Arg Arg Tyr Ser Thr Arg Thr Ile
35 40 45Asn Gly Val Gln Ala Thr Asn Lys Phe Thr Ala Val Gly Asn Pro Ser
50 55 60Leu Gln Arg Asp Pro Asp Trp Tyr Arg Trp Asn Tyr Asn His Ser Ile65 70 75 80Ala Val Trp Leu Arg Glu Cys Ser Arg Ser His Ala Lys Ile Cys Asn
85 90 95Cys Gly Gln Phe Arg Lys His Trp Phe Gln Glu Cys Ala Gly Leu Glu
100 105 110Asp Arg Ser Thr Gln Ala Ser Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Pro Leu
115 120 125Arg Val Gln Gly Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Asp Tyr His Tyr Ser
130 135 140Gln Pro Thr Pro Asn Arg Lys Lys Val Tyr Lys Thr Val Arg Trp Gln145 150 155 160Asp Glu Leu Ala Asp Arg Glu Ala Asp Phe Thr Pro Ser Glu Glu Asp
165 170 175Gly Gly Thr Thr Ser Ser Asp Phe Asp Gly Asp Ile Asn Phe Asp Ile
180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Ile Val Asp Glu Leu Leu Gly Arg Pro Phe Thr
195 200 205Thr Pro Ala Pro Val Arg Ile Val.
210 215
Claims (4)
1.一种制备CAV核酸序列或氨基酸序列的方法，其特征在于培养用重组核酸分子转化的宿主细胞或用载体病毒感染的宿主细胞，其中所述重组核酸分子或载体病毒含有编码至少部分选自下列多肽的核酸序列：
a：有以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的ORF1；
b：有以SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的ORF2；
c：有以SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的ORF3；及其功能等价物；然后从培养物中收集含有CAV的物质。
2.根据权利要求1的方法，特征在于：所述序列包含至少部分以SEQ ID NO：1表示的位于876到2225，101到502或403到1053的DNA顺序。
3.一种制备CAV疫苗的方法，它包括将按照权利要求1的方法获得的含有CAV的物质与可作药用的载体混合的步骤。
4.一种制备CAV免疫试剂的方法，其特征在于将具有至少部分选自下列一组的氨基酸序列的多肽与一固体支持物或标记物结合：
a，有以SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的ORF1；
b，有以SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的ORF2；
c，有以SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列的ORF3；及其功能等价物。
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