CN1309708A - 来源于猪的断奶后多系统消耗综合症病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了新的PCⅦ病毒基因组的克隆,以及来源于PCⅦ基因组的蛋白质的表达。这些蛋白质可被用于预防和治疗PCⅦ感染的疫苗组合物,以及用于确定脊椎动物中PCⅦ感染的的诊断方法。来源于该病毒基因组的多核苷酸可被用作引物和探针。

Description

来源于猪的断奶后多系统消耗综合症病毒 技术领域
本发明总的来说涉及病毒。更具体地说，本发明涉及从表现断奶后多系统消耗综合症(PMWS)的猪体内分离出来的新的猪环状病毒(PCV)的分离和鉴定。
发明背景
断奶后多系统消耗综合症(PMWS)是一种新发现的猪疾病。PMWS看来似乎破坏宿主的免疫系统，导致断奶后的猪死亡率升高。这种疾病具有较长的潜伏期，通常为3-8周，影响感染猪的一些器官。受PMWS影响的猪崽通常死于伴随组织细胞性细胞渗透的呼吸衰竭和间质性肺炎。
猪环状病毒(PCV)对猪造成广泛影响，且具有高度传染性。最初检测到的PCV认为是猪肾(PK15)细胞系的非致细胞病变性污染物。目前已经将PCV分类为一种新的病毒家族环状病毒科。这些病毒很小，无包膜物质，具有单链环DNA基因组。
已经在一定范围的动物种类中鉴定了多种环状病毒，包括PCV、鸡贫血病毒(CAV)、鹦鹉的喙和羽毛病病毒(BFDV)，植物病毒包括三叶草地下阻碍生长病毒(SCSV)、椰子叶腐烂病毒(CFDV)和香蕉串顶端病毒(BBTV)。对于目前认识的环状病毒，看来似乎不存在DNA序列同源性或共同的抗原决定簇。Todd等(1991)Arch.Virol.117:129-135。
已经显示环状病毒家族的成员导致贫血、免疫缺陷相关疾病，并且在体外感染巨噬细胞。也就是最近发现PCV涉及PMWS。参见，例如，Ellis等(1998)加拿大兽医杂志(Can.Vet.J.)39:44-51和Gopi等(1997)加拿大兽医杂志38:385-386。然而，由于PCV在猪群中普遍存在，对PCV与PMWS的病因学关系提出了质疑。另外，用来源于污染PK15细胞培养物的PCV接种物对猪进行的试验性感染没有引起临床疾病。参见，例如，Tischer等(1986)Arch.Virol.91:271-276。
猪的感染物质，尤其是病毒，不仅深重影响着畜牧业，而且由于应用猪器官对人进行异种移植的兴趣不断增长，故给人带来潜在的公共健康危险。以前诊断PMWS病一直基于组织病理学检查。因此，有必要改善诊断PMWS-相关病原存在的方法，以及预防PMWS病。
发明简述
本发明基于一种新病毒的发现，本发明中该病毒被称为“PCVⅡ型”或“PCVⅡ”，其从受PMWS侵袭的猪崽的匀浆组织中分离出来。该病毒的特征在于它与从持续感染的PK15细胞中得到的非致病性猪环状病毒(本发明中称为“PCVⅠ型”或“PCVⅠ”)具有共同的特征。克隆了新PCV变异体的全长DNA基因组，PCVⅡ412，以及其它几种PCVⅡ分离体，并对它们进行了测序。这些DNA序列的片段可以用作探针诊断临床样品中是否存在该病毒，以及分离该病毒的其它天然存在的变异体。PCVⅡ基因组序列的明了也使病毒基因组开放读码框中编码各种蛋白质的多肽序列得以利用，使制备这些肽或其片段成为可能，而这些肽或其片段可用作诊断试验中的标准品或试剂和用作疫苗的成分。还可以由这些蛋白质生产保护性抗体，可以制备单克隆或多克隆形式的抗体。
因此全PCVⅡ序列的提供使下述多肽的设计和构建成为可能，所述多肽可以用作疫苗或诊断试剂，或者用作制备用于抗PMWS主动免疫治疗的单克隆抗体(Mab)制剂的中间体，或者用作制备用于诊断试剂的抗体的中间体。
因此，一方面本发明涉及用于制备PCVⅡ诊断试剂和疫苗的来源于PCVⅡ基因组的多核苷酸。在一个具体实施例中，多核苷酸能够选择性地与PCVⅡ核苷酸序列杂交，并且含有来源于或互补于图4A-4C(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和24)描述的PCVⅡ序列的至少大约8个连续核苷酸。在另一个实施方式中，多核苷酸编码一种免疫原PCVⅡ多肽，其与选自来源于(a)ORF 1(SEQID NO:3)、(b)ORF 2(SEQ ID NO:9)、(c)ORF 3(SEQ IDNO:7)、(d)ORF 4(SEQ ID NO:20)、(e)ORF 5(SEQ ID NO:21)、(f)ORF 6(SEQ ID NO:5)、和(g)含有至少约5个氨基酸的(a)-(f)的免疫原性片段多肽之一的多肽具有至少约85％的等同性。在一个优选的具体实施方式中，多核苷酸编码ORF 6(SEQID NO:5)的多肽，或其免疫原片段。
因此本发明涉及应用这些多核苷酸序列或其部分作为寡核苷酸探针，用于制备能够作为诊断试剂或疫苗抗原的肽，以及用于诊断和治疗疾病的多克隆和单克隆抗体。
本发明的其它方面包括表达系统，其能够实现由来源于全基因组序列编码的所需蛋白质的生产；含有该系统或其部分的重组载体；用该载体转化的重组宿主细胞；由转化细胞生产的蛋白质；以及由该蛋白质制备的疫苗。另外，本发明涉及由基因组编码的代表表位的肽序列，以及共价连接与标记或载体蛋白质的该序列。本发明还包括PCVⅡ基因组的各种ORF，以及由这些ORF编码的蛋白质，和其片段。
本发明还涉及制备多肽组合物例如疫苗和免疫诊断组合物、以及免疫球蛋白的方法，还涉及免疫分析法和含有引物、探针、多肽、和/或免疫球蛋白的分析试剂盒。在一个实施方式中，本发明涉及检测生物样品中PCVⅡ抗体的方法，包括：
(a)提取生物样品；
(b)将生物样品与上述免疫原PCVⅡ多肽在使PCVⅡ抗体(如果存在于生物样品中)结合PCVⅡ多肽的条件下反应，以形成抗体/抗原复合物；和
(c)检测是否存在该复合物，
由此检测样品中存在或缺乏PCVⅡ抗体。
在另一个实施方式中，本发明涉及检测生物样品中PCVⅡ同源序列的核酸杂交分析，包括：
(a)将生物样品与权利要求1的多核苷酸在促进多核苷酸和存在于生物样品中PCVⅡ核酸之间形成核酸复合物的条件下保温；和
(b)检测含有多核苷酸的复合物。
当结合附图阅读本发明的下列详细描述后，将会更完全地理解本发明的上述和其它方面和特征。
附图简述
图1是PCVⅡ412的示意图，显示开放读码框的定位。
图2A-2C描述了PCVⅡ412基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。两条链均被显示。也显示了如所示ORF 1(SEQ ID NO:3)；ORF 2(SEQ ID NO:9)；ORF 3(SEQ ID NO:7)；ORF 4(SEQ IDNO:20)；ORF 5(SEQ ID NO:21)；ORF 6(SEQ ID NO:5)的各种ORF对应的翻译产物的氨基酸序列。
图3A-3D是来源于PCVⅡ412开放读码框与从PK15细胞中分离出的PCVⅠ相应开放读码框的氨基酸序列比较。图3A显示PCVⅡ412ORF 1(上线，SEQ ID NO:3)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ IDNO:4)的氨基酸序列比较。图3B显示PCVⅡ412的ORF 6(上线，SEQ ID NO:5)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列比较。图3C显示PCVⅡ412的ORF 3(上线，SEQ ID NO:7)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ ID NO:8)的氨基酸序列比较。图3D显示PCVⅡ412的ORF2(上线，SEQ ID NO:9)与PCVⅠ的相应ORF(下线，SEQ ID NO:10)的氨基酸序列比较。
图4A-4D是各种PCV分离体的核苷酸序列：来源于PK15细胞的PCVⅠ(SEQ ID NO:2):PCVⅡ412(SEQ ID NO:1):PCVⅡ9741(SEQ ID NO:11):PCVⅡB9(SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:24)。
图5显示用于检测PCV感染的多重PCR结果。该分析即鉴定了PCV感染，又鉴别了存在的PCVⅠ和PCVⅡ。1道是分子量标记。2-4道依次是PCVⅡ对照、PCVⅠ对照和阴性对照。5-13道是从PMWS-感染畜群的猪崽体内收集的血样。
图6显示对来源于PMWS-感染猪崽的各种组织样品进行的多重PCR的结果。1道两排是分子量标记。2道上排是阳性PCVⅡ对照，而3道是阴性对照。其余道是从PMWS-感染猪崽中收集的各种组织样品。
详细描述
本发明的实践将应用，除非另有说明，分子生物学、微生物学、重组DNA技术、和免疫学的常规方法，它们均在本领域技术范围内。这些方法在文献中有充分描述。参见，例如Sambrook,Fritsch和Maniatis，分子克隆：试验室指南，第Ⅰ、Ⅱ和Ⅱ卷，第二版(1989)；DNA克隆，第Ⅰ和Ⅱ卷(D.N.Glover编，1985)寡核苷酸合成(M.J.Gait编，1984)核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；动物细胞培养(R.K.Freshney编，1986)；固定化细胞和酶(IRL出版社，1986)；Perbal,B.，分子克隆操作指南(1984)；系列，酶学方法(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press,Inc.)；和试验免疫学手册，第Ⅰ-Ⅳ卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986,Blackwell Xcientific Publications)。在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于如所指的具体DNA、多肽序列或处理参数，当然可以改变。还应当理解，本发明使用的专有名词目的仅在于描述本发明的具体实施方式，不是意图限制。
必须注意到，如本说明书和后附的权利要求中用到的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数指示物，除非上下文已经清楚地有相反指示。因此，例如，提及的“一种抗原(an antigen)”包括两种或多种抗原的混合物。提及的“一种赋形剂(an excipient)”包括两种或多种赋形剂的混合，等等。
全文使用下列氨基酸简写：
丙氨酸：Ala(A)      精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N)    天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C)    谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)      甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)    异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)    赖氨酸：Lys(K)
蛋氨酸：Met(M)    苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)    丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)    色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)    缬氨酸：Val(V)A．定义
除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语与本发明涉及领域的常规技术人员通常理解的含义相同。虽然一些类似于或等同于本发明所述的方法和材料可以用于本发明的实践，但优选的材料和方法是本文描述的那些。
在描述本发明时，将用到下列术语，试图如下所述定义它们。
术语“PCVⅡ蛋白”“PMWS蛋白”或编码它们的核苷酸序列，应当分别是这样的蛋白质或核苷酸序列，它们来源于本发明所述的新的PCVⅡ分离体。几种PCVⅡ分离体的核苷酸序列在图4A-4B中显示，对应的六种被鉴定的PCVⅡORF的氨基酸序列在图2A-2C中显示。然而，本发明定义的PCVⅡ或PMWS蛋白、或编码它们的基因不限于上述序列。
另外，如本发明中用到的，“来源于”PCVⅡ基因组或其互补物的核苷酸序列指为期望目的保留例举多核苷酸的基本特性，代表其来源全序列的一部分的序列。一种具体的，但非限定的该衍生物的例子由这样一种序列代表，其编码相同或基本相同氨基酸序列，但因为密码简并性，使用不同的具体密码；另一个例子是与病毒DNA互补的序列。诊断试验中使用的探针或寡核苷酸必须保留所示序列的互补性，但可以比全序列短或可以删除其一部分。然而，对于操作或表达应用，通常需要改变核苷酸，以产生或删除限制性位点，提供加工位点，或以不产生不利效果功能的方式改变编码的氨基酸序列。术语“核苷酸序列”和“多核苷酸”均指核糖核酸和脱氧核糖核酸序列，包括基因组链和其互补序列。
因此“来源于”含有PCVⅡ分离体基因组的核苷酸序列的序列指其包括基因组核苷酸序列相应(或它互补链)区的序列，或用与该期望用途相同领域的已知方法改进的所述序列区段的组合。当然，这些序列不一定是物理来源于所述基因的核苷酸序列，而是指这样的多核苷酸，即通过基于由其来源区段中的碱基序列提供的信息的任何方式产生的多核苷酸。例如，典型DNA序列“来源”的区段包括编码特异表位的区段。同样地，“来源于”PCVⅡORF的肽指基本上等同于这些多肽或其部分的氨基酸序列，并具有与该部分具有同样生物学特性的氨基酸序列。
而且，衍生的蛋白质或核苷酸序列不一定物理来源于上述基因，而可以通过任何方式产生，包括例如，基于本发明提供的信息化学合成、分离(例如，从PCVⅡ分离体)或通过重组生产。另外，该术语意在指与该基因编码的连续氨基酸序列基本上具有氨基酸序列同源性(如下文的定义)，并表现免疫学活性的蛋白质。
因此，该术语意指全长序列、以及免疫原性的、截短的和部分序列，以及该蛋白质的活性类似物或前体形式。该术语还包括该具体基因的核苷酸片段，包括该基因的至少约8个连续碱基对，更优选至少约25到50或75或更多的连续碱基对。该片段用作下面将要充分探讨的诊断方法，和重组蛋白质生产的探针。
该术语还包括天然形式的蛋白质，或制剂模式的碱性或酸性附加盐形式。该酸性附加盐可以涉及游离氨基，碱性盐可以通过游离羧基形成。下面将进一步探讨药物可接受的碱性或酸性附加盐。另外，可以将蛋白质与其它生物材料，例如脂类和糖组合，或通过侧链修饰，例如氨基的乙酰化、羟基侧链的磷酸酯化、巯基的氧化、氨基酸残基的糖化，以及其它对被编码的一级序列的修饰，来改进该蛋白质。
因此该术语意指该序列的缺失、添加和取代，只要该多肽能够发挥功能，产生本发明所述的免疫应答。在这点上，特别优选的取代通常是本质上保守的，即，在一族氨基酸之间发生的取代。例如，通常将氨基酸分成四族：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸氨；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(2)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)无电荷极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸有时被分类为芳香氨基酸。例如，可以理所当然地预测这样的分离取代：亮氨酸到异亮氨酸或缬氨酸，反之亦然；天冬氨酸到谷氨酸，或相反；苏氨酸到丝氨酸或相反；或者用类似的结构相关氨基酸进行的氨基酸保守取代将不会对生物活性产生重大影响。与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列，但含有少量氨基酸取代的蛋白质基本上不会影响蛋白质的免疫原性，因此该蛋白质在参照多肽的定义范围内。
“开放读码框”或“ORF”是编码一种多肽的多核苷酸序列区域。
至于“断奶后多系统消耗综合症”或“PMWS”指一种脊椎动物，特别是猪的疾病，其临床特征在于体重逐渐减轻、呼吸急促、呼吸困难和黄疸。其病理改变包括淋巴细胞到肉芽肿的间质性肺炎、淋巴结病，和，不常发生的淋巴细胞到肉芽肿的肝炎和肾炎。参见，例如，Clark,E.G.,Am.Assoc.Swine Pract.1997:499-501；和Harding,J.Am.Assoc.Swine Pract.1997:503。
“分离”的核酸分子是从自然界中发现该分子的完整生物体中分离或分泌出的核酸分子；或缺失通常与其天然形式相关的全部或部分序列的核酸分子；或这样一种序列，它天然存在，但具有与此相关的异源序列(如下定义)。
术语“疫苗组合物”意指含有抗原的任何药物组合物，该组合物可以用于预防或治疗受体的疾病或病症。因此该术语包括如下所述的两种亚单位疫苗，以及含有完全杀死、减毒或灭活的微生物。
至于“亚单位疫苗组合物”指含有至少一种免疫原性多肽，但不是所有抗原，来源于或同源于来自相关病原体抗原的组合物。该组合物基本上无完整病原体细胞或颗粒，或者细胞或颗粒的溶解物。因此，“亚单位疫苗组合物”由来自病原体的至少部分纯化(优选基本上纯化)的免疫原性多肽，或者其重组类似物制备。亚单位疫苗组合物可以包括亚单位抗原或基本上没有来自病原体的其它抗原或多肽的相关抗原。
术语“表位”指特异于B细胞和/或T细胞应答的抗原或半抗原上的位点。该术语还可以与“抗原决定簇”或“抗原决定位点”相互替换。可以用显示一种抗体阻断另一种抗体结合目标抗原能力的简单的免疫分析法鉴定识别相同表位的抗体。
对一种组合物或疫苗的“免疫应答”指在宿主体内形成细胞和/或抗体介导的对相关组合物或疫苗产生的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种下列作用：特异性地对包括相关组合物或疫苗的一种或多种抗原产生抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或γδT细胞。优选，宿主将表现治疗性或保护性免疫应答，以至于对新感染的抗性将被增强和/或疾病的临床严重度将被降低。该保护作用将通过感染的宿主通常表现症状的降低或缺乏，感染宿主较短的恢复时间和/或较低的病毒效价证明。
术语“免疫原性”蛋白质或多肽指诱导上述免疫应答的氨基酸序列。本发明提到的“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物、或其免疫原性片段。“免疫原性片段”指包括一种或多种表位，因此能够诱导上述免疫应答的蛋白质片段。该片段可以应用本领域已知的很多表位作图技术鉴定。参见，例如，分子生物学方法中的表位作图方案，第66卷(Glenn E.Moris，编，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。例如，可以通过例如，在固相支持物上同时合成大量肽，该肽对应蛋白质分子的一部分，使肽与抗体反应而肽仍然贴附于支持物，来确定线型表位。该技术是本领域已知技术，描述于例如美国专利4,708,871；Geysen等(1984)美国国家科学院科学进展81:3998-4002；Geysen等(1986)分子免疫学23:709-715。同样，可以通过确定氨基酸的空间构象，例如，通过X-射线晶体学和2-维核磁共振简单地鉴定构象表位。参见，例如，表位作图方案，同上。
上述概念还包括合成抗原，例如，多表位、旁侧表位、核其它重组的或合成的衍生抗原。参见，例如，Bergmann等(1993)欧洲免疫学杂志23:2777-2781；Bergmann等(1996)免疫学杂志157:3242-3249；Suhrbier,A(1997)免疫和细胞生物学75:402-408；Gardner等(1998)第12届世界AIDS会议，Geneva,Switzerland，1998年6月28日-7月3日。
用于本发明目的的免疫原性片段通常该分子包括至少约3个氨基酸，优选至少约10-15个氨基酸，更优选25或更多氨基酸。对于该片段的长度没有严格的上限，其可以包括几乎全长蛋白质序列，或甚至含有两种或多种蛋白质表位的融合蛋白质。
“天然”蛋白质或多肽指从蛋白质自然发生的来源分离出来的蛋白质或多肽。“重组”多肽指通过重组DNA技术制备的多肽；即，从用编码所需多肽的外源DNA构建体转化的细胞中制备的多肽。“合成”多肽是通过哈合成制备的多肽。
“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体、或粘粒，其中另一种DNA片段可以贴附于其上，以使贴附片段发生复制。
DNA“编码序列”或“核苷酸序列编码”的特定蛋白质是在体外或体内处于适当调控元件的控制之下被转录和翻译成多肽的DNA序列。编码序列的界限通过5′(氨基)末端的起始密码和3′(羧基)末端的翻译终止密码确定。编码序列可以包括但不限于，原核细胞序列、来自真核细胞mRNA的cDNA、来自真核细胞(例如，哺乳动物)的基因组DNA序列，以及合成的DNA序列。转录终止序列通常定位于编码序列的3′端。
DNA“控制元件”指启动子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控区、增强子等的总称，其总体提供编码序列在宿主细胞中转录和翻译。不是所有这些控制序列都必须总是存在于重组载体中，只要所需的基因能够被转录和翻译即可。
“有效地连接”指元件的排列，其中所述成分如此布局以至能发挥它们的常规功能。因此，控制元件有效地连接于编码序列能够实现编码序列的表达。控制元件不必与编码序列相邻，只要它们发挥指导其表达的功能。因此，例如，启动子和编码序列之间可以插入不翻译但转录的序列，启动子仍然能够认为是“有效地连接”于编码序列。
控制元件，例如启动子，“指导编码序列在细胞中的转录”，其中RNA聚合酶将结合启动子，编码序列将被转录成mRNA，其然后翻译成由编码序列编码的多肽。
“宿主细胞”是被外源核酸分子转化的，或能够转化的细胞。
当该外源DNA被导入细胞膜内部，则细胞被外源DNA“转化”。外源DNA可以，也可以不整合(共价连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。例如，在原核细胞和酵母中，外源DNA可以保留在游离基因元件(例如质粒)上。对于真核细胞，稳定转化细胞是一种外源DNA已经整合到染色体上，以至其经染色体复制被遗传到子代细胞中的细胞。这种稳定性通过真核细胞建立包括含有外源DNA的子代细胞群的细胞系或集落的能力证明。
“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽之间的等同百分率。当两种DNA，或两种多肽序列在分子的指定长度之间表现至少约80-85％、优选至少约90％，最优选至少约95-98％序列等同性时，则二者彼此“基本上同源”。如本发明提到的，基本上同源还指与特定DNA或多肽序列完全相同的序列。
可以通过直接比较两种分子之间的经排列序列后的序列信息，计录两种排列序列之间完全匹配的数目，除以较短序列的长度，得到的结果再乘以100。方便提供的计算机程序可以用于辅助分析，例如ALIGN,Dayhoff,M.O.(蛋白质序列和结构图集，M.O.Dayhoff编，5增刊，3:353-358，国家生物医学研究基因，Washington,DC)，其对Smith和Waterman((1981)，应用数学进展(Advances in Appl.Math.)2:482-489)的用于肽分析的局部同源性运算法则进行了改编。确定核苷酸序列等同性的程序在Wisconsin序列分析包，8版(来自Genetics Computer Group,Madison,WI)中提供，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，也依赖于Smith和Waterman运算法则。这些程序应用生产商推荐的和在上面指出的Wisconsin序列分析包中描述的缺省参数，易于使用。
或者，可以通过在同源区域之间形成稳定双链的条件下使多核苷酸杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，确定消化片段的大小来确定同源性。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交试验中，在，例如，该特定系统定义的严紧条件下，鉴定。确定合适的杂交条件在本领域技术技术范围内。参见：例如，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；核酸杂交，同上。
如果两种核酸片段能够与PCVⅡ核酸或其变异体特异性杂交(例如，与PCVⅡ核酸杂交但不与来自环状病毒家族其它成员的多核苷酸杂交)，或特异性引导聚合酶链式反应：(ⅰ)在如，例如，Sambrook等(同上)和核酸杂交(同上)中所述的典型杂交和清洗条件下；(ⅱ)应用降低严紧度的清洗条件下，该条件允许最多约25-30％碱基对错配，例如：2×SSC、0.1％SDS，室温两次，每次30分钟；然后2×SSC、0.1％ SDS,37℃一次，30分钟；然后2×SSC，室温两次，每次10分钟；或(ⅲ)选择在标准条件下(例如，Saiki等(1988)科学239:487-491中所述)典型聚合酶链式反应(PCR)中应用的引物，其导致PCVⅡ或其变异体序列特异性增殖，则认为这两种核酸片段与PCVⅡ多核苷酸“可选择性杂交”。
术语“功能等同”意指与参照氨基酸序列或其免疫原性部分诱导的应答相比，该蛋白质的氨基酸序列将诱导基本上相同或增强的前面定义的免疫应答的蛋白质。
DNA构建体的“异源”区是一种在另一种DNA分子中或贴附于另一种DNA分子的可鉴定的DNA片段，其与天然存在的其它分子没有发现相关性。因此，如果异源区编码一种病毒基因，则该基因通常将由其来源病毒基因组中不贴附病毒基因的DNA贴附。异源编码序列的另一个例子是编码序列本身不是天然发现(例如，具有与天然基因不同密码子的合成序列)的构建体。如本发明中涉及的，等位基因变异或自然发生的突变事件不会提高DNA的异源区。
本发明提及的术语“治疗(treatment)”指(Ⅰ)防止感染或再感染(预防)，或(ⅱ)相关疾病症状的缓解或消除(治疗)。
如本发明提及的，“生物样品”指从受体中分离出的组织和液体样品，包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、粪便、尿、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴组织和淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸系统、肠道、和泌尿生殖器道的外分泌物、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、器官、活检，以及体外细胞培养物的样品，包括但不限于，在培养基中使细胞和组织生长的条件培养基，例如，重组细胞和细胞成分。
本发明提及的术语“标记”和“可检测标记”指能够检测的分子，包括但不限于，放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(例如，生物素活半抗原)等。术语“荧光剂”指在检测范围内能够发射荧光的物质或部分。本发明中可以应用的标记的具体实例包括荧光素、若丹明、丹酰、伞花内酯、Texas红、发光氨、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
至于“脊椎动物受体”指心形亚门(subphylum cordata)的所有成员，包括单不限于，哺乳动物例如牛、羊、猪、山羊、马、和人；家畜类动物例如狗和猫；以及鸟，包括家养的、野生的和猎鸟例如公鸡和母鸡包括小鸡、火鸡和其它鸡类鸟。该术语没有指示具体年龄。因此，意图覆盖成年和新生动物，以及胎儿。B．一般方法
本发明的核心是发现了一种从PMWS感染猪体内分离出来的新的环状病毒，本发明命名为“PCVⅡ”。本发明应用的材料和方法使发现发现一个家族的核苷酸序列(它们各自含有新PCVⅡ病毒的一个完整基因组)成为可能。该家族核苷酸序列的可应用性，首先使较小异源性差异的该基因组家族的其它成员的分离成为可能，其次，使DNA片段的构建和蛋白质应用于诊断成为可能。例如，至少约8-10个或更多核苷酸的低聚物，优选包括至少约15-20个核苷酸的低聚物用作疾病诊断的杂交探针。该探针可以用于检测，例如，怀疑携带病毒的受试者的血清中，病毒基因组的存在。同样，编码蛋白质的基因可以被克隆和用于设计探针，以检测和分离其它病毒分离体中的同源基因。
PCVⅡ序列还能够用于设计和生产PCVⅡ-特异性多肽，其用作诊断血清或血液中PCVⅡ引起的抗体是否存在的试剂。抗这些多肽的抗体也可用作诊断试剂。因为可以解码完全基因组范围中的几个开放读码框，所以能够推测PCVⅡ-相关蛋白质的一级结构。最后，该基因序列的信息还能够设计和生产有效抗PCVⅡ的疫苗，因此用于预防PMWS和用于生产保护性抗体。
来自基因组的序列信息能够推测由病毒基因组编码的各种多肽的氨基酸序列和鉴定其适当表位。能够利用独立获得和表达的相关DNA片段生产由PCVⅡ基因组中鉴定的几种ORF编码的全长蛋白质，或其适当部分，因此利用重组技术提供所需的多肽。原核宿主和真核宿主都可以被用于该表达。短多肽片段也可以被化学合成并被连接到载体蛋白质上用作疫苗。另外，可以生产连接于赋予免疫原性的蛋白质的表位。由此生产的蛋白质本身可以用作疫苗，或者可以用于诱导宿主中免疫活性B细胞，然后该B细胞可以用于生产在被动免疫治疗中应用的分泌抗体的杂交瘤。
更具体地说，三种PCVⅡ分离体——PCVⅡ412(SEQ ID NO:1)、PCVⅡ9741(SEQ ID NO:11)、和PCVⅡB9(SEQ ID NO:12,SEQID NO:24)的完全基因序列如土4A-4B所示。各PCVⅡ分离体之间核苷酸序列同源性百分率超过99％等同性。新发现的病毒基因组与感染的PK15细胞分离出的PCV(本发明中称为“PCVⅠ”)在核苷酸水平上具有约76％的等同性。如实施例中的进一步描述，在三个区段中发现核苷酸插入和缺失(插入缺失，indel)。
如图1所示，新病毒含有至少六个潜在的开放读码矿(ORF)，它们编码含有多于50个氨基酸残基的蛋白质，而来源于PK15的PCVⅠ具有七个潜在的ORF。代表性PCVⅡ分离体的ORF出现在下列核苷酸位置(应用图4A-4B所示的PCVⅡ分离体的编号)：
ORF 1    51-992
ORF 2    671-360
ORF 3    565-389
ORF 4    553-729
ORF 5    1016-1174
ORF 6    1735-1037由这六种ORF编码的多肽如图2A-2C所示。
PCVⅡ靶向的主要细胞是外周血中的单核细胞，象巨噬细胞，当然感染动物的各种组织和器官中也发现了病毒。感染的巨噬细胞丧失了其正常功能，使宿主免疫系统损害，导致死亡。
新环状病毒的克隆和测序提供了有关PMWS病因物质的信息。如上面的解释，测序信息、以及克隆和其基因产物在诊断和研制疫苗中是有用的。特别是，PCR和基于抗体的诊断方法用于诊断疾病，以及在本发明中用于专属地将本发明的新PCVⅡ病毒与来源于持续感染的PK15细胞的PCVⅠ鉴定和区别开来。测序信息还用于设计特异性引物，以表达病毒-特异性基因产物，用于研究病毒结构，生产特异性抗体，以及鉴定猪环状病毒相关疾病的致病基因。B.1．PCVⅡ基因序列的制备
从PMWS感染猪的组织中分离出的病毒得到新PCVⅡ病毒基因组。从各种来源提取病毒DNA，包括感染的Dulac和Vero细胞小球、外周血暗黄色膜细胞、来自感染动物的组织和血清。应用实施例中更充分描述的方法从样品中提取DNA。
通过比较环状病毒家族中已知病毒之间的序列和结构相似性，利用保守茎环结构的互补序列设计独特引物。然后进行单引物PCR，并克隆产物。在两个方向上对插入质粒载体的不同取向的两种全长病毒基因组进行测序。制备其它PCR产物，并测序以确保引物/茎环区的可靠性。
利用类似引物，其它PCVⅡ分离体，得到包括PCVⅡ 9741、和PCVⅡ B9。这可能是首次从病毒颗粒而不是从DNA复制形式克隆出环状病毒。
提取PCVⅡ基因组的方法的描述当然大多数是已经公知的。本发明提供了得到的序列，也可以利用合成法或通过合成法与应用类似于本发明所述方法的部分序列修补组合制备全序列或其任何部分。B.2．PCVⅡ蛋白质的制备
PCVⅡ基因组序列的提供使来源于PCVⅡ基因组的编码病毒多肽和其抗原活性区的表达载体的构建称为可能。编码所需蛋白质的片段可以利用常规限制性消化从cDNA克隆得到或通过合成法得到，并被连接到载体中，例如含有融合序列部分例如β-半乳糖苷酶。任何含有一个开放读码框的所需的PCVⅡ基因组部分可以作为一种重组蛋白质得到，例如一种成熟或融合蛋白质，或者能够通过化学合成或一般的重组方法得到。
由上述DNA序列、活性片段、类似物编码的PCVⅡ蛋白质合和来源于它们的嵌合蛋白质能够通过很多方法制备是显而易见的。重组产物可以采用部分蛋白质序列形式、全长序列、包括信号序列的前体形式，物信号序列的成熟形式、或甚至融合蛋白质(例如，具有合适的重组宿主的引导物，或具有另一种病原的另一种亚单位抗原序列)。
可以构建基因文库，得到的克隆用于转化合适的宿主细胞。收集克隆，利用多克隆血清或单克隆抗体筛选PCVⅡ蛋白。
或者，当确定氨基酸序列后，可以制备含有已确定氨基酸序列部分密码子的寡核苷酸探针，并用于筛选编码受试者蛋白质的基因的基因组或cDNA文库。制备寡核苷酸太镇合DNA文库，以及通过核酸杂交筛选它们的基本策略对本领域普通技术人员是公知的。参见，例如，DNA克隆：第Ⅰ卷，同上；核酸杂交，同上；寡核苷酸合成，同上；Sambrook等，同上。当从筛选文库中鉴定出阳性杂交的克隆后，可以通过限制性酶分析和DNA测序确定特定文库插入体含有PCVⅡ蛋白质基因或其同源物。然后可以利用标准方法进一步分离该基因，如果需要，应用PCR方案或限制性酶删除全长序列的一部分。
同样，可以应用已知方法，例如酚提取法直接从病毒中分离基因，然后进一步对序列操作，已产生任何所需的改变。参见，例如，本发明的实施例和Hamel等(1998)病毒学杂志72:5262-5267，属于用于得到和分离病毒DNA的方法的描述。
或者，可以通过合成而不是克隆制备DNA序列。如果DNA序列将要用于制备蛋白质，可以用特定氨基酸序列的合适密码子设计DNA序列。通常，如果序列将被用于表达，那么技术人员将选择用于预期宿主的优选密码子。通过重叠经标准方法制备的寡核苷酸来组合全序列，并组合成完全的编码序列。参见，例如，Edage(1981)自然292:756；Nambair等(1984)科学223:1299；Jay等(1984)生物化学杂志259:6311。
一旦制备或分离出所需蛋白质的编码序列后，可以将它们克隆到任何适当载体或复制子中。本领域技术人员已知大量克隆载体，适当克隆载体的选择是一件选择的问题。克隆重组DNA载体并能够转化宿主细胞的实施例包括抗菌素(E.coli)、pBR322(E.coli)、pACYC177(E.coli)、pKT230(革兰氏阴性细菌)、pGV1106(革兰氏阴性细菌)、pLAFR1(革兰氏阴性细菌)、pME290(非-E.coli革兰氏阴性细菌)、pHV14(E.coli和枯草杆菌)、pBD9(杆菌属)、pIJ61(链霉菌属)、pUC6(链霉菌属)、YIp5(酵母属)、YCp19(酵母属)和牛痘病毒(哺乳动物细胞)。参见，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；B.Perbal，同上。
基因可以处于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和，任选地，操纵基因(本发明中总称为“调控”元件)的操纵之下，以使编码所需部分的DNA序列在被含有该表达构建体的载体转化的宿主细胞中转录成RNA。编码序列可以含有也可以不含信号肽或引导序列。如果含有信号序列，则它可以是自身的同源序列或异源序列。引导序列可以由宿主在转录后的加工中除去。参见，例如，美国专利4,431,739；4,425,437,4,338,397。
也可能需要其它的调控序列，其使蛋白质序列的表达调控与宿主细胞的生长相关。调控序列是本领域技术人员已知的，实例包括使基因的表达响应化学或物理刺激物而开启或关闭的那些序列，包括调控化合物的存在。载体中还可以出现其它类型的调控元件，例如，增强子序列。
操纵序列和其它调控序列可以在插入载体(例如上述克隆载体)之前连接于编码序列。或者，可以将编码序列直接克隆到已经含有调控序列和适当限制性位点的表达载体中。
在某些情况下，可能需要改编编码序列，以使它按照适当的取向连接于控制序列；即，以便维持适当的读码框。还可能需要制备所需PCVⅡ蛋白质的突变体或类似物。可以通过删除蛋白质编码序列的一部分、或通过插入序列、和/或通过取代序列中一种或多种核苷酸制备突变体或类似物。在，例如，Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；核酸杂交，同上中描述了改变核苷酸序列的方法，例如定点突变。
然后表达载体用于转化适当的宿主细胞。很多哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括美国典型培养物收藏中心(ATCC)提供的无限增殖细胞系，例如但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK’)细胞，以及其它细胞。同样，发现细菌宿主例如E.coli、枯草杆菌、和链球菌spp.将用于本发明的表达构建体。本发明中应用的酵母宿主特别地包括啤酒糖酵母、白色假丝酵母、麦芽糖假丝酵母、多形汉逊氏酵母、脆壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母、季也蒙氏毕赤氏酵母、巴斯德毕赤氏酵母、粟酒裂殖糖酵母和Yarrowia lipolytica。杆状病毒表达载体适用的昆虫细胞尤其包括Aedes aegypti、苜蓿银纹夜蛾、家蚕、Drosophilamelanogaster，草地夜蛾、和粉纹夜蛾。
根据选择的表达系统和宿主，在表达目标蛋白质的条件下培养经上述表达载体转化的宿主细胞，制备本发明的蛋白质。然后从宿主细胞中分离蛋白质并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，可以直接从培养基中纯化单比知。如果不分泌蛋白质，则从细胞溶解物中分离。适当生长条件的选择和提取方法在本领域技术范围内。
也可以利用已知氨基酸序列或来源于目标基因的DNA序列得出的氨基酸序列，通过化学合成法，例如固相肽合成，制备本发明的蛋白质。这些方法是本领域技术人员公知的。参见，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，固相肽合成，第2版，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984)和G.Barany和R.B.Merrifield，肽：分析、合成、生物学，编者：Gross和J.Meienhofer，第2卷，科学出版社，New York(1980)pp.3-254，用于固相肽合成技术；和M.BOdansky，肽合成原理，Springer-Verlag，Berlin(1984)和E.Gross和J.Meienhofer，编，肽：分析、合成、生物学，同上，第1卷，用于典型溶液合成。如果所述抗原的小片段即可引起目标受试者的免疫应答，则化学合成肽可能是优选的。
基因组分析表明至少存在六个开放读码框，至少其中之一编码推测的DNA复制酶基因。B.3．抗原多肽和与载体结合物的制备
肽的抗原区一般相对较小，通常位10个氨基酸或更短的长度。少至5个氨基酸的片段通常即可表现抗原区的特征。因此，利用PCVⅡ基因组作为基础，编码任何来源于PCVⅡ的多种ORF，例如ORF 1-6，特别是ORF 6的短多肽片段的DNA可以重组表达为融合蛋白质或分离肽。另外，可以化学合成短氨基酸序列。在合成肽被正确配置从而能提供正确表位，但因为太小而不具有免疫原性的例子中，可以将肽连接到适当的载体上。
本领域已知很多获得该连接的方法，包括利用从Pierce Company,Rockford,Illinois得到的N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶-硫)丙酸盐(SPDP)和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)形成二硫键。(如果该缺乏巯基，可以通过加入半胱氨酸残基提供。)这些试剂在它们自身之间和一种蛋白质上的半胱氨酸残基肽之间形成二硫键，通过赖氨酸上的ε-氨基或其他氨基酸上的其它游离氨基形成酰胺键。大量这类二硫化物/酰胺形成试剂是已知的。参见，例如，免疫研究(1982)62:185。其它双功能偶联试剂形成硫醚键而不是二硫键。商业提供了很多这类硫醚-形成试剂，包括6-马来酰亚胺己酸、2-溴乙酸、2-碘乙酸、4-(N-马来酰亚胺-甲基)环己烷-1-羧酸等。可以通过将羧基与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸钠盐混合活化羧基。上述列表并不详尽，显然可以对所述化合物进行改动。可以使用任何载体，只要其自身不诱导对宿主有害的抗体产生，例如各种血清白蛋白，破伤风类毒素、或匙孔冒贝血蓝蛋白(KLH)。
当结合物注射到受试者体内，将产生抗血清，其含有不仅与结合物而且与运载该序列类似部分的融合蛋白质，以及全长PCVⅡ的适当决定簇特异性反应的免疫球蛋白。B.4．抗体的产生
由本发明的新病毒编码的蛋白质，或其片段可以用于生产抗体，包括多克隆和单克隆抗体。如果需要多克隆抗体，可以用本发明的抗原或其片段或突变抗原免疫经选择的哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马等)。收集免疫动物的血清，按照已知程序处理。参见，例如，Jurgens等(1985)色谱杂志348:363-370。如果适用含有多克隆抗体的血清，可以通过免疫亲合色谱，应用已知程序纯化多克隆抗体。
本领域技术人员也可以容易地制备蛋白质和其片段的单克隆抗体。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的一般方法是公知的。可以通过细胞融合，也可以通过其它技术，例如用致瘤DNA直接转化B淋巴细胞，或者用Epstein-Barr病毒转化，来制备无限增殖的抗体生产细胞系。参见，例如，M.Schreier等，杂交瘤技术(1980)；Hammerling等，单克隆抗体和T-细胞杂交瘤(1981)；Kennett等，单克隆抗体(1980)；还参见美国专利4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,452,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。抗所需蛋白质或其片段的产生的单克隆抗体的拼接可以筛选各种性质；即同种型、表位、亲合性等。利用免疫亲合技术，单克隆抗体可以用于纯化它们对抗的个体抗原。多克隆和单克隆抗体还可以用于主动免疫或者可以与亚单位疫苗制剂组合，以增强免疫应答。多克隆和单克隆抗体也可以用于诊断目的。B.5．疫苗制剂和给药
本发明的新病毒蛋白质可以配制成疫苗组合物，单独或与其它抗原一起用于免疫下述受试者。例如，Remington′s药物科学，MackPublishing Company,Easton,Pennsylvania,18版，1990中描述了制备这类制剂的方法。通常，本发明的疫苗配制成可注射的液体溶液或悬浮液。也可以配制成注射前溶解于或悬浮于液体载体的适当固体形式。制剂还可以被乳化或将活性成分包封于脂质体载体中。活性免疫原成分通常于相容性药物载体，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合物混合。另外，如果需要，载体可以含有少量辅料例如保湿剂或乳化剂和pH缓冲剂。
制剂中还可以加入增强疫苗有效性的佐剂。这类佐剂包括，没有限制，由铝盐(明矾)形成的佐剂，例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；水包油和油包水型乳剂，例如完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、avridine和二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)；由细菌细胞壁成分构成的佐剂，例如包括单磷脂酰脂类A(MPL)(Imoto等(1985)Tet.Lett.26:1545-1548)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、和细胞壁骨架(CWS)；来源于ADP-核糖酸化细菌毒素，例如来源于白喉毒素(例如，CRM197，一种非毒性白喉毒素突变体(参见，例如，Bixler等(1989)试验医学生物学进展(Adv.Exp.Med.Biol.)251:175；和Constantino等(1992)疫苗)、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、E.coli热不稳定毒素(LT1和LT2)、假单胞菌内毒素A、肉毒杆菌C2和C3毒素、以及来自产气荚膜梭菌、螺状梭菌、艰难梭菌的毒素；皂甙佐剂例如Quil A(美国专利5057540)、或者从皂甙制得的颗粒例如ISCOM(免疫复合物)；细胞因子，例如白细胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；胞壁酰肽例如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-丙三氧基-3-羟磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，等；来源于CpG家族分子的佐剂，含有CpG基元的CpG二核苷酸和合成的寡核苷酸(参见，例如，Krieg等，自然(1995)374:546和Davis等免疫学杂志(1998)160:870-876)；以及合成佐剂，例如PCPP(聚[二(羧酸酯苯氧基)膦腈](Payne等，疫苗(1998)16:92-98)。
这类佐剂由很多销售商商业提供，例如Accurate Chemicals；RibiImmunechemicals,Hamilton,MT；GIBCO；Sigma,St.Louis,MO。
如上所述，蛋白质可以连接于载体，以便增加其免疫原性。适当的载体包括大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质，包括血清白蛋白、匙孔帽贝血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、和其它本领域技术人员已知的蛋白质；多糖，例如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素小珠等；多聚氨基酸例如聚谷氨酸、聚赖氨酸等；氨基酸共聚物；以及灭活的病毒颗粒。
可以使用天然形式的蛋白质，或者可以通过例如赖氨酸残基的琥珀酰化或与半胱氨酸-硫内酯反应修饰它们的功能基团成分。还可以通过例如，将功能氨基与2-亚氨基硫羟烷或3-(4-二硫吡啶基)丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，将巯基引入载体(或抗原)。还可以修饰适当的载体，以引入空间手臂(例如己撑二胺或其它大小相似的双功能分子)用于连接肽。
其它适用于本发明蛋白质的载体包括轮状病毒的VP6多肽，或其功能片段，如美国专利5071651所公开的。利用美国专利4722840中公开的方法制备的病毒蛋白质和受试者免疫原的融合产物也是有用的。其它适用的载体包括细胞，例如淋巴细胞，因为以这种形式出现模拟在受试者体内出现的天然模式，故其促进被免疫的状态。或者，本发明的蛋白质可以与红细胞偶联，优选受试者自身的红细胞。偶联肽与蛋白质或细胞的方法对于本领域技术人员是公知的。
另外，蛋白质可以配制成中性或盐形式的疫苗组合物。药物可接受盐包括酸附加盐(通过活性肽的游离氨基形成)，其用无机酸，例如盐酸或磷酸，或例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。还可以用来源于无机碱例如，钠、钾、铵、钙或铁的氢氧酸根盐和例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等有机碱与游离羧基形成盐。
疫苗制剂将含有“治疗有效量”的活性成分，也就是说，能够诱导受试者对给药组合物产生免疫应答的量。该应答将通过感染宿主通常表现症状的减轻或消失和/或较短的恢复时间证明。
本领域技术人员通过标准试验很容易确定准确用量。蛋白质浓度通常约占组合物的1％到95％(w/w)，如果需要甚至更高或更低。
为了免疫受试者，通常非肠道给药疫苗，通常经肌肉内注射。然而其它给药方法，例如皮下、腹膜内和静脉注射也可以接受。给药量依赖处理动物、动物免疫系统合成抗体的能力、和所需的保护程度而定。本领域普通技术人员可以容易地通过建立量效曲线的常规试验确定有效剂量。给药疫苗免疫受试者至少一个剂量，优选两个剂量。而且，可以给动物给药需要维持对感染免疫状态的若干剂量。
适用于其它给药方式的其它疫苗制剂包括栓剂、有时可以是气溶胶、鼻内给药制剂、口腔给药制剂，以及缓释制剂。对于栓剂，载体组合物将包括常规粘合剂和载体，例如，polyalkaline glycol、或甘油三酸酯。该栓剂可以用含活性成分约0.5％-10％(w/w)，优选约1％-2％的混合物制备。口服制剂载体包括例如通常应用的赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可以配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、或粉末剂形式，含活性成分约10％到约95％，优选约25％到约70％。
鼻内制剂通常包括即不对鼻粘膜产生刺激也不明显干扰临床功能的载体。稀释剂例如水、生理盐水或其它已知物质可以用于本发明的主题。鼻内制剂还可以含有防腐剂，例如但不限于，氯丁醇和洁尔灭。可以加入表面活性剂以增强试验蛋白质被鼻粘膜吸收的能力。
可以向蛋白质中加入载体或介质例如脂质体、不可重吸收的不渗透聚合物例如乙烯醋酸乙烯酯共聚物和Hytrel共聚物、溶胀性聚合物例如水凝胶、或者可重吸收的聚合物例如胶原和某些聚酸或聚酯例如用于制备重吸收结构的材料，制备控释或缓释制剂。本发明蛋白质还可以利用本领域已知的移植微型泵给药。
本发明的蛋白质还可以通过表达所述蛋白质的载体病毒给药。发现可用于本发明的载体病毒包括但不限于牛痘和其它痘病毒、腺病毒、和疱疹病毒。举例说明，可以如下构建表达新蛋白质的牛痘病毒重组体。首先将编码特定蛋白质的DNA插入适当载体，以使所述DNA连接于牛痘启动子并且旁侧牛痘DNA序列，例如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后所述载体用于转染同时感染牛痘的细胞。同源重组使牛痘启动子加编码本发明蛋白质的基因插入病毒基因组。产生的TK重组体可以在存在5-溴脱氧尿苷的情况下培养细胞，然后筛选抗性病毒蚀斑，来筛选产生的TK重组体。
一种给药的替代途径涉及基因治疗或核酸免疫。因此，编码本发明蛋白质的核苷酸序列(连同调控元件)可以在其体内翻译之前直接对受试者给药。或者，可以通过转染受试者的离体细胞或组织，然后将转化材料重新导入宿主实现基因转移。可以将DNA直接导入宿主机体，即通过注射(参见美国专利号：5580859和5589466；国际公开号WO/90/11092；和Wolff等(1990)科学247:1465-1468)。还可以应用已知方法实现脂质体介导的基因转移。参见，例如，美国专利号：5703055；Hazinski等(1991)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,4:206-209；Brigham等(1989)美国医学科学杂志(Am.J.Med.Sci.)298:278-281；Canonico等(1991)临床研究39:219A；和Nabel等(1990)科学249:1285-1288。靶向物质，例如抗特异性细胞型上出现的表面抗原的抗体，可以共价连接于脂质体表面，从而核酸可以被传送到可能感染的特定组织和细胞。B.6．诊断方法
如前面的解释，本发明的蛋白质还可以用作诊断试剂以检测生物样品中是否存在PCVⅡ的反应性抗体，以便确定PCVⅡ感染是否存在。例如，可以利用标准电泳和免疫诊断技术，包括免疫分析法例如竞争性、直接反应、或夹层类型分析检测与蛋白质反应的抗体的存在。这些分析法包括但不限于，Western印记；凝集试验；酶标和酶介免疫分析，例如ELISA；生物素/抗生物素蛋白类型分析；放射性免疫分析法；免疫电泳；免疫沉淀等。反应通常包括显示标记物例如荧光、化学发光、放射性、酶标记或染料分子，或其它检测抗原和与其反应的抗体复合物形式的方法。
上述分析法通常涉及液相中未结合抗体从结合有抗原-抗体复合物的固定相支持物上分离。可以用于本发明实践的固体支持物包括下述物质，例如硝基纤维素(例如，膜或微滴孔形式)；聚氯乙烯(例如，片或微滴孔)；聚苯乙烯乳胶(例如，小珠或微滴平板)；聚偏氟乙烯(polyvinylidine fluoride)；重氮化纸；尼龙膜；活化珠；磁性响应珠等。
通常，固体支持物首先与固相成分(例如，一种或多种PCVⅡ蛋白质)在适于结合的条件下反应，从而所述成分充分固定到支持物上。有时，可以通过首先将抗原与具有更好结合特性的蛋白质偶联来增强抗原与支持物的固定化。适当的偶联蛋白质包括但不限于，大分子例如血清白蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔帽贝血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、和本领域技术人员已知的其它蛋白质。可以用于将抗原结合到支持物上的其它分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物等。这类分子和将这些分子与抗原偶联的方法是本领域技术人员已知的。参见，例如，Brinkley,M.A.生物化学(1984)6:56-63；Anjaneyulu和Staros，国际肽和蛋白质研究杂志(International J.of Peptide and Protein Res.)(1987)30:117-124。
将固体支持物与固相成分反应后，所有未固定化的固相成分通过清洗从支持物上除去，然后在适当的结合条件下使支持物结合成分与可能含有配体(例如，抗固定化抗原的抗体)的生物样品接触。清洗除去所有未结合的配体之后，在适当结合条件下加入第二结合体，其中第二结合体能够选择性地与结合配体缔合。然后利用本领域已知技术检测第二结合体的存在。
更具体地说，可以使用ELISA法，其中微滴平板的孔用所需蛋白质涂层。然后将含有或可能含有抗-蛋白质的免疫球蛋白分子的生物样品加入涂层的孔中。保温足以使抗体结合固定抗原的一端时间后，清洗平板除去未结合部分，加入可检测的标记的第二结合分子。使第二结合分子与所有捕获的样品抗体反应，清洗平板，利用本领域已知方法检测第二结合分子的存在。
因此，在一个具体实施例中，利用含有抗抗体配体的抗体的第二结合体可以很容易地检测生物样品中结合的抗-抗原配体的存在。本领域已知很多抗猪免疫球蛋白(Ig)分子，利用本领域技术人员的已知方法可以将它们很容易地结合到可检测的酶标记物上，例如辣根过氧化酶、碱式磷酸酶或脲酶。然后使用合适的酶底物产生可检测信号。在其它相关实施方式中，可以应用本领域技术人员已知的方法实施竞争型ELISA法。
还可以在溶液中进行分析，使蛋白质和特异于那些蛋白质的抗体在沉淀条件下形成复合物。在一个具体实施方式中，应用本领域已知的偶联技术，例如直接化学或间接偶联，将蛋白质贴附于固相颗粒(例如，琼脂糖小珠等)。然后在适当的结合条件下使抗原涂布的颗粒与可能含有该蛋白质抗体的生物样品接触。结合抗体之间的交联形成颗粒-抗原-抗体复合凝集物，其能够沉淀并可应用清洗和/或离心从样品中分离。可以应用任何标准方法，例如上述免疫诊断法分析反应混合物，确定抗体-抗原复合物的存在或缺乏。
在进一步的实施方式中，提供了一种免疫亲合基质，其中来自可能含有抗目的蛋白质抗体的生物样品的多克隆抗体群固定于底物。对此，可以应用固定化抗原进行样品的初步亲合纯化。由此得到的样品制品将仅含抗PCVⅡ组分，避免了亲合支持物上潜在的非特异性结合性质。本领域已知很多高产率和良好保留抗原结合活性的固定免疫球蛋白(完整的或特异性片段)的方法。不被任何具体方法所限，固定的蛋白A或蛋白G可以用于固定免疫球蛋白。
因此，一旦免疫球蛋白分子被固定从而提供了一种免疫亲合基质后，将标记蛋白质于结合抗体在适当的结合条件下接触。当所有非特异性结合抗原从免疫亲合支持物上清洗掉后，可以应用本领域已知方法通过标记物分析确定结合抗原的存在。
另外，蛋白质诱导的抗体，而不是蛋白质本身可以用于上述分析，以便检测给定样品中抗蛋白质抗体的存在。这些分析法基本上如上述进行，它们也是本领域技术人员公知的。
而且，还可以进行基于核酸的分析。对此，应用公开的PCVⅡ核酸序列作为基础，制备低聚物，用作杂交探针或PCR引物，以检测例如，来自可能携带病毒的受试者的生物样品中病毒基因组的存在。在本发明的该实施方式中使用的低聚物具有约8个核苷酸或更多核苷酸的长度，优选至少约10-12个苷酸酸的长度，和高达50个或更多核苷酸的长度。优选，低聚物来源于缺乏异质性的病毒基因组区。
低聚物可以通过从基因组中切出，或通过重组或合成法制备。例如，应用常规方法，例如自动寡核苷酸合成法制备低聚物。
低聚物可以用作诊断分析中的探针。在一个有代表性的分析法中，处理待分析的生物样品，提取其中含有核酸。样品中得到的核酸进行凝胶电泳或其它尺寸分离技术。或者，核酸样品可以不进行尺寸分析即用于斑点印记。然后用报告组分标记探针。适当的标记物和标记探针的方法是本领域已知的，包括，例如，通过插入切口移位或激酶激发的放射性标记物、生物素、荧光探针和化学发光探针。然后在适当的严紧杂交条件下用标记探针处理从样品中提取的核酸。
探针可以于目标PCVⅡ基因序列完全互补。然而，诊断分析中使用的探针越长，互补性的数量可能约低。通常，该分析法中使用高度严紧的条件，尤其当探针是完全的或高度互补的。然而，如果是异质性目标区，应当使用较低严紧度的条件。调整严紧度的条件是本领域公知的。该调整在杂交和清洗程序中使用，包括调整温度、离子强度、甲酰胺的浓度和反应时间的长短。这些因素在例如Sambrook等(同上)中列出。
在一个更具体的实施方式中，上述方法包括PCVⅡ核酸特异性探针的应用，其中两个探针(引物)限定了PCVⅡ基因组的内部区域。在该实施方式中，每个探针具有一条含PCVⅡ核酸内部区3′端内部的链。然后将核酸/探针杂交复合物转化成含有引物延伸区片段的双链探针。含探针的片段经连续重复以下步骤扩增，(ⅰ)使双链片段变性产生单链链片段，(ⅱ)使单链于探针杂交，形成链/探针复合物，(ⅲ)在存在DNA聚合酶和所有四种脱氧核糖核酸的条件下从链/探针复合物产生双链片段，和(ⅳ)重复步骤(ⅰ)到(ⅲ)直到获得所需的扩增程度。然后按照已建立的程序坚定扩增产物。本发明的方法可以进一步包括能够选择性地与上述内部区杂交而不与用于扩增的特异性探针/引物序列杂交的第三多核苷酸探针。
PCR技术，例如上述的那些，是本领域公知的。参见，例如，PCR方案：方法和应用指南(Academic Press)；PCR实践研究(IRLpress)；Saiki等(1986)自然324:163。
基于核酸的分析中还可以使用其它扩增方法，例如连接酶链使反应(LCR)、PCR、Q-β复制酶等。
本发明使用的其它分析包括“生物-桥(Bio-bridge)”系统，其使用末端脱氧核苷酸转移酶将未修饰的3′-多聚-dT-尾加到核酸探针上(E nzo Biochem.Corp.)。存在多聚dT-尾巴的探针与目标核苷酸序列杂交，然后与生物素修饰的多聚-A杂交。另外，EP124221描述了一种DNA杂交方法，其中分析物被退火成为单链DNA探针，其与酶标记的寡核苷酸互补，然后得到的加尾的双链体与酶标寡核苷酸杂交。EP204510描述了一种DNA杂交法，其中分析物DNA与具有尾巴的探针(例如多聚-dT-尾巴)和具有杂交探针尾巴的序列的扩增链，例如多聚-A-序列，并且其能够结合大量标记链接触。如上述，该方法首先涉及血清中目标PCVⅡ序列扩增到约106个序列/ml。然后可以利用本领域已知的杂交法检测扩增的序列。
另外，来源于PCVⅡ病毒基因组的核酸序列还可以用于原委杂交分析法。通常，该分析应用福尔马林固定的细胞培养制品或组织，例如淋巴结、脾、扁桃体、肝、肺、心、肾、胰腺、鼻甲骨、大肠和小肠等。参见，例如，Sirinarumitr等(1996)病毒学方法杂志56:149-160，描述了适当的原位杂交法。
上述分析试剂，包括蛋白质、其抗体或低聚物，可以以具有适当说明和其它必须试剂的试剂盒方式提供，以进行上述免疫分析。根据应用的具体免疫分析法，试剂盒还可以含有适当标记物和其它包装好的试剂和材料(即清洗缓冲液等)。可以应用这些试剂盒进行标准免疫分析，例如上述的那些。
下面是进行本发明具体实施方式的实施例。这些实施例仅为举例说明的目的提供，不是意图以任何方式限制本发明的范围。C．试验
                     材料和方法
细胞培养Dulac细胞系，一种无PCV的PK15衍生物，从JohnEllis博士处得到(Saskatchewan大学，Saskatoon,Saskatchewan)。Vero细胞系从美国典型培养物收藏中心(ATCC),Manassas,VA得到。这些细胞在ATCC建议的培养基中，在37℃，5％CO2下培养。
猪环状病毒典型PCVⅠ从持续感染的PK15细胞(ATCCCCL33)中分离。分离体PCVⅡ412从用PMWS感染猪崽的淋巴结匀浆攻击的猪崽的淋巴结得到。该被攻击的猪崽诊断患有PMWS。分离体PCVⅡ9741从来自分离了PCVⅡ412后的同一群PMWS感染猪崽的外周血的buffy-coat分离出来。分离体PCVⅡ B9从1997年秋季PMWS临床爆发的美国猪群中的感染猪崽中分离得到。
PCVⅠ的增殖应用Tischer等(1987)Arch.Virol,96:39-57的改进方法使来自持续感染的PK15细胞的PCVⅠ生长并纯化。简单地说，从PK15细胞收获的PCV以约1moi重复感染PK15细胞单层两小时，之后细胞用300mM D-葡糖胺处理。清洗细胞一次后，将含有5％FBS的DMEM(Gibco，类号21013)加入细胞，再次培养细胞四天。刮下感染细胞，1500×g离心15分钟后收集。然后在37℃用0.5％ Triton X-114处理细胞沉淀30分钟。再进行一次低速离心以除去细胞碎片后，向上清液中加入等量Freon(Sigma，类号T-5271)，用Polytron以最高速度混匀混合物1分钟。然后离心混合物，收集上层，与等体积0.1M PBS混合。在20％蔗糖缓冲层中以210000×g超离心30分钟后，收集病毒沉淀。
野生分离体(PCVⅡ)的培养分离体PCVⅡ412以类似于PCVⅠ的方法培养和纯化，除了使用Dulac细胞。分离体PCVⅡ B9在用来自美国PMWS爆发的自连接全长PCR产物感染的异质Vero细胞中生长。因此，排除了其它猪病原污染的可能。B9转染的Vero细胞被连续传代，然后如上述用300mM D-葡糖胺处理。
病毒DNA分离从不同来源提取病毒DNA，包括感染的Dulac和Vero细胞沉淀，外周血buffy-coat细胞，来自感染动物的组织和血清。用蛋白酶K处理组织样品，利用酚/氯仿法或Qiagen组织试剂盒(Qiagen,Aanta Clarita,CA)提取病毒DNA。同样地利用Qiagen血液试剂盒收集来自肝素化血和血清的外周血buffy coat细胞的DNA。
猪崽的感染猪崽来源于无特异性病原体的母猪。出生后第一天，每只猪崽接受约1克从PMWS感染猪崽收集的淋巴结。口服和非肠道途径组织匀浆分布相同。每个试验组使用10只猪崽，每天观察连续7周。两组被攻击，两组作为未感染的对照。一组攻击组和一组对照组在第0天和第14天另接受环孢菌素A(2mg/kg)处理。给猪崽饲喂听装奶(肉色)和水(50∶50)，直到它们自行断奶，接受高营养密度的商品配制食物。
野生PCV分离体的PCR，克隆和测序应用两步研究进行分离体PCVⅡ412病毒基因组DNA的初步克隆。设计了与保守茎环序列，Loop-(表1)杂交的引物，用于进行利用互补序列和环状天然PCV基因组DNA的单引物PCR。该单引物PCR的PCR反应是一个两步程序。第一步包括94C1分钟变性，37℃30秒退火和72℃2分钟延伸的5次循环。第二步包括类似程序除了退火温度升高到52℃的25次循环。将PCR产物克隆到TA克隆载体上(Invitrogen,Carlsbad,CA)。对三种不同克隆的两条链均进行测序，确保序列的可靠性。基于得到的序列，在病毒DNA序列的非编码区设计了引物1000和R1F，用于克隆全长病毒基因组。本研究中应用的所有引物的序列在表1中显示。然后从全长克隆得到环区序列。分离体PCVⅡ9741和PCVⅡ B9的序列从纯化的PCR产物中得到。NRC，加拿大的植物生物技术研究所用几种内部引物进行自动DNA测序。分离体PCVⅡ412(AF085695)、PCVⅡ9741(AF086835)和PCVⅡ B9(AF086834)的序列已经保藏于国家生物技术信息中心(NCBI)。
                                 表1本研究中使用的引物的序列
引物名称 引物序列 序列号：
  Loop- ACTACAGCAGCGCACTTC  13
  1000- AAAAAAGACTCAGTAATTTATTTCATATGG  14
  R1F ATCACTTCGTAATGGTTTTTATT  15
  1710+ TGCGGTAACGCCTCCTTG  16
  850- CTACAGCTGGGACAGCAGTTG  17
  1100+ CATACATGGTTACACGGATATTG  18
  1570- CCGCACCTTCGGATATACTG  19
  1230- TCCCGTTACTTCACACCCAA  22
  400+ CCTGTCTACTGCTGTGAGTA  23
序列分析其它环状病毒的序列从NCBI得到。应用各种公开领域进行序列分析，例如生物工作台(Biology workbench),Blastsearch,DNA/蛋白质分析工具等。用Clustal W程序(生物工作台，intemet地址：http://biology.ncsa.uiuc.edu)形成序列排列，通过PAUP3.1程序(David L.Swofford,Laboratory of Molecular Systematics,MRC534,MRC at Smithsonian Institution,Washington,D.C.)绘制系统发生树。
多重PCR设计了两套引物，鉴定PCV的组-特异性序列和株系-特异性序列。引物对1710+/850-是PCV-组特异性的，1100+/1570-是新的PCV株系-特异性对，其与来源于PK15细胞的新PCV有所差别。这两套引物对在PCR反应中具有类似的退火温度，在标准热启动PCR反应中以0.5μM的浓度一同使用。还使用了Ampli Taq Gold(Perkin Elmer)和Plentinum Taq(Gibco)。
抗血清Tischer博士(Koch研究所，Berlin,FRG)友情提供标准柏林兔抗PCVⅠ抗体。用纯化分离体PCVⅡ 412的水包油型乳剂(50μg/剂量)注射两只兔，得到兔抗-PCVⅡ 412富集血清。以21天的间隔重复注射3次。从PMWS感染猪群的恢复期猪收集猪抗-PMWS血清。
ELISA纯化的PCV在碳酸钠缓冲液(0.05M,pH9.6)中稀释到浓度为0.5μg/100μl，用于涂布Immulon Ⅱ平板(DynatechLaboratories,Inc.)。平板用TTBS(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,0.05％Tween20,pH 7.5)冲洗六次，然后加入连续稀释的初级兔或猪抗体。用TTBS清洗六次后，加入碱式磷酸酶-结合的抗兔或抗猪二级抗体(1/5000稀释度)(Kirkegaard和Perry)。用p-硝基酚磷酸盐(PNPP,3g/L)的1M二乙醇胺溶液，0.5MgCl2(pH9.8)以100μl/孔使平板显色，然后在ELISA读数仪(BioRad)上在405/490nm处对平板读数。
淋巴细胞表面标记的FACA分析采集圈养的PMWS感染猪崽和阴性对照的血样。溶解RBC，用抗-猪CD3、CD4和CD8单克隆抗体染色WBC，然后用荧光标记的抗-小鼠二级抗体染色。特异性标记细胞用2％甲醛固定，用FACS系统(Becton Dickinson)计数5000个细胞。
                     实施例1
                    PMWS的再现
PMWS未曾在控制条件下再现，也未曾进行过病因学研究。为了确定该疾病的病因物质，如前面在材料和方法中的描述，收集了PMWS感染猪的多种组织，进行研究。淋巴结表现最明显的总损伤，组织病理学改变，通过免疫染色确定环状病毒感染。因此，淋巴结用于上面所述的攻击试验。
按照材料和方法中的描述进行的攻击试验成功地诱导猪PMWS。尤其是，某些死于感染的猪崽和无症状感染猪崽到试验末期形成PMWS样显微损伤。
在一个攻击试验中，使用的起始材料是具有慢性消耗和淋巴结增大症状的猪肺组织。这些临床症状是PMWS的特征。将组织与无菌0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合，通过一个Polytron混合器混匀。组织匀浆用于攻击猪。具体地说，总共40只猪崽(约1天大)随机(平衡一群小猪的年龄、性别和体重)分配成为“组织攻击组”、“与环孢菌素A一同组织攻击组”，“对照组”，或“环孢菌素A”处理组。环孢菌素处理没有对处理的猪产生临床或血液学影响，除了给药后3小时这些猪的血液中检测到环孢菌素。因此，对于分析环孢菌素处理组崩溃。
通常，被攻击猪PMWS疾病的尸检症状包括增大的淋巴结和肺组织的不完全塌陷。组织提取物处理组(9只中有7只)比安慰剂处理组(18只中有2只)有明显更多(p＜0.01；双尾Fishers精确检验)的猪检测到PMWS疾病的尸检症状。组织提取物注射(212gm/d)处理组的平均每日增长与安慰剂处理(202gm/d)组基本上没有差异。
试验全程提取血样，尸检时采集组织样品。样品用于通过PCR，利用PCR引物1230-和400+(表1)测试CVⅡ病毒DNA,PCR产生830个碱基对的产物。四只施用肺组织提取物的猪表现阳性血样；而给用安慰剂的猪血液中没有检测到PCVⅡ DNA。8只“病毒攻击”处理组存活猪中的7只的一种或多种组织中检测到PCVⅡ，而来自对照组猪的所有组织均为PCVⅡ阴性。偶然性制表分析表现显著差异(p＜0.001；双尾Fishers精确检验)。
在另一个攻击试验中，采集表现慢性耗竭和淋巴结增大的猪的肺组织，通过离心(8000rpm 30分钟)除去组织碎片。上清液应用于氯化铯梯度，然后于10000×g离心。色带看起来在41％ CsCl2(1.28gm/ml)和63％ CsCl2(1.40gm/ml)之间。这些色带应用于30％ CsCl2“脚(foot)”，然后在100000×g离心2小时。沉淀重新悬浮于15mL无菌0.1M PBS。
总共20只断奶猪崽(约3周龄)随机(平衡出生的同窝崽、性别和体重)分配成“对照”或“病毒攻击”处理组。猪崽在大约3周龄的第0天断奶。通常，PMWS疾病的临床症状包括淋巴结增大和耗竭或生长迟缓。病毒处理组中(7只猪)比安慰剂处理组(1只猪)有明显较多(p＜0.02；双尾Fishers精确检验)的猪检测到淋巴结增大。病毒注射(580gm/d)处理组平均每日增加趋向比给用安慰剂(616gm/d)组低，但差异不显著(p=0.17；双尾成对T检验)。组间内部器官(肝、肺、心、脾、肾)的相对质量没有差异。
应用上述PCR技术对试验全程采集的血样和尸检时采集的组织样品检测PCVⅡ病毒DNA。
所有血样，包括麻醉之前采集的血样均为PCVⅡ阴性。“病毒攻击”处理组中，10只猪中的8只的一种或多种组织检测到PCVⅡ，而对照组中猪的所有测试组织均为PCVⅡ阴性。偶然性列表分析表明存在显著差异(p＜0.001；双尾Fishers精确检验)。
总之，这些试验确证用含有PCVⅡ的组织提取物和梯度纯化病毒材料注射断奶猪崽导致多种组织感染。感染持续至少8周时间。
                     实施例2
                 PCVⅡ的分离和增殖
为了确证PMWS感染病因物质的存在，来自猪#412(感染后21天处死的试验性攻击猪崽)的各种组织用于分离病毒。来自猪#412的淋巴结样品在Dulac细胞中连续传代后，观察病毒累积或适应。首先形成一种独特的细胞致病作用模式，随后通过应用前面所述的标准柏林抗PCV抗体的ELⅡSA测定，病毒滴度增加。
然后通过电子显微检查，检测分离体PCVⅡ412感染的Dulac细胞中环状病毒的存在。六次传代后，应用Western印迹分析能够稳定地检测到病毒结构蛋白质。
                     实施例3
 PMWS-感染猪群中的无症状感染猪崽和恢复期猪崽中
              的特异性抗-PCVⅡ抗体
因为猪环状病毒可能拥有某些异质性，应用从PMWS爆发猪群采集的猪崽的血清，对PCV和分离体PCVⅡ 412病毒进行ELISA。大多数无症状PCVⅡ感染猪崽和恢复期猪崽形成抗PCVⅡ的特异性抗体，但没有对PCVⅠ的抗体。
                    实施例4
    PCVⅡ病毒和病毒基因组DNA的分离，克隆和测序
为了发现两种猪环状病毒株系之间的遗传学差异，从感染的Dulac细胞中提取病毒DNA。考虑到PCVⅠ和PCVⅡ之间可能的遗传非相关性，本研究从最保守区设计引物。以前关于PK15的PCV DNA序列分析(Mankertz等(1997)遗传病毒学杂志(J.Gen.Virol)71:2562-2566；Meehan等(1997)遗传病毒学杂志78:221-227)表明复制起点存在一个茎环结构。由于该重要区域的高度保守性质设计了一种单引物，指向茎环区的反向重复序列。通过单引物实现了PCVⅡ412病毒DNA的扩增。克隆到TA克隆载体后，通过对几种克隆和两条链的自动测序得到病毒基因组序列，以确保可靠性。然后从由引物1000-和R1F从病毒的唯一一个非编码区产生的第二个全长克隆得到茎环或引物区的真实序列。PMWS 412的核苷酸序列显示在图2A-2C的上线。
应用类似引物，得到其它PCVⅡ分离体，包括从得到PCVⅡ412的同一猪群得到PCVⅡ9741，和从美国PMWS爆发猪得到的PCVⅡB9。对这些株系测序，并与PCVⅡ412和PCVⅠ比较。参见比较PCVⅡ412和PCVⅠ的图2A-2C，以及比较PCVⅡ412序列和各种PCV分离体的图4A-4B。
应用PAUP3.1程序进行的系统发生分析结果表明新PMWS分离体与PCVⅠ高度相关，属于不同群。因此这些分离体被命名为“PCVⅡ”分离体。新猪环状病毒分离体之间的核苷酸序列同源性百分率超过99％的等同性。相比较而言，这些核苷酸序列与PK15 PCVⅠ比较仅表现75.8％的全核苷酸序列同源性。不同区域核苷酸序列的比较分析进一步表明这两种病毒推测的复制相关蛋白质基因享有81.4％的同源性，而其它大ORF的核苷酸序列仅有67.6％的同源性。
而且，三个区域发现存在核苷酸插入和缺失(插入缺失(indels))。在新分离体中，在PCVⅠ序列38-61之间(在推测的由ORF1编码的35.8kd蛋白质的起始密码的旁侧)有13个碱基的插入。PCVⅠ915-1033区域(含有15个碱基的插入缺失)在末端和猪环状病毒的两个最大ORF(其它ORF是反义的)的连接区。第三区覆盖了PCVⅠ序列的1529-1735，含有15个碱基的插入缺失突变，定位于推测的由IRF6编码的27.8kd蛋白质的氨基末端。还将PCVⅠ序列于其它环状病毒科成员的提供序列进行了比较。PCVⅠ与香蕉串顶端病毒(BBTV)，一种植物病毒，而不是与鸡贫血症病毒(CAV)以及喙和羽毛病病毒(BFDV)(二者均为鸟环状病毒)更为密切相关。分离体PCVⅡ 412的基因图谱在图1中显示。总共有六个潜在的ORF，它们编码超过50个氨基酸残基的蛋白质。PCVⅡ 412和PK15 PCVⅠ之间的比较表明四个IRF具有同源性(表2)。以前曾报道过35.8kd，即推测的DNA复制酶蛋白质的功能(Meehan等(1997)遗传病毒学杂志78:221-227)。对这些蛋白质的分析预示35.8kd蛋白质和反义27.8kd蛋白质是核蛋白。核苷酸序列分析还表明这两种蛋白质的起始密码在复制起点的33个碱基范围内，它也可能是启动子。另外，这两个ORF末端具有允许的终止密码和多聚A尾巴信号。因为可以在Western印迹中发现某些推测蛋白质(基于大小)，这些发现表明猪环状病毒mRNA可以从被复制形式的两条意义链转录。然而，不存在长得足以编码通过Western印迹分析检测到的PCVⅡ 412分离体的共有的31kd蛋白质和另一种20kd蛋白质的编码序列。这表明翻译后切割和/或RNA剪切可能参与某些猪环状病毒蛋白质的表达。
                                 表2PK15 PCVⅠ和PCVⅡ 412的推测氨基酸序列的比较
开放读码框PCVⅠ412 序列同源性(5％)PCVⅠ/412 推测的定位和功能
47-983(ORF 1) 51-992(ORF 1) 83.5 细胞核，推测的Rep蛋白质
1723-1024(ORF 6) 1735-1037(ORF 6) 66.4 核心
552-207(IRF 4) 565-389(ORF 3) 40.9 内质网
658-40(IRF 3) 671-359(ORF 2) 29.1 微体
                    实施例5
            利用分子克隆法纯化PCVⅡ
Dulac细胞发现感染了猪环状病毒，在很多猪原始细胞系也发现猪环状病毒的感染。另外，还发现其它猪病原不一致地与PMWS-感染猪崽中的PCVⅡ相关。因此，为了获得纯的PCVⅡ培养物，利用脂质体将遗传克隆的PCVⅡ DNA转移到易感的非猪原始Vero细胞中。
                       实施例6
            PCVⅡ鉴定和PMWS诊断中的多重PCR
为了区分两种猪环状病毒株系，PCVⅠ和PCVⅡ，在比较分析DNA序列的基础上设计了两组引物。在检测饲养动物样品的多重PCR中，使用PCV组-特异性引物对1710+/850，和分离体PCVⅡ 412株系-特异性1100+/1570-。这些引物对被用于冷冻组织和外周血的暗黄色膜细胞。如应用这些引物的多重PCR鉴定，不仅鉴定了这些样品中的PCVⅡ感染，而且还确定了这些饲养动物样品的遗传相关性。之后通过电子显微镜确定了环状病毒的存在。
该诊断法方法的效能进一步通过另一组从PMWS-感染猪群收集的样品来验证(参见图5)。PMWS感染猪崽的几乎所有组织中均可鉴定PCVⅡ DNA序列(图6)。
                   实施例7
     PMWS爆发之前和期间的PCVⅡ病毒血症
利用血清进行的PCR使我们能够验证表现特异性抗-PCVⅡ抗体的猪群中的PCVⅡ病毒血症。监测了一组年龄从1天到7周大的23只猪崽，以约两周间隔采集样品。通过检测23只猪崽中的9只的PCVⅡ病毒血症从出现到消失的指标，观察PCVⅡ病毒血症和PMWS爆发的全过程。表现PCVⅡ病毒血症的大多数猪崽形成PMWS，某些表现验证的PMWS。表3显示典型猪中PMWS的表现。大多数器官和组织中发现肉眼可见的损伤(表3)。
        表3.典型PMWS感染猪崽的临床、组织学、病毒学和免疫学报告
PMWS猪            肉眼可见外观           组织病理              PCR
  H254  脊柱、多毛、淡漠、颤抖
  唾液                       ND                 ND              ND
  尿液                色淡/清亮                 ND              +
  胆汁               稀薄，不粘                 ND              +
  粪便               稀少但正常                 ND              +
  血清                       N                  ND              +
  血浆                     黄色                 ND              +
  皮肤                 略显黄色                                 +
  脂肪                少/无脂肪                                 +
  肌肉                        N                                 +
    舌                        N               舌炎              +
扁桃体                     小囊       淋巴细胞损耗              +Cerv.LN                     增大       淋巴细胞损耗             +
Med.LN 非常大，表面暗淡，中心黄       淋巴细胞损耗              +
                             色
肠系膜LN   增生显著，暗淡，湿润       淋巴细胞损耗              +
腹股沟LN         大，暗淡，湿润       淋巴细胞损耗              +
    脾                 小，单薄       淋巴细胞损耗              +
  胸腺             小，难以发现                 ND              +
  气管                        N            转化腺炎             +
    肺      A，M叶80％肺膨胀不全：
                        质地坚硬，       间质性肺炎             +
          全部肺叶均有色斑和斑点
  心脏                单薄，松弛                                +
    肝       “伪装”形式的斑点                                 +
  胆囊                       N                                  +
  胰腺                       N                                  +
肾上腺                       N      病灶性肾上腺炎              +
    脑                       N              脑膜炎              +
    眼             N，白色巩膜                                  +
    胃             N，充满食物                                  +
  小肠                       N            派伊儿结              +
  大肠        N，沙/砾样内容物          粘膜下发炎              +
    肾      增大，暗淡，没有脓          间质性肾炎              +
  膀胱                       N                                  +
                                                    Refmg×10^g/L
   CBC                WBC:20.1                          11.0-22.0
             Segs:62％或12.462                          3.08-10.4
           淋巴：29.0％或5.829                          4.29-13.6
  FACS              CD3:52.1％                               55％
                     CD4:9.0％                               30％
                    CD8:66.5％                               15％
                   实施例8
      PMWS感染猪崽中宿主免疫系统机能障碍
有趣的是当大多数组织中发现淋巴细胞渗透时，发现所有淋巴组织都一致地出现淋巴细胞损耗(表3)。还观察到CD4细胞减少，CD8细胞增加，而CD3细胞保持相对稳定(表4，来自两只PMWS感染猪崽和40只阴性对照猪崽的平均数)。这些变化导致CD4/CD8的比率从1.58到0.13显著降低。这些结果表明PCVⅡ能够诱导宿主免疫系统障碍，因此抑制宿主对PCVⅡ及其它可能病原的免疫应答。因此，PMWS可能是一种猪崽的免疫缺陷疾病。
                                      表46周大的PMWS感染猪崽和对照猪崽的淋巴细胞表面标记
    CD3     CD4     CD8  CD4/CE8的比率
PMWS     59.88     8.85     67.6     0.13
对照     53.46     24.02     15.18     1.58
因此，公开了新PCVⅡ分离体的克隆、表达和特征，以及应用它们的方法。虽然详细地描述了本发明的优选实施方式，应当理解可以在不背离本发明权利要求限定的实质和范围的情况下进行明显的改动。

Claims (30)

1．一种能够选择性地与猪环状病毒Ⅱ型(PCVⅡ)核苷酸序列杂交的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包括至少约8个连续的来源于或互补于图4A-4C(SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和24)所示PCVⅡ序列的核苷酸。
2．权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸长度至少为10个核苷酸。
3．权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸长度至少为15个核苷酸。
4．权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸长度至少为20个核苷酸。
5．权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括与图4A-4C(SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12和24)所示的PCVⅡ序列，或其含有至少约75个连续核苷酸的片段具有至少约85％等同性的序列。
6．权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有选自包括PCVⅡ412(SEQ ID NO:1)、PCVⅡ9741(SEQ ID NO:11)和PCVⅡB9(SEQ ID NO:12和24)的PCVⅡ序列。
7．一种多核苷酸序列，编码免疫原性猪环状病毒Ⅱ型(PCVⅡ)多肽，所述多肽与选自包括来源于(a)开放读码框(ORF)1(SEQID NO:3)、(b)ORF 2(SEQ ID NO:9)、(c)ORF 3(SEQ IDNO:7)、(d)ORF 4(SEQ ID NO:20)、(e)ORF 5(SEQ ID NO:21)、(f)ORF 6(SEQ ID NO:5)，和(g)含有(a)-(f)至少约5个氨基酸的免疫原性片段的多肽具有至少约85％等同性。
8．权利要求7的多核苷酸，其中该多核苷酸编码与来源于ORF6(SEQ ID NO:5)的多肽或含有其至少约5个氨基酸的免疫原片段具有至少约85％等同性的免疫原性PCVⅡ多肽。
9．权利要求8的多核苷酸，其中该多核苷酸编码ORF 6(SEQ IDNO:5)的多肽。
10．一种重组载体，包括：
(a)权利要求1-9任意之一的多核苷酸；
(b)有效连接所述多核苷酸的调控元件，从而使所述多核苷酸中的编码序列能够在宿主细胞中转录和翻译，并且至少一种所述调控元件对所述编码序列来说是异种的。
11．用权利要求10的重组载体转化的宿主细胞。
12．一种制备重组PCVⅡ多肽的方法，包括：
(a)提供权利要求11的宿主细胞群；和
(b)在由存在于所述重组载体中的编码序列编码的PCVⅡ多肽被表达的条件下，培养所述细胞群。
13．一种由权利要求12的方法制备的蛋白质。
14．一种免疫原性猪环状病毒Ⅱ型(PCVⅡ)多肽，与选自包括来源于(a)开放读码框(ORF)1(SEQ ID NO:3)、(b)ORF 2(SEQ ID NO:9)、(c)ORF 3(SEQ ID NO:7)、(d)ORF 4(SEQ ID NO:20)、(e)ORF 5(SEQ ID NO:21)、(f)ORF 6(SEQ ID NO:5)，和(g)含有(a)-(f)至少约5个氨基酸的免疫原性片段的多肽具有至少约85％等同性。
15．权利要求14的多肽，其中该多肽与来源于ORF 6(SEQ IDNO:5)的多肽或含有其至少约5个氨基酸的免疫原性片段具有至少约85％等同性。
16．权利要求15的多肽，其中该多肽具有由IRF 6(SEQ ID NO:6)编码的多肽序列。
17．权利要求14-16任意之一的多肽诱导的抗体。
18．一种组合物，含有权利要求14-16任意之一的免疫原性PCVⅡ多肽和药物可接受载体。
19．权利要求18的组合物，进一步含有佐剂。
20．一种组合物的制备方法，包括提供一种权利要求14-16任意之一的免疫原性PCVⅡ多肽，然后将所述多肽与药物可接受载体混合。
21．权利要求14-16任意之一的免疫原性PCVⅡ多肽在生产治疗或预防脊椎动物患者PCVⅡ感染的组合物中的应用。
22．权利要求14-16任意之一的免疫原性PCVⅡ多肽在生产检测生物样品中是否存在PCVⅡ抗体的组合物中的应用。
23．一种检测脊椎动物受试者中PCVⅡ感染的免疫诊断检验试剂盒，所述检验试剂盒包括权利要求14-16任意之一的免疫原性PCVⅡ多肽，和进行免疫诊断试验的说明。
24．权利要求1-6任意之一的多核苷酸在生产检测生物样品中是否存在PCVⅡ同源序列的组合物中的应用。
25．一种检测脊椎动物患者中PCVⅡ感染的免疫诊断检验试剂盒，所述检验试剂盒含有权利要求1的多核苷酸，和进行所述免疫诊断试验的说明。
26．一种治疗或预防脊椎动物受试者中PCVⅡ感染的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求18或19的组合物。
27．一种检测生物样品中猪环状病毒Ⅱ型(PCVⅡ)抗体的方法，包括：
(a)提供一种生物样品；
(b)使所述生物样品与权利要求14-16任意之一的免疫原性PCVⅡ多肽，在使生物样品中可能存在的PCVⅡ抗体结合所述PCVⅡ多肽从而形成抗体/抗原复合物的条件下反应；和
(c)检测是否存在所述复合物；
由此检测所述样品中PCVⅡ抗体的存在或缺乏。
28．一种检测生物样品中PCVⅡ同源序列的核酸杂交分析，包括：
(a)在促进权利要求1-6之一的多核苷酸和生物样品中存在的PCVⅡ核酸形成核酸复合物的条件下，将生物样品与多核苷酸温浴；和
(b)检测含有的多核苷酸复合物。
29．权利要求28的分析方法，其中所述多核苷酸是标记的，通过检测标记物的存在来检测复合物。
30．权利要求28的分析方法，其中所述检测包括应用两种PCVⅡ核酸特异性探针，其中该两种探针限定了PCVⅡ核酸的内部区，每种探针具有包含该区3’-末端内部的一条链，通过引物延伸反应将核酸/探针杂交复合物转化成含有探针的双链片段，
通过连续重复以下步骤扩增含有探针的片段数目：(ⅰ)使双链片段变性产生单链片段，(ⅱ)使单链体与探针杂交形成链/探针复合物，(ⅲ)在存在DNA聚合酶和所有四种脱氧核糖核苷酸的情况下，由链/探针复合物形成双链片段，和(ⅳ)重复步骤(ⅰ)到(ⅲ)直到获得所需的扩增程度，
鉴定扩增产物。
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