CN103834670B - 优化的猪圆环病毒orf2截短基因 - Google Patents
优化的猪圆环病毒orf2截短基因 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103834670B CN103834670B CN201410061725.1A CN201410061725A CN103834670B CN 103834670 B CN103834670 B CN 103834670B CN 201410061725 A CN201410061725 A CN 201410061725A CN 103834670 B CN103834670 B CN 103834670B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- orf2
- circular ring
- subtilis
- gene
- pht43
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了优化的猪圆环病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ？ID？NO．1。所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。本发明采用以上技术方案，通过将去除NLS片段并根据密码子偏好性优化后的截短基因，能够成功的在枯草芽孢杆菌中得到表达。
Description
技术领域
本发明属于属于生物技术领域，特别涉及优化的猪圆环病毒ORF2截短基因。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型：PCV1与PCV2。PCV2含有两个主要开放阅读框ORF1和ORF2。其中ORF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。
PVC2的ORF2基因编码Cap蛋白，为病毒的外壳蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市场上已经有以Cap蛋白为主要成份的疫苗产品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆虫细胞表达系统生产。还未见微生物发酵生产的疫苗产品。
大肠杆菌是得到广泛应用的蛋白生产菌种。ORF2外壳蛋白在大肠杆菌中的表达已经有不少研究报道。比如，孙继国2009，查振林2005，周伦江2008，陈德坤2010，zhangGaiping2012。但所有上述报道均未能表达ORF2的全长基因序列，而是去除信号肽NLS的截短序列。目前认为，其原因是ORF2外壳蛋白在N端的一段NLS序列，含有大肠的稀有密码子。
在研究人员的努力下，已有少数研究组成功的在大肠杆菌中成功的表达了ORF2基因。Celer2007报道，成功的在大肠杆菌的特殊菌种BL21-CODON-PLUS中表达了ORF2全长基因序列。其成功在于运用了特殊的菌种，这种菌种被插入了多个野生型大肠杆菌不具备的稀有密码子基因。另一个技术路径是通过改变原ORF2基因的密码子使用方法，得到优化的适于在大肠杆菌中表达的基因。Bumba2009首先报道了一个优化的序列(GenbankEU376523)，使得ORF2蛋白在大肠杆菌BL21中获得了10mg/L的表达量。Huang2012等人又报道了一个优化的序列(GenbankAY885225)，同样获得了全长蛋白的成功表达。这两个序列是目前已知的两个优化的ORF2-NLS序列。
枯草芽孢杆菌作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。国内外在开发和使用枯草芽孢杆菌作为克隆和表达系统方面做了许多研究，但是到目前为止尚未有枯草芽孢杆菌表达PCV2-ORF2基因序列的的报道。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的为提供能够在枯草芽孢杆菌中成功得到表达的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
优化的猪圆环病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。
所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。
所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
本发明采用以上技术方案，通过将去除NLS片段并根据密码子偏好性优化后的截短基因，能够成功的在枯草芽孢杆菌中得到表达。
附图说明
下面将结合附图说明和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。
图1为本发明优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的表达载体质粒PHT43-ORF2双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱（1.PHT43-ORF2经双酶切的电泳条带；2.PHT43-ORF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNALadderMarker）；
图2为本发明优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的表达质粒PHT43-ORF2成功转化枯草芽孢杆菌168后，提取表达菌株中质粒经BamH1和Sma1双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱（1.BS168/PHT43-ORF2经双酶切的电泳条带；2.BS168/PHT43-ORF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNALadderMarker）；
图3为本发明优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的表达质粒PHT43-ORF2成功转化枯草芽孢杆菌WB800后，提取表达菌株中质粒经BamH1和Sma1双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱（1.WB800/PHT43-ORF2经双酶切的电泳条带；2.WB800/PHT43-ORF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNALadderMarker）；
图4为本发明优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的表达菌株诱导表达重组蛋白的Western-blot分析结果（1.BS168/PHT43-ORF2诱导表达的重组蛋白；2.WB800/PHT43-ORF2诱导表达的重组蛋白；3.BS168/PHT43-ORF2未诱导；4.WB800/PHT43-ORF2未诱导）。
具体实施方式
本发明的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。
为便于后续纯化，在本发明的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的3’末端引入6×His标签后，再在其两端分别引入BamH1和Sma1的酶切位点送生物公司合成此序列。
所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。
所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
为了验证本发明的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因能够在枯草芽孢杆菌中得到表达，本发明采用以下试验进行验证。
胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司；BamH1、Sma1、T4DNALigase、DL2000核酸分子量标准物、低分子量蛋白标准物均购自TaKaRa公司。
主要溶液和试剂的配制：
1)碱裂解法制备质粒DNA所用溶液：
溶液I：50mMglucose，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)。
溶液II：0.2MNaOH，1%SDS(m/v)(现配现用)。
溶液III：3MKAC60.0mL，冰醋酸11.5mL，H2O定容至100mL。
2)0.1MCaCl2：1.47gCaCl2溶于100ml纯水中，灭菌，4℃保存备用。
3)枯草芽胞杆菌感受态细胞制备用培养基
10×最低盐溶液：K2HPO4·3H2O91.7g，KH2PO430g，(NH4)2SO410g，柠檬酸钠5g，MgSO4·7H2O1g，在蒸馏水中依次溶解，定容至500mL。
GMI溶液：1×最低盐溶液95mL，50%glucose1mL，5%CasaminoAcid0.4mL，10%Yeastextract1mL，2mg/mLL-trp溶液2.5mL。
GMII溶液：1×最低盐溶液195mL，50%glucose2mL，5%CasaminoAcid0.16mL，10%Yeastextract0.08mL，0.5MMgCl21mL，0.1MCaCl21mL，2mg/mLL-trp溶液1mL。
1.质粒PHT43-ORF2的小量提取
1)取1.5mL菌液于离心管中，12000rpm离心2min，弃上清。
2)菌体沉淀重悬于100μL溶液Ⅰ中，室温下放置5-10min。
3)加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，混匀，冰浴5min，使细胞膜裂解。
4)加入150μL预冷的溶液Ⅲ，见白色絮状沉淀，于冰上放置5min。
5)12000rpm离心10min，上清液移入干净离心管中，加入等体积(450μL)的酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min。
6)小心移出上清(约400μL)于一新微量离心管中，加入2倍体积(800μL)预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，12000rpm离心10min。
7)弃上清，加入1mL70％乙醇洗沉淀一次，12000rpm离心5min。
8)吸除上清液，室温干燥，将沉淀质粒PHT43-ORF2溶于20μLTE缓冲液中进行保存。
2.大肠杆菌感受态TOP10细胞的制备及转化
1)挑取TOP10单菌落于LB培养基中，37℃培养过夜。
2)第二天，按1:100转接到新的LB培养基中，培养至OD600为0.3-0.5。
3)取1mL菌液，冰浴10min，12000rpm离心1min。
4)弃上清，加入1mL0.1M的CaCl2，混匀，冰浴30min。
5)12000rpm离心1min，弃上清，加入100μL0.1M的CaCl2，混匀，即为大肠杆菌感受态TOP10细胞。
6)适量DNA立即加入100μL制备好的大肠杆菌感受态TOP10细胞中，冰浴30min。
7)42℃热击45s，冰浴2min，再加入500μL不含抗生素的LB培养基，37℃培养1h。
8)菌液涂布在含氨苄抗性的平板上，37℃培养过夜，次日检查和验证大肠杆菌感受态TOP10细胞转化子。
3.枯草芽孢杆菌spizizen法感受态细胞的制备及转化
1)芽孢杆菌划线在LB平板上，37℃培养过夜。
2)用接种针接一单菌落于5mLGMI溶液中，30℃，100rpm振荡培养过夜。
3)次日取0.5mL菌液转接到4.5mLGMI溶液中，37℃，200rpm培养3.5h。
4)取3mL上一步骤的培养液转接到27mLGMII溶液中，37℃100rpm继续培养1.5h，5000g离心10min收集菌体。
5)用3mL原培养液上清轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。
6)将感受态细胞分装成每管0.5mL，每管菌液中加入适量DNA。于37℃，200rpm振荡培养60min后涂布到氯霉素抗性平板上。
7)待菌液被吸收后，倒置平板，37℃过夜培养过夜，次日检查和验证枯草芽孢杆菌的转化子。
4.表达载体的构建
优化的猪圆环病毒ORF2截短基因经BamH1和Sma1双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳（条件为：1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min），然后进行切胶，并用胶回收试剂盒回收目的基因ORF2。
大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体PHT43经BamH1和Sma1双酶切，切胶回收约8000bp左右的质粒骨架。
用T4DNA连接酶将ORF2与质粒骨架连接起来，通过转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，得到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒PHT43-ORF2。质粒PHT43-ORF2经BamH1和Sma1双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳（条件为：1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min）进行验证，由图1中可以看出质粒PHT43-ORF2质粒双酶切后在大约600bp位置有目标条带，说明大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体PHT43已经成功连接上ORF2，送去invitrogen公司测序后，测序结果正确。
5.表达载体转化枯草芽孢杆菌BS168或WB800
验证正确的质粒PHT43-ORF2，通过Spizizen化学转化法，转化枯草芽孢杆菌BS168或WB800，构建枯草芽孢杆菌工程菌BS168/PHT43-ORF2或WB800/PHT43-ORF2。分别提取质粒BS168/PHT43-ORF2或质粒WB800/PHT43-ORF2经BamH1和Sma1双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳（条件为：1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min）进行验证，由图2和图3中可以看出双酶切后在大约600bp位置有目标条带，说明质粒BS168/PHT43-ORF2或质粒WB800/PHT43-ORF2已经成功转化枯草芽孢杆菌BS168或WB800，送去invitrogen公司测序后，测序结果正确。
6.重组蛋白的表达
将枯草芽孢杆菌工程菌BS168/PHT43-ORF2或WB800/PHT43-ORF2以1%的接种量转接表达菌株得重组蛋白BS168/PHT43-ORF2或重组蛋白WB800/PHT43-ORF2，当培养OD600至0.6时，进行Western-blot分析，具体步骤如下，分别在重组蛋白BS168/PHT43-ORF2或WB800/PHT43-ORF2中加1mMITPG诱导6h，将诱导后和作为对照未进行诱导的阳性菌分别离心重悬于ddH2O，以2:1加上样处理缓冲液(2%SDS,0.1%溴酚蓝10%甘油)混匀后，沸水煮沸10min，离心去菌体，取上清液进行SDS-PAGE，采用120v电压，电泳时间为2h，割胶转印至硝酸纤维素膜后，加入5%脱脂牛奶10mL，于37℃封闭1h；加组氨酸标签一抗10mL(1:2500稀释)，于4℃孵育过夜(12h以上)；加山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)抗体10mL(1:2500稀释)37℃作用1h，在1mL二氨基联苯胺(DAB)缓冲液中显色。从图4可以看出阳性菌均没有条带，而BS168/PHT43-ORF2或WB800/PHT43-ORF2分别在在23.2kD左右有明显蛋白条带，与预期重组蛋白大小一致，从而说明本发明的猪圆环病毒ORF2截断基因能够成功表达Cap蛋白。
SEQUENCELISTING
<110>福州大北农生物技术有限公司；福州大学
<120>优化的猪圆环病毒ORF2截短基因
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>579
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aacggcattttcaatacacggctttcaagaacatttggctatacaattaaaagaacaacg60
gtaaaaacaccgtcttgggcggtggatatgatgagattcaatattaatgactttctgccg120
ccgggcggcggctctaacccgagaagcgttccgtttgaatattacagaatcagaaaggta180
aaagtagaattctggccttgttcaccgattacacaaggcgaccgcggagtgggctccagt240
gctgttattctagatgataactttgtcacaaaagcaacagccctcacctatgatccgtat300
gtaaactacagcagccggcatacaattacacagccgttttcatatcatagccgttatttt360
acgccaaaacctgtgcttgattctacgattgattactttcagccgaacaacaaaagaaat420
cagctttggctccggctgcaaactgctggaaatgtagatcatgtgggcctcggcactgcg480
ttcgaaaacagcatttatgaccaggaatacaatatccgagttacgatgtatgtgcaattt540
agagaatttaaccttaaagatccgccattaaatccttaa579
Claims (3)
1.优化的猪圆环病毒ORF2截短基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO．1。
2.如权利要求1所述的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的应用，其特征在于：所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。
3.根据权利要求2所述的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410061725.1A CN103834670B (zh) | 2014-02-24 | 2014-02-24 | 优化的猪圆环病毒orf2截短基因 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410061725.1A CN103834670B (zh) | 2014-02-24 | 2014-02-24 | 优化的猪圆环病毒orf2截短基因 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103834670A CN103834670A (zh) | 2014-06-04 |
| CN103834670B true CN103834670B (zh) | 2016-01-06 |
Family
ID=50798567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410061725.1A Active CN103834670B (zh) | 2014-02-24 | 2014-02-24 | 优化的猪圆环病毒orf2截短基因 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103834670B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029717A2 (en) * | 1997-12-11 | 1999-06-17 | University Of Saskatchewan | Postweaning multisystemic wasting syndrome virus from pigs |
| CN102978232A (zh) * | 2012-08-23 | 2013-03-20 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法 |
| CN103013896A (zh) * | 2012-10-15 | 2013-04-03 | 周建业 | Hplc12型冰结构蛋白在枯草芽孢杆菌中重组表达与制备方法 |
| CN103173470A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-26 | 斯澳生物科技（苏州）有限公司 | 大肠杆菌来源的pcv2 orf2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备 |
| CN103451196A (zh) * | 2013-09-13 | 2013-12-18 | 江苏省农业科学院 | 密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因及其应用 |
-
2014
- 2014-02-24 CN CN201410061725.1A patent/CN103834670B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029717A2 (en) * | 1997-12-11 | 1999-06-17 | University Of Saskatchewan | Postweaning multisystemic wasting syndrome virus from pigs |
| CN102978232A (zh) * | 2012-08-23 | 2013-03-20 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种IPTG诱导猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达的方法 |
| CN103013896A (zh) * | 2012-10-15 | 2013-04-03 | 周建业 | Hplc12型冰结构蛋白在枯草芽孢杆菌中重组表达与制备方法 |
| CN103173470A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-26 | 斯澳生物科技（苏州）有限公司 | 大肠杆菌来源的pcv2 orf2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备 |
| CN103451196A (zh) * | 2013-09-13 | 2013-12-18 | 江苏省农业科学院 | 密码子优化的猪圆环病毒2型Cap蛋白编码基因及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Expression of porcine circovirus 2 ORF2 gene requires codon optimized E. coli cells;Maria Trundova等;《Virus Genes》;20071231;第34卷;199页摘要，200页右栏第4-5段 * |
| High-level expression and immunogenicity of a porcine circovirus type 2 capsid protein through codon optimization in Pichia pastoris;Yabin Tu等;《Appl Microbiol Biotechnol》;20131231;第97卷;2867-2875 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103834670A (zh) | 2014-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113929786B (zh) | 新型冠状病毒突变株s蛋白及其亚单位疫苗 | |
| CN102174086B (zh) | 一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白和亚单位疫苗 | |
| CN103074361B (zh) | 一种将外源基因整合至绵羊李斯特菌基因组的方法 | |
| CN107529534B (zh) | 一种副鸡禽杆菌的保护性抗原、及其表达和应用 | |
| CN108611359B (zh) | 猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法及其应用 | |
| CN101885760A (zh) | 密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗 | |
| CN108794583B (zh) | 貉细小病毒病毒样颗粒、其制备方法与应用以及该病毒样颗粒制备的疫苗 | |
| CN109134667A (zh) | 融合蛋白及其制备方法、应用、表达系统和疫苗 | |
| CN104693310A (zh) | 一种嵌合蛋白、病毒样颗粒及其应用 | |
| CN102643835A (zh) | 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白的原核表达及多抗制备和应用 | |
| CN102703483A (zh) | 罗非鱼重组口服蛋白tat-gh及制备方法和应用 | |
| WO2015158031A1 (zh) | 用于毕赤酵母重组质粒和表达耐辐射球菌ppri蛋白的毕赤酵母重组菌的dna分子 | |
| CN101812459A (zh) | 编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法 | |
| CN104152480A (zh) | 布鲁氏菌L7/L12、Omp31、Rsα、sodC免疫蛋白共表达载体构建和表达方法 | |
| CN103834670B (zh) | 优化的猪圆环病毒orf2截短基因 | |
| CN109395071A (zh) | 一种美人鱼发光杆菌胞外蛋白EF-Tu | |
| CN107167609B (zh) | 区分猪蓝耳病野毒株和疫苗毒株天津株的抗体间接elisa检测方法 | |
| CN106754981B (zh) | 一种利用大肠杆菌系统制备小鹅瘟病毒样颗粒的方法 | |
| CN102813918A (zh) | 一种猪圆环病毒2型重组亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN109266676A (zh) | 一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法 | |
| CN110478480A (zh) | 基于铁蛋白纳米颗粒的羊口疮f1l疫苗及其制备方法 | |
| CN115960250A (zh) | 一种重组猪圆环病毒3型三聚体蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN104163865A (zh) | 优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的dna序列及其编码蛋白质 | |
| CN107881181A (zh) | 利用分子伴侣DnaK构建的中性蛋白酶基因、蛋白、枯草芽孢杆菌及制备和应用 | |
| CN104031925A (zh) | 优化的猪圆环病毒orf2基因的nls序列 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Gushan Town Park in Jinan District of Fuzhou city in Fujian province village 110 350000 Co-patentee after: FUZHOU University Patentee after: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd. Address before: Gushan Town Park in Jinan District of Fuzhou city in Fujian province village 110 350000 Co-patentee before: FUZHOU University Patentee before: FUZHOU DA BEI NONG BIOTECH Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200624 Address after: 211102, 999 Ting Dong Road, Jiangning economic and Technological Development Zone, Nanjing, Jiangsu Co-patentee after: FUZHOU University Patentee after: Zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co.,Ltd. Address before: Gushan Town Park in Jinan District of Fuzhou city in Fujian province village 110 350000 Co-patentee before: FUZHOU University Patentee before: Zhaofenghua Biotechnology (Fuzhou) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |