CN104031925A - 优化的猪圆环病毒orf2基因的nls序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列，所述NLS序列为SEQIDNO．1。所述优化的猪圆环病毒ORF2基因在大肠杆菌中表达。本发明采用以上技术方案，通过优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列，使优化后的猪圆环病毒ORF2基因能够在大肠杆菌中成功获得表达。

Description

优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型：PCV1与PCV2。PCV2含有两个主要开放阅读框ORF1和ORF2。其中ORF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。

PVC2的ORF2基因编码Cap蛋白，为病毒的外壳蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市场上已经有以Cap蛋白为主要成份的疫苗产品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆虫细胞表达系统生产。还未见微生物发酵生产的疫苗产品。

大肠杆菌是得到广泛应用的蛋白生产菌种。Cap蛋白在大肠杆菌中的表达已经有不少研究报道。比如，孙继国2009，查振林2005，周伦江2008，陈德坤2010，zhang Gaiping2012。但所有上述报道均未能表达ORF2的全长序列。目前认为，其原因是Cap蛋白在N端有一段NLS(nuclear localization signal，核定位信号，核定位信号是另一种形式的信号肽，可位于多肽序列的任何部分)序列，含有大肠的稀有密码子。

在研究人员的努力下，已有少数研究组成功的在大肠杆菌中成功的表达了ORF2基因。Celer2007报道，成功的在大肠杆菌的特殊菌种BL21-CODON-PLUS中表达了ORF2全长基因。其成功在于运用了特殊的菌种，这种菌种被插入了多个野生型大肠杆菌不具备的稀有密码子基因。另一个技术路径是通过改变原ORF2基因的密码子使用方法，得到优化的适于在大肠杆菌中表达的基因。Bumba2009首先报道了一个优化的序列（Genbank EU376523)，使得Cap蛋白在大肠杆菌BL21中获得了10mg/L的表达量。Huang2012等人又报道了一个优化的序列(Genbank AY885225)，同样获得了全长蛋白的成功表达。这两个序列是目前已知的仅有的两个优化的ORF2-NLS序列。

而从生产毒株获得的PCV2-ORF2基因的编码序列。克隆到大肠杆菌的表达质粒PET28a上。初步的实验证明克隆的全长ORF2基因不能在大肠中表达。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的为提供能够使全长ORF2基因在大肠杆菌中表达的优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列，所述NLS序列为SEQ ID NO.1。

所述优化的猪圆环病毒ORF2基因在大肠杆菌中表达。

本发明采用以上技术方案，通过优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列，使优化后的猪圆环病毒ORF2基因能够在大肠杆菌中成功获得表达。

附图说明

下面将结合附图说明和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

图1为本发明优化的猪圆环病毒ORF2基因的表达载体质粒PET28A-ORF2双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱（1.PET28A-ORF2经双酶切的电泳条带；2.PET28A-ORF2未酶切的电泳条带；3.100bp DNA Ladder Marker）；

图2为本发明优化的猪圆环病毒ORF2基因的表达菌株BL21/PET28a-ORF2诱导表达的重组蛋白的Western-blot分析结果（1.PET28A-ORF2诱导表达的重组蛋白；2.PET28A-ORF2未诱导）。

具体实施方式

本发明的优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列，所述NLS序列为SEQ ID NO.1。

为便于后续纯化，在本发明的猪圆环病毒ORF2基因的3’末端引入6×His标签后，再在其两端分别引入Nco1和Xho1的酶切位点送生物公司合成此序列。

所述优化的猪圆环病毒ORF2基因在大肠杆菌中表达。

为了验证含有本发明的优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列的ORF2基因能够在大肠杆菌中得到表达，本发明采用以下试验进行验证。

胶回收试剂盒、质粒回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司；Nco1、Xho1、T4DNA Ligase、DL2000核酸分子量标准物、低分子量蛋白标准物均购自TaKaRa公司。

主要溶液和试剂的配制：

1)碱裂解法制备质粒PET28a所用溶液：

溶液I：50mM glucose，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)。

溶液II：0.2M NaOH，1%SDS(m/v)(现配现用)。

溶液III：3M KAC60.0mL，冰醋酸11.5mL，H₂O定容至100mL。

2)0.1M CaCl₂：1.47g CaCl₂溶于100ml纯水中，灭菌，4℃保存备用。

1.质粒PET28a-ORF2的小量提取

1)取1.5mL菌液于离心管中，12000rpm离心2min，弃上清。

2)菌体沉淀重悬于100μL溶液Ⅰ中，室温下放置5-10min。

3)加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，混匀，冰浴5min，使细胞膜裂解。

4)加入150μL预冷的溶液Ⅲ，见白色絮状沉淀，于冰上放置5min。

5)12000rpm离心10min，上清液移入干净离心管中，加入等体积(450μL)的酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min。

6)小心移出上清(约400μL)于一新微量离心管中，加入2倍体积(800μL)预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，12000rpm离心10min。

7)弃上清，加入1mL70％乙醇洗沉淀一次，12000rpm离心5min。

8)吸除上清液，室温干燥，将沉淀即质粒pET28a-ORF2溶于20μL TE缓冲液中进行保存。

2.大肠杆菌感受态BL21细胞的制备及转化

1)挑取BL21单菌落于LB培养基中，37℃培养过夜。

2)第二天，按1:100转接到新的LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.3-0.5。

3)取1mL菌液，冰浴10min，12000rpm离心1min。

4)弃上清，加入1mL0.1M的CaCl2，混匀，冰浴30min。

5)12000rpm离心1min，弃上清，加入100μL0.1M的CaCl₂，混匀，即为大肠杆菌感受态BL21细胞。

6)适量DNA立即加入100μL制备好的大肠杆菌感受态BL21细胞中，冰浴30min。

7)42℃热击45s，冰浴2min，再加入500μL不含抗生素的LB培养基，37℃培养1h。

8)菌液涂布在含卡纳抗性的平板上，37℃培养过夜，次日检查和验证大肠杆菌感受态BL21细胞转化子。

3.表达菌株的构建

本发明的猪圆环病毒ORF2基因，经Nco1和Xho1双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳（条件为：1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min），然后进行切胶，并用胶回收试剂盒回收目的基因ORF2。

质粒pET28a经Nco1和Xho1双酶切，切胶回收约5300bp左右的质粒骨架。

用T4DNA连接酶将ORF2与质粒骨架连接起来，通过转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到成功转化的表达菌株BL21/PET28a-ORF2。提取表达菌株中质粒PET28A-ORF2经Nco1 和Xho1双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳（条件为：1%琼脂糖凝胶，电压电泳90v，电泳时间为25min）进行验证，由图1中可以看出质粒PET28A-ORF2双酶切后在大约720bp位置有目标条带，说明质粒PET28A已经成功连接上ORF2，并成功转入表达菌株BL21，送去invitrogen公司测序后，测序结果正确。

4.重组蛋白的表达

将大肠杆菌工程菌BL21/PET28A-ORF2诱导表达的重组蛋白，进行Western-blot分析，具体步骤如下，以1％的接种量转接表达菌株，培养至OD600约0.6时，加1mM ITPG诱导6h，将诱导后和作为对照未进行诱导的阳性菌分别离心重悬于ddH₂O，以2:1加上样处理缓冲液(2％SDS,0.1％溴酚蓝10％甘油)混匀后，沸水煮沸10min，离心去菌体，取上清液进行SDS-PAGE，采用120v电压，电泳时间为2h，割胶转印至硝酸纤维素膜后，加入5％脱脂牛奶10mL，于37℃封闭1h；加组氨酸标签一抗10mL(1:2500稀释)，于4℃孵育过夜(12h以上)；加山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)抗体10mL(1:2500稀释)37℃作用1h，在1mL二氨基联苯胺(DAB)缓冲液中显色。从图2可以看出阳性菌均没有条带，而PET28A-ORF2在28kD左右有明显蛋白条带，与预期重组蛋白大小一致，从而说明含有本发明的优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列的ORF2基因能够成功表达Cap蛋白。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大北农生物技术有限公司、福州大学

<120> 优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgccgcccct ggctcgtcca cccc 24

Claims (2)

1.优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列，其特征在于：所述NLS序列为SEQ ID NO．1。

2.根据权利要求1所述的优化的猪圆环病毒ORF2基因的NLS序列，其特征在于：所述优化的猪圆环病毒ORF2基因在大肠杆菌中表达。