CN102128925B - 一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法及试剂盒制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法及试剂盒，本发明马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法，是以辣根过氧化物酶标记的羊抗马二抗结合物、化学发光底物在获得诊断抗原和阳性对照血清的基础上建立的；本发明方法试剂用量少成本低、特异性高、灵敏度高操作更快捷且无毒无害，所需条件低、试验结果易判定和长期保存，特异性比ELISA更强，用本发明检测均未发现假阳性和假阴性的结果。

Description

一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法及试剂盒制备

技术领域

本发明涉及一种马泰勒氏虫病（马巴贝斯虫病）免疫印迹检测方法及试剂盒制备方法，特别涉及一种采用免疫印迹试验检测马泰勒氏虫病血清抗体的方法以及及其诊断试剂盒的制备方法，属于动物疫病检测领域。

背景技术

马泰勒氏虫病（Theileria equi or Babesia equi）是由寄生于马属动物的红细胞内的马泰勒氏虫所引起的血液原虫病，经硬蜱传播。感染后主要寄生在动物血液细胞中。临床表现为发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿、脾大等症状，发现时病马已死亡或濒死。

马泰勒氏虫病分布世界各地，它的流行直接与有传播能力的蜱的分布有关。南非的马泰勒氏虫病年发病率为1.88%，致死率均在10%以上，有时接近50%。在欧洲以及俄罗斯南部和东部大部分地区都有马泰勒氏虫的分布。非洲和马达加斯加都呈地方性流行，美洲、亚洲也都有病例报告。巴西马泰勒氏虫病血清学调查阳性率高达90.6%，苏丹马泰勒氏虫病血清学调查阳性动物高达63.5%，蒙古马泰勒氏虫血清学阳性动物达72.8%。我国马泰勒氏虫病主要流行于新疆、内蒙古西部及南方各省，吉林省、青海省也是马泰勒氏虫病流行地区，有的地区阳性感染率达到30%以上。据报道，在我国有14个省区都曾有该病散发或地方性流行，发病较重的省区，平均死亡率为11.9%。

马泰勒氏虫病带虫免疫可长达7年。疫区的马匹由于经常遭受蜱的叮咬，反复感染，因此一般不发病或只表现轻微症状而耐过，但由外地进入疫区的新马及新生的幼驹由于没有这种免疫性，容易发病。在没有疫情但有蜱类活动的地区，对外来马匹要严格进行马泰勒氏虫病的检疫，防止带虫马进入。

该病在世界范围内分布广泛，为严重传播性疾病，难以根除，因此各国均把该病列为重要监测的马病之一，由于该病对国际贸易产生重要影响，世界动物卫生组织（OIE）将该病列为对国际贸易产生重要影响的疾病。我国农业部将其列为二类动物传染病。在国际贸易中，大多数国家签署的双边检疫协定中，将该病列为法检项目。

    由于该病感染动物后，常不表现为明显的临床症状，因此很难从症状上诊断。该病主要是通过实验室检验方法进行确诊。实验室检验方法常采用血清学检测方法，主要有间接荧光抗体试验、补体结合试验和酶联免疫吸附试验。间接荧光抗体试验的缺点在于敏感性不强，且容易受操作者主观因素影响结果判断。补体结合试验的缺点是敏感性低，当血清中含有抗补体抗体或抗红细胞抗体时都不能通过补体结合试验检测，补体结合试验因不能检测IgG(T)亚型抗体，因此会出现假阴性结果。竞争酶联免疫吸附试验虽然操作简便，敏感性较强，比补体结合试验和免疫荧光抗体试验在敏感性上有提高，但仍然容易出现假阳性结果。探讨研究新的检测方法是科学技术发展的必由之路，也是疾病检测技术发展的要求。

    免疫印迹法是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术，但多用于鉴定某种蛋白。

1997年美国Patricia J.Holman对马泰勒氏虫补体结合试验阳性的血清用免疫印迹法进行确认（Patricia J.Holman,et al.Case report:Field-acquired subclinical babesia equi infection confirmed by in vitro culture.Journal of clinical microbiology,1997,35(2):474-476.）。Patricia J.Holman所采用的免疫印迹方法是用化学显色底物DAB染色，化学显色底物使用方便，但底物有毒、灵敏度较低。

目前国内，用免疫印迹法检测动物疫病的研究较少，国内无马泰勒氏虫病免疫印迹杂交检测方法及诊断试剂盒的研究报道。

发明内容

本发明人进行了大量的实验工作，终于建立了一种马泰勒氏虫病免疫印迹诊断试剂盒的制备方法，本发明采集健康小型马红细胞体外培养马泰勒氏虫，经过扩大培养，将获得的培养物制成免疫印迹诊断抗原，并经实验室感染马匹获得马泰勒氏虫抗体阳性对照血清。 同时，在获得诊断抗原和阳性对照血清的基础上建立了马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法。

本发明目的是提供一种马泰勒氏虫病免疫印迹诊断试剂盒及其制备方法，本发明目的通过以下技术方案实现：

（1）制备虫体培养用红细胞：

无菌采集健康马血，离心处理后用VYM’s缓冲液洗涤、悬浮得到；

离心条件：4℃-8℃ 低速  30±5 min；

（2）建立及扩大马泰勒氏虫体外培养：

无菌采集感染马泰勒氏虫病马的抗凝血，经离心处理，用3x VYM’s缓冲液洗涤、悬浮获得染虫红细胞后，采用HL2A-FBS组织培养液培养，当染虫率达到1.5%-2%时即进行分代培养；当分代培养物染虫率超过2%时进行第一次扩大培养；之后每当染虫率达到3%或以上时即再次扩大培养；

培养环境为90%N₂，5%O₂，5%CO₂；一个培养周期为24 小时； 

（3）制备马泰勒氏虫病免疫印迹杂交诊断抗原：

当步骤（2）培养物的染虫率超过5%时，收集培养物，经离心、洗涤，最后以PI buffer+1%NP40溶解至清亮，再加入 LDSsample buffer（4x） 、sample Reducing Agent（10x），充分混匀。煮沸，迅速冷却，获得马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原。

（4）制备阳性对照血清：

将25mL用等量10%常规异源马血清磷酸盐缓冲液混合的马泰勒氏虫红细胞培养物，静脉注射至脾未切除的小型马体内，3天后用大约10000个蜱（约0.5克）未饲喂的蜱幼虫，装在一个布袋中，放置在小型马上。13天后拿走已变成饱满的蛹的蜱，蜱养6天，第6天将蜱放到实验用小型马匹上8天，两个星期后采集血清，补体结合试验可检测到马泰勒氏虫抗体，即获得阳性对照血清。

   取（1）马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原、（2）辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗马结合物、（3）阳性对照血清、阴性对照血清、（4）底物（peroxide solution+Luminol enhancer solution）、（5）蛋白分子量标准标记物（Marker）、（6）4 -12 % Bis-Tris胶、（7）硝酸纤维膜、（8）MOPS  SDS Running Buffer(20x)、（9）NuPAGE Antioxidant、（10）转印缓冲液、（11）磷酸盐缓冲液（pH7.3）、（12）封闭液、（13）洗液、(14)感光胶片、(15)使用说明书

置纸质盒中，得到马泰勒氏虫病免疫印迹检测试剂盒。

本技术方案的优点和特点：

抗原制备用虫体的染虫率达到5%时即可用于制备免疫印迹诊断抗原，抗原制备周期短，大大缩短了生产试剂盒的周期。

本发明的另一个目的是提供一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法，本方法是以辣根过氧化物酶标记的羊抗马二抗结合物、化学发光底物在获得诊断抗原和阳性对照血清的基础上建立的。

本发明目的通过以下技术方案实现：

（1）取4 ～12 % Bis-Tris胶板，洗涤干净；

（2）以SDS Running Buffer和 NuPAGE Antioxidant为溶剂，采用电泳法分离抗原蛋白：得到含有抗原蛋白的胶板；

（3）用冷藏的转印缓冲液将抗原蛋白转移至纤维膜；

（4）血清与抗原孵育：

将转印有抗原蛋白的膜置于封闭液中在摇床上孵育；之后将膜取出再置于以封闭液按1:100～1:500稀释的血清样品中，振荡感作；

（5）酶结合物孵育：

将膜转置于以封闭液按1:5000～1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗马二抗结合物，振荡感作；

（6）底物孵育：将膜移置于底物中，避光感作；得含底物孵育物的膜；

（7）曝光，显影：

吸干膜上的水，用保鲜膜将膜包好，置暗夹中，红灯下，取感光胶片放在膜上，扣上暗夹，曝光；在红灯下取出胶片，放入显影机中显影；得显影感光胶片；

（8）结果判断：

当阳性血清对照在25kDa和37kDa间出现两条带，位置约在34kDa和28kDa处时，阳性对照成立；当阴性血清对照无条带出现时，阴性对照成立；这时可进行检测样品的判定：当在25kDa和37kDa间出现两条带，条带位置与阳性对照相同时，可判定为阳性样品；当在25kDa和37kDa间无条带出现时，可判定为阴性样品。

所述底物是peroxide solution+Luminol enhancer solution。

为了获得更好的效果，抗原蛋白工作浓度优选1:5000。

本技术方案的优点和特点是：

1、试剂用量少、成本低

本发明所用的二抗工作浓度为1:5000～1:10000，二抗的用量少，节省了试剂的消耗，节约了成本。

2、本发明方法特异性高、灵敏度高，操作更快捷

被检血清样品在1:500稀释时即有很好的免疫印迹反应，且无毒无害、特异性高；所需的时间短，整个试验在4 h内完成。

3、试验所需的条件低、试验结果易判定和长期保存.

本发明建立的免疫印迹试验在常温下即可完成。由于是将反应条带曝光于胶片上，结果易判定且可长期保存，不存在褪色的问题。

4、本发明方法不仅能够对马泰勒氏虫病血清抗体进行检测，更能够对其他血清学方法如IFA、CFT、ELISA检测为阳性的结果进行确证，特异性比ELISA更强。

5、用本发明检测方法检测马群血清，检测结果均未发现假阳性和假阴性的结果。

附图说明

免疫印迹法检测马泰勒氏虫病阴性和阳性结果。

M: 蛋白质分子量标准； 1.1:马泰勒氏虫病阴性对照血清；

1.2: 马泰勒氏虫病阴性对照血清；2.1: 马泰勒氏虫病阳性对照血清；

2.2:马泰勒氏虫病阳性对照血清。

具体实施方式

    为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但并不限制本发明。

实施例1：制备马泰勒氏虫病免疫印迹诊断试剂盒

配制试剂：

1、1x VYM’s 缓冲液：

CaCl₂.2H₂O    0.016 g

KCl          0.400 g

KH₂PO₄      1.415 g

MgSO₄.7H₂O   0.154 g

Na₂HPO₄      0.077 g

NaCl         7.077 g

Glucose       20.500 g

ddH₂O        1 L

搅拌溶解后，加入Adenine  0.0423 g 、Guanosine 0.0708 g，调pH值至7.0-7.2，真空抽滤（0.22 μm），4℃保存备用。

2、 HL2A-FBS 培养液：

HL-1 培养基              35 mL

      胎牛血清                  10 mL

      HB101 supplement           1 mL

Hepes                     0.238 g

      L-glutamine(100x)           1 mL

      Hypoxanthine(20mmol)       0.5 mL

      Gentamicin                 1 mL

      Antibiotic-antimycotic(100x)   1 mL

磁力搅拌5 min，调pH至7.2，真空抽滤（0.22 μm），4℃保存备用。

3、  PI buffer：

Tris        3.03 g

        去离子水    500mL

     磁力搅拌器搅拌1h，调pH 8.0，加

        EDTA（SIGMA）                  0.93g

         IODAOACETAMIDE(C₂H₄INO)(SIGMA)  0.46g

      磁力搅拌过夜，加

          TLCK（C₁₄H₂₂C_l2N₂O₃S）         18.45  mg

  制备诊断用抗原

（1）制备虫体培养用红细胞：

无菌采集600 mL健康马血至已灭菌的装有玻璃珠的真空三角瓶中，旋转三角瓶直至出现白色凝块。在超净台内，将马血倒入离心管中，4℃ 800 xg离心30 min，吸弃血浆层和白细胞层。用VYM’s缓冲液 洗三次，每次尽可能将血浆层和白细胞层吸弃。之后加入2倍体积的VYM’s缓冲液，用移液器轻轻悬浮红细胞泥，4℃ 800 xg离心30 min。吸弃血浆层和白细胞层后再加入2倍体积的VYM’s缓冲液至红细胞泥中，用移液器轻轻悬浮，得虫体培养用红细胞，置聚丙烯管中，4 ℃保存，备用。

（2）建立马泰勒氏虫体外培养：

采集感染马泰勒氏虫病马的抗凝血，4℃ 800 xg离心30 min，用移液器吸弃血浆层和白细胞层。用3xVYM’s缓冲液洗三次，每次尽可能吸弃上清液和白细胞层，最后4℃ 800 xg离心30 min，得染虫红细胞。

将1 mL HL2A-FBS 培养液加入至24孔细胞组织培养板内，吸取50μL染虫红细胞至细胞孔内，再吸取所得虫体培养用红细胞150 μL。将细胞组织培养板置37 ℃培养箱中培养；培养环境为：93%N₂，2.0%O₂，5%CO₂。

每天换1次培养液，方法是：不搅动细胞层吸弃约1mL培养液，再加入1mL 新的HL2A-FBS培养液。将板重新置前述培养箱中继续培养。

当染虫率达到1.5%-2%时，进行分代培养。方法是：将板取出，吸弃1mL 培养液，再加入1mL新的HL2A-FBS培养液，用移液器轻轻悬浮培养物，得第一代培养物。在新的细胞孔内加入600 μL HL2A-FBS培养液，并取600 μL第一代培养物至新的细胞孔内，轻轻混匀。另取600 μL HL2A-FBS 培养液加入至旧的细胞孔内。在新、旧细胞孔内各加入100 μL虫体培养用红细胞。将板置前述培养箱继续培养至染虫率超过2%。

（3）马泰勒氏虫体外扩大培养：

首先将虫体培养扩大至4个细胞孔。方法是：在组织细胞培养板中，向新的细胞孔中加入600 μLHL2A-FBS培养液，取100 μL虫体培养用红细胞至新的细胞孔中；从旧的细胞孔中吸弃约1.2 mL旧培养液，加入约1.2 mL新的培养液至旧的细胞孔内，并吸取600 μL培养物至新的细胞孔内。置前述培养箱中培养24小时。制备血涂片，进行染虫率检测。

当染虫率超过3%时向三角瓶中扩大培养，方法是：取灭菌的三角瓶A，向其中加入10 mL HL2A-FBS 培养液、1 mL虫体培养用红细胞及3个细胞孔的培养物后，置前述培养箱中培养24 小时；之后，将三角瓶A取出，从中吸弃7 mL-10 mL旧培养液，用新的HL-1组织培养液补足吸弃的量，继续置前述培养箱中培养24 小时。

当染虫率超过3%时，再次扩大培养，方法是：另取2个三角瓶，向其中各加入6 mL新的培养液及1 mL虫体培养用红细胞；吸弃三角瓶A中的培养液并加入等量的新培养液，轻轻混匀后，分别吸取7 mL至2个新的三角瓶中，将它们置前述培养箱中培养24 小时。按照此法，当染虫率超过3%时即扩大培养，从2个三角瓶至4个再至8个三角瓶。

当8个三角瓶中的染虫率超过5%时，染虫红细胞扩大培养完成。 

收集其中7个三角瓶中的培养物至2个50 mL离心管中,1500 rpm 4℃离心30 min；吸弃上清液，获得感染有马泰勒氏虫的红细胞。再置1.5mL离心管中，3000 rpm 4 ℃离心2 min；吸弃上清液，取750 μL细胞泥至新的离心管中，加入750 μL双蒸水，涡旋振荡轻轻混匀，台式离心机14000 rpm离心3 min。吸弃上清液，加入1.0 mL 磷酸盐缓冲液 (pH 7.3),用移液器吹吸

轻轻混匀，再14000 rpm离心3 min；吸弃上清液，加入1.0 mL双蒸水，仍用移液器吹吸轻轻混匀，再以14000 rpm离心5 min；吸弃上清液。加入磷酸盐缓冲液，混匀，14000 rpm离心10 min，重复1次。吸弃上清液，加入200 μL PI buffer+1%NP40，重新溶解至清亮。

取溶解物200 μL至1支新的离心管中，加入50 μL LDS sample buffer（4x） 、25 μLsample Reducing Agent（10x），充分混匀。煮沸10 分钟，迅速放入冰盒中冷却，即得诊断用抗原， -20℃保存，备用。

制备诊断用阳性对照血清

经带虫蜱Boophilus microplus实验室感染小型马获得阳性对照血清： 

将25mL用等量10%常规异源马血清磷酸盐缓冲液混合的马泰勒氏虫红细胞培养物，静脉注射至脾未切除的小型马体内，3天后用大约10000个蜱（约0.5克）未饲喂的蜱幼虫，装在一个布袋中，放置在小型马上。13天后拿走已变成饱满的蛹的蜱，蜱养6天，第6天将蜱放到实验用小型马匹上8天，两个星期后采集血清，补体结合试验可检测到马泰勒氏虫抗体，获得马泰勒氏虫病免疫印迹杂交诊断阳性对照血清。封装，-20℃保存，备用。

取（1）封装诊断用抗原、（2）辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗马结合物；（3）、封装阳性对照血清、阴性对照血清、（4）底物（peroxide solution+Luminol enhancer solution）、（5）蛋白分子量标准标记物（Marker）、（6）4 ～12 % Bis-Tris胶、（7）硝酸纤维膜、（8）MOPS  SDS Running Buffer(20x) 、（9）NuPAGE Antioxidant 、（10）转印缓冲液、（11）磷酸盐缓冲液（pH7.3）、（12）封闭液、（13）洗液、(14)感光胶片、（15）使用说明书置纸质盒中，冷藏保存。

实施例2：马泰勒氏虫病免疫印迹检测

试剂配制：

1、10x电泳缓冲液： 

Tris    121.1 g

              甘氨酸  570  g

              蒸馏水   4  L

2、转印缓冲液:

               10x电泳缓冲液   100 mL

               甲醇             200 mL

               蒸馏水           700 mL

3、封闭液：含0.2 % Tween-20、10 %脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液

4、洗液：含0.2 % Tween-20的磷酸盐缓冲液

取NuPAGE 4%-12% Bis-Tris 胶板，用1 x SDS Running Buffer洗胶孔三次；将胶板正面朝前放在Mini-Cell垂直电泳仪核心架内，锁紧。在电泳槽内加入200 mL 1 x SDS Running Buffer和500 μL NuPAGE Antioxidant ，混合均匀。下槽内加入600 mL 1 x SDS Running Buffer。向胶孔内加入7μL～10μL蛋白分子量标准标记物（Marker）和实施例1所得抗原样品，抗原蛋白的工作浓度是1:5000， 200V 350mA 跑胶1小时，得到含有抗原蛋白的胶板。

之后将抗原蛋白转移至硝酸纤维膜：

先将胶、硝酸纤维膜、转印夹、滤纸、纤维垫用转印缓冲液浸泡，然后在转印夹的黑面上，依次放上纤维垫、滤纸、胶块、纤维膜、滤纸、纤维垫，压走气泡，扣紧转印夹。将转印夹装在转印槽内，向槽内倒入先前置于冰箱中冷藏的转印缓冲液，将槽放于磁力搅拌器上，150 V 350 mA 转印1小时。

将转印有抗原蛋白的膜在磷酸盐缓冲液 (PBS,pH7.3)中冲洗，然后放在含有封闭液的容器中，置摇床上孵育1 小时。将膜取出剪成若干条，正面朝下，放在装有用封闭液按1:500稀释好的血清样品的容器中，在振荡器上振荡感作30分钟。结束后用洗液洗3次，每次5分钟。

倒掉洗液，然后加入用封闭液按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗马二抗结合物中，振荡感作30 分钟。用洗液洗3次，每次5分钟。

倒掉洗液，加入peroxide solution+Luminol enhancer solution底物，避光感作5 分钟。

用吸水纸吸干膜上的水，用保鲜膜将膜包好，将膜正面朝上摆好放在暗夹中置暗室中，红灯下，取1张感光胶片，放在膜上，扣上暗夹，曝光30s-60秒。

在红灯下取出胶片，放入显影机中显影。得显影感光胶片。

应用例   结果判定

取实施例2所得显影感光胶片，显示阳性血清对照在25kDa和37kDa间出现两条带，位置约在34kDa和28kDa处，与阳性对照相同，判定为阳性样品。

Claims (1)

1.一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测试剂盒，包括马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原，辣根过氧化物酶标记的羊抗马结合物，阳性对照血清、阴性对照血清，底物peroxide solution+Luminol enhancer solution，蛋白分子量标准标记物，4 ～12 % Bis-Tris胶，硝酸纤维膜，MOPS  SDS Running Buffer，NuPAGE Antioxidant，转印缓冲液，磷酸盐缓冲液， 封闭液，洗液，感光胶片；其特征在于马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原通过下述方法制备：

（1）制备虫体培养用红细胞：

将健康马血，离心处理后用VYM’s缓冲液洗涤、悬浮得到；

（2）建立及扩大马泰勒氏虫体外培养：

将感染马泰勒氏虫病马的抗凝血，经离心处理，用3x VYM’s缓冲液洗涤、悬浮获得染虫红细胞后，采用HL2A-FBS组织培养液培养，当染虫率达到1.5%-2%时即进行分代培养；当分代培养物染虫率超过2%时进行第一次扩大培养；之后每当染虫率达到3%或以上时即再次扩大培养；扩大培养环境为90%N₂，5%O₂，5%CO₂；一个扩大培养周期为24 小时；

（3）制备马泰勒氏虫病免疫印迹杂交诊断抗原：

当步骤（2）培养物的染虫率超过5%时，收集培养物，经离心、洗涤，最后以PI buffer+1%NP40溶解至清亮，再加入 4x LDS samplebuffer 、10x sample Reducing Agent，充分混匀，煮沸，迅速冷却，即得马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原。

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