KR20160086965A - 노화 관련 질환들의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

노화 관련 질환들, 예를 들면 인지 장애 질환들을 위한 대상의 치료를 위한 방법들과 조성물들이 제공된다. 방법들의 양상들은 젊은 혈장 함유 혈액 제제를 그것이 필요한 개인, 예를 들면 노화 관련 질환, 예를 들면 노화 관련 인지 장애의 발생으로부터 고통을 받거나 또는 발생의 위험이 있는 개인에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법들의 실행에서 사용하는 조성물들 및 그 키트들이 제공된다.

Description

노화 관련 질환들의 치료를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING AGING-ASSOCIATED CONDITIONS}

관련 특허들의 교차 참조

35 U.S.C. §119(e)에 의거하여, 본 출원서는 2014년 10월 27일에 출원된, 미국가특허출원 제 62/069,044호, 및 2013년 12월 9일에 출원된, 미국가특허출원 제 61/913,812호의 출원 날짜의 우선권을 주장하며, 이들은 참조로써 여기에 통합된다.

생물체의 노화는 시간에 따른 변화들의 축적을 수반한다. 신경계에서, 노화는 건강한 개인들에서의 인지 감퇴 및 퇴행성 질환들에 대한 민감성을 유도하는 구조적 및 신경생리학적 변화들을 수반한다((Heeden, T. & Gabrieli, J.D., Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 5(2), 87-96 (2004); Raz, N. 등. Neuroanatomical correlates of cognitive aging: evidence from structural magnetic resonance imaging. Neuropsychology 12(1), 95-114 (1998); Mattson, M.P. & Magnus, T., Ageing and neuronal vulnerability. Nat. Rev. Neurosci. 7(4), 278-294 (2006); Rapp, P.R. & Heindel, W.C., Memory systems in normal and pathological aging. Curr. Opin. Neurol. 7(4), 294-298 (1994)). 이러한 변화들에 시냅스 손실 및 발생하는 신경 기능의 손실이 포함된다. 따라서, 비록 상당한 신경세포 사멸이 일반적으로 자연적 노화 과정 동안에 발견되지 않더라도, 노화하는 뇌 내의 신경세포들은 치사에 가까운(sub-lethal) 노화 관련 구조적 변경들, 시냅스 보전(synaptic integrity) 및 시냅스에서의 분자적 처리에 취약하며, 이들 모두는 인지 기능을 손상시킨다.

자연적 노화 동안의 정상 시냅스 손실에 더하여, 시냅스 손실은 많은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative condition)에 공통인 조기 병리학적 이벤트이며, 이러한 질환들과 관련된 신경 및 인지 장애와 가장 잘 관련된다. 대신에, 노화는 알츠하이머병(AD)과 같은 치매 관련 신경퇴행성 질환들에 대한 단일의 가장 우점하는 위험 인자로 남아있다(Bishop, N.A., Lu, T., & Yankner, B.A., Neural mechanisms of ageing and cognitive decline. Nature 464(7288), 529-535 (2010); Heeden, T. & Gabrieli, J.D., Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 5(2), 87-96 (2004); Mattson, M.P. & Magnus, T., Ageing and neuronal vulnerability. Nat. Rev. Neurosci. 7(4), 278-294 (2006)).

인간 수명이 증가함에 따라, 더 많은 인구가 노화 관련 인지 손상으로부터 고통을 겪으며, 노화의 영향들로부터 보호하거나 또는 심지어 대항함으로부터 인지 보전을 유지하기 위한 수단을 밝히는 것이 매우 중요하다(Hebert, L.E. 등. Alzheimer disease in the US population: prevalence estimates using the 2000 census. Arch. Neurol. 60(8), 1119-1122 (2003); Bishop, N.A., 등., Neural mechanisms of ageing and cognitive decline. Nature 464(7288), 529-535 (2010)).

노화 관련 질환들, 예를 들면 인지 손상 질환들 또는 노화 관련 치매를 위한 대상의 치료를 위한 방법들 및 조성물들이 제공된다. 방법들의 양상들은 젊은(young) 혈장 함유 혈액 제제를 그것이 필요한 개인, 예를 들면 노화 관련 질환, 예를 들면 노화 관련 인지 손상 또는 노화 관련 치매의 발생 위험으로부터 고통을 받는 개인에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법들의 실행에 사용하는 조성물들 및 그것의 키트들이 제공된다.

본 발명은 노화 관련 질환들의 치료를 위한 효과적인 방법 및 조성물을 게공한다.

도 1. 이시성 부생체(heterochronic parabiont)들의 전체 유전자(genome-wide) 마이크로어레이 분석은 노령 해마(old hippocampus) 내의 가소성 관련 발현 프로파일을 식별한다. 수술 4주 후에 노령(18개월령) 등시성(isochronic) 및 이시성 부생체들의 해마에 대한 마이크로어레이 분석이 실행되었다. 그룹 당 n=4 마우스. 모든 분석을 위하여 하향 조절된 유전자들은 청색으로 도시되고 상향 조절된 유전자들은 황색으로 도시된다. a, 병체결합(parabiosis) 쌍들을 도시한 개략도. 등시성 쌍들은 회색으로 도시되었고 이시성 쌍들은 적색으로 도시되었다. b. 마이크로어레이의 유의성 분석(SAM)을 기초로 하여 p＜0.01 및 d-스코어＞1.5에서 컷-오프를 사용하여 노령 등시성 및 이시성 부생체들의 해마 사이에서 다르게 발현되는 유전자들의 데이터 세트로의 무감독 계층 클러스터링(unsupervised hierarchical clustering)에 의한 히트 맵이 발생되었다. c. SAM을 기초로 하여 p＜0.01 및 d-스코어＞1.5에서 컷-오프를 사용하여 AmiGO(Gene Ontology)에 의해 확인된 유전자들과 관련된 시냅스 가소성의 계층 클러스터링. b 및 c에서의 색 바(color bar)들은 Z-스코어들을 반영한다. d.시냅스 가소성에 관련된 생물학적 경로는 등시성 및 이시성 부생체 내에서 다르게 발현되는 유전자들을 기초로 하는 창의 경로 분석(ingenuity pathway analysis, IPA) 소프트웨어를 사용하여 최상 시그널링 네트워크의 일부분으로서 확인되었다. IPA에 의해 식별된 추론된 분자 상호작용들이 회색으로 도시된다.
도 2. 이시성 병체결합은 노령 뇌 내의 시냅스 형성 및 시냅스 가소성을 향상시킨다. a-g, 수술 5주 후 분석된 노령(18개월령) 등시성 및 이시성 부생체들에 대한 조직학 및 전기생리학적 분석이 수행되었다. 그룹 당 n=5-6 마우스. a, 노령 등시성 및 이시성 부생체들의 해마의 치상회(dentate gyrus, DG) 내의 Egr1, cFos, 및 인산화 사이클릭 AMP 반응 성분 결합(CREB) 단백질의 면역조직화학적 검출. 화살표들은 개별 세포들을 도시한다. (스케일 바: 100㎛). b-d, Egr1(b), c-Fos(c) 및 인산화 CREB(d)의 면역염색의 정량화. 마우스 당 5 신경세포가 분석되었다. e, f, 대표적 골지 염색 이미지(e) 및 3차 분지들 상의 수상 돌기(dendritic spine) 밀도의 정량화(f). 마우스 당 5 신경세포가 분석되었다. g, 노령 부생체들의 치상회로부터 군집 전위 진폭(population spike amplitude, PSA)이 기록되었다. 등시성 및 이시성 부생체들에 대한 대표적 장기간 강화(long term potentiation, LTP) 레벨들이 도시된다. 데이터는 평균±SEM; ^* P＜0.05, ^** P＜0.01; t-검정(b-d)으로서 표현되었다.
도 3. 젊은 혈액 투여는 노령 마우스들에서의 해마 의존적 학습 및 기억을 향상시킨다. a-c. 노령(18개월령) 마우스들이 24일에 걸쳐 8회 젊거나(3개월령) 또는 노령(18개월령) 혈장으로의 처리 이후에 인지적으로 조사되었다(100㎕/정맥내 투여). 그룹 당 n=8 마우스. a, 혈장 처리 및 인지 검사를 위하여 사용된 연대순을 도시한 개략도. b, c, 해마 학습 및 기억이 혈장 처리를 따른 전후 관계상 두려움 조절(contextual fear conditioning)(b) 및 방사상 암 수중 미로(radial arm water maze, RAWM)(c)에 의해 평가되었다. b, 훈련 24시간 이후의 퍼센트 비율 프리징 시간. c, 플랫폼의 발견 이전의 엔트리 암 오차들의 수. 데이터는 평균±SEM; P＜0.05, ^** P＜0.01; t-검정(b), ANOVA, 본페로니 사후 검정(Bonferroni post hoc test)(c)에 의해 나타내었다.
도 4. 등시성 병체결합은 시냅스 가소성 마커들의 발현을 변경하지 않는다. 노령(18개월령) 등시성 부생체들 및 쌍이 없는 연령 일치 대조군들의 해마의 치상회 상에서 시냅스 가소성 마커들의 조직학적 분석이 수행되었다. 그룹 당 n=5-6 마우스. a-c, Egr1(b), c-Fos(c) 및 인산화 CREB(d)에 대한 면역염색의 정량화. 마우스 당 5개의 섹션이 분석되었다. 바(bar)들은 평균+SEM; n.s., 유의하지 않음; t-검정이다.
도 5. 이시성 부생체는 시냅스 가소성 마커들의 발현을 변경하지 않는다. a-c, 총 25 신경세포를 위하여 마우스(18개월령) 당 5 신경세포에에 대한 Neurolucida 소프트웨어(v10, MBF Bioscence)를 사용하여 골지 분석이 수행되었다. 그룹 당 n=5. a, 세포체(soma)로부터의 거리에 대하여 신경세포 당 쉘(shell) 당 평균 교차들로서 숄 분석(Sholl analysis)이 그래프화되었다. b, c, 1차, 2차 및 3차 수상 돌기 분지(dendritic branch)들의 평균 수(b) 및 총 수상 돌기 길이(c)를 정량화하기 위하여 신경세포 추적이 사용되었다. d, 입력-출력 곡선들은 노령 등시성 및 이시성 부생체들 사이의 시냅스 강도, 기초 시냅스 전달의 주요 파라미터들의 어떠한 통계학적 차이도 나타내지 않는다. 바들은 평균+SEM; n.s., 유의하지 않음; t-검정이다.
도 6. 해마 의존적 학습 및 기억은 노령 마우스들에서 손상된다. a-e, 전후 관계상 두려움 조절(a-c) 및 RAWM(d-e) 패러다임들을 사용하여 젊은(3개월령) 성인 동물들 대 노령(18개월령) 성인 동물들에서의 정상 노화 동안의 학습 및 기억이 조사되었다. a, 젊은 동물들 및 노령 동물들은 두려움 조절 훈련 동안에 유사한 기준선 프리징 시간(baseline freezing time)을 나타내었다. b, 전후 관계상 두려움 조절 동안에 노령 마우스들은 전후 관계상 기억 검사 동안에 감소된 프리징 시간을 나타낸다. c, 훈련 24시간 이후에 신호 기억에서의 어떠한 차이도 검출되지 않았다. e, 노령 마우스들은 RAWM 작업의 검사 기간 동안에 플랫폼 위치에 대한 손상된 학습 및 기억을 나타낸다. 인지 결손들은 표적 플랫폼의 발견 이전에 만들어진 엔트리 암 오류들의 수로서 정량화되었다. 졺은 동물들 및 노령 동물들 사이에 수영 속도들의 어떠한 차이도 검출되지 않았다. 데이터는 그룹 당 8 동물로부터 존재한다. 바들은 평균+SEM; n.s., 유의하지 않음; t-검정이다.
도 7. 젊은 혈액으로의 노출은 신호 기억 또는 수영 속도에 영향을 미치지 않는다. a-c, 노령 성인 수컷 마우스들(18개월령)에 젊은(3개월령) 또는 노령(18개월령) 동물들로부터 유도된 혈장이 24일에 걸쳐 8회 정맥내로 주입되었다(100㎕/주입). a, 젊거나 또는 노령 혈장으로 정맥내로 주입된 동물들은 훈련 동안에 유사한 기준선 프리징 시간을 나타내었다. b, 훈련 24시간 후에 새로운 전후 관계에서 조건부 자극(톤 및 광)에 재노출될 때 그룹들 사이에 신호 기억에서의 어떠한 차이도 검출되지 않았다. c, RAWM의 훈련 기간 동안에 노령 및 젊은 혈장 처리된 마우스들의 수영 속도들. 데이터는 그룹 당 8 동물로부터 존재한다. 바(bar)들은 평균 + SEM; n.s., 유의하지 않음; t-검정이다.
도 8. 해마 의존적 학습 및 기억은 노령 혈액의 노출의 의해 변경되지 않는다. a-e, 학습 및 기억이 두려움 조절 및 RAWM 패러다임들을 사용하여 미처리 노령 성인 마우스들(18개월령)에서 조사되었고 노령(18개월령) 동물들로부터 유도된 혈장이 24일에 걸쳐 8회 정맥내로 주입된(100㎕/주입) 노령 동물들과 비교하였다. 그룹 당 n=8. 두려움 조절 훈련 동안에 기준선 프리징에서의 어떠한 차이도 검출되지 않았고(a), 전후 관계(b) 또는 신호(cued)(c) 두려움 조절 검사 동안에 프리징에서의 어떠한 차이도 검출되지 않았다. d, RAWM 패러다임에서 공간 학습 및 기억에서의 어떠한 차이도 검출되지 않았다. e, 노령 혈장을 받은 동물들 및 미처리 대조군들 사이에 수영 속도들의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 바들은 평균 + SEM; n.s., 유의하지 않음; t-검정이다.
도 9. 젊은 혈장의 변성은 노령 마우스들 내의 혈장 처리의 양성 인지 효과들을 폐지한다. a. 훈련 환경과 동일한 전후 관계로의 노출의 1분 동안에 인산 완충 용액(PBS), 젊은 혈장 또는 젊은 변성 혈장으로 처리된 노령 마우스들에서 관찰된 퍼센트 비율 프리징(n=10-12/그룹). b. 마우스들이 새로운 전후 관계에 노출되나 훈련으로부터 톤 및 광 신호가 주어지는 신호 작업(cued task) 동안에 PBS, 젊은 혈장 또는 젊은 변성 혈장으로 처리된 노령 마우스들에서 관찰된 퍼센트 비율 프리징(n=10-12/그룹). 바들은 평균+/-SEM을 나타낸다. 그룹들은 일원 ANOVA에 의해 비교되었고 그 뒤에 다중 비교를 위하여 터키 사후 검정이 뒤따랐다(^* P＜0.05).
도 10. 젊은 혈액의 세 가지의 매주 투여는 노령 마우스들 내의 해마 의존적 학습과 기억 및 신경발생을 향상시킨다. a, 혈장 처리, 인지 검사 및 조직학적 분석를 위하여 사용된 연대순을 도시한 개략도. 일주일에 1회(0일, 7일, 14일) 세 가지 150㎕ 주입이 정맥 내로 주어졌다. 제 3 주입 이후에, 3-일 방사상 암 수중 미로(RAWM) 작업이 실행되었는데, 하나의 그룹(혼합 처리)은 21일째에 시작하였고, 또 다른 그룹은 24일째에 시작하였다. 30일째(훈련) 및 31일째(검사)에 두려움 조절 검사(FC)가 실행되었다. 모든 마우스는 그 이후에 신경발생이 평가된, 희생 3일 전에 매일 BrdU(50㎎/㎏) 복강내 주입되었다. b, 훈련일(1일째) 및 검사일(2일 및 3일째) 상의 플랫폼 발견 이전의 엔트리 암(entry arm) 오류들의 수. 혈장 처리된 그룹은 PBS 처리된 그룹보다 2일 및 3일째에 일정하게 더 낫게 수행하였다. 하나의 블록은 3회 시도를 나타낸다. c, 1일째, 블록 1 대 3일째, 블록 15에서 만들어진 오류들을 수를 나타내는 RAWM에서의 학습의 정량화. 젊은 혈장 처리된 그룹은 블록 15 대 블록 1에서 상당히 더 적은 오류들을 만들었다. d, 전후 관계상 두려움 조절 검사에서의 정규화된 프리징 행동은 작업에 대한 향상된 기억과 일치하는, PBS 처리된 그룹과 비교하여 젊은 혈장 처리된 그룹에서 상당히 더 많은 프리징을 나타낸다. e, 젊은 혈장으로 처리된 마우스들은 PBS 처리된 그룹과 비교하여 해마의 치상회(DG) 내의 상당히 많은 수의 BrdU 양성 세포들을 나타낸다. 데이터는 평균±SEM; ^* P＜0.05, ^** P＜0.01; ANOVA, 본페로니 사후 검정(Bonferroni post hoc test)(b); t-검정(c-e)으로서 나타내었다.
도 11. (a) 마우스들 사이의 병체결합의 이러한 차이 형태들을 도시한 개략도: 야생형 등시성(WT iso), APP 등시성(APP iso) 및 APP 이시성(APP het). 등시성 쌍들은 나이가 일치하고 젊은(2-3개월령) 야생형 마우스에 연결되는, 이시성 쌍으로부터의 APP 마우스들과 동일한 연령이다. 하나의 코허트는(cohort) 노령(16-20개월) 수컷 마우스들 및 또 다른 중간 연령의(10-12개월) 암컷 마우스들로 구성되었다. 모든 쌍은 5주 동안 수술로 연결되었다. (b) 노령 APP iso(n=6) 및 APP het(n=4) 마우스들의 해마 내의 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)들(3D6 염색)의 면역조직화학 검출의 정량화. (c) 수컷 APP iso(n=6) 및 APP het(n=4) 마우스들의 해마 내의 불용성 총 Aβ 및 Aβ42 레벨들의 ELISA 측정들. (d-e) 노령 수컷 부생체들의 치상회의 분자 층 내의 시냅토파이신(synaptophysin) 면역활성(d) 및 캘빈딘(calvindin) 면역활성(e)의 정량화; WT iso(n=6), APP iso(n=6), APP het(n=4). (f) 중간 연령의 암컷 부생체들의 치상회의 분자 층 내의 캘빈딘 면역활성의 정량화; WT iso(n=9), APP iso(n=11), APP het(n=9). 모든 데이터는 평균±s.e.m. ^* P＜0.05, ^** P＜0.01, ^*** P＜0.001, 스튜던트 t 검정(b), 이원 ANOVA, 시닥(Sidak's) 사후 검정(c), 일원 ANOVA, 터키 사후 검정(d-f)으로서 도시된다.
도 12. 젊은 혈장의 투여는 시냅스 활성 및 칼슘 관련 단백질들을 회복시키고 hAPP^L/S 마우스들의 인지를 향상시킨다. (a) 4개 처리 그룹, 야생형(WT) 혹은 PBS 또는 젊은 혈장으로 처리된 hAPP^L/S 마우스들(정맥내 꼬리 정맥 주입 당 150㎕, 30일에 걸쳐 8회). (b) WT pbs(n=14), 야생형 혈정(WT plm)(n=13), APP pbs(n=11) 및 APP plm(n=12) 마우스들의 치상회의 분자 층 내의 시냅토파이신 면역활성의 정량화, (c) WT pbs(n=15), WT plm(n=13), APP pbs(n=10) 및 APP plm(n=12) 마우스들의 치상회의 분자 층 내의 캘빈딘 면역활성의 정량화, (d-e) 웨스턴 블롯(Western blot)이 모든 4개 처리 그룹으로부터의 해마 용해물(lysate)들 상에서 실행되었다, n = 그룹 당 8. (d) ERK(44/42kDa), 인산화 ERK(44/42kDa; pERK), 및 로딩 대조군으로서 신경세포 특이 에놀라아제(neuron specific enolase, NSE)를 위한 대표적인 웨스턴 블롯. (e) pERK/ERK의 비율의 정량화는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 대역들의 농도계측에 의해 결정되었다. (f-g) APP 마우스들의 인지 검사는 PBS(n=11) 또는 젊은 혈장(n=13)의 8회 정맥내 주입으로 주입되었다. (f) 작업 기억은 5분 동안 Y-미로 검사에서의 자발적 변경에 의해 평가되었다. (g) 해마 의존적 학습 및 기억은 훈련 48시간 후에 동일한 전후 관계에서의 퍼센트 비율 프리징에 의해 표시되는 전후 관계상 두려움 조절에 의해 평가되었다. 하나의 마우스가 이상점(outlier)들을 식별하는 ROUT 방법에 의해 결정되는, 비정상적 프리징 행동에 기인하여 APP pbs 그룹으로부터 배제되었다. 모든 데이터는 평균 + s.e.m. # ^* P＜0.05, ^** P＜0.01, ^*** P＜0.001, ^**** P＜0.0001, 일원 ANOVA, 터키 사후 검정(b-c, e), 스튜던트 t 검정(f-g)로서 도시된다.
도 13. 18개월령 마우스들(N=4-5/그룹)이 2-3개월령 C57BI/6J 마우스들로부터 분리된 분획된 혈장으로 2주에 걸쳐 7회 정맥내로 주입되었다. 젊은 혈장의 하나의 풀(pool)이 표시된 분자량(즉, 3.5 kDa, 25 kDa, 50 kDa, 및 3.5 kDa + IgG의 결손) 아래의 분자들을 배제한, 분자량 컷-오프 투석 멤브레인을 사용하여 분획되었다. 처리된 마우스들로부터의 해마는 분리되었고 유전자 발현을 위한 전체 유전자 아피매트릭스(Affymetrix) 어레이들 상에서 분석되었다. 히트 맵은 증가되거나(적색) 또는 감소된(청색) 전체 유전자 발현과 관련한 처리에 의한 거의 완전한 분리를 나타낸다.
도 14. 12개월령 마우스들이 4주 동안에 1주일에 2회 150㎕ PBS 또는 2개월령 마우스들로부터의 150㎕ 혈장(PLM)으로 정맥내로 주입되었다. 혈장 인자들은 단백질 마이크로 어레이(a) 또는 Liminex 사이토카인 분석법(b-c)으로 분석되었다. a) 젊은 혈액 혈장의 투여 상에서 12개월령 마우스들 내의 유의하게 증가되거나 또는 감소된 6개의 혈장 인자를 나타내는 히트 맵. 무감독 계층 클러스터링은 PBS 샘플들로부터 혈장 샘플들을 분리한다. b-c) 인터류킨(interleukin) 22(IL-22) 및 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor, LIF)는 PBS와 비교하여 젊은 혈액 혈장의 투여 4주 후에 12개월령 마우스들에서 증가되었다.
도15. 비비만성 당뇨병(NOD)/중증 복합형 면역 결핍(SCID)(NOD SCID 감마, NSG) 마우스들은 (a) 이중코르틴(doublecortin) + 치상회 내의 세포들, (b) 총 해마 영역의 퍼센트 비율로서의 CD68 염색, 및 (c) 치상회 내의 cfos 양성 세포들의 총 수의 노화 의존적 변화들을 나타낸다. (평균+/-SEM; 스튜던트 t 검정 및; ^* P＜0.05, ^** P＜0.01, ^*** P＜0.001.)
도 16. (a) 노화된 NSG 마우스들에서의 프리징의 레벨들은 이전에 두려움과 관련시키도록 훈련된 챔버에 노출될 때 마지막 90초 내에서 젊은 NSG 마우스들에서보다 상당히 낮다. (b) (a)로부터의 젊은 그리고 노령 NSG 마우스들에서의 전후 관계상 두려움 조절의 초기 간격들 내의 프리징 레벨들의 정량화, (c) 노화된 NSG 마우스들은 탈출 홀(escape hole)의 발견에 있어서 수일에 걸쳐 그리고 반즈 미로(Barnes maze) 동안에 동일한 날의 시도들 내에서 결손들을 나타낸다. 노화된 NSG 마우스들은 또한 매일의 전체 실행도(daily overall performance)에 대하여 젊은 NSG 마우스들과 비교하여 결손들을 나타낸다. (e) 학습의 비율, 초기 훈련 시도로부터 개별 프로브 시도들의 차이는 젊은 NSG 마우스들에서 상당히 높다. (평균+/-SEM; 2-그룹 비교를 위한 스튜던트 t 검정 및; 적절하면, 이원 반복되는 측정 ANOVA, 그 뒤에 다중 비교의 보정을 위한 본페로니 사후 검정; ^* P＜0.05, ^** P＜0.01, ^*** P＜0.001.)
도 17. 인간 제대혈 기증자들(n=15), 젊은 기증자들(n=19), 또는 노령 기증자들(n=16)로부터 얻은 혈장 샘플들 중에서의 연령 그룹에 의한 단백질 발현에 대하여 고도의 클러스터링을 설명하는 히트 맵. 블록들은 모든 연령 그룹 중에서의 그러한 단백질에 대한 발현의 레벨들에 대하여 강화되거나(황색) 또는 감소된(청색) 개별 분비된 시그널링 단백질들을 나타낸다. 도시된 단백질들은 시간 상관 SAM 이후에 유의한 단백질들이다(q＜5%).
도 18, 노화된 NSG 마우스들 내로 젊거나 또는 노령 기증자들로부터의 인간 혈장(hPLM)의 주입들은 비히클(vehicle) 처리된 NSG 마우스들과 비교하여 해마(왼쪽) 또는 피질(오른쪽) 내의 CD68 염색에 의해 차지하는 퍼센트 영역의 변화들을 나타내었다. (평균+/-SEM; 스튜던트 t 검정; ^* P＜0.05, ^** P＜0.01)
도 19. 전후 관계상 두려움 조절 작업(2일째)에서의 프리징의 레벨들의 훈련 동안에 관찰된 프리징(1일째)로의 정상화 이후에, 젊은 인간 혈장(hPLM)은 노령 인간 혈장으로 처리된 노화된 NSG 마우스들과 비교하여 4.5분에서 전후 관계상 기억이 증가하였다. (평균+/-SEM; 표시된 간격에서 스튜던트 t 검정; ^* P＜0.05.)
도 20. 비히클 처리된 마우스들과 비교하여 인간 제대혈 또는 젊은 혈장으로 처리된 노화된 마우스들 내의 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)에 의한 유전자 발현 레벨들. 전초기 유전자 발현(Egr1, Junb, fos)의 변화들이 3주에 걸쳐 인간 혈장 또는 비히클로 정맥내로 처리된 노화된 NSG 마우스들로부터 분리된 뇌들 내에서 평가되었다. (평균+/-SEM; 스튜던트 t 검정; ^* P＜0.05.)
도 21. 부가적인 가소성 관련 우전자들(BDNF 및 Camk2a)이 인간 제대혈 혈장 또는 비히클로 처리된 노화된 NSG 마우스들 내의 qPCR에 의해 측정되었다. (평균+/-SEM; 스튜던트 t 검정; ^* P＜0.05.)
도 22. (a) 이전에 두려움과 관련시키도록 훈련된 챔버에 노출될 때 마지막 90초 내의 제대혈 혈장 또는 비히클로 처리된 노화된 NSG 마우스들에서의 프리징의 레벨들의 정량화. (b) 제대혈 혈장으로 처리된 노화된 NSG 마우스들은 탈출 홀의 발견에 있어서 4일째에 그리고 반즈 미로 동안에 동일한 날의 시도들 내에서 향상된 학습 및 기억을 나타낸다. (c) 제대혈 혈장 처리된 마우스들은 또한 매일의 전체 실행도와 관련하여 비히클 처리된 NSG 마우스들과 비교하여 향상된 학습 및 기억을 나타낸다. (d) 학습의 비율, 초기 훈련 시도로부터의 프로브 시도들의 차이는 제 3 프로브 시도에 대하여 비히클 처리된 마우스들과 비교하여 제대혈 혈장 처리된 마우스들에서 상당히 높았다. (평균+/-SEM; 2-그룹 비교를 위한 스튜던트 t 검정 및; 적절하면, 이원 반복되는 측정 ANOVA, 그 뒤에 다중 비교의 보정을 위한 본페로니 사후 검정(Bonferroni post hoc test); ^* P＜0.05, ^** P＜0.01, ^*** P＜0.001.)
도 23. (a) 제대혈 혈장 처리된 마우스들의 뇌들로부터 얻은 조각들은 해마의 관통 경로 내의 자극 이후에 치상회 내의 군집 전위 진폭들을 측정함으로써 평가되는 것과 같은 향상된 장기간 강화(LTP)를 나타낸다. (b) (a)에 도시된 PSA의 유지 기간의 정량화.(평균+/-SEM; 스튜던트 t 검정; ^* P＜0.05.)
도 24. (a) 비히클, 노령 인간 혈장(hPLM), 또는 제대혈 인간 혈장으로 처리된 TRAP-FOS 마우스들에 대하여 치상화(DG) 내의 cfos로부터 효과기 단백질 발현을 구동하는 TRAP된 세포들의 수의 정량화. (b) 비히클, 노령 인간 혈장(hPLM), 또는 제대혈 인간 혈장으로 처리된 TRAP-FOS 마우스들에 대하여 치상화(DG) 내의 cfos로부터 효과기 단백질 발현을 구동하는 TRAP된 NeuN 양성(신경세포) 세포들의 수의 정량화. (c) 비히클, 노령 인간 혈장, 또는 제대혈 인간 혈장으로 처리된 TRAP-FOS 마우스들에 대하여 CA1 영역 내의 cfos로부터 효과기 단백질 발현을 구동하는 TRAP된 세포들의 수의 정량화. (d) 비히클, 노령 인간 혈장(hPLM), 또는 제대혈 인간 혈장으로 처리된 TRAP-FOS 마우스들에 대하여 CA1 영역 내의 cfos로부터 효과기 단백질 발현을 구동하는 TRAP된 NeuN 양성 세포들의 수의 정량화. (평균±SEM; 일원 ANOVA; 그 뒤에 다중 비교를 위한 터키 사후 검정(Tukey's post-hoc test); ^* P＜0.05.)

노화 관련 질환들, 예를 들면 인지 장애 질환들, 노화 관련 치매 또는 말초 기관(들)의 노화 관련 생리학적 기능의 쇠퇴에 대한 대상의 치료를 위한 방법들 및 조성물들이 제공된다. 방법들의 양상들은 젊은 혈장 함유 혈액 제제를 그것이 필요한, 예를 들면 노화 관련 질환들, 예를 들면, 노화 관련 인지 장애 또는 치매의 병리학적 유형의 발생으로부터 고통을 받거나 또는 발생 위험이 있는 개인에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법들을 실행에 사용하는 조성물들 및 그것의 키트들이 제공된다.

본 발명의 방법들 및 조성물들이 설명되기 전에, 본 발명은 물론 변경될 수 있는 것과 같이, 설명되는 특정 방법 또는 조성물에 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 여기서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 예들의 설명을 위한 목적이며, 이를 한정하는 것으로 의도되어서는 안 된다는 것을 이해하여야 하는데, 그 이유는 본 발명의 범위는 첨부된 청구항들에 의해서만 한정될 것이기 때문이다.

값들의 범위가 제공될 때, 문맥이 명확하게 달리 설명하지 않으면 하한의 단위의 1/10까지, 그러한 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 간격 값이 또한 명확하게 개시되는 것을 이해하여야 한다. 어떠한 정해진 값 또는 정해진 범위 내의 사이 값 및 그러한 정해진 범위 내의 어떠한 다른 정해진 또는 사이 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 발명 내에 포함된다. 이러한 더 작은 범위들의 상한 및 하한은 범위 내에 독립적으로 포함되거나 또는 배제될 수 있으며, 하나, 무(neither), 또는 모든 한계가 더 작은 범위 내에 포함되는 각각의 범위가 또한 정해진 범위 내의 어떠한 특별하게 배제된 한계의 대상이 되는, 본 발명 내에 포함된다. 정해진 범위가 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 때, 포함된 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위들이 또한 본 발명 내에 포함된다.

달리 정의되지 않으면, 여기서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 여기에 설명되는 것과 유사하거나 또는 동등한 어떤 방법들 및 재료들도 본 발명의 실행 또는 검사에 사용될 수 있으며, 일부 잠재적이고 바람직한 방법들 및 재료들이 이제 설명된다. 여기서 언급되는 모든 문헌은 인용된 문헌들과 함께 방법들 및/또는 재료들을 개시하고 설명하도록 참조로써 여기에 통합된다. 본 발명은 반박이 존재하는 정도까지 통합된 문헌의 어떠한 내용도 대체한다는 것을 이해하여야 한다.

본 발명을 구독하는데 통상의 지식을 가진 자들에 자명해질 것과 같이, 설명되고 도시되는 각각의 개별 실시 예들은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다른 몇몇 실시 예들과 분리되거나 또는 결합될 수 있는 개별 부품들 및 특징들을 갖는다. 인용되는 어떠한 방법들도 인용된 이벤트들의 순서 또는 논리적으로 가능한 어떠한 다른 순서로 수행될 수 있다.

여기서 사용되는 것과 같이 그리고 첨부된 청구항들에서, 단수 형태 "하나", "한", "그"는 문맥이 명확하게 달리 설명하지 않는 한 복수 대상들을 포함한다는 사실에 유의하여야만 한다. 따라서, 예를 들면, "세포(a cell)"의 언급은 복수의 그러한 세포를 포함하고 "펩티드(the peptide)"의 언급은 하나 이상의 펩티드 및 그것의 등가물들, 예를 들면 통상의 지식을 가진 자들에 알려진, 폴리펩티드들 등의 언급을 포함한다.

여기에 개시된 공보들은 본 발명의 출원일 이전의 문서에 대해서만 제공된다. 여기서 어떤 것도 본 발명이 이전 발명에 의해 그러한 공보보다 선행할 자격이 없다는 인정으로서 해석되어서는 안 된다. 게다가, 제공되는 공개 일자는 실제 공개 일자들과 다를 수 있으며 이는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.

방법들

위에 요약된 것과 같이, 본 발명의 양상들은 노화 관련 질환들에 대한 대상의 치료를 위한 방법들을 포함한다. 노화 관련 질환은 질환, 예를 들면, 생물체의 노화를 수반하는, 질환 또는 다른 바람직하지 않은 질환을 의미한다. 노화 관련 질환은 예를 들면, 세포 손상, 조직 손상, 기관 기능장애, 노화 관련 수명 단축 및 발암(carcinogenesis)과 같으나 이에 한정되지 않는, 신체의 중추 또는 말초 기관에 대한 노화 관련 손상과 같이, 다수의 다른 방법들로 나타날 수 있으며, 흥미 있는 특정 기관들 및 조직들은 피부, 신경세포, 근육, 췌장, 뇌, 신장, 폐, 위, 장(intestine), 비장(spleen), 심장, 지방 조직(ose tissue), 고환(testis), 난소, 자궁, 간 및 뼈(bone)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 경우들에서, 방법들에 따른 대상의 치료는 중추 기관, 예를 들면 뇌, 척수 등과 같은 중추신경계의 변화를 야기하며, 변화는 예를 들면 아래에 더 상세히 설명될 것과 같이, 분자적, 구조적 및/또는 기능적 변화를 포함하나 이에 한정되지 않는, 다수의 다른 방법들로 나타날 수 있다. 일부 경우들에서, 방법들에 따른 대상의 치료는 간, 근육, 심장, 혈액 등과 같은, 말초 기관의 변화를 야기하며, 변화는 예를 들면 아래에 더 상세히 설명될 것과 같이 다수의 다른 방법들로 나타날 수 있다.

일부 실시 예들에서, 치료되는 노화 관련 질환은 개인의 인지 능력에서의 노화 관련 장애이다. 인지 능력 또는 "인지"는 주의와 집중, 복잡한 작업과 개념의 학습, 기억(단기간 및/또는 장기간에서의 새로운 정보의 획득, 유지, 및 검색), 정보 처리(오감에 의해 수집되는 정보의 처리), 시공간 기능(시지각(visual perception), 깊이 지각, 심상(mental imagery)의 사용, 그림 복사, 대상 또는 형태의 구성), 언어의 생산과 이해, 언어 유창성(verbal fluency , 언어 탐색), 문제점들의 해결, 결정, 및 실행 기능(계획 및 우선순위 매김)을 포함하는 정신적 과정을 의미한다. "인지 감퇴(cognitive decline)"는 이러한 능력들의 하나 이상의 점진적인 감퇴, 예를 들면 기억, 언어, 사고, 판단 등의 감퇴를 의미한다. "인지 능력의 손상" 및 "인지 손상"은 건강한 개인, 예를 들면 연령에 맞게 건강한 개인에 대한, 또는 이전에 시간, 예를 들면 2주, 1달, 2달, 3달, 6달, 1년, 2년, 5년, 또는 10년 이상의 초기 시점에서의 개인의 능력에 대한 인지 능력의 감소를 의미한다. "노화 관련 인지 장애"는 일반적으로 예를 들면, 자연적 노화 과정, 예를 들면 경도 인지 장애(mild cognitive impairment, M.C.I.)와 관련된 인지 장애; 및 노화 관련 장애, 즉 노쇠의 증가에 따른 빈도의 증가에서 나타나 장애, 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병, 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅턴 병(Huntington disease), 근위축성 측색 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 녹내장(glaucoma), 근긴장성 이영양증(myotonic dystrophy), 혈관성 치매(vascular dementia) 등과 같은 신경퇴행성 질환(neurodegenerative condition)을 포함하는 노화와 관련된 인지 능력의 장애;를 의미한다.

"치료", "치료하는" 등은 일반적으로 원하는 약학 및/또는 생리학적 효과의 획득을 의미한다. 효과는 그것의 질환 또는 증상의 완전하거나 또는 부분적인 방지와 관련하여 예방적일 수 있거나 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용의 부분적 또는 완전한 치유와 관련하여 치료상일 수 있다. 여기서 사용되는 것과 같은 "치료"는 포유동물 내의 질병의 어떠한 치료도 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 질병의 성향이 있을 수 있으나 아직 이를 가진 것으로 진단되지 않은 대상에서의 발생으로부터 질병을 방지; (b) 질병의 억제, 그것의 발생을 저지; 또는 (c) 질병의 완화, 즉 질병의 퇴행을 야기. 치료는 다양한 다른 신체적 징후들, 예를 들면 유전자 발현의 변조, 조직 또는 기관들의 회복 등을 야기할 수 있다. 치료제는 질병 또는 손상의 개시 이전에, 동안에 또는 이후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정시키거나 또는 감소시키는 진행중의 질병의 처리가 특히 관심사이다. 그러한 치료는 영향을 받은 조직들 내의 기능의 완전한 상실 이전에 실행될 수 있다. 대상 치료요법은 질병의 증상 단계 동안에, 그리고 일부 경우들에서 질병의 증상 단계 이후에 투여될 수 있다.

노화 관련 질환이 노화 관련 인지 감퇴인 일부 경우들에서 본 발명의 방법들에 의한 치료는 노화 관련 인지 감퇴의 진행을 느리게 하거나, 또는 감소시킨다. 바꾸어 말하면, 개인의 인지 능력들은 설명된 방법들에 의한 치료 이전 또는 치료의 부재에서보다 설명된 방법들에 의한 치료 이후에 더 느리게 감퇴한다. 일부 경우들에서, 본 발명의 방법들에 의한 치료는 개인의 인지 능력들을 안정시킨다. 예를 들면, 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받는 개인의 인지 감퇴의 진행은 개시된 방법들에 의한 치료 이후에 중단된다. 또 다른 예로써, 개인, 예를 들면 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받을 것으로 예상되는 40세 이상의 개인은 개시된 방법들에 의한 치료 이후에 방지된다. 바꾸어 말하면, 어떠한 (또 다른) 인지 장애도 관찰되지 않는다. 일부 경우들에서, 본 발명의 방법들에 의한 치료는 예를 들면 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받는 개인에서의 인지 능력들의 향상에 의해 관찰되는 것과 같이, 인지 장애를 감소시키거나, 또는 반전시킨다. 바꾸어 말하면, 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받는 개인의 인지 능력들은 개시된 방법들에 의한 치료 이전보다 더 나은데, 즉 그것들은 치료를 더 낫게 한다. 일부 경우들에서, 본 발명의 방법들에 의한 치료는 인지 장애를 제거한다. 바꾸어 말하면, 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받는 개인들은 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받는 개인에서의 향상된 인지 능력들에 의해 입증되는 것과 같이, 개시된 방법들에 의한 치료 이후에 개인이 40세 이하였던 때의 그것들의 레벨로 회복된다.

대상에 방법들을 실행하는 데 있어서, 젊은 혈장 함유 혈액 제제는 그것이 필요한 개인, 예를 들면 노화 관련 질환, 예를 들면 노화 관련 인지 장애 또는 노화 관련 치매로부터 고통을 받거나 또는 고통을 받을 위험에 있는 개인에 투여된다. 이와 같이, 본 발명의 실시 예들에 따른 방법들은 젊은 개인("기증자(donor) 개인", 또는 "기증자")으로부터의 혈장 함유 제품을 적어도 노화 관련 인지 장애로부터 고통을 받거나 또는 고통을 받을 위험에 있는 개인("수용자(recipient) 개인" 또는 "수용자")에 투여하는 단계를 포함한다. "혈장 함유 혈액 제제"은 혈장을 포함하는 혈액으로부터 유도되는 어떠한 제품을 의미한다. 용어 "혈장"은 그것의 전통적인 의미로 약 92% 물, 알부민(albumin), 감마 글로불린(gamma globulin), 항-혈우병(anti-hemophilic) 인자, 및 다른 응혈 인자(clotting factor) 등과 같은 7% 단백질 및 1%의 무기염, 당, 지방 호르몬과 비타민들로 구성되는 혈액의 담황색의(straw-colored), 연노랑(pale yellow)) 액체를 언급하도록 사용된다. 대상 방법들에서의 사용에 적합한 혈장 함유 혈액 제제들의 비-제한적 실시 예들은 항-응고제(예를 들면, EDTA, 시트르산염(citrate), 수산염(oxalate), 헤파린(heparin) 등)로 처리된 전체 혈액을 포함하며, 혈액 제제들은 백혈구 세포들을 제거하기 위하여 전체 혈액을 여과함으로써 생산되며, 혈액 제제는 필수적으로 정제된 혈장으로 구성된다. 일부 경우들에서, 사용되는 젊은 혈장 제품은 그것에 적어도 이러한 성분들이 전체 혈액 내에 존재하는 정도로, 적혈구들, 백혈구들 등과 같은, 전체 혈액 네에서 발견되는 하나 이상의 성분이 결핍되도록, 제품이 전체 혈액이 아닌 것을 의미하는, 비-전체(non-whole) 혈액 혈장이다. 일부 경우들에서, 젊은 혈장 제품은 실질적으로, 완전하지는 않더라도, 무세포성(acellular)이며, 그러한 경우들에서 세포 함량은 0.5% 이하를 포함하는, 1% 이하와 같은, 5% 이하일 수 있다.

용어 "개인", "대상", "호스트(host)" 및 "환자"는 여기서 호환 가능하게 사용되고 진단, 치료, 또는 치료요법이 바람직한 어떠한 포유동물 대상, 특히 인간들을 언급한다. 일반적으로, 기증자 및 수용자는 동일한 종(species)일 것이다. 본 발명의 방법들로 치료될 수 있는 포유동물 종들은 개(canine)와 고양이(feline); 말(equine); 소(bovine); 양(ovine); 등 및 영장류, 특히 인간들을 포함한다. 대상 방법들, 조성물들, 및 시약들은 또한 예를 들면 실험적 연구에서의, 동물 모델들, 특히 소형 포유동물들, 예를 들면 쥐(murine), 토끼목(lagomorpha), 등에 적용될 수 있다. 아래의 설명은 인간들에 대한 대상 방법들, 조성물들, 시약들, 장치들 및 키트들에 초점을 맞물 것이나, 통상의 지식을 가진 자들에 의해 그러한 설명은 종래 지식을 기초로 하여 흥미 있는 다른 포유동물들에 쉽게 변형될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

"젊은 개인"은 40세 이하인 개인, 예를 들면 30세 이하, 예를 들면 25세 이하를 포함하는, 35세 이하인, 개인을 의미한다. 일부 경우들에서, 혈장 함유 혈액 제제의 젊은 혈장의 소스로서 역할을 하는 개인은 10세 이하, 예를 들면 1세 이하를 포함하는 5세 이하인 개인이다. 일부 경우들에서, 대상은 신생아이며 혈장 제품의 소스는 제대혈(umbilical cord)이며, 혈장 제품은 신생아의 제대혈로부터 채취된다. 이와 같이, "젊은 개인"은 0 및 40세 사이, 예를 들면 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40세인 대상을 언급할 수 있다. 일반적으로, 개인은 건강하며, 예를 들면 개인은 채취 시기에 어떠한 혈액성 악성종양(hematological malignancy) 또는 자기면역 질병(autoimmune disease)도 갖지 않는다.

"노화 관련 인지 장애로부터 고통을 받거나 또는 고통의 위험이 있는"은 약 50세 이상, 예를 들면 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상이고, 일반적으로 90세와 같이 100세 미만인, 즉 약 50 및 100세 사이의, 예를 들면 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 약 90세이고, 노화 관련 질환, 예를 들면 자연적 노화 과정과 관련된 인지 장애, 예를 들면 경도 인지 장애(M.C.I.)로부터 고통을 받는, 개인; 아직 노화 관련 질환의 증상, 예를 들면 인지 장애를 나타내기 시작하지 않은, 약 50세 이상, 예를 들면 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상이고, 일반적으로 90세와 같이 100세 미만인, 즉 약 50 및 100세 사이의, 예를 들면 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100세인, 개인; 노화 관련 질병, 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병, 전측두엽 치매, 헌팅턴 병, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 치매 등에 기인하는 인지 장애로 고통을 받는 어떠한 연령의 개인; 및 일반적으로 인지 장애가 수반되는 노화 관련 질병, 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상성 마비(progressive supranuclear palsy), 헌팅턴 병, 근위축성 측색 경화증, 척수성 근위축(spinal muscular atrophy), 다발성 경화증, 다-계통 위축(multi-system atrophy), 운동 실조증(ataxias), 근긴장성 근이영양증(myotonic dystrophy), 치매 등으로 진단을 받고, 아직 인지 장애의 증상을 나타내지 시작하지 않은 어떠한 연령의 개인을 포함하는 것을 의미한다.

일부 경우들에서, 혈액 제제의 기증자(즉, 젊은 개인)는 수용자(즉, 노화 관련 인지 장애로부터 고통을 받거나 또는 고통의 위험이 있는)와 다르다. 바꾸어 말하면, 혈액 제제는 수용자에 동종 이계이다(allogeneic). 일부 그러한 경우들에서, 투여되는 혈액 제제는 기증자의 혈액형 및 수용자의 혈액형을 기초로 하여 선택된다. 혈액형은 기증자와 수용자의 적혈구들 상의 A와 B 항원 및 Rh 항원의 존재 또는 부재를 의미한다. 예를 들면, 종래 기술에서 잘 이해되는 것과 같이, 개인은 적혈구 세포들 상에 A와 B 항원 모두를 갖지 않을 수 있으며(그리고 따라서 혈장 내에 A와 B 항원 모두에 특이적인 항체들을 가질 것이다), 이런 경우에 개인은 "O형"이다. 개인은 적혈구 세포들 상에 A 항원을 갖고 B 항원을 갖지 않을 수 있으며(그리고 따라서 혈장 내에 A 항원이 아닌 B 항원에 특이적인 항체들을 가질 것이다), 이런 경우에 개인은 "A형"이다. 개인은 적혈구 세포들 상에 B 항원을 갖고 A 항원을 갖지 않을 수 있으며(그리고 따라서 혈장 내에 B 항원이 아닌 A 항원에 특이적인 항체들을 가질 것이다), 이런 경우에 개인은 "B형"이다. 개인은 적혈구 세포들 상에 A와 B 항원 모두를 가잘 수 있으며(그리고 따라서 혈장 내에 A와 B 항원에 대한 어떠한 항체도 없음), 이런 경우에 개인은 "AB형"이다. 종래에 잘 알려진 것과 같이, 기증자 혈액의 수용자로의 안전한 수혈은 만일 기증자가 O형이고 수용자가 모든 형태이면; 만일 기증자가 A형이고 수용자가 A형 또는 AB형이며; 만일 기증자가 B형이고 수용자가 B형 또는 AB형이면; 혹은 만일 기증자가 AB형이고 수용자가 AB형이면 발생할 수 있다. 부가적으로, 종래에 잘 알려진 것과 같이, Rh 항원은 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있는데, 즉 개인은 각각 Rh-양성 또는 Rh-음성이다. 종래에 잘 알려진 것과 같이, 기증자 혈액의 수용자로의 수혈은 만일 기증가가 Rh⁺ 또는 Rh^-이고 수용자가 Rh⁺이면; 혹은 기증자가 Rh^-이고 수용자가 Rh⁺이면 발생할 수 있다. 그러한 다른 경우들에서, 예를 들면 혈액 제제가 A/B 또는 Rh 항원들을 나타내는 어떠한 세포도 포함하지 않은 수혈된 제제, 예를 들면 본질적으로 혈장으로 구성되는 혈액 제제일 때, 어떠한 혈액형의 기증자로부터의 혈액 제제도 수용자가 투여될 수 있다.

다른 경우들에서, 기증자와 수용자는 동일한 개인일 수 있는데, 즉 혈액은 개인으로부터 수혈되고, 수혈된 혈액으로부터 제조된 혈액 제제는 다시 예를 들면 10년 이상 이후에, 예를 들면 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90년 이후에, 동일한 개인에 전달(복원)된다. 바꾸어 말하면, 혈액 제제는 수용자에 자가 유래된다(autologous). 예를 들면, 혈액은 개인이 약 40세 이하, 예를 들면 10 및 40세 사이, 예를 들면 10, 15, 20, 25, 30, 35 또는 40세일 때, 개인으로부터 채취되었을 수 있으며, 개인이 약 50세 이상, 예를 들면 50 및 90세 사이, 예를 들면 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100세일 때 다시 개인에 수혈된다. 따라서, 본 발명의 특정 실시 예들에서, 혈액은 개인으로부터 채취되고, 보존되며, 노령일 때 다시 그 개인에 전달된다.

위에 나타낸 것과 같이, 대상 방법에서의 사용에 적합한 혈액 제제는 젊은 개인으로부터 수혈된 혈액으로부터 제조되는 혈장 함유 혈액 제제이다. 혈액은 수동으로, 자동화 장비로, 또는 그것들의 조합으로 수혈된다.

기증자의 생명을 위협하지 않는 어떠한 편리한 양이 수혈될 수 있다. 일부 경우들에서, 200-600 밀리미터의 혈장 함유 혈액 제제, 예를 들면 400-500㎖, 또는 450-500㎖의 양이 수혈된다. 수혈된 혈액은 응고를 방지하는 제제, 즉 항-응고제, 예를 들면 EDTA, 시트르산염, 수산염, 헤파린 등으로 처리될 수 있다. 예를 들면, 항-응고제는 수혈됨에 따라 혈액에 첨가될 수 있다. 또 다른 예로서, 혈액이 수집되는 용기가 항-응고제를 포함할 수 있다. 다른 제제들, 예를 들면 완충제(buffer), 방부제(preservatives), 예를 들면 인산염(phosphate), 덱스트로오스(dextrose), 아데닌(adenine), 글루코오스(glucose), 라피노오스(raffinose) 등, 바이러스를 죽이는 제제들, 예를 들면 용매 세정제(solvent detergent) 등이 도한 혈액에 첨가될 수 있다.

일부 경우들에서, 혈액은 예를 들면 백혈구, 적혈구, 혈소판 항체들 등을 제거하도록 분획될 수 있고, 혈장 함유 분획, "혈장 함유 혈액 제제"는 사용을 위하여 보유한다. 예를 들면, 전체 혈액은 수집이 완료된 후에 여과, 원심분리 등에 의해 분획될 수 있다. 또 다른 예로서, 전체 혈액은 기증자로부터 수혈됨에 따라 분획될 수 있고, 비-혈장 성분들은 기증자의 혈류(blood stream)로 돌아온다. 예를 들면, 혈장을 포함하는 분획된 혈액은 성분 채집술(apheresis)에 의해 채취될 수 있다. "성분 채집술"은 채취된 혈액이 특정 성분들, 예를 들면 백혈구, 적혈구, 혈장 등을 분리하고 나머지 혈액 성분들을 기증자의 혈류로 돌려보내는 기계를 통과하는 자동화 혈액 수집을 의미한다. 일부 경우들에서, 성분 채집술은 혈장 채집술, 즉 혈장이 분리되고 나머지 혈액 성분들이 기증자의 혈류로 돌아오는 성분 채집술이다. 일부 그러한 경우들에서, 혈장 함유 혈액 제제는 본질적으로 혈장으로 구성된다.

일부 실시 예들에서, 혈장 함유 혈액 제제, 즉 전체 혈액 또는 그것의 혈장 함유 분획은 미리 결정된 임계 이하의 평균 분자를 갖는 폴리펩티드 분획과 같은, 하나 이상의 폴리펩티드 분획을 제거하도록 더 처리된다. 미리 결정된 임계(threshold)는 변경될 수 있으나, 관심 있는 임계들은 3.5kDa, 10kDa, 25kDa, 50kDa를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 경우들에서, 특정 단백질 성분, 예를 들면 IgG 등이, 또한 제거될 수 있다. "평균 분자량"은 폴리펩티드 내의 아미노산의 총 수를 각각에 대한 110kDa의 평균 분자량으로 곱함으로써 계산된 것과 같은 폴리펩티드의 질량을 의미한다. 종래에 거의 액체 샘플들로부터 주어진 분자량인 폴리펩티드의 제거를 위한 다수의 방법이 알려졌다. 예를 들면, 혈액 제제는 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography, SEC), 예를 들면 혈장 함유 혈액 제제가 거의 주어진 분자량의 단백질을 지연시키고, 이에 의해 이러한 작은 폴리펩티드들의 통과를 검소시키는 구멍들을 포함하는 비드(bead)들의 매트릭스를 통과하는 겔 여과 크로마토그래피의 대상이 될 수 있다. 또 다른 예로서, 혈액 제제는 튜브 또는 패킹된 컬럼을 통한 층류(laminar flow) 하에서 발생하는 샘플의 포물선형(parabolic) 또는 푸아즈이유(Poiseuille) 유사 흐름이 큰 입자들이 튜브의 중심에서 빠른 이동 흐름으로 이동하고 작은 입자들이 튜브의 벽에 가까운 느린 이동 흐름을 따라 지연되도록 야기하는, 유체 역학 크로마토그래피(hydrodynamic chromatography, HDC)의 대상이 될 수 있다. 어떠한 종래의 방법, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피, 유체 역학 크로마토그래피 등도 혈액 제제로부터 거의 주어진 임계 평균 분자량을 갖는 단백질들을 제거하도록 사용될 수 있다. 본 발명의 주어진 실시 예들에서 사용될 수 있는 흥미 있는 특정 분획들은: 거의 3.5kDa의 평균 분자량을 갖는 폴리펩티드들이 제거된 분획들; 거의 10kDa의 평균 분자량을 갖는 폴리펩티드들이 제거된 분획들; 거의 25kDa의 평균 분자량을 갖는 폴리펩티드들이 제거된 분획들; 거의 50kDa의 평균 분자량을 갖는 폴리펩티드들이 제거된 분획들; 및 거의 위의 임계들(예를 들면, 3.5kDa, 10kDa, 25kDa, 50kDa) 중 어느 하나의 평균 분자량을 갖는 폴리펩티드들이 제거되고 IgG가 제거된 분획들. 바꾸어 말하면, 혈액 제제는 주어진 분자량(예를 들면, 3.5kD-; 10kD-; 25kD-; 50kD-)이 감소된 혈장 함유 혈액 제제로 보일 수 있다. 일부 경우들에서, 투여되는 분획은 변성 분획이 아니다.

그렇게 준비된, 혈장 함유 혈액 제제, 예를 들면 전체 혈액 또는 그것의 혈장 함유 분획은 그리고 나서 노화 관련 질환, 예를 들면 인지 장애의 발생으로부터 고통을 받거나 또는 발생의 위험이 있는 개인에 투여될 수 있다. 일부 실시 예들에서, 혈장 함유 혈액 제제는 즉시, 예를 들면 수집의 약 12-48시간 내에, 노화 관련 인지 장애의 발생으로부터 고통을 받거나 또는 발생의 위험이 있는 개인에 투여된다. 그러한 경우들에서, 혈액 제제는 냉장, 예를 들면 0-10℃ 하에서 저장될 수 있다. 다른 실시 예들에서, 혈장 함유 혈액 제제는 예를 들면, 수용자에 투여될 때와 같은 시간까지 종래에 알려진 것과 같은, 냉동 보존(cryopreservation) 등에 의해 보존된다.

예를 들면, 제제는 예를 들면 기증의 약 24 또는 48시간 내에, 즉 수집 이후 바로 내지 수집 이후 약 48시간 내에 냉동될 수 있고 약 -20℃ 이하, 예를 들면 -80℃ 이하, 일부 경우들에서 -90℃ 이하, 또는 -135℃ 이하, 예를 들면 -196℃에서 저장될 수 있다. 일부 경우들에서, 신선 냉동되며, 예를 들면 이는 신선 동결 혈장(Fresh Frozen Plasma, FFP)이다. 다른 경우들에서, 화학 보존제, 예를 들면 냉동 보존제, 예를 들면 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 보존에 도움을 주기 위하여 첨가될 수 있다. 예를 들면, Kreher 등. (2003) Journal of Immunological Methods 278:79-93; Reimann, 등. (2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:352-359; 및 Romeu 등. (1992) J. Immunol. Methods 154:7-10이 참조된다. 냉동 보존제는 예를 들면 만일 혈장 함유 혈액 제제가 또한 백혈구들, 적혈구들 등을 포함하면, 혈액 제제 내의 세포들의 생존도를 유지하는데 특별하게 사용한다. 예를 들면, 20% 이상의 세포들이 해동 상에서 생존할 것이며, 예를 들면 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상, 일부 경우들에서, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상과 같은, 90% 이상의 세포들이 보존제의 제거 후에 생존 가능할 것이다. 혈액 제제는 위에 설명된 것과 같은, 주어진 임계 이하인, 예를 들면 3.5kDa, 25kDa, 50kDa 이하의 평균 분자량을 갖는 단백질들의 제거 이전 또는 이후에 보존될 수 있다. 다른 경우들에서, 혈액 제제는 감소 이후에 보존될 것이다. 그러한 기술들 또는 종래 기술들 이후에, 혈액 제제는 1년 이상, 예를 들면 2, 3, 4, 또는 5년 이상, 일부 경우들에서, 10, 20, 30 또는 40년 이상, 예를 들면 50, 60, 70 또는 80년 동안 저장될 수 있다. 혈액 제제의 해동 상에서, 보존제는 만일 사용되면, 개인으로의 투여를 위한 준비에서, 어떠한 종래의 용액, 예를 들면 어떠한 등장액(isotonic solution)으로 대체될 수 있다.

혈장 함유 혈액 제품은 혈액 제제를 개인에 투여하기 위한 어떠한 종래의 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있다. 일부 경우들에서, 혈액 제제는 정맥 내로(intravenously) 투여된다. 혈액 제제는 종래에 알려진 정맥 내 용액들, 예를 들면 물 내의 5% 덱스트로오스, 등장 식염수(0.9%)와 같은 등장성 전해질 용액(isotonic electrolyte solution) 등과 혼합될 수 있다. 혈액 제제는 어떠한 편리한 액세스 장치, 예를 들면 정맥 내 주사용 바늘, 압축기 건(compressor gun), 말초 캐뉼라(peripheral cannula), 중심 Ⅳ 라인(central Ⅳ line) 등, 예를 들면, 삽입형 포트(implantable port), 터널식 라인(tunneled line), 중심 정맥 라인들, 말초 삽입형 중심 카테터(peripherally inserted central catheter)들 등을 사용하여 투여될 수 있다. 투여는 수혈을 위하여 사용되는 어떠한 정맥, 예를 들면 일반적으로 종래에 알려진 수혈을 위하여 사용되는 양 및 비율, 예를 들면 투여 당 개인의 ㎏ 중량 당 10-20㎖, 분 당 약 5㎖의 비율로, 쇄골하(subclavian), 내경정맥(internal jugular), 대퇴부(femoral), 상대 정맥(superior vena cava), 하대 정맥 (inferior vena cava), 우심방(right atrium) 등을 통할 수 있다.

대상 방법들의 실행에 있어서, 노화 관련 질환, 예를 들면 인지 장애 또는 노화 관련 치매로부터 고통을 받거나 또는 고통의 위험이 있는 개인에 노화 관련 질환, 예를 들면 노화 관련 인지 장애를 치료하기 위한 젊은 혈장 제제의 유효량이 투여된다. 임상적 의미에서, 혈액 제제의 유효량 또는 투여량(dose)은 적절한 기간 동안, 일반적으로 적어도 약 1주, 및 아마도 약 2주 이상, 약 3주, 3주, 8주, 또는 그 이상 동안까지 투여될 때, 자연적 노화 또는 노화 관련 장애에 기인하는 손상된 인지 또는 다른 형태의 퇴행성 질환으로 고통을 받는 개인에서의 인지 감퇴의 감소 및/또는 인지 향상을 입증할 젊은 혈장 제제의 양이다. 예를 들면, 유화 투여량은 일반적으로 적어도 약 1주, 및 아마도 약 2주 이상, 약 3주, 3주, 8주, 또는 그 이상까지와 같은, 적절한 기간 동안 투여될 때, 예를 들면 약 20% 이상, 예를 들면 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상, 일부 경우들에서 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 느리게 할, 예를 들면 자연적 노화 또는 노화 관련 장애로부터 고통을 받는 환자의 인지 감퇴를 중단시킬 투여량이다. 일부 경우들에서, 혈액 제제의 유효량 또는 유효 투여량은 질병 상태의 진행을 느리게 하거나 또는 중단시킬 뿐만 아니라 질환의 반전(reversal)을 유도할 것인데, 즉 인지 능력의 향상을 야기할 것이다. 예를 들면, 일부 경우들에서, 유효량은 적절한 기간 동안, 일반적으로 적어도 약 1주, 및 아마도 약 2주 이상, 약 3주, 3주, 8주, 또는 그 이상 동안까지 투여될 때, 노화 관련 인지 손상으로부터 고통을 받는 개인의 인지 능력들을 혈액 제제의 투여 이전의 인지에 대하여 예를 들면, 1.5배, 4배, 5배, 일부 경우들에서, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 이상 향상시킬 양이다.

인지 능력, 예를 들면 주의와 집중, 복합 작업들과 개념들을 학습하는 능력, 기억, 정보 처리, 시공간(visuospatial) 기능, 언어의 생산과 이해 능력, 문제점들의 해결과 판단 능력, 및 실행 기능들의 실행 능력을 위한 인지 검사들 및 지능(IQ) 검사들이 종래에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 유효량이 투여된 것을 확인하기 위하여 이들 중 어떠한 것도 대상 혈액 제제로의 처리 이전에 및/또는 동안에 그리고 이후에 개인의 인지 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 이것들은 예를 들면, 일반 실무자 인지 평가(General Practitioner Assessment of Cognition, GPCOG) 검사, 기억 장애 선별(Memory Impairment Screen),간이 정신 상태 검사(Mini Mental State Examination, MMSE), 캘리포니아 언어 학습 검사(California Verbal Learning Test), 제2판, 기억을 위한, 단문, 델리스-카플란 실행 기능 시스템(Delis-Kaplan Executive Functioning System) 검사, 알츠하이머 질병 평가 척도(ADAS-Cog), 정신장애 평가 척도(Psychogeriatric Assessment Scale) 등을 포함한다. 기능적 뇌 향상들의 진행은 자기 공명 영상(Magnetic Resonance Imaging, MRI) 또는 양전자 방사 단층 촬영(positron emission tomography, PET) 등과 같은, 뇌 영상 기술들에 의해 검출될 수 있다. 일상 활동들, 실행 기능들, 이동성 등을 모니터하기 위하여 광범위한 부가적인 기능 평가들이 적용될 수 있다. 일부 실시 예들에서, 방법은 인지 능력을 측정하는 단계, 및 혈액 제제가 투여되기 이전의 개인의 인지 능력과 비교하여 혈액 제제의 투여 이후의 감소된 비율의 인지 감퇴, 인지 능력의 안정화, 및/또는 인지 능력의 향상을 검출하는 단계를 포함한다. 그러한 측정들은 혈액 제제의 투여 이후에 1주 이상, 예를 들면 1주, 2주, 3주 이상, 예를 들면, 4주 6주, 또는 8주 이상, 예를 들면, 3달, 4달, 5달, 또는 6달 이상 만들어질 수 있다.

생화학적으로 설명하면, 노화 관련 인지 장애를 방지하거나 또는 치료하기 위한 혈액 제제의 "유효량" 또는 "유효 투여량"은 약 20% 이상, 예를 들면 30% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상, 일부 경우들에서, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 일부 경우들에서 약 100%, 즉 무시할 수 있는 양까지 저해하거나, 반감시키거나, 감소시키거나, 또는 억제하며, 일부 경우들에서, 자연적 노화 과정 동안에 또는 노화 관련 장애의 진행 동안에 발생하는 시냅스 가소성의 감소 및 시냅스들의 손실을 반전할 혈액 제제의 양을 의미한다. 바꾸어 말하면, 혈액 제제의 유효량과 접촉되는 세포들은 신호, 예를 들면 시냅스들의 형성과 유지를 촉진하는, 활성 신호들에 더 반응적이 될 것이다.

장기간 강화의 유도로서 체외(in vitro) 및 체내 모두에서 관찰될 수 있다. 예를 들면 신경 회로들 내의 장기간 강화의 유도는 예를 들면 국부적 신경 활성의 장기간 강화 유사 지속성 변화들을 유도하기 위한 깨어 있는 개인 상의 비침습적 자극(non-invasive stimulation)(Cramer 및 Bastings (2000)(Cramer 및 Bastings (2000) Mapping clinically relevant plasticity after stroke. Neuropharmacology. 39(5):842-51); 예를 들면 양전자 방사 단층 촬영, 기능적 자기 공명 영상, 및/또는 경두개 자기 자극(transcranial magnetic stimulation)의 사용에 의한 개인들 내의 매핑 가소성 및 증가된 신경 회로 활성(Cramer 및 Bastings (2000) Mapping clinically relevant plasticity after stroke. Neuropharmacology. 39(5):842-51); 및 학습 이후의 신경 가소성, 즉, 예를 들면 검색 관련 뇌 활성의 평가에 의한 기억의 향상들을 검출함으로써(Buchmann A, 등. (2008) Prion protein M129V polymorphism affects retrieval-related brain activity. Neuropsychologia. 46(9):2389-402); 또는 친숙하고 친숙하지 않은 대상들과의 반복 대비 이후에 기능적 자기 공명 영상(fMRI)에 의한 뇌 조직의 영상화에 의해(Soldan A, 등. (2008) Global familiarity of visual stimuli affects repetition-related neural plasticity but not repetition priming. Neuroimage. 39(1):515-26; Soldan A, 등. (2008) Aging does not affect brain patterns of repetition effects associated with perceptual priming of novel objects. J Cogn Neurosci. 20(10):1762-76); 깨어 있는 개인들에 관찰될 수 있다. 일부 실시 예들에서, 방법은 시냅스 가소성을 측정하는 단계, 및 혈액 제제가 투여되기 이전의 개인의 시냅스 가소성과 비교하여 혈액 제제의 투여 이후의 시냅스 가소성의 감소된 손실 비율, 시냅스 가소성의 안정화, 및/또는 시냅스 가소성의 증가를 검출하는 단계를 포함한다. 그러한 측정들은 혈액 제제의 투여 이후에 1주 이상, 예를 들면 1주, 2주, 3주 이상, 예를 들면, 4주 6주, 또는 8주 이상, 예를 들면, 3달, 4달, 5달, 또는 6달 이상 만들어질 수 있다.

투여되는 혈액 제제의 유효량의 계산은 다양할 수 있다. 투여되는 최종 양은 투여되는 혈액 제제, 투여 경로, 및 치료되는 장애 또는 질환의 본질에 의존할 것이다. 일부 경우들에서, 혈액 제제는 한 번 투여될 것이다. 다른 경우들에서, 혈액 제제는 한 번 이상, 예를 들면 규칙적으로, 예를 들면 매주, 매달, 반년마다, 또는 매년 투여될 것이다. 예를 들면, 혈액 제제는 2주 이상, 예를 들면 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 8주 이상 등 동안 매주 투여될 수 있다. 또 다른 예로써, 혈액 제제는 2달 이상, 예를 들면 3달, 4달, 5달, 6달, 7달, 8달, 9달, 10달, 11달, 12달, 또는 12달 이상 동안 매달 투여될 수 있다. 또 다른 예로써, 혈액 제제는 반년마다, 또는 매년 투여될 수 있다. 통상의 지식을 가진 자들은 초기 투여량이 그러한 기간 동안 투여될 수 있고 그 뒤에 일부 경우들에서, 감소된 투여량으로 존재할, 유지 투여량이 뒤따를 수 있다는 것을 이해할 것이다.

일부 실시 예들에서, 대상 혈액 제제는 노화 관련 인지 장애를 치료하기에 적합한 활성을 갖는 활성 제제와 함께 제공될 수 있다. 예를 들면, 다수의 활성 제제들, 예를 들면 콜린에스테라아제 억제제(cholinesterase inhibitor)들(예를 들면, 도네페질(Donepezil), 리바스티그민(Rivastigmine), 갈란타민(Galantamine), 타크린(Tacrine)), 메만틴(Memantine), 및 비타민 E가 알츠하이머병(예를 들면, 기억 상실, 착란(confusion), 사고와 추리의 문제점들)의 인지 증상들의 치료에 일부 효과를 갖는 것으로 나타났다. 또 다른 예로서, 다수의 제제, 예를 들면 시탈로프람(citalopram, 셀렉사(Celexa)), 플루옥세틴(fluoxetine, 프로작(Prozac)), 파록세인(paroxeine, 팍실(Paxil), 세르트랄린(sertraline, 졸로프트(Zoloft)), 트라조돈(trazodone, 데시렐(Desyrel)), 로라제팜(lorazepam, 악티반(Ativan), 옥사제팜(oxazepam, 세락스(Serax)), 아리피프라졸(aripiprazole, 아빌리파이(Abilify)), 클로자핀(clozapine, 클로자릴(Clozaril)), 할로페리돌(haloperidol, 할돌(Haldol)), 올란자핀(olanzapine, 자이프렉사 (Zyprexa)), 쿠에티아핀(quetiapine, 세로켈(Seroquel)), 리스페리돈(risperidone, 리스페달(Risperdal)) 및 지프라시돈(ziprasidone, 지오돈(Geodon))이 알츠하이머병의 행동 또는 정신적 증상들의 치료에 일부 효과를 갖는 것으로 나타났다. 일부 실시 예들에서, 대상 혈액 제제는 제 2 제제 이전에 제공된다. 일부 실시 예들에서, 대상 혈액 제제는 제 2 제제 이후에 제공된다. 일부 실시 예들에서, 대상 혈액 제제는 제 2 제제와 동시에 제공된다. 그러한 특정 실시 예들에서, 대상 혈액 제제는 하나 이상의 이러한 부가적 제제를 포함한다.

대상 방법들의 일부 양상들에서, 방법은 예를 들면 여기에 설명된 방법들 또는 종래에 알려진 방법들을 사용하여, 치료 이후에 질환 및/또는 시냅스 가소성을 측정하는 단계, 및 인지 감퇴 또는 시냅스 가소성의 손상의 비율이 감소되었는지 및/또는 인지 능력 또는 시냅스 가소성이 개인 내에서 향상되었는지를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 그러한 경우들에서, 결정은 인지 또는 시냅스 가소성 검사의 결과, 및 초기 시간, 예를 들면 2주 전, 1달 전, 2달 전, 3달 전, 6달 전, 1년 전, 2년 전, 5년 전, 또는 10년 전, 또는 그 이상에서의 동일한 개인에 대해 실행된 결과들의 비교 의해 만들어진다.

일부 실시 예들에서, 대상 방법들은 대상 혈장 함유 혈액 제제의 투여 이전에, 인지 및 시냅스 가소성의 측정을 위하여 예를 들면 여기에 설명되는 방법들 또는 종래에 알려진 방법들을 사용하여, 인지 장애를 갖는 것으로 개인을 진단하는 단계를 더 포함한다. 일부 경우들에서, 진단하는 단계는 인지 및/또는 시냅스 가소성을 측정하는 단계 및 인지 또는 시냅스 가소성의 결과들을 하나 이상의 참조, 예를 들면 양성 대조군 및/또는 음성 대조군과 비교하는 단계를 포함할 것이다. 예를 들면, 참조는 노화 관련 인지 장애들을 경험하거나(즉, 양성 대조군) 또는 노화 관련 인지 장애들을 경험하지 않은(즉, 음성 대조군) 하나 이상의 연령과 일치되는 개인에 의해 실행되는 검사의 결과들일 수 있다. 또 다른 예로서, 참조는 초기에, 예를 들면 2주 전, 1달 전, 2달 전, 3달 전, 6달 전, 1년 전, 2년 전, 5년 전, 또는 10년 전 또는 그 이상에서, 동일한 개인에 의해 실행된 검사의 결과들일 수 있다.

일부 실시 예들에서, 대상 방법들은 노화 관련 장애, 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병, 전측두엽 치매, 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 헌팅턴 병, 근위축성 측색 경화증, 척수성 근위축, 다발성 경화증, 멀티-시스템 위축, 녹내장, 운동 실조증, 근긴장성 이영양증, 치매 등을 갖는 것으로 대상을 진단하는 단계를 더 포함한다. 그러한 노화 관련 장애들을 진단하기 위한 방법은 종래에 잘 알려져 있으며, 개인을 진단하는 있어서 이들 중 어떠한 것도 통상이 지식을 가진 자들에 의해 사용될 수 있다. 일부 실시 예들에서, 대상 방법들은 노화 관련 장애를 갖는 것으로 그리고 노화 관련 장애를 갖지 않는 것으로 개인을 진단하는 단계 모두를 포함한다.

위에 요약된 것과 같이, 본 발명의 양상들은 노화 관련 인지 장애 질환들이 아닌 노화 관련 질환들을 위한 대상의 치료를 더 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 양상들은 말초 기관 기능의 노화 관련 감퇴의 처리를 위한 젊은 혈장 제제의 투여를 포함한다. 아래의 실험 섹션에서 설명되는 것과 같이, 젊은 혈액 제제의 회춘 및 재생 효과들은 근간, 뇌, 심장 및 췌장에서 관찰되었다. 일부 실시 예들에서, 젊은 혈장의 투여로부터 혜택을 받는 말초 기관은 근육, 간, 뇌, 심장, 췌장뿐만 아니라, 다른 말초 기관들을 포함할 것이나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 예들에서, 혈장의 전신 투여로부터 혜택을 받을 기관은 수용자의 혈액일 것이다. 특히, 연령에 따라 변화하는, 세포 내 통신 인자들은 더 젊은 레벨들로 복원될 것이며; 예를 들면, 연령에 따라 증가하는, 감염 인자들이 감소될 것이며, 연령에 따라 감소되는, 영양 인자(trophic factor)들은 증가될 것이다. 일부 경우들에서, 방법들은 예를 들면 적절한 대조군(아래의 실험 섹션에서 설명되는 것과 같은)과 비교하여, 호스트 내의 하나 이상의 조직의 하나 이상의 유전자의 발현 레벨들의 변화를 야기한다. 주어진 유전자의 발현 레벨의 변화는 1.5배 이상을 포함하는 1.0배 이상과 같은, 0.5배 이상일 수 있다. 조직은 변경될 수 있고 일부 경우들에서 신경계 조직, 예를 들면 뇌 조직을 포함하는 중추 신경계 조직, 예를 들면 해마 조직이다. 일부 경우들에서, 발현이 변조되는, 예를 들면 향상되는 하나 이상의 유전자는 가소성 관련 시그널링 경로의 구성원인 제제를 인코딩하는 유전자(즉, 시냅스 가소성 조절 유전자), 예를 들면 Tlr4, Gria1, Kcnj10, Kdr, Ncam, Sdfr1, Egr1, Fos 단백질들, 예를 들면 c-Fos, Drd1a, Stxbp1, Mef2c, Cntn2, Junb, Bdnf 및 CamK2a이다. 일부 경우들에서, 해마 유전자 발현의 변조는 예를 들면 적절한 대조군과 비교하여, 향상된 해마 가소성으로 나타난다. 일부 경우들에서, 발현이 변조되는, 예를 들면 향상되는 하나 이상의 유전자는 RELN, NTRK3, EPHA4 등과 같으나 이에 한정되지 않는, 시냅스 가소성 및 학습과 기억과 관련된 네트워크의 구성원인 제제를 인코딩하는 유전자이다.

일부 경우들에서, 치료는 예를 들면, 적절한 대조군(아래의 실험 섹션에서 설명되는 것과 같은)과 비교하여, 호스트의 하나 이상의 조직 내의 하나 이상의 단백질의 레벨들의 향상을 야기한다. 주어진 반백질의 단백질 변화는 1.5배 이상을 포함하는, 1배 이상과 같은, 0.5배 이상일 수 있으며, 일부 경우들에서 레벨은 건강한 야생형 레벨의 10% 이하, 예를 들면 5% 이하를 포함하는, 25% 이하와 같은, 50% 이하 내의, 건강한 야생형 레벨에 도달할 수 있다. 조직은 다양할 수 있으며, 일부 경우들에서 신경계 조직, 예를 들면, 뇌 조직, 예를 들면 해마 조직을 포함하는, 중추신경계 조직이다. 흥미 있는 표적 단백질들은 시냅스 단백질, 예를 들면 시냅토파이신, 칼슘 결합 단백질, 예를 들면 캘빈딘을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 경우들에서, 방법들은 하나 이상의 조직 내의 하나 이상의 구조적 변화를 야기한다. 조직은 변경될 수 있고 일부 경우들에서, 신경계 조직, 예를 들면 뇌 조직을 포함하는, 중추 신경계 조직, 예를 들면 해마 조직이다. 흥미 있는 구조적 변화는 예를 들면 적절한 대조군과 비교하여, 해마의 치상회(DG) 내의 성숙 신경세포들의 수상 돌기 밀도의 증가이다. 일부 경우들에서, 해마 구조의 변조는 예를 들면 적절한 대조군과 비교하여, 향상된 시냅스 형성으로서 나타난다. 일부 경우들에서, 방법들은 예를 들면 적절한 대조군과 비교하여, 장기간 강화의 향상을 야기할 수 있다.

일부 경우들에서, 방법들은 예를 들면 적절한 대조군과 비교하여, 학습과 기억의 향상을 야기한다. 학습과 기억의 향상은 다수의 다른 방법들, 예를 들면 아래의 실험 섹션에서 설명되는 전후 관계상 두려움 조절 및/또는 방사상 암 수중 미로 패러다임들로 평가될 수 있다. 전후 관계상 두려움 조절에 의해 측정될 때, 치료는 일부 경우들에서 전후 관계 기억 검사에서 증가된 프리징을 야기할 수 있으나, 신호 기억 검사에서는 아니다. 방사상 수중 미로에 의해 측정될 때, 치료는 일부 경우들에서 작업의 검사 기간 동안에 플랫폼 위치에 대한 향상된 학습 및 기억을 야기한다. 일부 경우들에서, 치료는 예를 들면 적절한 대조군과 비교하여, 해마 의존적 학습 및 기억의 향상된 인지 향상으로서 나타낸다.

일부 경우들에서, 여기에 설명되는 방법에 따른 치료는 혈액 내의 세포 내 통신 단백질들의 광범위한 생물체 변화를 야기하고, 결과로서 생긴 단백질 변화들은 다중 조직에 대한 다면 발현성(pleiotropic) 유익 효과를 가질 수 있다. 레벨들이 치료 이후에 유익하게 향상될 수 있는 흥미 있는 단백질들은 IL-22, LIF 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 양상들은 본 발명의 방법들에서의 사용을 위하여, 노화 관련 질환들의 치료와 관련하여 활성을 위하여 후보군 조성물들을 스크리닝하는 방법들을 더 포함한다. 방법들의 실시 예들은 후보군 조성물을 적절한 동물 모델에 투여하는 단계, 및 후보군 조성물이 원하는 활성을 갖는지를 평가하도록 투여 이후에 동물 모델을 평가하는 단계를 포함한다. 흥미 있는 동물 모델들은 비-인간 포유동물 모델들, 예를 들면 인간 혈액 제제들, 예를 들면 혈장을 견딜 수 있는, 면역 거부의 유해한 영향들의 경험을 갖는 쥐 모델들을 포함한다. 그러한 동물들은 비-비만성 당뇨병(NOD)/중증 복합형 면역 결핍(SCID) (NOD SCID 감마, NSG) 쥐들과 같은, 기능적 면역 시스템이 결핍된 쥐 모델들을 포함한다(Shultz 등. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174, 6477-6489 (2005)). 후보군 조성물은 위에 설명된 혈액 제제를 포함하나 이에 한정되지 않는, 어떠한 조성물일 수 있다. 동물들은 여기서 설명되는 어떠한 분석법 및 프로토콜들을 사용하여, 유전자 발현 레벨, 단백질 레벨, 구조적 레벨 및 행동 레벨을 포함하는 다수의 다른 방법들에서 평가될 수 있다.

실용성

대상 방법들 및 젊은 혈장 함유 혈액 제제들은 개인의 인지 능력에서의 장애와 같은, 노화 관련 질환들의 방지를 포함하는, 치료에 사용한다. 예를 들면 여기에 개시된 방법들에 의해, 대상 혈장 함유 혈액 제제와 관련한 치료로부터 혜택을 받을 노화 관련 인지 장애로부터 고통을 받거나 또는 고통의 위험이 있는 개인들은 약 50세 이상, 예를 들면 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 90세 이상, 및 일반적으로 100세 이하, 즉 약 50 및 100세 사이, 예를 들면, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100세, 그리고 자연적 노화 과정, 예를 들면 경도 인지 장애(M.C.I.)로 고통을 받는 개인들; 및 아직 인지 장애의 증상을 나타내기 시작하지 않은, 약 50세 이상, 예를 들면 60세 이상, 70세 이상, 80세 이상, 90세 이상, 및 일반적으로 100세 이하, 즉 약 50 및 100세 사이, 예를 들면, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 약 100세인 개인들; 을 포함한다. 자연적 노화에 기인하는 인지 장애들의 실시 예들은 다음을 포함한다:

경도 인지 장애(M.C.I.). 경도 인지 장애는 기억, 또는 시간에 따라 악화되나 전체 정신 기능 및 일상 활동은 손상되지 않는 계획, 명령 이행, 또는 결정과 같은 다른 정신 기능들을 갖는 문제점들로서 나타나는 인지의 보통의(modest) 분열이다. 따라서, 비록 신경세포 사멸이 일반적으로 발생하지 않더라도, 노화하는 뇌 내의 신경세포들은 이들 모두 인지 기능을 손상시키는, 시냅스에서의 구조, 시냅스 보전, 및 분자 처리의 반-치사 노화 관련 변경들에 취약하다.

예를 들면 여기에 개시된 방법들에 의해, 대상 혈장 함유 혈액 제제로의 치료로부터 혜택을 받을 노화 관련 인지 장애의 발생으로부터 고통을 받는 개인들은 또한, 노화 관련 장애에 기인하는 인지 장애로부터 고통을 받는 어떠한 연령의 개인들; 및 인지 장애의 증상들이 아직 나타나기 시작하지 않은, 일반적으로 인지 장애가 수반되는 노화 관련 장애로 진단된 어떠한 연령의 개인들; 을 포함한다. 그러한 노화 관련 장애들의 다음을 포함한다:

알츠하이머병(AD). 알츠하이머병은 대뇌 피질(cerebral cortex) 및 하부피질 회백질(subcortical gray matter) 내의 과도한 수의 노인성 반점(senile plaque)들과 관련된 인지 기능의 점진적, 검출 수 없는 손상이며, 이는 또한 b-아밀로이드(b-amyloid) 및 타우(tau) 단백질로 구성되는 신경원섬유 엉킴(neurofibrillary tangles)을 포함한다. 흔한 형태는 60세 이상의 인간들에 영향을 미치고, 그것의 정도는 노화가 진행함에 따라 증가한다. 이는 노인들에서 65% 이상의 치매를 설명한다.

알츠하이머병의 원인은 알려지지 않았다. 질병은 약 15% 내지 20%의 케이스에서 유전적이다. 나머지, 이른바 산발적 케이스는 일부 유전적 결정인자(genetic determinant)들을 갖는다. 질병은 대부분의 초기 발병에서 상염색체 우성 유전적 패턴을 가지며 일부 후기 발명 케이스들에서 가변 만년(late-life) 침투성을 갖는다. 환경 인자들이 능동적 조사의 초점이 된다.

질병의 과정에서, 시냅스들, 및 궁극적으로 신경세포들은 대뇌 피질, 해마, 및 피질하부 구조들(마이네르트(Meynert) 핵 기저부 내의 선택적 세포 손상을 포함하여), 청반(locus caeruleus), 및 배동맥 솔기핵(nucleus raphae dorsalis) 내에서 손상된다. 대뇌 글루코오스 사용 및 관류(perfusion)가 뇌의 일부 영역들(초기 단계 질병에서의 두정엽(parietal lobe)과 측두부 피질(temporal cortex)들, 후기 단계 질병에서의 전액골 피질(prefrontal cortex))에서 감소된다. 신경엽(neuritic) 또는 노인성 반점(아밀로이드 코어(amyloid core)주위의 신경돌기(neurite)들, 성상세포(astrocyte)들, 및 교질 세포(glial cell)들로 구성되는) 및 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangles, 쌍나선형 필라멘트들로 구성되는)은 알츠하이머병의 발병에 역할을 한다. 노인성 반점들 및 신경섬유 매듭들은 정상적인 노화와 함께 발생하나, 그것들은 알츠하이머병을 갖는 개인들에서 더 많이 유행된다.

파킨슨병. 파킨슨병(PD)은 느리고 감소된 이동, 근육 경직, 안정 떨림(resting tremor), 및 자세 불안정(postural instability)을 특징으로 하는 폭발성의(idiopathic), 느리게 진행되는, 퇴행성 중추신경계 장애이다. 원래는 주로 운동 장애로 고려되었으나, 파킨슨병은 이제 또한 인지, 행동, 수면, 자율 기능, 및 감각 기능에 영향을 미치는 것으로 인식된다. 가장 흔한 인지 장애들은 주의와 집중, 작업 기억, 실행 기능, 언어 생산, 및 시공간적 기능에서의 장애를 포함한다.

일차 파킨슨병에서, 흑질(substantia nigra)의 색소 신경세포, 청반(locus caeruleus), 및 다른 뇌간(brain stem) 도파민 세포 그룹들이 손상된다. 원인은 알려지지 않았다. 미상 핵(caudate nucleus) 및 피각(putamen)에 돌출한, 흑질 신경세포들의 손상은 이러한 영역들 내의 신경전달물질인 도파민의 결핍을 야기한다. 발병은 일반적으로 40세 이후이며, 노령의 그룹에서 발생 정도가 증가한다.

이차 파킨슨병은 다른 특발성 퇴행성 질병들, 약물들, 또는 외인성 독성물질들에 기인하는 기저 핵(basal ganglia) 내의 도파민의 작용의 손상 또는 방해로부터 야기한다. 이차 파킨슨병의 가장 흔한 원인은 도파민 수용체들의 차단에 의해 파킨슨병을 생산하는, 항정신병 약(antipsychotic drug)들 또는 레서핀(reserpine)의 섭취이다. 덜 흔한 원인들은 일산화탄소 또는 망간 중독, 뇌수종(hydrocephalus), 구조적 병소(종양들, 중뇌 또는 기저 핵에 영향을 미치는 경색(infarct)들), 경막하 혈종(subdural hematoma), 및 선상체흑질 변성증(striatonigral degeneration)을 포함하는, 퇴행성 장애들을 포함한다.

전측두엽 치매. 전측두엽 치매(FTD)는 뇌의 전두엽(frontal lobe)의 점진적인 악화로부터 야기하는 질환이다. 기간에 따라, 악화는 측두엽(temporal lobe)으로 진행할 수 있다. 발생률에서 알츠하이머병 다음으로, 전측두엽 치매는 20%의 초로성 치매(pre-senile dementia) 케이스들을 설명한다. 증상들은 영향을 받은 전두엽 및 측두엽의 기능들을 기초로 하여 세 가지 그룹으로 분류된다: 한편으로는 무기력과 비-자발성(aspontaneity), 및 다른 한편으로는 탈억제(disinhibition)를 포함하는 증상들을 갖는, 행동 변종(variant) 전측두엽 치매; 조음 장애(articulation difficulty), 음운적(phonological) 및/또는 구문 착오(syntactic error)들에 기인하는 음성 능변(speech fluency)의 장애가 관찰되나 단어 이해는 보존되는, 진행성 비유창성 실어증(progressive nonfluent aphasia, PNFA); 및 환자들이 정상적인 음운과 구문에 유창하나 명명과 단어 이해의 문제점의 증가를 갖는, 의미 치매(semantic dementia, SD). 모든 전측두엽 치매 환자들에 공통인 다른 인지 증상들은 실행 기능과 집중 능력의 장애를 포함한다. 지각, 공간 기술(spatial skill) 및 실천(praxis)을 포함하는, 다른 인지 능력들은 그대로 남아있다. 전측두엽 치매는 구조적 자기 공명 영상 스캔들에서 노출된 전두엽 및/또는 측두엽 위축의 관찰에 의해 진단될 수 있다.

다수의 전측두엽 치매의 형태들이 존재하며, 이들 중 어느 하나는 대상 방법들 및 조성물들을 사용하여 치료되거나 또는 방지될 수 있다. 예를 들면, 전측두엽 치매의 한 형태는 의미 치매(SD)이다. 의미 치매는 언어 및 비-언어 영역 모두에서의 의미적 기억의 손상을 특징으로 한다. 의미 치매 환자들은 흔히 언어 발견 어려움의 불평과 함께 존재한다. 임상 징후들은 달변 실어증(fluent aphasia), 명칭 실어증(anomia), 단어 의미의 손상된 이해, 및 연합성 시각 실인증(associative visual agnosia, 의미론적으로 관련된 그림들과 대상들을 일치시키는 능력)을 포함한다. 질병이 진행됨에 따라, 비록 거의 말기 증상들을 갖지 않는 "순수" 의미 치매의 케이스들이 설명되었으나 행동 및 인성 변화들이 측두엽 치매에서 볼 수 있는 것과 유사하게 나타난다. 구조적 자기 공명 영상은 측두엽들(왼쪽 상에 우점적으로) 내의 위축의 특징적인 패턴을 나타내며, 하부가 상부 관련보다 크고 전방 측두엽 위축이 후방보다 크다.

또 다른 예로서, 또 다른 형태의 측두엽 치매는 피크 병(Pick's disease, PiD, 또한 PcD)이다. 정의하는 질병의 특성은 은(silver) 염색의, "피크 바디들"로서 알려진 구형 응집체(spherical aggregation)들 내로 축적하는, 신경세포들 내의 타우 단백질들의 증대이다. 증상들은 언어 상실(실어증) 및 치매를 포함한다. 안와전두 장애(orbitofrontal dysfunction )를 갖는 환자들은 공격적이 되고 사회적으로 부적합하게 된다. 그들은 강탈하거나 혹은 강박적이거나 또는 반복적인 고착 행동(stereotyped behavior)들을 나타낸다. 환자들은 배내 측(dorsomedial) 또는 배외 측(dorsolateral) 전두엽 장애는 관심, 동정의 부족, 또는 감소된 자발성을 나타낼 수 있다. 환자들은 자가-모니터링의 부재, 비정상적 자기-인식, 및 의미 공감의 불능을 나타낼 수 있다. 양쪽 후측방 전두엽 피질(bilateral posterolateral orbitofrontal cortex) 및 오른쪽 전전두엽 피질(right anterior insula) 내의 회백질 손실(gray matter loss )을 갖는 환자들은 병적으로 단것을 좋아하는(sweet tooth) 것과 같은, 섭식 행동들의 변화를 나타낼 수 있다. 전외측(anterolateral) 전두엽 피질 내의 더 많은 중심의 회백질 손상이 있는 환자들은 과식증(hyperphagia)이 발생할 수 있다. 일부 증상들은 초기에 완화될 수 있으나, 질병은 진행되고 환자들은 종종 2 내지 10년 내에 사망한다.

헌팅턴 병. 헌팅턴 병(HD)은 감정, 행동, 및 정신적 비정상; 지식 또는 인지 기능의 상실; 및 운동 비정상(운동 방해)의 발생을 특징으로 하는 유전적 진행성 신경퇴행성 장애이다. 헌팅턴 병의 고전적 징후들은 무도병(chorea, 얼굴, 팔, 다리, 몸통에 영향을 미칠 수 있는 불수의(involuntary), 급속의, 불규칙한, 요동 운동)의 발생뿐만 아니라 사고 과정 및 후천적 지식 능력들의 점진적 손상을 포함하는 인지 감퇴를 포함한다. 기억, 추상적 사고, 및 판단의 장애; 시간, 위치, 또는 정체성의 부적절한 인식(방향감각 상실); 증가된 불안; 및 성격 변화들(성격 분열)이 존재할 수 있다. 비록 증상들이 일반적으로 인생의 40대 또는 50대 동안에 분명하게 나타나나, 발명에서의 연령은 다양하고, 초기 아동부터 말기 성인(예를 들면, 70대 또는 80대)까지 범위이다.

헌팅턴 병은 상염색체 우성 질환으로서 가족들 내에 전염된다. 장애는 염색체 4(4p 16.3) 상의 유전자 내의 비정상적으로 긴 시퀀스들 또는 "코딩된 명령들의 "반복들"의 결과로서 발생한다. 헌팅턴 병과 관련된 신경 시스템 기능의 점진적인 손상은 기저 핵(basal ganglia) 및 대뇌 피질(cerebral cortex)을 포함하는, 뇌의 특정 영역들 내의 신경세포들의 손상으로부터 야기한다.

근위축성 측색 경화증. 근위축성 측색 경화증(ALS)은 운동 신경세포를 공격하는 급성 진행성의, 예외 없이 치명적인 신경 질환이다. 근 쇠약과 위축 및 전각 세포 기능 장애(anterior horn cell dysfunction)의 징후들이 손에서 가장 자주 나타나고 발에서 덜 자주 나타난다. 발병 부위는 임의적이고, 진행은 비대칭이다. 경련이 일반적이고 위축을 선행할 수 있다. 드물게, 환자는 30% 생존하고; 50%는 발병 3년 이후에 사망하고, 20%가 5년 생존하며, 10%가 10년 생존한다. 진단 특징들은 중간 또는 후반 성인 동안의 발명 및 진행성의, 감각 이상 없는 일반화된 운동 관련을 포함한다. 신경 전도 속도는 질병의 후기까지 정상이다. 최근 연구들은 인지 장애들뿐만 아니라, 특히 즉각적 언어 기억, 시각 기억, 언어와 실행 기능의 감퇴에 대한 제시를 기록하였다.

근위축성 측색 경화증 환자들의 심지어 정상으로 나타나는 신경세포들에서도 세포체 영역, 시냅스 수, 및 총 시냅스 길이의 감소가 보고되었다. 활성 구역의 가소성이 그 한계에 도달할 때 시냅스의 연속적인 손실이 기능 장애에 이르게 한다는 사실이 제안되었다. 새로운 시냅스들의 형성 촉진 또는 시냅스 손실의 방지는 이러한 환자들 내의 신경세포 기능을 유지할 수 있다.

다발성 경화증. 다발성 경화증(MS)은 차도 및 악화의 재발을 갖는, 다양한 증상들 및 중추신경계 기능장애의 징후들을 특징으로 한다. 가장 흔하게 존재하는 증상들은 몸통 내의, 또는 얼굴의 일 측 상의 하나 이상의 끝 부위의 지각이상; 다리 또는 손의 쇠약 또는 동작의 서투름; 또는 시각 장애, 예를 들면 부분 소경(blindness) 및 하나의 눈의 통증(구 후시 신경염, retrobulbar optic neuritis), 시야의 흐릿함, 또는 암점(scotomas)이다. 통상의 인지 장애들은 기억(새로운 정보의 습득, 유지, 및 검색), 주의와 집중(특히 분리 주의), 정보 처리, 실행 기능들, 시공간 기능들, 및 언어 유창성의 손상들을 포함한다. 통상의 초기 증상들은 복시(double vision, diplopia), 하나 이상의 손발의 일시적 쇠약, 사지(limb)의 경미한 결림 또는 특이 피로, 가벼운 보행 장애, 방광 제어의 어려움, 현기증, 및 가벼운 감정 장애를 야기하는 안구 마비이며; 모두는 산발적 중추신경계 관여를 나타내고 때때로 질병이 인식되기 수개월 또는 수년 전에 발생한다. 과도한 열이 증상들과 징후들을 두드러지게 할 수 있다.

과정은 상당히 다양하고, 예측 불가능하며, 대부분의 환자들에서, 이장성이다(remittent). 처음에, 차도 후 수개월 또는 수년은 특히 질병이 구 후시 신경염으로 시작할 때, 에피소드(episode)들을 분리할 수 있다. 그러나 일부 환자들은 빈번한 공격을 가질 수 있고 급격하게 무능력해지며; 소수에 대하여 과정은 급속도로 진행될 수 있다.

녹내장. 녹내장은 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell, RGB)들에 영향을 미치는 흔한 신경퇴행성 질병이다. 증거는 망막 신경절 세포들을 포함하여, 시냅스들과 수상 돌기들 내의 분획된 퇴행 프로그램의 존재를 제시한다. 최근의 증거는 또한 노령 성인들에서의 인지 장애 및 녹내장 사이의 연관성을 나타낸다(Yochim BP, 등. Prevalence of cognitive impairment, depression, and anxiety symptoms among older adults with glaucoma. J Glaucoma. 2012;21(4):250-254).

근긴장성 이영양증. 근긴장성 이영양증(DM)은 이영양성 근 위축 및 근긴장을 특징으로 하는 상염색체 우성 다중 시스템 장애이다. 분자 결함은 염색체 19q 상의 미오토닌(myotonin)-단백질 키나아제 유전자의 3' 비-전사 영역에서의 확대된 트리뉴클레오티(CTG) 반복이다. 증상들은 어떠한 연령에서도 발생할 수 있고, 임상 심각성의 범위는 광범위하다. 근긴장은 손 근육들에서 두드러지고, 하수증(ptosis)은 심지어 가벼운 경우들에서 흔하다. 심각한 경우들에서, 현저한 말초 근육 악화는 흔히 백내장(cataracts), 조기 대머리, 마르고 모난 얼굴, 심부정맥(cardiac arrhythmia), 정소 위축(testicular atrophy), 및 내분비 이상(예를 들면, 당뇨병)과 함께 발생한다. 정신 지체가 심각한 인지 형태들에서 흔하나, 전방 및 시간적 인지 기능들의 노화 관련 감퇴, 특히 언어 및 실행 기능들의 감퇴가 장애의 중간 성인 형태들에서 관찰된다. 심각하게 영향을 받은 사람들은 50대 초반에 사망한다.

치매. 치매는 일상 기능을 방해하기에 충분히 심각하게 사고 및 사회 능력들에 영향을 미치는 증상들을 갖는 장애들의 분류를 설명한다. 위에 설명된 노화 관련 장애들의 후기 단계들에서 관찰되는 치매의 다른 경우들은 아래에 설명되는, 혈관성 치매(vascular dementia), 및 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies)를 포함한다.

혈관성 치매, 또는 "다-경색 치매(multi-infarct dementia)"에서, 인지 장애는 일반적으로 일련의 경미한 발작, 또는 때때로 선행되는 한 번의 큰 발작 또는 다른 작은 발작들 이후에 뇌로의 혈액 공급의 문제점들에 의해 야기된다. 혈관성 병소들은 소혈관 질환(small vessel disease), 또는 국소적 병소, 또는 둘 모두와 같은, 만성 뇌혈관 질환(diffuse cerebrovascular disease)의 결과일 수 있다. 혈관성 치매로 고통을 받는 환자들은 진행성 인지 감퇴가 관찰되는, 급성 뇌혈관 사고 이후에, 급성으로 또는 아급성으로(subacutely), 인지 장애를 나타낸다. 인지 장애들은 비록 관련된 뇌의 변화들이 알츠하이머병 병리학에 기인하지 않고 결국 치매를 야기하는, 뇌 내의 만성의 감소된 혈액 흐름에 기인하더라도, 언어, 기억, 복합 시각 처리;, 또는 실행 기능을 포함하는, 알츠하이머병에서 관찰되는 것과 유사하다. 정신 상태 검사와 관련한 평가들과 함께 다-경색 치매의 진단을 확인하기 위하여 단일광자방출단층촬영(single photon emission computed tomography, SPECT) 및 양전자 방사 단층 촬영(positron emission tomography, PET) 신경 촬영법이 사용될 수 있다.

루이소체 치매(DLB, 또한 루이소체 치매, 만성 루이소체 질환, 피질 루이소체 질환, 및 루이형 노인성 치매를 포함하는 다른 다양한 명칭들로 알려진)는 해부학적으로 사후 뇌 조직학에서 검출될 수 있는 신경세포들 내의 루이소체들(알파시누클레인(alpha-synuclein) 및 유비퀴틴 단백질(ubiquitin protein)의 집단)의 존재를 특징으로 한다. 그것의 주요 특징은 인지 감퇴, 특히 실행 기능의 인지 감퇴이다. 민첩성 및 단기간 기억이 올라갔다 떨어졌다 할 것이다. 선명하고 상세한 화상들의 지속적 또는 재발성 환시(visual hallucinations)가 흔히 초기 진단 증상이다. 루이소체 치매는 비록 알츠하이머병이 일반적으로 상당히 점진적으로 시작하고, 루이소체 치매가 급속 또는 급성 발병을 갖더라도, 흔히 그 초기 단계에서 알츠하이머병 및/또는 혈관성 치매와 혼동된다. 루이소체 치매 증상들은 또한 파킨슨병에서와 유사한 운동 증상(motor symptoms)을 포함한다. 루이소체 치매는 치매 증상들이 파킨슨 증상들에 대하여 나타나는 기간에 의해 때때로 파킨슨병에서 발생하는 치매와 구별된다. 치매를 갖는 파킨슨병(PDD)은 치매 발병이 파킨슨병의 발명 이후에 1년 이상일 때의 진단일 수 있다. 루이소체 치매는 인지 증상들이 동시에 또는 파킨슨 증후군의 1년 이내에 시작할 때 진단된다.

진행성 핵상성 마비. 진행성 핵상성 마비(PSP)는 복잡한 안구 운동 및 사고 문제점들과 함께, 걸음걸이와 균형의 제어에 관한 심각하고 진행성 문제점들을 야기하는 뇌 장애이다. 질병의 고전적인 징후 중 하나는 눈을 적절하게 조준할 수 없는 것이며, 이는 안구 운동들을 조정하는 노의 영역 내의 병변 때문에 발생한다. 일부 개인들은 이러한 영향을 블러링(blurring)으로서 설명한다. 영향을 받은 개인들은 흔히 우울증, 무관심뿐만 아니라 진행성 경도 치매를 포함하여, 감정과 행동의 변경을 나타낸다. 장애의 긴 이름은 질병이 느리게 그리고 계속해서 악화되기 시작하고(진행성), 안구 운동들을 제어하는 핵이라 불리는 완두콩 크기의 구조체들 위의(핵상) 뇌의 특정 부분들의 손상에 의한 쇠약(마비)을 야기하는 것을 나타낸다. 진행성 핵상성 마비는 처음에 1964년에 독특한 장애로 설명되었다. 이는 때때로 장애를 정의한 과학자들의 결합된 이름을 반영하여, 스틸-리차드슨-올체브스키 증후군(Steele-Richardson-Olszewski syndrome)으로서 언급된다. 비록 진행성 핵상성 마비가 상당히 악화되더라도, 누구도 진행성 핵상성 마비 자체로 사망하지는 않는다.

운동 실조증. 운동 실조증을 갖는 인간들은 협응력(coordination)에 대한 문제점을 갖는데 이동 및 균형을 제어하는 신경계의 일부분이 영향이 받기 때문이다. 운동 실조증은 손가락, 손, 팔, 다리, 대사(speech), 및 안구 운동에 영향을 미칠 수 있다. 용어 운동 실조증은 흔히 감염, 장애, 다른 질병들, 또는 중추신경계 내의 퇴행성 변화들과 관련될 수 있는 비-협응력의 증상을 설명하도록 사용된다. 운동 실조증은 또한 National Ataxia Foundation의 주요 역점인 유전성 및 산발적 운동 실조증으로 불리는 신경계의 특정 퇴행성 질병들의 그룹을 나타내도록 사용된다.

다-계통 위축. 다-계통 위축(MSA)은 퇴행성 신경 장애이다. 다-계통 위축은 신경 세포들의 퇴화와 관련된다. 이러한 세포 퇴화는 이동, 균형, 및 방광 제어 또는 혈압 조절과 같은 신체의 다른 자율 기능들에 대한 문제점을 야기한다. 다-계통 위축의 원인은 알려져 있지 않으며 어떠한 특이 위험 인자들도 확인되지 않았다. 약 55%의 케이스가 남자에서 발생하고, 발명의 일반적인 연령은 50대 후반 내지 60대 초반이다. 다-계통 위축은 흔히 파킨슨병과 일부 동일한 징후들로 존재한다. 다-계통 위축 환자들은 만일 있더라도 일반적으로 파킨슨병을 위하여 사용되는 도파민 약제들에 최소 반응을 나타낸다.

일부 실시 예들에서, 대상 방법들 및 조성물들은 노화 관련 인지 장애의 진행의 감속(slowing)에 사용한다. 바꾸어 말하면, 개인에서의 인지 능력들은 개시된 방법들에 의한 치료 이전 또는 치료의 부재에서보다 개시된 방법들의 치료 이후에 더 느리게 검소할 것이다. 그러한 일부 경우들에서, 대상 치료 방법들은 치료 이후의; 인지 감퇴의 진행의 측정, 및 인지 감퇴의 진행이 감소되는지의 결정을 포함한다. 그러한 일부 경우들에서, 결정은 기준, 예를 들면 대상 혈액 제품의 투여 이전에 두 개 이상의 지점에서 미리 인지의 측정에 의해 결정되는 것과 같은, 치료 이전의 개인에서의 인지 감퇴의 비율과의 비교에 의해 만들어진다.

대상 방법들 및 조성물들은 또한 개인, 예를 들면 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받는 개인 또는 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통의 위험이 있는 개인의 인지 능력들의 안전화에 사용한다. 예를 들면, 개인은 일부 노화 관련 인지 장애를 실증할 수 있고, 개시된 방법들로의 치료 이전에 관찰되는 인지 장애의 진행은 개시된 방법들에 의한 치료 이후에 중단될 것이다. 또 다른 예로써, 개인은 노화 관련 인지 감퇴의 발생에 대한 위험에 놓일 수 있고(예를 들면, 개인은 50세 이상일 수 있거나, 또는 노화 관련 장애를 진단받았을 수 있다), 개인의 인지 능력들은 실질적으로 변하지 않을 것인데, 즉 개시된 방법들로의 치료 이전과 비교하여 개시된 방법들로의 치료 이후에, 어떠한 인지 장애도 검출될 수 없다.

대상 방법들 및 조성물들은 또한 노화 관련 인지 장애로부터 고통을 받는 개인에서의 인지 장래를 감소시키는데 사용한다. 바꾸어 말하면, 인지 능력은 대상 방법들에 의한 처리 이후에 개인에서 향상된다. 예를 들면, 개인에서의 인지 능력은 대상 방법들에 의한 처리 이전에 개인에 관찰되는 인지 능력에 대하여 대상 방법들에 의한 처리 이후에 예를 들면 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 또는 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상 또는 100배 이상을 포함하는, 40배 이상 증가된다. 일부 경우들에서, 대상 방법들 및 조성물들에 의한 처리는 노화 관련 인지 감퇴로부터 고통을 받는 개인에서의 인지 능력을 개인이 약 40세 이하인 때의 레벨로 회복시킨다. 바꾸어 말하면, 인지 장애가 폐기된다.

시약들, 장치들 및 키트들

또, 위에 설명된 방법들 중 하나 이상을 실행하기 위한 시약들, 장치들 및 그것들의 키트들이 제공된다. 대상 시약들, 장치들 및 그것들의 키트들은 매우 다양할 수 있다. 흥미 있는 시약들 및 장치들은 그것들이 필요한 대상 내로의 투입을 위한 혈장 함유 혈액 제품의 제조 방법들과 관련하여 위에 설명된 것들, 예를 들면, 항-응고제, 냉동보존제, 완충제, 등장액 등을 포함한다.

또, 멸균 카트리지들, 또는 3.5 kDa 이하의 평균 분자량을 갖는 단백질들의 유동을 유지하거나 또는 지연시킬 매트릭스를 포함하는, 칼럼(column)들과 같은 장치들이 흥미롭다. 그러한 카트리지는 (ⅰ) 입구, (ⅱ) 크기 배제 매트릭스, (ⅲ) 출구, (ⅳ) 그 안에 매트릭스를 포함하는 하우징, 및 (ⅴ) 입구를 출구에 연결하는 하우징을 통한 유체 경로를 포함할 것이다. 카트리지는 적어도 하나의 유체 투과가능 멤브레인, 하나 이상의 다공성 섬유(들), 또는 복수의 입자를 포함하는 서포트(support)를 포함할 수 있다. 서포트는 하우징과 개별적으로 또는 그것의 통합 부품으로서 형성될 수 있으며, 예를 들면 알루미늄, 셀룰로오스, 덱스트린, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 또는 실리카를 포함하는, 어떠한 편리한 재료들로부터 제조될 수 있다. 카트리지는 멤브레인 여과 또는 칼럼 크로마토그래피에 의한 분리를 위하여 구성될 수 있고, 적절한 양의 단백질, 예를 들면 수 그램의 단백질로부터 결합할 수 있다. 무균 패키징은 멸균 및 무-발열 조건들로 유지하도록 입구, 및 출구를 둘러쌀 수 있다. 하우징은 약 200㎖-500㎖의 용량을 포함하도록 만들어질 수 있다. 예를 들면 더 큰 용량의 혈액 제품의 여과를 위하여, 더 큰 카트리지들이 또한 고려된다. 카트리지 부분들(예를 들면, 입구, 출구 및 하우징)은 유리, 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리스티렌(polystyrene), 또는 스테인리스 강으로 제조될 수 있다. 외부 펌프는 연성 튜빙을 통하여 라인 압력을 카트리지에 제공할 수 있고, 이에 의해 매트릭스 및 칼럼을 통하여 유체 상의 유동률을 제어할 수 있다.

이러한 시약들 및/또는 카트리지들을 포함하는 키트들이 또한 고려된다. 키트들은 또한, 혈액 수집 백(bsg), 튜빙(tubing), 니들(needle)들, 원심분리 튜브들 등을 포함할 수 있다.

또, 다른 실시 예들에서, 여기에 설명되는 것과 같은 키트들은 6개 이상의 젊은 혈장 제품의 컨테이너를 포함하여, 세 개 이상, 4개 이상, 5개 이상과 같은, 두 개 이상의 젊은 혈장 제품의 컨테이너를 포함한다. 일부 경우들에서, 크트 내의 구별되는 젊은 혈장 제품의 컨테이너의 수는 8개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 18개 이상, 21개 이상, 24 이상 또는 36개 이상, 예를 들면 48개 이상을 포함하여, 30 개 이상일 수 있다. 각각의 컨테이너는 그 안에 포함된 젊은 혈장 제품에 관한 다양한 데이터를 포함하는 식별 정보와 관련될 수 있으며, 이러한 식별 정보는 젊은 혈장 제품의 기증자의 연령, 젊은 혈장 제품에 관한 처리 상세내용, 예를 들면 혈장 제품이 평균 분자량(위에 설명된 것과 같은) 위의 단백질들을 제거하였는지의 상세내용, 혈액형 세부내용 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 키트 내의 각각의 컨테이너는 그 안에 포함된 젊은 혈장에 관한 식별 정보를 포함하고, 식별 정보는 젊은 혈장 제품의 기증자 연령에 관한 정보를 포함하며, 예를 들면 식별 정보는 젊은 혈장 제품 기증자의 노화 관련 데이터의 확인을 제공한다(그러한 식별 정보는 채취 시기의 기증자의 연령일 수 있다). 일부 경우들에서, 키트 컨테이너들의 각각의 컨테이너는 실질적으로 동일한 연령의 기증자로부터의 젊은 혈장 제품을 포함하는데, 즉 즉 모든 컨테이너는 실질적으로 동일한 기증자들, 만일 동일하지 않으면, 동일한 연령의 기증자들로부터의 제품을 포함한다. 실질적으로 동일한 연령은 키트들의 젊은 혈장 제품들이 획득되는 다양한 기증자들이 일부 경우들에서, 4년 이하, 예를 들면 1년 이하, 예를 들면 1개월 이하를 포함하는, 9개월 이하, 6개월 이하, 3개월 이하와 같은, 2년 이하를 포함하는, 3년 이하와 같은, 5년 이하로 차이가 나는 것을 의미한다. 식별 정보는 라벨, RFID 칩 등과 같은 컨테이너의 어떠한 편리한 부품 성에 존재할 수 있다. 식별 정보는 원하는 대로 인간 판독 가능할 수 있거나, 컴퓨터 판독 가능할 수 있거나 등일 수 있다. 컨테이너들은 어떠한 편리한 구성을 가질 수 있다. 컨테이너들의 용량은 다양할 수 있으나, 일부 경우들에서 용량은 25㎖ 내지 2500㎖, 예를 들면 100㎖ 내지 500㎖를 포함하는, 50㎖ 내지 1000㎖와 같은, 10㎖ 내지 5000㎖의 범위이다. 컨테이너들은 강성(rigid)이거나 또는 연성일 수 있으며, 어떠한 종래 재료, 예를 들면 의료용 플라스틱 재료들을 포함하는 중합체 재료들로부터 제조될 수 있다. 컨테이너들에 더하여, 그러한 키트들은 예를 들면 위에 설명된 것과 같은, 투여 장치들을 더 포함할 수 있다. 그러한 키트들의 부품들은 컨테이너들 또는 다른 키트 부품들을 지탱하도록 구성되는, 어떤 적절한 패키징, 예를 들면 박스 또는 유사 구조체 내에 제공된다.

위의 부품들에 더하여, 대상 키트들은 대상 방법들을 실행하기 이한 사양들을 더 포함할 것이다. 이러한 사양들은 하나 이상이 키트 내에 존재할 수 있는, 다양한 형태들로 대상 키트들 내에 존재할 수 있다. 이러한 사양들이 존재할 수 있는 한 가지 형태는 적절한 매체 또는 기판 상의 인쇄된 정보, 예를 들면 키트의 패키징 내의, 패키지 인서트 등 내의, 정보가 프린트되는 한 장 또는 여러 장의 종이와 같다. 또 다른 수단들은 그 안에 정보가 기록된, 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들면 디스켓, CD, 휴대용 플래시 드라이브 등일 수 있다. 존재할 수 있는 또 다른 수단들은 제거된 사이트에서의 정보를 액세스하도록 인터넷을 통하여 사용될 수 있는 웹사이트 주소이다. 어떠한 편리한 수단들도 키트들 내에 존재할 수 있다.

실험

아래의 실시 예들은 통상의 지식을 가진 자들에 본 발명의 생산 및 사용 방법의 완전한 내용과 설명을 제공하도록 제안되고, 이는 본 발명의 발명자들이 간주하는 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고 또한 아래의 실험들은 모두 또는 단지 실행되는 실험들이라는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 사용되는 숫자들(예를 들면, 양, 온도 등)과 관련한 정확도를 보장하도록 노력하였으나 일부 실험 오차들과 편차들이 처리되어야 한다. 달리 나타내지 않으면, 부분들은 중량의 부분들이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이며, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법들이 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook 등., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed.(Ausubel 등. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods(Bollag 등., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner 등. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual(I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998);과 같은 그러한 표준 교과서들에서 발견될 수 있으며, 이들은 여기에 참조로써 통합된다. 본 발명에 언급되는 유전 조작을 위한 시약들, 클로닝 벡터들, 및 키트들은 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 Clontech와 같은 상업용 공급업체로부터 이용 가능하다.

실시 예 1

여기에 노령 동물의 젊은 혈액으로의 노출이 구조적, 기능적 및 인지 레벨에서 노화하는 뇌의 기존 영향들에 대항할 수 있다는 사실이 도시된다. 젊은, 그리고 노령 동물들의 순환계들이 관련된, 이시성 부생체들의 유전자 전체 마이크로어레이 분석을 사용하여 노령 마우스들의 해마 내의 향상된 가소성을 나타내는 발현 프로파일이 확인되었다. 게다가, 성숙 신경세포들의 수상 돌기 밀도의 구조적 향상들 및 시냅스 가소성의 기능적 향상들이 노령 이시성 부생체들의 해마 내에서 관찰되었다. 마지막으로, 젊은 혈액 혈장의 노령 마우스들 내로의 정맥내 투여는 전후 관계상 두려움 조절 및 공간 학습과 기억 모두에서 노화 관련 인지 장애들을 개선시켰다. 함께, 이러한 데이터는 만년에 젊은 혈액으로의 노출이 노령 뇌에 존재하는 노화 관련 변화들을 반전시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

재료 및 방법

동물들. C57BL/6 젊은 마우스(mouse)들(Jackson Laboratory) 및 C57BL6 노형 마우스들(National Institutes on Aging)이 12시간 명:암 주기 하의 특이 무균(specific pathogen-free) 조건들 하에서 배양되었고 모든 동물의 처리와 사용은 VA Palo Alto Committee on Animal Research에 의해 승인된 기관 가이드라인에 따랐다.

병체결합 수술은 이전에 설명된 과정들을 따랐다(Villeda, S.A. 등. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature 477(7362), 90-94 (2011); Conboy, I.M. 등., Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment. Nature 433 (7027), 760-764 (2005)). 미러-이미지 절개들이 피부를 통하여 만들어졌고 짧은 절개가 복벽(abdominal wall)을 통하여 만들어졌다. 인접한 부성체들의 복막 개구부들이 함께 봉합되었다. 각각의 부생체로부터 팔과 무릎 관절이 함께 봉합되었고 각각의 마우스의 피부는 인접한 부생체의 피부에 봉합되었다(stapled, 9㎜ Autoclip, Clay Adams). 각각의 마우스는 바이트릴(Baytril) 항생제 및 통증을 위한 것과 같은 Buprenex로 동시에 주사되었고 회복 동안에 모니터링되었다.

유전자 마이크로어레이 분석. 등시성 및 이시성 부생체로부터 해마가 절개되었고 트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA가 추출되었다. cDNA 및 cRNA가 순차적으로 합성되었으며 제조사의 프로토콜에 따라 RNA 증폭 키트(Ambion)를 사용하여 증폭되었다. cRNA는 그리고 나서 제조사의 설명에 따라 Illumina 비드칩(beadchip) 어레이 MouseWG-6 v2.0에 혼합되었다. 제조사의 가이드라인을 따라 llumina 비드스튜디오(beadstudio) 데이터 분석 소프트웨어(Illumina)에 의해 데이터가 분석되었다. z-스코어 데이터 세트들의 무감독 계층 클러스터링을 위하여 Cluster 3.0 소프트웨어가 사용되었다. 히트 맵(heat map)들의 발생을 위하여 Java TreeView 소프트웨어가 사용되었다. 데이터 세트 분석을 위하여 Microarray 소프트웨어("stat.stanford.edu/~tibs/SAM/index.htm" 월드 와이드 웹 상에서 발견된, SAM 3.00 알고리즘)의 유의성 분석을 기초로 하는, 각각 P＜0.01 및 절대 d-스코어＞2(도 2b) 또는 d-스코어＞1.5(도 2b)에서의 컷-오프가 적용되었다. 상당히 변화된 프로브 세트들은 창의 경로 분석(IPA, Ingenuity Systems, www.ingenuity.com)을 사용하여 통계적으로 강화된 경로들을 위하여 분석되었으며 AmiGo("godatabase.org/cgi-bin/amigo/go/cgi 월드 와이드 웹 상에서 발견된, The Gene Ontology Consortium)를 사용하여 생물학적 기능을 위하여 분류되었다.

면역 조직 화학(immunohistochemistry). 조직 처리 및 면역 조직 화학이 표준 공개된 기술들을 따라 자유 부유 섹션(free-floating section)들 상에서 실행되었다(Ruckh 등, Rejuvenation of Regeneration in the Aging Central Nervous System, Stem Cell 10, 96-103 (2012)). 마우스들은 클로랄 수화물(chloral hydrate, Sigma-Aldrich)로 마취되었고 0.9% 식염수로 경심관류로(transcardially) 관류되었으며 뇌들이 제거되었고 30% 수크로오스로의 동결보호 이전에 48시간 동안 인산염 완충 4% 포름알데히드 내에 고정되었다. 자유 부유 대조군 섹션들(40㎕)이 래빗(rabbit) 항-Egr-1 (1:500; Santa Cruz), 래빗 항-cFos (1:500; Millipore) 또는 래빗 항-포스포 CREB (1:5000; Oncogene Research Products) 1차 항체들과 함께 하룻밤 동안 배양되었고 비오틴이 부착된(biotinylated) 2차 항체들 및 디아미노벤지딘(Diaminobenzidine, DAB, Sigma-Aldrich)을 갖는 ABC 카트(Vector)를 사용하여 염색이 나타났다. 개별 세포 수가 정량화되었고 Egr-1과 cFos, 및 인산화 CREB가 NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평균 신호 강도로서 정량화되었다.

골지 염색. 뇌 제거 이후에 반구체가 암실에서 실온으로 7-10일 동안 10㎖ '변형 골지-콕스(Golgi-Cox) 염색 용액(Jing, Deqiang 및 Lee, Francis, 코넬 대학교)'에 담겨졌다. 뇌들은 72시간 동안 4℃에서 dH₂O 내의 30% 수크로오스로 이동되었다. 섹션들(150㎕)은 dH₂O 내의 0.3% 젤라틴으로 코팅된 슬라이드들 상에 장착되었다(mounted). 간단히 건조한 후에, 슬라이스들은 40% 수크로오스에 3회 담겨졌고 암실에서 72시간 동안 공기 건조되었다. 슬라이스들은 부드러운 혼화(shaking)로 3×10분, dH2O 내로 담겨졌고, 그리고 나서 6분 동안 발생 용액으로 이동되었다. 슬라이스들은 그리고 나서 dH2o 내에서 3×10분 세척되었고, 등급의 에탄올을 통하여 탈수되었으며, 히스토클리어(Histoclear) 내에 담겨졌으며, 그리고 나서 DPX 장착 배지를 사용하여 커버슬립으로 덮었다. 신경세포들은 100배에서 추적되었고 뒤따르는 모든 분석은 Neurolucida 소프트웨어(v120, MBF Bioscience)를 사용하여 수행되었다. 세포체로부터 10㎕ 간격으로 등심성 구체를 위치시킴으로써 각각의 신경세포를 위한 숄 분석이 실행되었다. 수상 돌기가 각각의 구체를 교차한 횟수 및 각각의 구체 내의 총 수상 돌기 길이가 정량화되었다. 수상 돌기 길이는 x, y, 및 z 평면 내의 거리를 가로지르고 각각의 반지름 내에 포함되는 신경세포들의 다중 수지상 분지를 가로질러 합산되었다.

세포외 전기생리학. 새포외 전기생리학은 이전에 설명된 것과 같이 실행되었다(Rosenzweig, E.S. & Barnes, C.A., (2003) Impact of aging on hippocampal function: plasticity, network dynamics, and cognition. Progress Neurobiol. 69(3), 143-179). 급성 해마 조각들(400㎕ 두께)이 노령 부생체들로부터 준비되었다. 조각들은 5% CO₂/95% O₂로 연속적으로 산소 공급되는 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, ACSF; mM 단위로: NaCl 124.0; KCl 2.5; KH₂PO₄ 1.2; CaCl₂ 2.4; MgSO₄ 1.3; NaHCO₃ 26.0; 글루코오스 10.0) 내에 유지되었다. 기록들은 Axopatch-2B 증폭기 및 pClamp 10.2 소프트웨어(Axon Instruments)로 실행되었다. 잠긴 조각들은 중력 주유에 의해 레저버로부터 2㎖/분의 유동률로 산소 공급되는 인공 뇌척추액으로 연속적으로 뿌려졌다. 필드 전위(군집 전위(population spike))는 인공 뇌척수액으로 채워진 유리 미소전극들을 사용하여 기록되었다(저항: 4-8 MΩ). 2상 전류 펄스(1 위상 당 0.2ms, 총 0.4ms)가 동심 양극 자극 전극(FHC, Inc)을 통하여 10초 간격으로 전달되었다. 이러한 주파수 자극으로 어떤 명백한 스냅스 저하 또는 촉진도 관찰되지 않았다. 치상회 내의 필드 군집 전위를 기록하기 위하여, 기록 전극은 치상회의 배 부위의 측 또는 중간 측면에 위치되었다. 자극 전극은 관통 경로(perforant pathway) 섬유들을 자극하기 위하여 해마 열창(hippocampal fissure) 바로 이에 위치되었다. 신호들은 1㎑에서 필터링되었고 10㎑에서 디지털화되었다. 100 펄스(0.4ms 펄스 기간, 100㎐)의 2개의 트레인으로 구성되는 파상풍 자극(Tetanic stimulation)이 3초의 트레인간 간격으로 전달되었다. 군집 전위의 진폭은 음성파(negative wave)의 초기 위상으로부터 측정되었다. 5회의 연속적인 트레이스(trace)까지 각각의 측정에 대하여 평균을 구하였다. 시냅스 전달은 입력-출력 곡선들의 발생에 의해 평가되었으며, 자극 강도는 최대의 약 30%로 조정되었고, LTP는 그것의 기본 진폭에 대하여 높은 주파수 자극을 따르는 군집 전위의 진폭의 평균 퍼센트 변화로서 계산되었다.

전후 관계상 두려움 조절. 패러다임은 이전에 공개된 기술들을 따랐다(Alberini, C.M., Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity. Physiol. Rev. 89(1), 121-145 (2009)). 마우스들은 환경적 전후관계(두려움 조절 챔버)를 해마 의존적 전후 관계상 두려움 조절을 위한 검사를 가능하게 하는 혐오 자극(가벼운 발 충격, 무조건 자극(US))과 연관시키도록 학습하였다. 가벼운 발 충격은 또한 편도체(amygdala) 의존적 신호 두려움 조절을 평가하기 위하여 광 및 톤 신호(조건 자극(conditioned stimulus, CS))와 짝을 이루었다. 조건식 두려움은 프리징 행동으로서 나타내었다. 특정 훈련 파라미터들은 아래와 같다: 톤 기간은 30초이다; 레벨은 70dB, 2㎑이다; 충격 기간은 2초이다; 강도는 0.6mA이다. 1일째에 각각의 마우스는 두려움 조절 챔버 내로 위치되었고 2초 발 충격(0.6mA)으로 끝나는 30초 톤(70dB)의 전달 이전에 2분 동안 살피도록 허용되었다. 2분 후에, 제 2 조건 자극/무조건 자극 쌍이 전달되었다. 2일째에 각각의 마우스는 먼저 동일한 정확한 전후관계를 포함하나 조건 자극 또는 발 충격의 투여가 없는 두려움 조절 챔버 내에 위치되었다. 프리징은 1-3분 동안 분석되었다. 1시간 후에, 마우스들은 다른 냄새, 세정 용액, 바닥 질감, 챔버 벽 및 형태를 포함하는 새로운 전후 관계에 위치되었다. 동물들은 조건 자극에 재노출되기 전에 2분 동안 살피도록 허용되었다. 프리징은 FreezeScan 비디오 추적 시스템 및 소프트웨어(Cleversys, Inc)를 사용하여 측정되었다.

방사상 암 수중 미로. 패러다임은 이전에 설명된 프로토콜을 따랐다(Jones, M.W. 등. A requirement for the immediate early gene Zif268 in the expression of late LTP and long-term memories. Nat. Neurosci. 4(3), 289-296 (2001)). 플랫폼을 포함하는 목표 암 위치는 훈련 및 검사 기간을 통하여 일정하게 유지되나, 출발 암은 각각의 시도 동안에 변경된다. 훈련기간 동안의 1일째에, 마우스들은 15회 시도 동안 훈련되고, 시도들은 가시 및 숨겨진 플랫폼 사이에서 변경된다. 검사기간 동안의 2일째에, 마우스들은 숨겨진 플랫폼으로 15회 시도 동안 검사된다. 부정확한 목표 내로의 진입은 오류로서 점수가 주어지고, 오류들은 훈련 블록들에 걸쳐(3회의 연속적인 시도) 평균을 낸다.

혈장 수집. 죽을 때에 심장 내 출혈에 의해, 200-300 젊은(3개월령) 또는 노령(18개월령) 마우스들로부터 풀링된(pooled) 마우스 혈장이 수집되었다. 혈장은 EDTA로 수집된 혈액으로부터 준비되었고 그 뒤에 원심분리가 뒤따랐다. 부분 표면은 사용 때까지 -80℃에서 저장되었다. 투여 이전에 혈장은 3.5 kDa 이하의 평균 분자량을 갖는 단백질을 제거하기 위하여 3.5 kDa 분자량 배제 멤브레인을 통하여 PBS 내에 투석되었다. 젊은 성인 마우스들이 젊거나 또는 노령 마우스들로부터 분리된 혈장(100㎕/주입)으로 24일 동안 8회 꼬리 혈관(tail vein) 내로의 정맥 내 주입을 통하여 처리되었다.

데이터 및 통계 분석. 데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표현된다. 통계 분석은 프리즘(Prism) 5.0 소프트웨어(GraphPad Software)로 실행되었다. 두 그룹 사이의 평균들은 양측 짝이 없는 스튜던트 t-테스트(two-tailed, unpaired Student's t test)로 비교하였다. 서로에 대한 또는 하나의 대조군 그룹에 대한 다중 그룹으로의 평균의 비교는 일원 변량 분석(1-way ANOVA) 및 본페로니 사후 검정들로 분석되었다. 수행되는 모든 조직학, 전기 생리학 및 행동 실험은 무작위 및 블라인드 방식으로 수행되었다.

결과

인간과 마우스들에서, 해마는 공간 및 간헐적(episodic) 인지 기능들에서의 장애들을 야기하는 형태학적 변경들과 감소된 가소성의 영향에 특히 취약한 뇌 영역이다(Andrews-Hanna, J.R. 등. Disruption of large-scale brain systems in advanced aging. Neuron 56(5), 924-935 (2007); Scheff, S.W. 등. Synaptic alterations in CA1 in mild Alzheimer's disease and mild cognitive impairment. Neurology 68, 1501-1508 (2007); Nicholson, D.A. 등. Reduction in size of perforated postsynaptic densities in hippocampal axospinous synapses and age-related spatial learning. J. Neurosci. 24, 7648-7653 (2004); Smith, T.D. 등. Circuit-specific alterations in hippocampal synaptophysin immunoreactivity predict spatial learning impairments in aged rats. J. Neurosci. 20, 6587-6593 (2000); Geinisman, Y. 등. Loss of perforated synapses in the dentate gyrus: morphological substrate of memory deficits in age rats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3027-3031 (1986); Heeden, T. & Gabrieli, J.D., Insights into the ageing mind: a view from cognitive neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 5(2), 87-96 (2004); Morrison, J.H. & Baxter, M.G., The ageing cortical synapse: hallmarks and implications for cognitive decline. Nature Rev Neurosci 13(4), 240-250 (2012); Villeda, S.A. 등. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature 477(7362), 90-94 (2011); Raz, N. 등. Neuroanatomical correlates of cognitive aging: evidence from structural magnetic resonance imaging. Neuropsychology 12(1), 95-114 (1998); Mattson, M.P. & Magnus, T., Ageing and neuronal vulnerability. Nat. Rev. Neurosci. 7(4), 278-294 (2006); Rapp, P.R. & Heindel, W.C., Memory systems in normal and pathological aging. Curr. Opin. Neurol. 7(4), 294-298 (1994); Rosenzweig, E.S. & Barnes, C.A., Impact of aging on hippocampal function: plasticity, network dynamics, and cognition. Progress Neurobiol. 69(3), 143-179 (2003)). 따라서, 본 발명의 발명자들은 이시성 부생체들(도 1a) 및 혈액 혈장 투여(도 3a)의 조합을 사용하여 분자적, 구조적, 기능적 및 인지 레벨에서 마우스들의 해마의 노화 내에서 젊은 혈액으로의 노출이 갖는 잠재적 이득들을 조사하였다.

젊은 혈액으로의 전신 노출이 해마의 노화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 광범위한 이해를 얻기 위하여, 본 발명의 발명자들은 노령 등시성(노령-노령) 및 이시성(노령-젊은) 부생체들로부터 해마의 전체 유전자 마이크로어레이 분석을 실행하였다(도 1a). 무감독 계층 클러스터링은 등시성 및 이시성 그룹들 사이에 독특한 유전자 발현 프로파일을 나타내었다(도 1b). 생물학적 과정들의 유전자 온톨로지(GO) 분류를 사용하여 본 발명의 발명자들은 시냅스 가소성 조절 하에서 분류되는 이시성 부생체들 내에 상이하게 발현된 유전자들의 서브셋을 식별하였다(도 1c). 게다가, Ingenuity Pathway Analysis(IPA)는 또한 이시성 부생체들 내의 탑 시그널링 네트워크(top signaling network)의 일부분으로서 Egr1(Alberini, C.M., Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity. Physiol. Rev. 89(1), 121-145 (2009); Jones, M.W. 등. A requirement for the immediate early gene Zif268 in the expression of late LTP and long-term memories. Nat. Neurosci. 4(3), 289-296 (2001)) 및 cyclic AMP response element binding (CREB) protein (Alberini, C.M., Transcription factors in long-term memory and synaptic plasticity. Physiol. Rev. 89(1), 121-145 (2009); Guzowski, J.F. 등. Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos, and zif268. J. Neurosci. 21(14), 5089-5098 (2001); Sanciu, M., 등. Phosphorylated cAMP response element binding protein in the mouse brain after fear conditioning: relationship to Fos production. Brain Res. Mol. Brain Res. 94(1-2), 15-24 (2001))을 포함하는 가소성 관련 시그널링 경로들의 두드러진 관여를 검출하였다(도 1d), 함께, 본 발명자들의 마이크로어레이 분석은 이시성 부생체들의 해마 내의 향상된 가소성을 나타내는 전사 프로파일의 존재를 시사한다.

시냅스 가소성과 관련된 분자 변화들을 더 조사하고, 본 발명자들의 마이크로어레이 분석을 확증하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 본 발명자들의 마이크로어레이 분석으로부터 확인된 인자들의 서브셋의 활성을 조사하였다. 특히, 본 발명의 발명자들은 노령 부생체들의 해마의 치상회(DG) 내의 면역조직화학에 의한, 활성 의존적 전초기(immediate early) 유전자들(Egr1 및 c-Foe)의 단백질 발현뿐만 아니라, CREB 인산화를 조사하였다(도 2a-d). 본 발명의 발명자들은 등시성 부생체들과 비교하여 해마 내의 Egr1(도 2a, b) 및 c-Fos(도 2a, c)를 발현하는 세포들의 수의 증가, 및 인산화된 CRE의 레벨(도 2a, d)의 상응하는 중가를 관찰하였다. 이전에 보고된 것과 같이, 말초적으로 유도되는 세포들은 부생체들의 뇌 내에서 거의 검출되지 않았으며(Villeda, S.A. 등. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature 477(7362), 90-94 (2011); Ajami, B. 등., Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neuro 10(12), 1538-1543 (2007)) 분자 변화들은 병체 결합 시술 자체에 의해 유발되지 않았다(도 4). 이러한 데이터는 노령 동물들의 해마 내의 시냅스 가소성이 젊은 혈액으로의 전신 노출에 의해 향상될 수 있다는 것을 나타낸다.

시냅스 가소성과 관련된 분자 변화들을 확인한 후에, 본 발명의 발명자들은 그 다음에 노령 부생체들 내의 시냅스 형성의 기초를 이루는 구조적 변화들을 특징지었다. 골지 분석을 사용하여, 본 발명의 발명자들은 척추 형성 및 수지상 분지(dendritic arborization)의 변화들을 위한 해마의 치상회 내의 기존의 성숙 신경세포들을 조사하였다. 흥미롭게도, 본 발명의 발명자들은 해마 과립 세포 신경세포들의 개별 수상 돌기들을 따라 수상 돌기들의 밀도가 등시성 부생체들과 비교하여 이시성에서 증가된 것을 관찰하였다(도 2e, f). 그러나 등시성 및 이시성 그룹들 사이에서 수지상 복잡도(도 5a), 수지상 분지 수(도 5b) 또는 수지상 분지 길이(도 5c)의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 함께, 이러한 구조적 데이터는 노령 동물의 젊은 혈액으로의 노출이 노화하는 해마 내의 시냅스 형성을 선택적으로 향상시킨다는 것을 나타낸다. 노령 뇌에서의 기능적 향상들이 또한 젊은 혈액으로의 노출에 의해 유발될 수 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 노령 부생체들로부터 준비된 해마 조각들에 대한 세포외 전기생리학적 기록들을 실행하였다. 등시성 부생체들의 치상회 내의 장기간 강화(long-term potentiation, LTP)는 기준선(baseline) 레벨에 빠르게 도달하였으나, 비-등시성 부생체들 내의 장기간 강화는 기록 기간을 통하여 기준선 위를 유지하였다(도 2g). 그룹들 사이에 시냅스 강도의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다(도 5d). 이러한 기능적 데이터는 노령 동물들의 해마 내의 시냅스 가소성이 젊은 혈액으로의 노출에 의해 향상된다는 것을 나타낸다.

학습 및 기억이 시냅스 형성에 의해 세포 레벨에서 매개되는 것을 고려할 때(Rosenzweig, E.S. & Barnes, C.A., Impact of aging on hippocampal function: plasticity, network dynamics, and cognition. Progress Neurobiol. 69(3), 143-179 (2003); Bliss, T.V. & Collingridge, G.L., A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361(6407), 31-39 (1993); Martin, S.J., Grimwood, P.D. & Morris, R.G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu. Rev. Neurosci. 23, 649-711 (2000)) with LTP serving as a putative functional correlate (Bliss, T.V. & Collingridge, G.L., A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361(6407), 31-39 (1993); Martin, S.J., Grimwood, P.D. & Morris, R.G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu. Rev. Neurosci. 23, 649-711 (2000)), 젊은 혈액으로의 노출 이후에 관찰되는 구조적 및 기능적 향상들이 더 높은 수준의 인지 과정들에서의 향상들을 수반할 수 있다는 것을 가정하는 것은 흥미로운 사실이다. 특히, 해마는 새로운 기억들의 획득과 유지에 기본적으로 중요하다. 그러나 이러한 과정들은 노화의 영향에 의한 장애에 상당히 민감하다(Villeda, S.A. 등. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature 477(7362), 90-94 (2011); Rapp, P.R. & Heindel, W.C., Memory systems in normal and pathological aging. Curr. Opin. Neurol. 7(4), 294-298 (1994)). 따라서, 젊은 혈액으로의 노출이 실제로 노령 마우스들 내의 해마 의존적 학습 및 기억들의 장애를 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 전후 관계상 두려움 조절 및 방사상 수중 미로(RAWM) 패러다임들을 사용하였다(도 3). 대조군으로서, 본 발명의 발명자들은 먼저 젊은 미처리 동물들 그리고 노령 미처리 동물들의 코허트(cohert)를 조사하였고 두 행동학적 패러다임으로 노화 관련 인지 장애들을 관찰하였다(도 6). 그 뒤에, 인지 검사 이전에 노령 마우스들의 독립 코허트가 젊거나 또는 노령 혈장으로 정맥 내로 2주 동안 총 8회 주사되었다(도 3a). 두려움 조절 동안에, 모든 마우스는 처리와 관계없이 유사한 기준선 프리징을 나타내었다(도 7a). 그러나 젊은 혈장을 받은 노령 마우스들은 전후 관계상 기억 검사에서 증가된 프리징을 나타내었으나(도 3b), 신호 기억 검사에서는 나타내지 않았다. 부가적으로, 방사상 수중 미로 패러다임의 훈련 기간에 모든 마우스는 유사한 공간 학습 능력(도 3c) 및 수영 속도(도 7c)를 나타내었다. 흥미롭게도, 젊은 혈장으로 투여된 노령 동물들은 본 발명자들의 전후 관계상 두려움 조절과 일치하는(도 3b), 작업의 검사 기간 동안에 플랫폼 위치에 대한 향상된 학습 및 기억을 입증하였다(도 3c). 중요하게도, 미처리 및 노령 혈장 처리된 동물들 사이에 두려움 조절 또는 방사상 수중 미로의 어떠한 인지 차이들도 검출되지 않았으며(도 8), 이는 젊을 때 유도된 혈액의 중요성을 입증한다. 함께, 이러한 행동학적 데이터는 젊은 혈액의 투여가(만년에서도) 노령 동물들에서의 해마 의존적 학습 및 기억의 인지 향상을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.

점증적으로, 본 발명자들의 데이터는 젊은 혈액으로의 노출이 노화 신경계의 재생 능력을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 게다가 심지어 구조적, 기능적 및 인지적 레벨에서 노화 자체의 기존 영향들에 대응할 수 있다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 현재 데이터는 감소된 신경발생 및 노화 관련 인지 감퇴 사이의 가벼운 연관성과 관련하여 일치하지 않는다(Morrison, J.H. & Baxter, M.G., The ageing cortical synapse: hallmarks and implications for cognitive decline. Nature Rev Neurosci 13(4), 240-250 (2012); Merrill, D.A. 등. Hippocampal cell genesis does not correlate with spatial learning ability in age rats. J. Comp. Neurol. 459, 201-207 (2003); Bizon, J.L. & Gallagher, M. Production of new cells in the rat dentate gyrus over the lifespan: relation to cognitive decline. Eur. J. Neuorsci. 18, 215-219 (2003); Drapeau, E. 등. Spatial memory performances of aged rats in the water maze predict levels of hippocampal neurogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14385-14390 (2003); Leuner, B. 등. Diminished adult neurogenesis in the marmoset brain precedes old age. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 17169-17173 (2007); Luo, J. 등., Glia-dependent TGF-beta signaling, acting independently of the TH17 pathway, is critical for initiation of murine autoimmune encephalomyelitis. J Clin Invest 117 (11), 3306-3315 (2007)). 그 결과, 이는 젊은 혈액으로의 노출 이후에 본 연구에서 관찰된 인지 향상들이 대부분 재생 능력의 변화에 기인하지 않고 가소성에서의 향상들의 결과에 기인한다는 것을 제안한다.

결국, 본 발명의 발견들은 노령 뇌 내에 남아있는 잠재적 가소성을 활용함으로써 노령자의 인지 장애의 반전을 목적으로 하는 치료적 개입을 향한 젊은 혈액의 이용의 실현 가능성을 나타낸다. 중요하게도, 이러한 연구들은 젊은 혈액의 투여의 바람직한 효과가 정상 노화를 넘어 AD와 같은 노화 관련 퇴행성 장애들로 고통을 받는 자들의 세포 및 인지 감퇴의 반전을 향하여 확장할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시 예 2

인지에 대한 재생 효과들을 매개하는데 있어서 젊은 혈액 내에 존재하는 가용성 인자들의 필요성을 평가하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 젊은 혈장 또는 열 변성된 혈장으로의 꼬리 혈관 주입에 의해 노령 마우스들(18개월)을 처리하였다. 순환 내에 존재하는 음성 인자들의 희석이 인지 향상을 기본을 이룰 수 있다는 가능성을 평가하기 위하여 PBS가 주입되었다. 젊은(8주) C57Bl/6J 마우스들로부터 수집되었고 3.5kDa 분자량 배제 멤브레인으로의 투석 이전에 풀링되었다(pooled). 혈장의 일부분은 95℃에서 2-3분의 변성에 의해 열 변성되었다. 마우스들은 수 주에 걸쳐 8회 주사되었고 goal 의존적 기억을 평가하기 위하여 두려움 조절 패러다임에 노출되었다. 마우스들에 광(light) 및 톤(tone)과 병행하여 가벼운 발 충격이 주어진 훈련의 1일차 이후에, 마우스들은 동일한 전후관계에 노출되었고 프리징 행동이 평가되었다. 케이지 환경은 그리고 나서 변경되었고 해마 의존적이 아니었던(단서) 기억을 평가하기 위하여 프리징 행동이 측정되었다. 도 9에 설명된 것과 같이, 젊은 혈장의 변성은 노령 마우스들의 인지 능력들에 대한 젊은 혈장의 긍정적인 효과들을 폐지하였다.

실시 예 3

젊은 혈장의 운반을 최적화하기 위하여, 인지 검사 및 조직학적 분석 이전에 3주 동안 1주일에 1회(150㎕/주입) 2개월령 마우스들로부터의 혈장이 18개월령 마우스들에 투여되는 실험이 수행되었다(도 8). 이러한 연구들은 완전히 맹검으로(blindel) 수행되었다. 도 10에 도시된 것과 같이, 본 발명의 발명자들은 나이가 일치하는 식염 처리 대조군들과 비교하여 젊은 혈장으로 처리된 마우스들에서 전후 관계상 두려움 조절 패러다임에서의 증가된 프리징, 더 나은 RAWM 성능, 및 두 배 더 많은 BrdU+ 신경세포들을 관찰하였다.

실시 예 4

여기에 젊은 건강한 순환계 환경에 알츠하이머병을 모델링하는 마우스의 노출이 이러한 모델들과 관련된 것으로 알려지고 질병을 갖는 인간 환자들에 유사하게 발생하는 것으로 알려진 신경병리학을 감소시키는 것이 도시된다.

상염색체 우성 알츠하이머병을 갖는 가족들에서 발견되는 돌연변이들을 포함하는 인간 아밀로니드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)을 과생산하는 형질전환 마우스 모델들은 아밀로이드 플라크, 신경퇴화, 및 행동 결손을 포함하는, 질병의 중요한 양상들을 복제한다. Thy1,2 프로모터, 특히 Masliah 연구실에 의해 발생된 Line 41(Rockenstein, E. 등. Early Formation of Mature Amyloid-β Protein Deposits in a Mutant APP Transgenic Model Depends on Levels of Aβ 1-42. Journal of Neuroscience Research 66:573-582 (2001)), develop amyloid pathology, neurodegeneration, and cognitive deficits (Rockenstein 등., supra)의 제어 하에서 신경세포들 내의 인간 APP751^{V7171,K670M/N671L}(aka 런던 및 스웨덴 돌연변이들)을 과발현하는 형질전환 마우스들은 아밀로이드 병리, 신경퇴화, 및 인지 결손을 발생한다(Rockenstein 등., supra). 이러한 마우스들(hAPP^L/S)은 다수의 독립 학술 실험실에서 연구되어 왔으며(Pickford 등. The autophagy-related protein beclin 1 shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid β accumulation in mice. J. Clin. Invest (2008); Faizi 등. Thy1-hAPPLond/Swe+ mouse model of Alzheimer's disease displays broad behavioral deficits in sensorimotor, cognitive and social function. 2012. Wiley Periodicals, Inc. Brain and Behavior; Knowles 등. The p75 Neurotrophin Receptor Promotes Amyloid-13(1-42)-Induced Neuritic Dystrophy in Vitro and in Vivo The Journal of Neuroscience, August 26, 29 (34):10627-10637 (2009)) 약물 개발을 위한 모델로서 사용되어 왔다.

마우스들 내의 AD 유사 질병에 대한 젊은 순환계 인자들의 영향을 결정하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 본 발명자들이 APP751^L/S와 함께 젊은 동물들을 연결한 이시성 병체결합(heterochronic parabiosis)을 사용하였다(도 11a). 노령 수컷(hAPP^L/S)의 해마 내에서, 젊은 혈액으로의 노출은 면역조직화학 및 생화학적 분석에 의해 측정된 것과 같이, 불용성 Aβ 레벨들에 영향을 미치지 않았다(도 11b, c).

시냅스 및 칼슘 결합 단백질들은 알츠하이머병 및 질병의 마우스 모델들에서 초기에 결핍되는 것으로 일관하여 나타났다. 해마의 치상회(DG)의 분자 층 내의 시냅스전(presynaptic) 터미널들 내의 시냅토파이신 면역활성의 정량화는 APP 이시성 부생체들에서 부분적으로 복원된, 야생형 등시성 부생체들과 비교하여 APP 등시성 부생체들에서 상당한 감소를 나타내었다(도 11d). 캘빈딘 면역활성을 위하여 동일한 영역이 분석되었다. 비록 캘빈딘이 완전히 결핍되지 않았으나, APP 이시성 마우스들에서 설명된 것과 같이 젊은 전신 환경으로의 노출 이후에 감소된, 야생형 등시성 부생체들과 비교하여 APP 등시성 부생체들의 치상회 내에서 상당한 감소가 관찰되었다(도 11e). 암컷 hAPP^L/S 마우스들은 수컷들과 비교하여 가속된 Aβ 강하를 가지며 중간 연령에서 감소된 캘빈딘 및 시냅토파이신 레벨들을 나타낸다. 수컷 마우스들과 유사하게, 캘빈딘 면역활성은 중간 연령의 암컷 APP 이시성 부생체들에서 복원되었으며(도 11f), 이는 젊은 순환계의 이득이 두 성별 모두에 적용되는 것을 나타낸다.

본 발명의 발명자들은 이전에 노화하는 뇌에 대한 이시성 병체결합의 유용한 효과들이 부분적으로 젊은 마우스들로부터의 혈장의 전신 주입에 의해 달성될 수 있다는 것을 나타내었으며(Villeda 등. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med 20, 659-663 (2014)), 따라서 본 발명의 발명자들은 젊은 혈장이 hAPP^L/S 마우스들에서 유사한 이득들을 가질 수 있는지를 조사하였다. 본 발명의 발명자들은 hAPP^L/S 마우스들의 그룹 및 야생형 한배 새끼(littermate)들의 그룹 내에 젊은 혈장 또는 PBS를 주입하였다. 각각의 그룹은 4주의 기간 동안에 8회의 꼬리 혈관 주입을 받았다.

모든 4개 처리 그룹의 치상회 내의 시냅토파이신 면역 활성의 정량화는 hAPP^L/S 마우스들 내의 젊은 혈장 투여가 야생형 대조군들의 레벨에 대하여 발현 레벨들을 복원하였다는 것을 설명하였다. hAPP^L/S 마우스들 내의 시냅토파이신 레벨들은 또한 신피질(neocortex), 다른 나머지들에 의해 도시된 것에 같이, 시냅스 터미널들이 hAPP^L/S 마우스들 내에서 감소된 또 다른 영역, 내의 야생형 레벨들로 복원되었다. 젊은 혈장 투여는 야생형 마우스들의 치상회 내의 캘빈딘(calbindin) 면역 활성에 영향을 미치지 않았다. 그러나, hAPP^L/S 마우스들이 젊은 혈장으로 주입되었을 때 야생형 마우스들과 비교하여 hAPP^L/S 마우스들 내의 캘빈딘 면역활성의 상당한 감소는 존재하지 않았다. 이러한 결과는 혈장 투여가 이시성 병체결합과 유사한, 시냅스 활성 및 칼슘 결합과 관련된 경로들을 복원할 수 있다는 것을 나타낸다. 본 발명의 발명자들은 그리고 나서 칼슘 네트워크 내에 관련된 주요 시그널링 분자들 중 하나, APP 마우스들에서 증가되는 것으로 알려진, MAP 키나아제 ERK에 대한 젊은 혈장 투여의 효과를 평가하였다. 인산화 ERK(pERK) 및 ERK의 웨스턴 블롯 분석(도 12d)은 감소된 ERK 활성을 나타내는, 혈장 투여의 결과로서(도 12e) hAPP^L/S 마우스들 내의 감소된 비율의 pERK 대 ERK 비율을 나타내었다.

세포내 칼슘 조절이 시냅스 가소성 및 기억 기능을 위하여 중요하고 알츠하이머병에서의 감소된 시냅토파이신 및 캘빈딘이 인지 감퇴와 상관되기 때문에, 본 발명의 발명자들은 젊은 혈장 투여에 의한 이러한 분자들 및 그것들의 기능의 복원이 hAPP^L/S 마우스들의 기억을 향상시킬 수 있다는 것을 가정하였다. 이러한 마우스들에서의 공간 작업 기억을 평가하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 Y-미로 자발성 변경 검사(Y-maze spontaneous alternation test)를 사용하였다(도 12f). 비록 PBS 처리된 hAPP^L/S 마우스들이 손상된 작업 기억을 나타내는, 50% 기회 레벨 하에서 실행되었으나(P＜0.41), 혈장 처리된 hAPP^L/S 마우스들은 기회 레벨 위에서 실행하였으며(P＜0.0082) 상당히 더 자발적 변경들을 만들었다. 혈장 처리 이후의 작업 기억의 향상들이 활성의 변화에 기인하지 않는다는 것을 나타내는, 두 처리 그룹 사이의 암 엔트리(arm entry)들의 총 수 사이의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 연상 학습 및 기억을 평가하기 위하여 본 발명의 발명자들은 단서 및 전후 관계상 두려움 조절 검사를 실행하였다. 훈련 기간 동안에, 두 그룹 모두는 유사한 기준선 프리징을 나타내었고 편도체(amygdala) 의존적 단서 기억에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 그러나 젊은 혈장을 받은 hAPP^L/S 마우스들은 해마 의존적 전후 관계상 기억 검사에서 증가된 프리징을 나타내었으며(도 12g), 이는 젊은 혈장이 알츠하이머병의 마우스 모델 내의 이러한 학습 및 기억 결손들을 회복시킬 수 있다는 것을 설명한다.

실시 예 5

여기에 단백질들의 서브셋을 포함하는 젊은 혈장의 정의된 분획들 및 원상태 혈장 내에 존재하는 그러한 분자들은 시냅스 가소성 유전자 네트워크들을 활성화하기에 충분하다는 것이 도시된다. 게다가, 분자 크기가 상당히 다른 단백질들 또는 분자들은 뇌와 통신할 수 있고 해마 내의 유전자 발현의 변화들을 유도할 수 있다. 2-3개월령 마우스들로부터 수확된 집단의 마우스 혈장은 정의된 분자량 절단들(3.5 kDa, 25 kDa, 50 kDa)을 갖는 투석 막(dialysis membrane)들을 사용하여 크기에 의해 대략 그것의 성분들의 분자량 내포를 기초로 하여 다음의 분획들로 분리되었다: ＞3.5 kDa, ＞25 kDa, 및 ＞50 kDa. ＞3.5 kDa. 분획의 사용 및 단백질 G 친화 침전법(affinity precipitation)에 의한 IgG 면역글로불린의 결핍에 의해 부가적인 분획이 발생되었다. 각각의 분획은 18개월령 마우스들(n = 분획 당 4-5 마우스) 내로 2주 동안 7회 정맥 내로 주입되었으며(주입 당 125㎕); 인산 완충 용액(PBS)이 대조군으로서 주입되었다. 처리의 끝에서, 뇌들은 절개되었고 해마 RNA가 추출되었으며 Affymetrix 유전자 어레이들을 사용하여 분석되었다. 수 백가지 유전자들이 PBS 처리된 마우스들과 비교할 때 혈장 분획들 중 어느 하나로 처리된 마우스들의 뇌들에서 당당히 변화하였다(도 13). 소프트웨어 툴(Ingenuity Pathway Analysis®(IPA))로의 생물 정보학(bioinformatics) 분석은 몇몇 네트워크들이 ＞25 kDA 분획에서 상당히 강화되었으나, 나머지 분획들에서 강화되지 않았거나 또는 덜 강화된 시냅스 가소성 그리고 학습 및 기억(예를 들면, 장기간 강화, 신경돌기들의 분지, 행동)과 관련되는 것을 나타내었다. 그러한 네트워크들 내의 중요한 유전자들은 릴린(Reelin), 신경영양성 티로신 키나아제(Neurotrophic tyrosine kinase) 3 수용체 및 에프린(Ephrin) 수용체 4A를 포함하는, 학습 및 기억에 알려진 유전자들을 포함하였다(표 1).

표 1

표 1: 25 kDA 이상의 혈장 또는 비히클로 처리된 뇌들 내에 검출된 상당히 변화된 유전자들을 사용하여, 경로 분석(IPA)이 실행되었으며, 이는 최상 네트워크로서 범주 "신경 시스템 발생 및 기능" 내의 상당히 강화된 유전자들의 네트워크들을 나타낸다. 이러한 네트워크는 386 분자로 구성되었다. 이러한 네트워크 내의 특정 경로들은 관련 P 값들 및 그러한 네트워크 내의 유전자 변화들을 기초로 하는 기능적 예측으로 도시된다.

함께, 이러한 발견들은 상이한 분자량의 분자들이 학습 및 기억과 관련된 유전자들을 활성화할 수 있으며 혈장의 일부 분획들은 뇌 내의 이러한 유전자들을 활성화하기에 충분하고, 나머지들은 우수하다는 것을 설명한다.

실시 예 6

여기에 젊은 혈장의 노령 마우스로의 투여가 처리의 생물체 전체 효과들을 나타내는, 혈액 내의 전신 변화들을 야기한다는 사실이 도시된다. 특히, 12개월령의, 노화된 마우스들이 2개월령 마우스들로부터의 혈장으로 총 4주 동안 1주일에 2회 주입되었다(n = 그룹 당 13-14 마우스). 각각의 주입은 따라서 주입 당 마우스의 체중량의 대략 5%를 설명하는, 150㎕ 인산 완충 용액(phosphate buffered saline, PBS) 또는 혈장으로 구성된다. 마지막 주입 4일 후에 모든 마우스로부터 혈액이 수집되었고 ＞200 상장 인자들 및 다른 세포내 통신 단백질들은 항체 기반 마이크로어레이들 또는 Luminex^® 기반 정량 분석법들을 사용하여 측정되었다. 마이크로어레이들로 측정된 상위 6가지 단백질의 무감독 완전 연결 클러스터링은 인산 완충 용액(PBS) 또는 혈장 처리된 마우스들로부터 혈액을 거의 완벽하게 분리하며 젊은 혈장으로 처리된 노화된 마우스들의 혈액 및 전신 환경이 상당히 변경되는 것을 설명한다. 증가된 많은 인자는 조직 재생의 기능들로 알려졌다. 혈장 처리된 노화된 마우스들로부터 혈액 내에 증가되는 인자들의 예들은 인터류킨 22(IL-22) 및 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함한다. 독립적으로 측정되고 마이크러어레이들로부터의 결과들로 확인되는 이러한 인자들은 다수의 조직에 유용한 효과들을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들면, LIF는 심근 경색(myocardial infarction) 이후의 심장 기능 및 재생을 향상시키고(Zouein 등., Eur Cytokine Netw. 24:11-9, (2013)), 골격근 재생을 지원하며(Hunt 등. Histochem Cell Biol. 139:13-34, (2013)), 시신경 재생 및 축색돌기 재생을 촉진한다(Fischer D, Leibinger M., Prog Retin Eye Res. 31:688-701, 2012). 유사하게, IL-22는 피부, 췌장, 간, 및 내장을 포함하는 다수의 조직 내에서 유용한 효과를 갖는 것으로 설명되어 왔다(Sabat 등. Nat Rev Drug Discov. 13:21-38, (2014)). 함께, 이러한 발견들은 젊은 혈장 처리가 혈액 내의 세포내 통신 단백질들의 생물체 전체 변화들에 이르게 하고 이러한 단백질들은 다수의 조직에 대한 다발성의 유용한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

실시 예 7

여기에 젊은 인간 혈장으로 처리된 마우스들이 뇌 내의 신경 활성의 증가들을 나타내고, 제대혈로부터의 인간 혈장이 신경세포들의 활성에 가장 강력하며, 젊은 인간 혈장으로의 장기간 처리가 노화된 마우스들 내의 인지를 향상시긴다는 것이 도시된다. 본 발명의 발명자들은 이전에 젊은 마우스 혈장이 해마, 학습 및 기억과 관련된 뇌 영역 내의 시냅스 가소성을 향상시킴으로써, 부분적으로 노화된 마우스 내의 인지 기능을 향상시키기에 충분하다는 것을 설명하였다(Villeda 등. Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice. Nat Med 20, 659-663 (2014)). 노화된 뇌를 회춘시키기 위한 복원제(restorative agent)로서 젊은 혈장의 전사 유용성을 설명하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 인간 혈장이 주입될 수 있고 면역 거부의 유해 영향 없이 견딜 수 있는 마우스 모델의 개발을 시도하였다. 본 발명의 발명자들은 기능적 면역 시스템이 결핍된, NOD/SCID(NSG) 마우스들(Shultz 등. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol 174, 6477-6489 (2005))이 항체 생산 및 상보적 활성이 심각하게 손상되는 것을 고려하여 이러한 목적을 위하여 다루기 쉬운 모델일 수 있다는 것을 가정하였다. 모델로서의 그 유용성을 설명하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 뇌 노화의 중요한 양상들을 요약하기 위하여 먼저 NSG 모델의 능력을 평가하였다. 도 15에 도시된 것과 같이, 본 발명의 발명자들은 NSG 마우스들이 해마의 치상화 내의 신생아 신경세포들의 수의 노화 관련 결손들뿐만 아니라, 해마 내의 CD68 염색에 의해 반영된 것과 같은, 증가된 미세아교세포증(microgliosis)을 나타내는 것을 발견하였다. 본 발명의 발명자들은 또한 치상회 내의 cfos-양성 세포들의 수의 나이 의존적 검소를 발견하였으며, 이는 시냅스 가소성에 중요한 역할을 하는 전초기 유전자 군을 위한 신경세포 대용물이다.

도 16에 도시된 것과 같이, 전후 관계상 두려움 조절 작업 내인지 또는 본 발명의 발명자들이 마우스들에 반즈 미로 작업 내의 탈출 홀의 위치를 기억하는지를 질문할 때, 본 발명의 발명자들은 노화된 NSG 마우스들에서 두드러진 인지 결손들을 관찰하였다. 중요하게도, 모든 나이 의존적 결손은 대략 중간 연령인, 결손들이 일반적으로 감지되기 어려운 정상 마우스들의 연령인 NSG 마우스들을 사용하여 관찰되었다. 함께 고려하면, 모델은 혈장 처리의 관련성이 급속 방식으로 인간 재료를 사용하여 검사될 수 있는 손쉬운 도구를 설명한다.

본 발명의 발명자들은 인간 혈장 내에 존재하는 가용성 인자들이 실질적으로 노화의 발생 단계들을 가로질러 다른지의 평가를 시도하였다. 본 발명의 발명자들은 제대혈 혈장 기증자들뿐만 아니라, 젊은 및 노령 개인들로부터 혈장을 분리하였고 본 발명자들의 실험실내 단백질 마이크로어레이 플랫폼을 사용하여 대략 600가지의 분비된 시그널링 단백질들의 상대적 레벨들을 분석하였다. 도 17에 도시된 것과 같이, 특히 제대혈 혈장 샘플들을 젊거나 또는 노령 기증자들과 비교할 때, 인간 혈장의 나이에 따른 구별이 존재한다. 젊거나 또는 노령 샘플들과 비교하여 제대혈 혈장 내에 존재하는 많은 인자의 현저한 강화가 존재하며, 이는 나이 의존적 발현의 감퇴를 나타내는 단백질들의 서브셋을 나타낸다. 본 발명의 발명자들은 그 다음에 노화된 NSG 마우스들 내의 인간 혈장의 주입이 신경세포염증, 재생 가능한 뇌 노화 표현형을 변경할 수 있는지의 평가를 시도하였다. 도 18에 도시된 것과 같이, 본 발명의 발명자들은 젊은 인간 혈장으로 처리된 노화된 NSG 마우스들의 해마 및 피질 내의 감지하기 어려우나, 상당한 미세아교세포증의 감소를 기록하였다. 노령 인간 혈장은 미세아교세포증의 레벨을 변경하기에 충분하지 않았다. 젊은 인간 혈장으로 처리된 마우스들은 노령 인간 혈장으로 처리된 마우스들과 비교하여 높은 레벨의 전후 관계상 두려움 조절을 나타냈으며, 이는 젊은 혈장들이 인지를 향상시키는데 충분한 인자들을 소유한다는 사실을 나타낸다(도 19).

전초기 유전자 발현, 특히 cfos, Junb, 및 Egr1의 발현은 근본적인 시냅스 가소성과의 연관성을 특징으로 한다(Bailey 등 Toward a molecular definition of long-term memory storage. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 13445-13452 (1996)). 본 발명의 발명자들은 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 인간 혈장 처리된 NSG 마우스들 내의 전초기 유전자 발현을 조사하였다. 본 발명의 발명자들은 제대혈 및 젊은 인간 혈장 모두가 전초기 유전자들(Egr1, Junb, 및 fos), cfos 단백질(도 20)뿐만 아니라 Bdnf 및 Camk2a(도 21)를 인코딩하는 유전자의 발현을 향상시키기에 충분하다는 사실을 발견하였다. 전체적으로 본 발명의 발명자들은 젊거나 또는 노령 인간 혈장으로 처리된 마우스들 내에서보다 제대혈 혈장 처리된 NSG 마우스들 내의 가소성 관련 유전자들의 더 중요한 향상들을 발견한다. 함께 고려하면, 본 발명자들이 데이터는 제대혈 혈장 내에 존재하는 인자들이 학습 및 기억과 관련된 뇌 노화 표현형들을 회춘시킬 수 있다는 것을 제안한다. 인간 제대혈 혈장이 연령 의존적 행동 결손들을 반전시킬 수 있는지를 검사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 비히클 또는 제대혈 혈장으로 NSG 마우스들을 처리하였고 전후 관계상 두려움 조절 및 반즈 미로 검사를 실행하였다. 도 22에 도시된 것과 같이, 제대혈 혈장은 비히클 처리된 마우스들과 비교하여 전후 관계상 두려움 조절 작업에서의 프리징의 레벨을 상당히 향상시켰다. 동일한 마우스들의 반즈 미로로의 노출은 비히클로 처리된 마우스들보다 결국에는 탈출 홀이 위치된 장소를 대부분 기억하도록 학습한다는 것을 나타내었다. 이러한 효과는 특히 미처리된 노화된 NSG 마우스들이 일반적으로 작업을 실행하는데 어려움을 갖는, 마지막 3회 시도에서의 최종일 검사에서 두드러졌다. 뒤따르는 프로브 시도들 및 4일째의 초기 훈련 시도 사이의 차이에 의해 나타내는 것과 같은, 학습의 비율은 또한 비히클 처리된 마우스들에서보다 제대혈 혈장으로 처리된 노화된 NSG 마우스들에서 상당히 컸다.

본 발명의 발명자들은 장기간 강화의 향상들, 증가된 시냅스 강도와 가소성에 대한 세포 및 전기생리학적 연관성(Bliss 및 Collingridge. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361, 31-39, (1993))이 제대혈 혈장으로 처리된 노화된 NSG 마우스들에서 관찰되는 증가된 학습과 기억의 기초를 이루는지를 조사하였다. 도 23에 도시된 것과 같이, 본 발명의 발명자들은 비히클 처리된 마우스들로부터의 조각들에서보다 제대혈 혈장 처리된 마우스들로부터의 해마 조각들 내의 상당히 높은 LTP의 레벨들을 관찰하였다. 함께 고려하면, 본 발명자들의 데이터는 궁극적으로 증가된 LTP의 기초를 이루는 세포 변화들에 이르게 하는 학습 및 기억과 관련된 유전자들의 발현의 증가에 의한 것과 같이, 제대혈 혈장 내에 존재하는 인자들이 노화된 마우스에서 학습과 기억을 향상시키는 메커니즘을 나타낸다.

본 발명자들의 데이터는 인간 혈장, 특히 제대혈 혈장이 해마 내의 cfos 발현의 변화를 포함하여 NSG 마우스들에서 뇌 노화의 양상들을 회춘시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 변화들이 또한 기능적 면역 시스템의 설정에서 관찰되는지를 평가하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 스탠포드 대학의 Liqun Luo의 실험실에 의해 개발된 TRAP-FOS 마우스 모델을 사용하였다(Guenthner 등. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron 78, 773-784 (2013)). 급성 시술(Acute manipulation)들은 흔히 cfos 발현을 포함하는, 전초기 유전자 발현의 일시적 변화를 야기할 수 있으며, 이는 분석 기간에 검출하는데 어려울 수 있다. 활성 재조합 내의 표적 재조합(Targeted Recombination in Active Recombination, TRAP) 모델에서, 타목시펜(tamoxifen) 의존족 CreER-T2는 FOS 프로모터로부터 시술 의존적 방식으로 발현될 수 있으며, 이는 한 번 발현되면 영구적인, 형광 효과기 단백질(fluorescent effector protein)을 야기한다. 이러한 방법으로, 본 발명의 발명자들은 cfos 발현의 급속 변화들을 조사하기 위하여 인간 제대혈 혈장으로의 급성 처리를 제공할 수 있으며, 중요한 면역 반응을 방지할 수 있다. 단지 단일 주입 후에, 본 발명의 발명자들은 TRAP-FOS 마우스들 내의 제대혈 혈장으로의 처리가 비히클로 처리된 TRAP-FOS 마우스들과 비교하여 해마의 치상회 및 CA1 모두에서 cfos 프로모터로부터 형광 단백질을 구동하는 상당히 더 많은 TRAP된 신경세포들을 야기하였다는 사실을 발견하였다(도 24). 노령 인간 혈장은 그러한 발현을 증가시키기에 불충분하였다. 본 발명자들의 결과들은 인간 혈장 내에 존재하는 인자들을 위 분명한 중요성을 설명한다. 인간 혈장 인자들을 사용하는 마우스들 내의 본 발명의 결과들을 고려해 볼 때, 분할된 인간 혈장은 인간 뇌 내의 유사한 생물학적 과정들을 표적으로 할 것이며, 노화 관련 인지 감퇴를 경험하는 환자들에 확실한 혜택을 제공할 것이다.

실시 예 8

가벼운 알츠하이머병 내지 중간의 알츠하이머병을 갖는 인간 환자는 젊은 혈액 기증자(30세보다 젊은 연령)로부터 200㎖의 인간 혈장으로 정맥 내로 투여되었다. 이러한 과정은 예를 들면, 4주 동안에 주당 1회씩 반복되며, 간병인은 그 동안에 환자의 일상생활의 일반적인 기능들과 활동을 기록한다. 치료가 완료된 후에 기능적 자기 공명 영상을 사용하여 휴지기 뇌 활성도를 위하여 환자의 뇌가 스캐닝되고 일련의 신경 심리 검사로 환자의 인지 기능이 평가된다. 항상, 환자, 간병인, 및 치료들 또는 검사를 운영하는 의사들은 환자가 젊은 혈장 또는 대조군으로서 식염수를 받았는지를 알지 못한다. 치료 이후에 획득된 측정들은 그리고 나서 치료가 개시되기 전에 환자에서 획득된 측정들과 비교된다. 젊은 혈장을 받은 환자들이 일상생활의 향상된 일반적 기능들과 활동들을 나타내는 것이 관찰된다.

첨부된 청구항들에도 불구하고, 본 발명은 또한 다음의 항들에 의해 정의된다:

1. 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법에 있어서,

노화 관련 질환을 위하여 대상을 치료하기 위하여 젊은 혈장 제제의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법

2. 제1항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 전체 혈액이 아닌, 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법.

3. 제1항 및 제2항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 적혈구 및/또는 백혈구가 결핍된, 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법.

4. 제1항, 제2항 또는 3항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 무세포성인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 미리 결정된 임계 아래의 평균 분자량을 갖는 단백질들이 결핍된, 노화 관련 질환의 치료 방법.

6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 40세 이하의 기증자로부터 획득되는, 노화 관련 질환의 치료 방법.

7. 제6항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 신생아의 제대혈로부터 획득되는, 노화 관련 질환의 치료 방법.

8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련은 노화 관련 인지 장애인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

9. 제8항에 있어서, 상기 노화 관련 인지 장애는 주의와 집중; 복합 작업들과 개념들의 학습; 기억; 정보 처리; 시공간 기능; 언어의 생산과 이해; 언어 유창성; 문제점들의 해결; 판단; 및 실행 기능들;로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 인지 능력의 장애를 포함하는, 노화 관련 질환의 치료 방법.

10. 제9항에 있어서, 상기 노화 관련 인자 장애는 자연적 노화와 관련된 인지 장애인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

11. 제9항에 있어서, 상기 노화 관련 인지 장애는 노화 관련 질병 또는 장애와 관련된 인지 장애인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

12. 제11항에 있어서, 상기 노화 관련 인지 장애는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 병, 전측두엽 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 진행성 핵상성 마비, 척수성 근 위축, 멀티-시스템 위축, 운동 실조증, 혈관성 치매 또는 다른 치매들인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

13. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:

상기 대상 내의 인지 능력을 측정하는 단계; 및

상기 젊은 혈장 제제의 투여 이후에 상기 대상 내의 인지 능력의 감퇴 비율의 감소를 검출하는 단계;를 더 포함하는, 노화 관련 질환의 치료 방법.

14. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:

상기 대상 내의 인지 능력을 측정하는 단계; 및

상기 혈액 제제의 투여 이후에 상기 대상 내의 인지 능력의 안정화 또는 향상을 검출하는 단계;를 더 포함하는, 노화 관련 질환의 치료 방법.

15. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 기관의 기능의 향상인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

16. 제15항에 있어서, 상기 관은 중추신경계 기관인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

17. 제15항에 있어서, 상기 기관은 말초 기관인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

18. 제1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 인간인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

19. 제18항에 있어서, 상기 대상인 50세 이상인, 노화 관련 질환의 치료 방법.

20. 하기를 포함하는 키트:

두 개 이상의 컨테이너를 포함하고, 상기 각각의 컨테이너는

젊은 혈장 제제; 및

상기 젊은 혈장 제제 기증자의 노화 관련 데이터의 식별 정보를 포함한다.

21. 제20항에 있어서, 상기 노화 관련 데이터는 채취 시기에 상기 젊은 혈장 제제 기증자의 연령을 포함하는, 키트.

22. 제20항 내지 21항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 적혈구가 결핍된, 키트.

23. 제20항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 백혈구가 결핍된, 키트.

24. 제20항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 무세포성인, 키트.

25. 제20항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 미리 결정된 임계 아래의 평균 분자량을 갖는 단백질들이 결핍된, 키트.

26. 제20항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 40세 이하인 기증자로부터 획득되는, 키트

27. 제26항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 신생아의 제대혈로부터 획득되는, 키트.

28. 대상 내의 노화 관련 인지 장애의 치료에서의 사용을 위한 혈액 제제의 생산 방법에 있어서,

노화 관련 인지 장애의 치료에서의 사용을 위한 혈액 제제를 생산하기 위하여 젊은 기증자로부터의 혈장 함유 혈액 제제로부터 미리 결정된 임계 이하의 평균 분자량을 갖는 단백질들을 제거하는 단계를 포함하는, 혈액 제제의 생산 방법.

29. 제28항에 있어서, 상기 제거하는 단계는 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는, 혈액 제제의 생산 방법.

30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 혈장 함유 혈액 제제는 혈장 반출법(plasmapheresis)에 의해 젊은 기증자로부터 채취되는, 혈액 제제의 생산 방법.

31. 제28항 내지 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 함유 혈액 제제는:

젊은 기증자로부터 채취된 전체 혈액에 항응고제를 첨가하는 단계;

상기 혈액 내의 펠릿 세포들에 유효한 비율로 항응고제 처리된 혈액을 원심분리하는 단계; 및

상청액을 수집하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 상기 상청액은 상기 혈장 함유 혈액 제제인, 혈액 제제의 생산 방법.

32. 제31항에 있어서, 상기 방법은 미리 결정된 임계 이하의 평균 분자량을 갖는 단백질들을 제거하는 단계 이전에 또는 이후에 상기 혈액 제제를 냉동보존하는 단계를 더 포함하는, 혈액 제제의 생산 방법.

33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기증자는 인간인, 혈액 제제의 생산 방법.

34. 제33항에 있어서, 상기 기증자는 40세 이하인, 혈액 제제의 생산 방법.

35. 노화 관련 질환을 위한 대상의 치료에서의 사용을 위한 혈액 제제에 있어서, 상기 혈액 제제는 제28항 내지 34항 중 어느 한 항에 따라 제조되는, 혈액 제제.

이전 설명들은 단지 본 발명의 원리들을 나타낸다. 통상의 지식을 가진 자들은 비록 여기에 명확하게 설명되거나 또는 도시되지 않더라도, 본 발명의 원리들을 구현하고 본 발명의 정신과 범위 내에 포함되는, 다양한 배치들을 고안할 수 있을 것이라는 서실에 유의하여야 한다. 게다가, 모든 실시 예 및 조건부 언어는 원칙적으로 본 발명의 원리들 및 본 발명의 발명자들에 의해 기술을 발전에 기여되는 개념들을 이해하는데 독자들에 도움을 주도록 의도되며, 그러한 특별하게 인용된 실시 예들과 조건들에 한정되지 않는 것으로서 구성되어야 한다. 게다가, 원리들, 양상들, 및 실시 예들을 인용하는 모든 설명뿐만 아니라 그것들의 특정 실시 예들은 그것들의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 그러한 등가물들은 현재 알려진 등가물들 및 미래에 개발되려는 등가물들, 즉 구조와 관계없이 동일한 기능을 실행하도록 개발되는 어떠한 소자들 모두를 포함하도록 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명된 바람직한 실시 예들에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 정신과 범위는 첨부된 청구항들에 의해 구현된다.

Claims (15)

1. 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법에 있어서,
   노화 관련 질환을 이하여 대상을 치료하기 위하여 젊은 혈장 제제의 유효량을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법
   
2. 제1항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 전체 혈액이 아닌, 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
3. 제1항 및 제2항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 적혈구 및/또는 백혈구가 결핍된, 대상 내의 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 무세포성인, 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 미리 결정된 임계 아래의 평균 분자량을 갖는 단백질들이 결핍된, 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 40세 이하의 기증자로부터 획득되는, 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 젊은 혈장 제제는 신생아의 제대혈로부터 획득되는, 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련은 노화 관련 인지 장애인, 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 노화 관련 인지 장애는 노화 관련 질병 또는 장애와 관련된 인지 장애인, 노화 관련 질환의 치료 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 노화 관련 질병 또는 장애는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 병, 전측두엽 치매, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증, 녹내장, 근긴장성 이영양증, 진행성 핵상성 마비, 척수성 근 위축, 멀티-시스템 위축, 운동 실조증, 혈관성 치매 또는 다른 치매들인, 노화 관련 질환의 치료 방법.
    
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 기관의 기능의 향상인, 노화 관련 질환의 치료 방법.
    
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 인간인, 노화 관련 질환의 치료 방법.
    
13. 하기를 포함하는 키트:
    두 개 이상의 컨테이너를 포함하고, 상기 각각의 컨테이너는
    젊은 혈장 제제; 및
    상기 젊은 혈장 제제 기증자의 노화 관련 데이터의 식별 정보를 포함한다.
    
14. 대상 내의 노화 관련 인지 장애의 치료에서의 사용을 위한 혈액 제제의 생산 방법에 있어서,
    노화 관련 인지 장애의 치료에서의 사용을 위한 혈액 제제를 생산하기 위하여 젊은 기증자로부터의 혈장 함유 혈액 제제로부터 미리 결정된 임계 이하의 평균 분자량을 갖는 단백질들을 제거하는 단계를 포함하는, 혈액 제제의 생산 방법.
    
15. 노화 관련 질환을 위한 대상의 치료에서의 사용을 위한 혈액 제제에 있어서, 상기 혈액 제제는 제14항의 방법에 따라 제조되는, 혈액 제제.

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