CN1129608C - 制备非细胞血红细胞代用品的方法和仪器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制备基本上没有四聚体的，基本上没有基质的，聚合的，吡哆酰基化的血红蛋白的方法。也公开了能以多达大约5升的量输入人患者的基本上没有四聚体的，基本上没有基质的，聚合的，吡哆酰基化的血红蛋白制品。

Description

制备非细胞血红细胞代用品的方法和仪器
                            发明背景
发明领域
本发明涉及制备血红细胞代用产品，即血红蛋白产品的方法和仪器。进一步涉及非细胞血红细胞代用品，包括没有基质污染物的，基本上没有四聚体的，交联的，聚合的，吡哆酰基化(pyridoxylated)的血红蛋白溶液。
相关技术
多年来，血库在由于外伤或者其它情况的手术中提供用于替代的全血。但是，从供血人获得的全血并不适用于各种情况。特别是，全血的使用有由于对供血人类型的要求，稳定性和货架寿命问题以及病毒和其它污染物引起的毒性的问题。这些问题特别与紧急情况有关，例如军队用血。因此，人们进行了诸多努力来开发由供血人获得的全血的代用品。这方面的进展已经导致对来自人或其它哺乳动物源的血的各种各样的改变。本领域公知没有基质的血红蛋白具有运送氧和可逆的氧(或配体)结合能力。因为毒性问题阻止其作为血代用品被使用，因此没有基质的血红蛋白需要进一步的改进，以提供没有毒性的有用的医药产品。
这样的改进包括(1)使血红蛋白没有或基本上没有基质和基质污染物；(2)吡哆酰基化；(3)聚合或交联；(4)去除四聚体；和(5)用一氧化碳或其它配体改性。
但是，用这些技术制备的血红蛋白溶液在能够携带足量的氧以拯救生命的同时，还有很多不期望的副作用和性质的麻烦。例如主要有麻烦的副作用是降低肾功能。认为这些变化是由于存在不期望的污染物，例如细菌内毒素或者红细胞膜碎片(基质)。象这样的一些污染物确实能产生肾改变，同时基本上没有上述污染物的血红蛋白溶液仍产生实质性肾机能障碍。肾机能障碍的原因归于未聚合的血红蛋白四聚体的生理上不可接受的量。输入四聚体血红蛋白的其它不期望的副作用是血管收缩，血红蛋白尿，心率压低，平均动脉血压升高和输入液特别外渗到腹膜腔。
实际中，已知没有任何由血红蛋白衍生的血代用品已经成功地完全避免毒性问题。这些产品也具有对患者施用后不可接受的短的半寿期。这样的半寿期需要短期重复置换血体(blood volume)。因此有着对于对人患者没有毒性并且在给予之后具有相当大的半寿期的血红蛋白产品的极大需求。当然，这些产品一定要能够以类似于全血所实现的方式可逆地将氧运送到组织。
                         发明概述
本发明提供对人没有毒性，并且当给予人时具有至少15小时的大的半寿期的血红蛋白代用品。本发明血红蛋白产品是没有基质的，吡哆酰基化且聚合的，以及没有病毒和其它有毒污染物的。此外，这些产品基本上没有白细胞(血白细胞)和血小板。
本发明也涉及制备本发明血红蛋白代用品的方法。该方法包括从血液中去除白细胞和血小板；洗涤和裂解血红细胞；通过过滤和热处理去除基质污染物和基质；制备血红蛋白的脱氧形式；吡哆酰基化作用和聚合作用；进一步纯化和浓缩；和脱氧作用。之后，得到的血红蛋白产品可以配制以提供具有正常生理范围内各种电解质水平的血红蛋白产品。
本发明也提供吡哆酰基化的，聚合的血红蛋白的含水制剂，其中血红蛋白是戊二醛聚合的含有四聚体物质的血红蛋白，具有图3所示分子量分布。该制剂可以用来制备非细胞血红细胞代用品。在这一方面，首先将制剂纯化以去除四聚体，然后合并适当量的电解质，来产生生理可接受的，非细胞的，可以接着被用来治疗需要输入氧载体的病人的血红细胞代用品。
                      附图简要说明
图1是用来产生为吡哆酰基化作用和聚合作用而制备的脱氧血红蛋白溶液的方法和仪器部分的示意图。
图2是从吡哆酰基化作用和聚合作用开始，产生脱氧的，纯化的，吡哆酰基化的，聚合的血红蛋白产品的方法和仪器部分的示意图和用来配制具有生理水平电解质的最终血红蛋白产品的方法和仪器部分的示意图。
图3是甘氨酸处理之后纯化之前聚合材料的HPLC示踪。滞留时间(RT)15.57，16.08，17.00，和18.19处的峰表示聚合产物。RT19.88和20.51处的峰表示四聚体材料。聚合物是该材料的76.2％。
图4是本发明血红蛋白产品的HPLC示踪。RT15.7，16.33，17.32，和18.56处的峰表示聚合的血红蛋白。RT21.18处的峰表示四聚体。
图5是本发明中使用的柱色谱纯化方法的示意图。
图6是本发明中使用的膜过滤纯化方法的示意图。
                   优选实施方案的详细描述
本发明涉及非细胞血红细胞代用品，包括基本上没有四聚体的，交联的，聚合的，吡哆酰基化的血红蛋白，其基本上没有基质，其基质污染物和其它污染物。
这里所使用的术语“交联的”指将分子“键桥”化学键接到分子上或分子中，或者分子之间，目的在于改变分子的形状，大小，功能或物理特征。交联的分子可以是聚合的或非聚合的，即交联的分子可以是四聚体的。
这里所使用的术语“四聚体”是指具有大约64Kd分子量的血红蛋白分子；即，该术语指天然的和分子内交联的血红蛋白分子。
这里所使用的术语“基本上没有四聚体”是指不再存在对哺乳动物给予的四聚体的生物反应时的关于四聚体污染物的纯度水平。主要的标准是当输入药学有效量时不存在肾功能的改变，即在大约99％或更好的纯度水平(存在少于大约1％的四聚体)。通过本发明方法产生的优选的产品含有不多于以总的血红蛋白(THb)重量为基础的大约0.8％四聚体。换句话说，根据本发明的基本上没有四聚体的产品含有不多于生理可接受量的非聚合的血红蛋白四聚体。本发明特别优选的产品含有少于大约0.5％的四聚体；本发明最特别优选的产品含有大约0.3-0.4％四聚体。发现这样的四聚体量是生理可接受的。
这里所使用的术语“超纯化产品”或“纯化的产品”具有与术语“基本上没有四聚体”相同的意义。
这里所使用的血红蛋白(THb)总量百分比％定义为血红蛋白克数/100ml溶液。
这里所使用的术语“聚合溶液”指在生物化学合适的载体中含有“交联剂”或聚合试剂，例如戊二醛，亚氨酸酯，双阿司匹灵或其它的溶液。
这里所使用的术语聚合指分子或四聚体亚单位(submits)之间的分子桥的键接，其中得到的聚合的分子的大小和重量相对于天然的或四聚体血红蛋白而增加。聚合的血红蛋白不是四聚体血红蛋白。
这里所使用的血红蛋白溶液指其中血红细胞中不含有该分子的四聚体血红蛋白或聚合的血红蛋白分子的溶液。这样的溶液不需要去除或基本上去除血红细胞基质或基质污染物。但是，优选的聚合的血红蛋白溶液是没有血红细胞基质和基质污染物的。
术语“半渗透膜”指对于某些分子种类是可渗透的而对于其它是不可渗透的一种膜，即作为排除某些分子量的选择性过滤器而起作用的膜。
根据本发明方法的产品，聚合的，吡哆酰基化的，由热处理的，病毒灭活的四聚体血红蛋白产生的，基本上没有四聚体(天然的或分子内交联的)血红蛋白，基质和各种其它污染物的血红蛋白溶液是生理可接受的和治疗和临床有用的。该产品具有氧运送性质所必需的可逆氧结合能力。最要注意的是，证明该产品在与具有类似于全血的氧-血红蛋白解离曲线(P50)相关的应用中具有好的负载特性和卸载特性。该产品在通过肺的毛细血管中以高亲和性结合氧，然后充份地将氧释放给体内的组织。该产品也不需要与受者的相容性研究。
当给予人时，该产品还具有大约至少15小时更优选大约24小时的半寿期。该血红蛋白产品可以以多达大约3.0L甚至多达大约5.0L的量对患者输注。换句话说，本发明血红蛋白产品可以被用来再充满基本上全部的人患者的血体积而不引起血管收缩，肾中毒，血红蛋白尿或者其它与静脉给与合成的或半合成的氧载体和血液代用品相关的问题。因此，本发明包括用一定量无基质，无四聚体，聚合的，吡哆酰基化的对患者没有毒性的血红蛋白产品对患者优选人患者输注的方法，其中所述量多至至少大约5.0L。这样一种方法包括使患者或受者接触用于对患者输注或转输的输注装置或其它这样的设备。
本发明方法的独特性在于其得到具有不多于大约以溶液中总的血红蛋白重量为基础的1％的四聚体的水平，更优选不多于大约以溶液中总的血红蛋白重量为基础的0.8％水平的产品。本发明方法提供的进一步的好处是其使终产物基本上没有微生物和病毒抗原和病原体。这样的微生物和病毒抗原和病原体被减少到检测不到的水平，即该产品根据通过美国药典第XXIII章〖71〗提出的分析进行测定是无菌的。这样的抗原和病原体的例子包括例如细菌，立克次体，真菌，原生动物，病毒和其它生物体。最重要的是，该方法提供了没有引起肝炎和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病毒的生物产品。
就所关注的生理性质而论，当以多至至少大约5.0L的量输注时，本发明生物产品不引起与已知的含有生理不期望量四聚体血红蛋白的血红蛋白溶液的静脉给药相关的血管收缩，肾中毒，血红蛋白尿和其它问题。静脉给与通过这里所描述的方法产生的产品没有导致尿产生的明显减少，没有导致肾小球过滤速度的明显降低，没有导致明显外渗到腹膜腔和没有导致产生的尿的颜色的明显变化。
因此，本发明方法提供在治疗外伤，心肌梗塞形成，中风，急性贫血和缺氧疾病例如低氧血，低氧或者由于肺对于使血液完全充氧的削弱或衰竭的晚期氧过少中有用的非细胞血红细胞代用品。该产品在治疗需要复苏的体液(例如外伤，尤其是出血性休克)，血管内体积增容剂或者改变转输的任何疾病或医学症状中也是有用的。除了医药治疗，该产品可以用于保存用于移植的器官。
本发明方法包括下面的步骤：
1.红细胞抽吸和过滤
2.细胞冲洗/裂解
3.热处理
4.超滤浓缩
5.除气
6.化学修饰
7.纯化
8.UP多浓缩
9.脱氧作用
10配制
本发明方法中优选的起始材料是过期的人全血或者袋装血红细胞。另外，也可以使用没有过期的(有效期内的)血液。优选的是，如果全血储存期超过了袋上标明的届满日2个星期，则不在该方法中使用。使用过期2个星期以上的全血在提取血红蛋白和去除细胞残余物例如基质蛋白和污染物方面提出了另外的困难。
这里所描述的所有方法适用于其它哺乳动物血液，可能有本领域技术人员范围内的小的改变。大多数方法可以在大约2℃至大约8℃，优选在大约4℃下进行。
在红细胞抽吸和过滤过程中，从供血者袋中无菌提取血红细胞(RBC)，不将空气引入到血液中，并且通过一系列过滤器，产生具有减少量的白细胞和血小板的RBC悬浮液。然后使得到的悬浮液进行细胞冲洗/裂解。
悬浮液在一氧化碳气氛下用大约1％氯化钠溶液洗涤以去除残留的血浆蛋白。然后用注射水(WFI)处理冲洗过的RBC，以溶解细胞，并使用交叉流过滤单元使得到的混合物澄清。然后热处理澄清的产物以沉淀另外的基质物质，过滤将其去除。该方法的产品是没有基质的血红蛋白(SFH)溶液，THb是大约3％(w/v)。
将含有碳氧血红蛋白的热处理过的并且没有基质的血红蛋白溶液浓缩并脱气，得到含有脱氧血红蛋白的SFH溶液。脱气包括首先用氧饱和碳氧血红蛋白溶液大约16小时，得到氧合的血红蛋白溶液，并且碳氧血红蛋白含量是以血红蛋白总重量为基础的大约7％重量比。接着用氮气，氩气或氦气将氧气逐出，形成含有游离血红蛋白即未配合的血红蛋白的溶液，并且氧合血红蛋白含量是以血红蛋白总重量为基础的大约7％重量比。将得到的脱气溶液过滤并转移到用于化学修饰的容器中。
脱气后，用吡哆醛-5’-磷酸酯(P5P)以吡哆醛-5’-磷酸酯与血红蛋白摩尔比是大约1∶1至3∶1的比例将没有基质的血红蛋白溶液吡哆酰基化。或者，可以使用吡哆醛-5’-磷酸2-Nor-2甲酰酯将没有基质的血红蛋白吡哆酰基化。向吡哆酰基化作用混合物中加入还原剂，例如氰基硼氢化钠或者优选硼氢化钠。过量的试剂和盐通过对没有热源的水透析而去除，或者优选用WFI渗滤。然后用戊二醛溶液聚合吡哆酰基化的血红蛋白。
用戊二醛水溶液聚合没有基质的，吡哆酰基化的血红蛋白溶液。聚合作用的持续时间和加入的戊二醛的量取决于血红蛋白溶液的体积，期望的聚合物产率和期望的分子量分布。一般情况下，更长的聚合作用时间提高聚合物产率和聚合物的分子量分布。大约16-18小时获得以血红蛋白总重量为基础的大约75％重量的聚合物的产率。优选的聚合作用的终点定义为根据大小排阻HPLC监测其中溶液含有以血红蛋白总重量为基础的大约75％重量的聚合物的点。或者，该终点定义为溶液含有以血红蛋白总重量为基础的大约65％重量的聚合物的点，即大约2.5小时。
聚合作用反应通过加入甘氨酸水溶液而骤冷(quench)。一定尽可能快地加入缓冲液。然后通过还是尽可能快地加入硼氢化钠水溶液来稳定交联。然后浓缩聚合的溶液，之后在氧气下渗滤使溶液氧合。最后向溶液中加入水直到溶液含有大约4％重量比的血红蛋白。
如图3和下面的实施例1所示，根据本发明的聚合作用产生窄分子量分布的高产率的聚合物。
聚合的，吡哆酰基化的血红蛋白溶液然后通过柱色谱，过滤，例如膜过滤，或者两者，以从溶液中去除残余的未聚合的(四聚体的)血红蛋白而纯化。纯化的聚合的血红蛋白溶液然后用在为了气体交换的制备中的超滤设备浓缩到大约6％。
然后浓缩的溶液用氮气脱氧。脱氧作用发生在大约10-12℃，直到溶液中氧合血红蛋白的量少于大约总血红蛋白重量的16％。
得到的脱氧的，纯化的，和聚合的血红蛋白溶液然后在冷却的容器中通过在氮气下的超滤作用而浓缩。pH调节至大约8.8-9.0，并且可以根据需要将电解质的量调节到正常血浆中存在的水平。另外，也可以可有可无地加入常规的抗氧化剂，例如谷胱甘肽，抗坏血酸或葡萄糖。溶液被浓缩到期望的水平后，优选是大约10％重量的聚合的，吡哆酰基化的，纯化的，没有四聚体的，没有基质的血红蛋白，溶液通过过滤灭菌，并且通过无菌的转移仪器转移到合适的药物可接受容器中。
得到的血红蛋白溶液的特征如下所示：
    聚合的血红蛋白
总的血红蛋白(g/dl)1     9.5-12.0
高铁血红蛋白(％总的Hbo)1     ＜8.0
碳氧血红蛋白(％总的Hb)1     ＜5.0
P50(托(torr)1     23-32
重量克分子渗透压浓度(mmol/Kg)2     280-360
钠(mmol/L)3     135-155
钾(mmol/L)3     3.5-4.5
氯化物(mmol/L)3     85-110
游离铁(ppm)4     ＜2.0
分子量分布-128Kd峰(％)5     10-24
分子量分布-192Kd峰(％)5     18-30
分子量分布-256Kd峰(％)5     45-70
四聚体(64K)(％)5     ＜0.8
内毒素(EU/mL)0     ＜0.03
磷脂ng/Hb7    ＜50
糖脂(ng/Hb)7    ＜2
1分光光度法测定的聚合的血红蛋白的水平。
2渗透压法测定的聚合的血红蛋白的水平。
3离子特定电极法测定的聚合的血红蛋白的水平。
4原子吸收法测定的聚合的血红蛋白的水平。
5大小排阻-HPLC测定的。
6通过LAL测定，使用从Associates of Cape Cod.购得的测定，测定成分具有目录号100-5，800-1，和3100-5。
7通过HPTLC测定。
下面的实施例证明本发明的某些方面。但是，要明白这些实施例只是为了详细说明的目的，而不是要整个地限定出本发明的条件和范围。除非另有说明，所有的温度以摄氏度表示。除非另有说明，所有的百分比例如总的血红蛋白(THb)以重量/体积(w/v)表示。还应该明白当给出典型的反应条件(例如温度，反应时间)时，也可以使用高于或低于这些具体范围的条件，即使一般不太方便。
除非有相反说明，本发明方法中所使用的所有的反应器和容器由316-L不锈钢制成，优选高度抛光从而容易快速清洗的医药级不锈钢。各种连接的吸管和试管也由这样的不锈钢制成或者由医药级聚四氟乙烯制成或者是聚硅氧烷试管。该方法中使用的过滤器和膜可以从Millipore Inc.，Pall-Filtron或者Cuno Inc购得。
在哺乳动物体内例如人体内测定得到的本发明产品的半寿期。一般情况下，用该产品对哺乳动物输入后一段时间后从哺乳动物取出血样。然后通过将血样离心，挤出(express)血浆部分，分光光度法测定血浆血红蛋白水平，来测定该产品的量，然后将哺乳动物中残存的该产品的量校正到该产品的半寿期。
如下进行根据本发明的大小排阻色谱HPLC。
样品用0.2M pH6.9的磷酸钾缓冲液稀释到0.2g/dl，通过0.2μ过滤器过滤，并且注射到由下面成分(以系统流过的顺序)组成的HPLC系统。
1.Pharmacia型2248泵
    -流动相是0.2M pH6.9磷酸钾
    -流动速率是1.0ml/分钟
2. 45cm PEEK或者钛管，0.010英寸(in.)，内径(I.D.)
3. Rheodyne型7725i注射器，带有200μl PEEK样品孔
4. 18cm PEEK或者钛管，0.010英寸(in.)，内径(I.D.)
5. Upchurch型A431 0.5μ过滤器
6. 9cm PEEK或者钛管，0.010英寸(in.)，内径(I.D.)
7. Phenomenex Biosep SEC s-3000 75×7.8mmGuard柱
8. 24cm PEEK或者钛管，0.010英寸(in.)，内径(I.D.)
9. Phenomenex Biosep SEC s-3000 600×7.8mm分析柱
10. 23cm PEEK或者钛管，0.010英寸(in.)，内径(I.D.)
11. Pharmacia Uvicord SD UV检测器
                      波长：    280nm
           液池(flow cell)：    8μl体积，2.5mm路径长
                      范围：    2AUFS
   恒定时间(time constant)：    10秒
通过LKB2221整合器记录280nm处的吸收峰，其整合各峰面积并且计算各聚合物种的总的血红蛋白面积。
可以从下面的非限制性实施例得到本发明进一步的说明。
实施例1
现在参考图1，过期血液的供血者袋 20(全血或者袋装的血红细胞)被放在合适的无菌的抽吸仪器 22中。作为例子的合适的抽吸仪器是具有两个抽吸站的系统。一旦供者袋置于抽吸站，就用抽吸仪器中的针穿刺供者袋，引入大约150ml 1％(w/v)氯化钠水溶液，并在减压或真空下从供者袋中抽吸过期的血液。抽吸出的血液通过100μ深的过滤器 24，接着通过系列中的两个5μ深的过滤器 26。血液通过5μ深的过滤器时，从血液中去除了白细胞。一般情况下，大约170个单位过期的全血被抽吸，过滤并接着被转移到图1所示的容器罐1中。然后用大约75升1％(w/v)氯化钠水溶液淋洗过滤器。
在血液进入容器罐1中之前，容器1中装入了大约70L 1％氯化钠水溶液。当所有170个单位过期的全血被抽吸，过滤和被转移，并且过滤器已经淋洗后，该容器罐中含有大约250升4％总的血红蛋白溶液。抽吸和过滤步骤中，容器罐1保持在减压下，即20-28英寸Hg真空。一旦所有的过期血液转移到容器罐1中，即关闭真空，并且将一氧化碳导入该容器罐，使得该容器罐含有一氧化碳气氛。
如图1所示，容器罐1与0.65μ切向流过滤器 28连接。通过切向流过滤器微量过滤，将最初加入的250升4％总的血红蛋白溶液浓缩到大约125升8％总的血红蛋白溶液。在这一点，血红蛋白溶液的pH是大约6-6.5。浓缩到8％总的血红蛋白后，通过加入1％(w/v)氯化钠溶液，渗滤，并以加入氯化钠溶液的同样速度去除滤液，来洗涤溶液。125L血红蛋白溶液一般用大约8体积1％氯化钠溶液(大约1000L)洗涤。洗涤后，将溶液浓缩到大约70L，即大约14％总的血红蛋白，并加入“注射用水”(WFI)，使溶液的体积达到至多180L。随着加入WFI，细胞溶胀并且破裂，将血红蛋白释放到溶液中。得到的血红蛋白溶液的浓度是大约5％总的血红蛋白(THb)。
得到的溶液还在容器罐1中澄清。该溶液首先浓缩到大约50L，并且滤液转移到容器罐2。溶液泵入通过过滤器时，血红细胞基质污染物和细胞壁物质被截留并被过滤器去除。容器罐1中残留的50L溶液用大约2.5体积WFI洗涤(渗滤)。该2.5体积洗涤液加入到容器罐2。然后将容器罐1中残留的物质浓缩到大约20L，并且将滤液加入到容器罐2。容器罐2中得到的体积是大约280L 3.3％总的血红蛋白溶液。
然后，得到的没有基质的血红蛋白溶液在容器罐2中经大约10个小时的时间在大约60-62℃温度下热处理。在该时间内，温和搅拌溶液。当溶液被加热并且具有大约55℃时，生成沉淀。
然后将得到的3.3％THb(w/v)没有基质的，热处理过的血红蛋白溶液通过0.2μ过滤器 30，接着通过0.1μ过滤器32过滤，并转移给容器罐3。然后将过滤过的血红蛋白溶液浓缩到大约18％THb，接着用4体积WFI(180L)洗涤并渗滤。浓缩和渗滤用10千道尔顿(kd)分子量超滤器 34进行，与超滤器 34相连的排放口 35收集滤液。在这一点，45L 18％总的血红蛋白溶液pH大约6-6.5，每克血红蛋白含有少于50ng磷脂，每克血红蛋白含有少于2ng糖脂，每毫升含有少于1％高铁血红蛋白，少于大约0.03内毒素单位内毒素。该溶液中的这种血红蛋白是碳氧血红蛋白。
然后将得到的碳氧血红蛋白溶液转移到容器罐4，在那里碳氧血红蛋白首先被氧合，然后脱氧。容器罐4安装有与氧气管和氮气管连接的气体喷射圈，从该容器罐底部进料到位于容器罐4顶部的计量喷射仪器，泡沫溢流收集器连接泡沫罐1，使得容器罐4中产生的泡沫进入泡沫罐 36，在那里泡沫浓缩成液体并返回容器罐4。容器罐4进一步包括一套Pall Rings，其装满容器罐体积的大约三分之一。泡沫罐 36包括排出气体的排气孔。容器罐4中的溶液是13％总的血红蛋白溶液。
在第一个氧合步骤中，以足以使气体在容器中均匀分布的速度将氧气喷入溶液。200L体积的容器被以大约25L/分钟的速度充满气体。碳氧血红蛋白的氧合作用进行大约16小时，使得得到的溶液含有少于以总的血红蛋白重量为基础的5％碳氧血红蛋白。氧合作用在大约10℃的温度下进行。容器罐4中产生的泡沫在泡沫罐 36中收集，并且在静置后，得到的溶液被转移回容器罐4。
氧合作用后，以相同的流速的氮气充入溶液大约6小时或者直到溶液中保留少于以总的血红蛋白为基础的10％氧合血红蛋白。充入氮气在大约10℃的温度和pH大约6-6.5下进行。或者可以用膜交换器将碳氧血红蛋白转化为脱氧血红蛋白。注意到基本上没有通常在泡沫步骤中出现的血红蛋白的变性。现在制备得到的脱氧溶液用于化学改性。
现在参考图2，将脱氧血红蛋白溶液转移到容器罐5用于化学改性。然后以P5P与血红蛋白摩尔比为1∶1至3∶1的比例向含有大约4℃脱氧血红蛋白溶液的容器罐5加入吡哆酰基(pyridoxyl-)-5-磷酸酯(P5P)水溶液(93.75g/L)。优选P5P与血红蛋白摩尔比为2∶1。吡哆酰基化在大约4℃温度下进行。P5P溶液一般经大约1分钟加入，并且混合大约15分钟，此后以硼氢化钠与血红蛋白摩尔比大约是20∶1的比例向血红蛋白溶液加入硼氢化钠/氢氧化钠溶液。合适的硼氢化钠/氢氧化钠水溶液每2升含有0.8克氢氧化钠和每2升含有90.8g硼氢化钠。尽可能快地经大约1分钟加入硼氢化物溶液，然后搅拌1小时。得到的50L吡哆酰基化血红蛋白溶液接着用10K道尔顿超滤器38用4体积WFI渗滤以去除过量的反应物。与超滤器38连接的排放口 40收集来自过滤器 38的滤液。
用4体积即200L WFI渗滤后，血红蛋白聚合。向含有吡哆酰基化血红蛋白的容器罐5加入足够量的WFI来制备4.5％总的血红蛋白溶(大约175L血红蛋白溶液)。以戊二醛与血红蛋白摩尔比大约为24∶1的摩尔比例将戊二醛溶液加入到吡哆酰基化血红蛋白溶液中。戊二醛溶液一般通过计量泵经大约2.5小时加入到血红蛋白溶液中。使聚合反应进行大约18小时。目的分子量分布是大约75％聚合物和25％四聚体。目标聚合物具有小于大约600000的分子量，占优势部分的分子量在100000-350000范围内。
当聚合反应达到目的分子量分布时(大约18小时后)，以甘氨酸与血红蛋白摩尔比为140∶1的比例向血红蛋白溶液加入甘氨酸水溶液(大约166g/L)(作为骤冷)。参见图3，其是得到的聚合的甘氨酸骤冷的血红蛋白产物的HPLC示踪。然后将得到的溶液混合大约10分钟，此后以硼氢化钠与血红蛋白的摩尔比为28∶1的比例向血红蛋白溶液中加入硼氢化钠/氢氧化钠溶液(具有上文确定的浓度)。将得到的混合物搅拌大约1小时。然后将溶液浓缩到大约50L(超滤器38)，并用4体积(200L)WFI洗涤。以上文指出的相同的摩尔比向浓溶液中加入另一份硼氢化钠，再搅拌1小时。得到的溶液用4体积(200L)WFI洗涤，得到聚合的，吡哆酰基化的，没有基质的，已经热处理过的血红蛋白。
得到的溶液通过使溶液在氧气中静置而被氧合，并接着转移给纯化系统42。纯化可以通过柱色谱，过滤，优选膜过滤(渗滤)，或者过滤与柱色谱结合来进行。
在一个实施方案中，将溶液转移到色谱进料器，容器罐6，如图5所示。在该实施方案中，得到的氧合血红蛋白溶液然后在容器罐6中被稀释到大约200L(4％总的血红蛋白)，并且用氯化钠溶液将氯化物的浓度调节到22mM。不必要调节钠浓度。
然后5个40L等份得到的血红蛋白溶液用柱子 44进行色谱。柱子 44含有亲和性凝胶，其是一种用一种黄颜料(从Affinity Chromatography，Ltd购得，为Mimetic Yellow No.1)改性的琼脂糖凝胶，其具有对于聚合物比对于四聚体大的亲和性。
如下进行色谱：40L氧合的，聚合的，吡哆酰基化的，没有基质的血红蛋白溶液装载到柱子 44上。用15柱体积(大约750L)30mM含水氯化钠缓冲液冲洗柱子，以去除四聚体。然后用大约250L 300mM氯化钠缓冲液冲洗柱子，以去除聚合物。聚合物级分在容器罐7中收集。不要的级分送到排放口 46。去除各等份后，用15mM盐酸溶液(150L)使柱子再生，用30mM氯化钠水溶液(250L)再平衡，并向柱子上载入另一等份进料溶液(40L)。又用30mM氯化钠接着用300mM氯化钠冲洗柱子。向柱子中加入40L等份的血红蛋白溶液并进行色谱，直到容器罐6空了。
将容器罐7中的收集的级分用与排放口 50连接的过滤器 48超滤(浓缩)至大约40L体积(6％总的血红蛋白)。然后将浓缩的血红蛋白溶液转移给气体交换容器罐8用于脱氧作用。
或者，将溶液转移给过滤循环容器10，如图6所示。然后在容器罐10中将血红蛋白稀释到大约4％THb。然后4％THb溶液用10mM氯化钠和从Pall-Filtron购得的300000分子量过滤器52渗滤。持续过滤，直到大约97％的血红蛋白材料通过过滤器进入容器罐11。(大约3％的材料，即高分子量聚合物保留在容器罐10中)。用cooximeter分光光度法测定血红蛋白的量。
容器罐11中得到的材料是大约2-4％THb，并且含有大约以THb为基础的7-10％四聚体。2-4％THb然后用10mM氯化钠和与排放口或活门 56连接的从Pall-Filtron购得的100000分子量过滤器 54渗滤。持续过滤，直到根据使用BioSep SEC-S3000600×7.8柱子的大小排阻色谱测定，达到四聚体水平少于0.8％血红蛋白质量。得到的纯化的血红蛋白溶液最初保留在容器罐11中，接着转移给气体交换容器罐8用于脱氧作用。
气体交换容器罐8可以是与容器罐4相同的容器罐，优选不同的容器罐。气体交换容器罐8以基本上与图1中气体交换容器罐4相同的方式装备，并且与泡沫罐 58以与容器罐4和泡沫罐 36连接的相同的方式连接。在大约10℃通入氮气并且溶液pH是大约7.5情况下，使脱氧作用进行大约2.5小时。持续通入氮气，直到少于以总的血红蛋白重量为基础的大约16％氧合血红蛋白留在溶液中。接着将得到的脱氧血红蛋白溶液转移到容器罐9用于配制。
在配制罐9中，首先在4℃将溶液浓缩到大约7％总的血红蛋白，并将pH调节到大约8.8-9.0。用0.2M氢氧化钠调节pH。然后向pH8.8-9.0的血红蛋白溶液中加入电解质溶液。加入葡萄糖和甘氨酸，分别达到大约5g/L和1.75g/L的终浓度。向溶液中加入氯化钾，达到大约3.5-4.5mM的钾浓度。然后加入3M氯化钠，达到85-110mM氯化物浓度。接着加入乳酸钠，达到135-155mM钠离子浓度。最后，加入0.45摩尔抗坏血酸，使抗坏血酸浓度升至大约1000mg/L。加入抗坏血酸作为用于贮存的防腐剂/抗氧化剂。得到的血红蛋白溶液具有每千克大约280-360mmol的终重量克分子渗透压浓度。
然后将配制的血红蛋白溶液用与活门 62连接的过滤器 60浓缩到大约10％总的血红蛋白，然后通过过滤器 64过滤将10％血红蛋白溶液灭菌，并无菌装入预先灭菌的袋中。
该实施例中制备的产物，批量A的特征在表1中给出。另外，根据上述用于批量A的方法制备的批量B和C的特征也在表1中给出。
表1
                                              批量试验                                  A            B          C血红蛋白，g/dL                        10.4         10.2       10.2高铁血红蛋白，％                      4.6          6.0        5.6碳氧血红蛋白，％                      0.2          14         1.5P50(托，pH7.35-7.45，pCO235-40托)    28.5         26.8       27.0重量克分子渗透压浓度，mmol/KG         318          320        317钠，mmol/L                            142          144        142钾，mmol/L                            4.0          4.0        4.0氯化物，mmol/L                        98           99         94游离的铁，ppm                         0.7          1.2        1.0分子量分布，                          128：16      128：11    128：16％每一个                              192：26      192：23    192：26MW(Kd)                                2568：58    2568：66 2568：58四聚体，％                            0.4          0.3        0.4内毒素，EU/mL                        ＜0.03        ＜0.03     ＜0.03
8材料也包括少量高分子量材料。
如上所述，为了详细说明的目的提供了本发明优选实施方案的详细描述，但是不以此为限。要理解在此公开的基础上对本领域技术人员是显而易见的所有的其它改变，结果和等价物在如权利要求所要求的本发明范围内。

Claims (20)

1.一种聚合的血红蛋白水溶液，包含：
占总血红蛋白重量的10-24％的分子量为128Kd的血红蛋白聚合物；
占总血红蛋白重量的18-30％的分子量为192Kd的血红蛋白聚合物；
占总血红蛋白重量的45-70％的分子量为256Kd的血红蛋白聚合物；和
余量的水。
2.权利要求1的血红蛋白水溶液，还包含电解质和高分子量物质。
3.权利要求1的血红蛋白水溶液，其中总四聚体含量小于总血红蛋白重量的0.8％。
4.权利要求1的血红蛋白水溶液，还包含：
a)总血红蛋白，9.5-12.0g/dl；
b)总高铁血红蛋白，小于总血红蛋白重量的8％；
c)总羧基血红蛋白，小于总血红蛋白重量的5％；
d)钠浓度，135-155mmol/L；
e)钾浓度，3.5-4.5mmol/L；
f)氯浓度，85-110mmol/Kg。
5.权利要求4的血红蛋白溶液，还包含：
g)总游离离子，小于2.0ppm；
h)总四聚体，小于总血红蛋白重量的0.8％；和
i)内毒素，小于0.03EU/ml。
6.权利要求5的血红蛋白溶液，还包含：
j)磷脂，小于50ng/Hb；和
k)糖脂，小于2ng/Hb。
7.权利要求4的血红蛋白溶液，其特征在于其具有280-360mmol/kg的重量摩尔渗透压浓度。
8.权利要求4的血红蛋白溶液，其特征在于其具有23-32托的氧-血红蛋白解离。
9.权利要求1的血红蛋白溶液，其中该溶液在人患者体内的半寿期是15小时。
10.权利要求1的血红蛋白溶液，其中该溶液在人患者体内的半寿期是24小时。
11.权利要求1的溶液，其中该溶液能以多达5升的量输入给人患者而不引起肾功能降低。
12.权利要求1的血红蛋白溶液，其中该溶液能以多达5升的量输入给人患者而不引起肾功能降低，并且该溶液在人患者体内的半寿期是24小时。
13.权利要求1的血红蛋白溶液，其中血红蛋白是戊二醛-聚合的血红蛋白。
14.吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白水溶液，包括：
(a)总血红蛋白，9.5-12.0g/dl；
(b)总高铁血红蛋白，少于总血红蛋白的8％；
(c)总羧基血红蛋白，少于总血红蛋白的5％；
(d)氧-血红蛋白解离，23-32托；
(e)重量摩尔渗透压浓度，280-360mmol/kg；
(f)钠浓度，135-155mmol/L；
(g)钾浓度，3.5-4.5mmol/L；
(h)氯化物浓度，85-110mmol/L；
(i)总游离铁，小于2.0ppm；
(j)分子量为128kd的血红蛋白聚合物，基于总血红蛋白重量的10-24％；
(k)分子量为192kd的血红蛋白聚合物，基于总血红蛋白重量的18-30％；
(1)分子量为256kd的血红蛋白聚合物，基于总血红蛋白重量的45-70％；
(m)总四聚体，小于0.8％；
(n)内毒素，小于0.03EU/ml；
(o)磷脂，小于50ng/Hb；和
(p)糖脂，小于2ng/Hb。
15.一种吡哆酰基化的，聚合的血红蛋白溶液，所述溶液包含：占总血红蛋白重量的16％的分子量为128Kd的血红蛋白聚合物，占总血红蛋白重量的26％的分子量为192Kd的血红蛋白聚合物，和占总血红蛋白重量的58％的分子量为256Kd的血红蛋白聚合物。
16.权利要求15的血红蛋白溶液，其中该溶液能以多达1.5升的量输入给人患者而不引起肾功能降低。
17.一种制备吡哆酰基化的，聚合的血红蛋白溶液的方法，所述溶液包含占总血红蛋白重量的16％的分子量为128Kd的血红蛋白聚合物，占总血红蛋白重量的26％的分子量为192Kd的血红蛋白聚合物，和占总血红蛋白重量的58％的分子量为256Kd的血红蛋白聚合物，该溶液能以多达3升的量输入给人患者而不引起肾功能降低，所述方法包括下列步骤：
(a)通过将含有血红细胞的混合物通过具有足以防止白细胞通过的最小平均孔大小的过滤器而去除白细胞；
(b)裂解血红细胞；
(c)加入一氧化碳并将(b)的产物加热到60-62℃的温度10小时，得到热处理过的血红蛋白溶液；
(d)过滤热处理过的血红蛋白溶液，以去除通过加热沉淀的基质和基质污染物；
(e)通过在10℃温度下通入氧气，然后通入氮气到热处理过的溶液来使热处理过的血红蛋白溶液脱气，产生泡沫，得到脱气的、热处理过的血红蛋白溶液；
(f)将脱气的溶液吡哆酰基化，得到吡哆酰基化的血红蛋白溶液；
(g)将吡哆酰基化的血红蛋白溶液聚合，产生吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白；
(h)将溶液氧合；
(i)纯化溶液，以去除四聚体血红蛋白，并收集纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白，其中该溶液含有少于以血红蛋白总重量为基础的0.8％的四聚体；
(j)将纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白脱氧；和
(k)调节纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白溶液的pH和电解质水平达到生理水平。
18.一种吡哆酰基化的，聚合的血红蛋白溶液，所述溶液包含16％的分子量为128Kd的血红蛋白聚合物，26％的分子量为192Kd的血红蛋白聚合物，和58％的分子量为256Kd的血红蛋白聚合物，该溶液能以多达3升的量输入给人患者而不引起肾功能降低，所述溶液是通过包括下列步骤的方法得到的：
(a)减压下将过期的或者没有过期的血液通过合适的抽吸装置，得到抽吸的血液；
(b)通过将含有血红细胞的混合物通过具有足以防止白细胞通过的最小平均孔大小的一系列过滤器而从抽吸的血液中去除白细胞；
(c)在一氧化碳气氛下在1％氯化钠溶液中洗涤(b)的产物，得到pH为6.0-6.5的血红蛋白溶液；
(d)用水稀释(c)的洗涤溶液，形成裂解的细胞的溶液；
(e)通过过滤器过滤裂解的细胞的溶液，制备没有基质污染物和细胞壁材料的血红蛋白溶液；
(f)加热并过滤(e)的血红蛋白溶液至60-62℃的温度10小时，得到热处理过的没有基质的血红蛋白溶液；
(g)浓缩和渗滤热处理过的没有基质的血红蛋白溶液，得到羧基血红蛋白溶液；
(h)通过在10℃温度下向热处理过的溶液通入氧气后通入氮气来使羧基血红蛋白溶液脱气，产生泡沫，得到脱气的、热处理过的血红蛋白溶液；
(i)将脱气的溶液用吡哆醛-5″-磷酸酯与血红蛋白摩尔比是1∶1至3∶1的吡哆醛-5 ″-磷酸酯吡哆酰基化，得到吡哆酰基化的血红蛋白溶液；
(j)用戊二醛水溶液将吡哆酰基化的血红蛋白溶液聚合，产生吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白溶液，其中血红蛋白重量分布是65-75％的聚合物和25-35％的四聚体；
(k)将聚合溶液氧合并稀释，直到溶液含有4％重量的血红蛋白；
(l)纯化(k)的溶液，以去除四聚体血红蛋白，并收集纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白，其中该溶液含有少于以血红蛋白总重量为基础的0.8％的四聚体；
(m)将纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白用氮气脱氧；
(n)调节纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白溶液的pH和电解质水平至8.8-9.0，和
(o)将(n)的调节了pH的溶液浓缩并灭菌。
19.一种制备吡哆酰基化的，聚合的血红蛋白溶液的方法，所述溶液包含16％的分子量为128Kd的血红蛋白聚合物，26％的分子量为192Kd的血红蛋白聚合物，和58％的分子量为256Kd的血红蛋白聚合物，该溶液能以多达3升的量输入给人患者而不引起肾功能降低，所述方法包括下列步骤：
(a)减压下将过期的或者没有过期的血液通过合适的抽吸装置，得到抽吸的血液；
(b)通过将含有血红细胞的混合物通过具有足以防止白细胞通过的最小平均孔大小的一系列过滤器而从抽吸的血液中去除白细胞；
(c)在一氧化碳气氛下在1％氯化钠溶液中洗涤(b)的产物，得到pH为6.0-6.5的血红蛋白溶液；
(d)用水稀释(c)的洗涤溶液，形成裂解的细胞的溶液；
(e)通过过滤器过滤裂解的细胞的溶液，制备没有基质污染物和细胞壁材料的血红蛋白溶液；
(f)加热并过滤(e)的血红蛋白溶液至60-62℃温度10小时，得到热处理过的没有基质的血红蛋白溶液；
(g)浓缩和渗滤热处理过的没有基质的血红蛋白溶液，得到羧基血红蛋白溶液；
(h)通过在10℃的温度下向热处理过的溶液通入氧气后通入氮气来使羧基血红蛋白溶液脱气，产生泡沫，得到脱气的、热处理过的血红蛋白溶液；
(i)将脱气的溶液用吡哆醛-5″-磷酸酯与血红蛋白摩尔比是1∶1至3∶1的吡哆醛-5″-磷酸酯吡哆酰基化，得到吡哆酰基化的血红蛋白溶液；
(j)用戊二醛水溶液将吡哆酰基化的血红蛋白溶液聚合，产生吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白溶液，其中血红蛋白的重量分布是65-75％的聚合物和25-35％的四聚体；
(k)将聚合溶液氧合并稀释，直到溶液含有4％重量的血红蛋白；
(1)纯化(k)的溶液，以去除四聚体血红蛋白，并收集纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白，其中该溶液含有少于以血红蛋白总重量为基础的0.8％的四聚体；
(m)将纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白用氮气脱氧；
(n)调节纯化的、吡哆酰基化的、聚合的血红蛋白溶液的pH和电解质水平达到8.8-9.0；和
(o)将(n)的调节了pH的溶液浓缩并灭菌。
20.权利要求1的血红蛋白溶液在制备用于治疗患者失血的药物中的用途。
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