SK134398A3

SK134398A3 - Aqueous solution of the pyridoxylated polymerized hemoglobin and method for preparing the same

Info

Publication number: SK134398A3
Application number: SK1343-98A
Authority: SK
Inventors: Richard E Dewoskin; Marc D Doubleday
Original assignee: Northfield Lab
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2001-01-18
Also published as: BG102810A; NZ538045A; CA2250274A1; EP0928294A1; RU2203087C2; ES2200177T3; PL187923B1; DK0928294T3; US6498141B2; US20100197566A1; JP2000507947A; BR9708388A; CA2250274C; PT928294E; DE69722422T2; BG63919B1; OA10884A; AP1028A; US20020025343A1; NO324121B1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa býka spôsobu výruby náhrady červených krviniek, to znamená hemoglobínových produktov a zariadenia na túto výrobu. Vynález sa týka riebunkovej náhrady červených krvi.niek, ktorá obsahuje roztok zosieťovariého pulymerizovaného pyridoxyloveného hemoglobínu bez obsahu tetraméru a stromálnych kontaminantov.

Dotera iší stav techniky

Mnoho rokov krvné banky poskytujú pre použitie počas chirurgických zákrokov Cv prípadoch úrazu a pod.) plnú krv. Použití.e plnej krvi od ľudských darcov nie je však v mnohých prípadoch vhodné a to predovšetkým vďaka problémom súvisiacim s vyhľadávaním vhodného darcu, so stabilitou a uchovateľnosťou a v napokon aj s eventuálnou toxi.ci.tou takejto krvi, spôsobenou prítomnosťou vírusov a iných kontaminantov. Tieto problémy sú predovšetkým zrejmé v mimoriadnych situáciách, napr. pri použití plnej krvi. vo vojenskom lekárstve. Vďaka tomu sa venovala značná pozornosť vývoju náhrad plnej krvi od ľudských darcov. Vzniklo mnoho modifikácii krvi ľudských alebo cicavčích darcov. Hemoglobín bez obsahu stromálnych kontaminantov je v odbore známy svojou vlastnosťou prenosu a reverzlbílného viazania kyslíka alebo iného ligandu. Keďže toxilogi.cké problémy zabránili jeho použitiu, hľadali sa ďalšie spôsoby, ako je hemoglobín bez obsahu stromálnych kontaminantov modifikovať tak, aby vznikol netoxický, farmaceutický použiteľný produkt.

Uvedené modifikácie zahrnujú: Cl) získanie hemoglobínu bez obsahu alebo s minimálnym obsahom strémy a stromálnych kontaminantov; C 2) pyridoxyláciu; C 3) polymerizáciu alebo zosieťovanie; C4) odstránenie tetraméru; a C5) modifikáciu oxidom uhoľnatým alebo inými ligandmi.

Hemoglobínové roztoky, pripravené uvedenými postupmi, síce vykazujú schopnosť prenášať dostatočné množstvo kyslíka a tým zabraňovať ireverzibilným poškodeniam tkanív, objavili sa však ich nežiadúce vedľajšie. účinky a vlastnosti. Jedným z najzávažnejších vedľajších účinkov je pritom napr. zhoršenie činnosti obličiek. Vznik tohoto problému sa prisudzoval, prítomnosti nežiadúcich kontamiriantov, napr. bakteriálneho endotoxínu alebo fragmentov membrán červených krviniek Cstrémy).

Napriek tomu, že uvedené kontaminanty skutočne spôsobujú poruchy

- r enálnych funkcií, aj použitie hemaglobíriových roztokov bez obsahu alebo s minimálnym obsahom vyššie uvedených kontamiriantov má za následok závažnú reriálnu dysfunkciu. Príčina je pripisovaná fyziologicky neprijateľnému množstvu nezpolymerizovaného hemoglobínového tetraméru. Ďalšími vedľajšími účinkami pri infúzii tetramérového hemoglobínu sú vazokonstrikcie, hemogloblnúrla, spomalenie srdcového rytmu, zvýšenie stredného arteriálrieho krvného tlaku a extravazácia irifuzátu predovšetkým do pobrušriicovej dutiny.

Dodnes nie je známa jediná hemoglobínová krvná náhrada, ktorá by nebola spojená s komplikáciami vzniknutými, v súvislosti s jej toxicitou. Doteraz popísané produkty mali tiež po podaní ľudskému pacientovi neprijateľne nízky polčas, čo má za následok nutnosť neustálej výmeny krvi a to vo veľmi krátkych intervaloch. Potreba hemoglobiriových produktov, ktoré sú pre pacienta netoxické a ktoré majú po podaní vyššiu hodnotu polčasu, teda ďalej trvá. Je pritom samozrejmé, že tieto produkty musia byt schopné reverzibilne viazať a prenášať kyslík ku tkanivám a to podobným spôsobom, akým sa to deje v prípade plnej krvi.

e

Podstata vynálezu *

Vynález sa týka hemoglobínovýoh náhrad, ktoré sú pre človeka netoxické a ktoré vykazujú po podaní človeku polčas minimálne 15 hodín. Hemoglobínové produkty podľa vynálezu sú pyridoxylátové a polymerizované a neobsahujú stromálne, vírusové ani iné toxické kontaminanty. Tieto produkty navyše obsahujú len minimálne množstvo leukocytov (bielych krviniek) a krvných doštičiek.

Vynález takisto zahrnuje spôsoby výroby hemoglobinových náhrad podlá vynálezu. Tieto postupy zahrnujú odstránení.e leukocytov a krvných doštičiek z krvi; premytie a lýzu Červených krviniek; odstránenie strumálnych kontainlnantov a strňmy filtráciou a tepelným spracovaním; prípravu deoxyhemoglobínu; pyridoxyláciu a polymerizáciu; ďalšie prečistenie a zahustenie; a odkysliCenie. Vzniknutý hemoglobíriový produkt môže byť formulovaný s cielom získania hemoglobínového produktu s takými hladinami. rôznych elektrolytov, ktoré ležia v normálnych fyziologických rozmedziach.

Vynález takisto zahrnuje vodný prípravok pyridoxylovariého polymérizovaného hemoglobínu. priCom hemoglobín je glutaraldehydom polymerizovariý hemoglobín obsahujúci tetrainérové podjednotky. ktorých distribúcia molekulových hmotností je znázornená na obr. 3. Tento prípravok môže byť. použitý pre výrobu nebunkovej náhrady červených krviniek. V tomto prípade sa prípravok najprv preCistí, čím dochádza k odstráneniu tetraméru a potom sa zlúCi s príslušným množstvom elektrolytov. čím vzniká fyziologicky prijateľná nebúriková náhrada červených krviniek, ktorá je potom použiteľná v prípadoch, kedy zdravotný stav ľudského pacienta vyžaduje infúziu látky -- prenášača kyslíka.

Stručná popíš obrazových príloh

Obr. 1 je schematickým diagramom znázorňujúcim tu fúzu výroby. ktorá vedie k získaniu hemoglobínového roztoku neobsahujúceho kyslík pre následnú pyridoxyláciu a polymerizáciu.

Obr. 2 je schematickým diagramom znázorňujúcim tu fázu výroby. ktorá zahrnuje pyridoxyláciu a polymerizáciu a ktorá vedie k prečistenému pyrldoxylovanému polymerizovanému hemoglobínevému produktu neobsahujúcemu kyslík a tu fázu výroby, ktorá vedie k vzniku hemoglobínového produktu s fyziologicky zodpovedajúcimi hladinami elektrolytov.

llbr. 3 znázorňuje stopovú analýzu polymerizovaného materiálu pri použití vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie a to po reakcii s glycínom a pred preCisbením. Polymerizovaný produkt je charakterizovaný plkmi prd. retenCných dobách 15.57, 16.08. 17.00 a J.8, 1.9. Tetramérový materiál je charakterizovaný plkmi v retenCných dobách 19,88 a 20,51. Polymérria zložka tvorí 76.2

X uvedeného materiálu.

• llbr . 4 znázorňuje stopovú analýzu hemogloblnovéhu produktu podlá vynálezu pri použití kvapalinovej chromatografie.

Polymerizovaný hemoglobín je charakterizovaný plkmi v retenCných dobách 15,7, 16.33. 17,32 a 18.56. Tetramér je charakterizovaný píkom v reteríCnej dobe 21.18.

Obr. 5 je schematickým diagramom znázorňujúcim Čistiacu fázu stĺpcovou ehromatografiou. ktorá je súCastou výrobného postupu pudla vynálezu.

Obr. 6 je schematickým diagramom znázorňujúcim Čistiacu fázu membránovou filtráciou, ktorá je súCastou výrobného postupu podľa vynálezu.

Vynález sa týka rieburikovej náhrady Červených krviniek, ktorá obsahuje zošle Ľovaný. polymerizovaný pyridoxylovaný hemoglobín bez obsahu alebo s minimálnym obsahom tetramérových podjednotiek, s brómy a stroinálnych a iných kontamiriantov.

Uvádzaný výraz zosietovariý znamená chemické vbudovanie *

molekulových mostíkov na alebo do molekuly, prípadne medzi molekuly, čo má za následok zmenu tvaru, veľkosti a funkčných m

alebo fyzikálnych vlastnosti danej molekuly. Zosietované molekuly mOžu byt polymerizované alebo nepolymerízovarié, to znamená, že znsietované molekuly mfižu byt aj tetramérrie.

Uvádzané výraz tetramér sa týka molekúl hemoglobínu, ktorých molekulová hmotnosť je približne 64 Kd; výraz sa vzťahuje ako na natívne, tak aj iritraniulekulárne zosieťované molekuly hemoglobínu.

Uvádzaný výraz v podstate neobsahujúci tetramér označuje takú mieru čistoty vzhľadom na obsah tetraméru, pri ktorom už nedochádza pri pudanl uvedeného množstva tetrainéru cicavcovi, ktorému je podaný, k určitým biologickým odpovediam. Hlavným kritériom je pritom neprítomnosť zhoršenia činnosti obličiek po podaní farmaceutický účinného množstva danej látky, ku ktorému dochádza pri miere čistoty 9‘J % a viac (podiel tetraméru je teda nižší ako i X). Produkt vyrobený postupom podľa vynálezu neobsahuje výhodne viac ako 0,8 Z tetraméru, vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu (total hemoglobín CTHb)). Inými slovami, produkt podľa vynálezu v podstate neobsahujúci tetramér neobsahuje väčšie ako fyziologicky prijateľné množstvo riezpolymerizovanéhu henioglobinového tetraméru. Výhodne obsahujú produkty podľa vynálezu menej ako 0,5 %; najvýhodnejšie obsahujú produkty podľa vynálezu 0,3 až 0,4 % tetraméru. Bolo dokázané, že takéto množstvá tetraméru sú fyziologicky prijateľné.

Uvedené výrazy ultraprečistený produkt alebo prečistený produkt majú rovnaký význam ako výraz v podstate neobsahujúci tetramér.

Uvedený výraz % celkového hemoglobínu zodpovedá množstvu gramov hemoglobínu na 100 ml roztoku.

Uvedený výraz polymérizačný roztok znamená roztok, ktorý obsahuje zosieťovacie alebo polymér j.začné činidlo, napr. glutaraldehyd, imidoestery. diaspirin a pod. v biochemický prijateľnom nosiči.

Uvedený molekulových pod jednotky.

zaradenie tetramérrie výraz polymér izovariý znamená mostíkov medzi molekuly alebo pričom veľkosť a hmotnosť výsledného polyméru je väčšia ako pokiaľ ide o natívny alebo tetrainérriy hemoglobín. Polyinerizovaný hemoglobín nie je tetramérny hemoglobín.

β

Uvedený výraz hemoglobínový roztok znamená roztok tetramérneho hemoglobínu alebo polymeriznvaných molekúl hemoglobínu, pričom Červených krviniek, červených krviniek tieto molekuly nie hú obsiahnutí-': v bunkách Takýto roztok nemusí neobsahovať strúmu alebo stromálne kontaminanty. Výhodne však neobsahujú strúmu ani roztoky polymerlzovaného hemoglobínu stromálne kontaminanty.

Výraz semipermeabilná membrána oznaCuje takú membránu, ktorá je priepustná len pre určité druhy molekúl a ktorá tak funguje ako selektívny filter, ktorý zabraňuje prechodu molekúl s určitými molekulovými, hmotnosťami.

Produkt vyrobený postupom podľa vynálezu - roztok polyinerizovaného, pyridoxylovaného hemoglobínu neobsahujúceho tetramérny C natívny alebo zosieťovaný) hemoglobín a stromálne a iné kontaminanty, vyrobený z tepelne spracovaného. vírusovo inaktivovariého tetramérneho hemoglobínu - je -fyziologicky prijateľný a terapeuticky a klinicky použiteľný. Produkt má schopnosť reverzibilrie viazať kyslík, čo je pre transport kyslíka nevyhnutné. Predovšetkým vykazuje produkt podľa vynálezu solídne schopnosti pri. vytváraní a zanikaní väzby produkt-kyslík, čo dokazuje aj disociačná krivka kyslík-hemoglobín (P_so). ktorá je podobná plnej krvi. Produkt podľa vynálezu viaže kyslík s vysokou afinitou v pľúcnych kapilárach a potom v zodpovedajúcej miere uvoľňuje do tkanív celého tela. Použitie produktu podľa vynálezu takisto nevyžaduje stanovenie kompatibility voči príjemcovi.

Produkt podľa vynálezu vykazuje ďalej po podaní človeku polčas najmenej 15 hodín, výhodnejšie asi 24 hodín. Hemoglobínový produkt podľa vynálezu môže byť podávaný pacientovi formou infúzie a to v objeme asi 3,0 litre a dokonca až asi 5,0 litrov. Inými slovami, hemoglobínový produkt podľa vynálezu môže nahradiť v podstate celú pacientovu krv bez toho, aby spôsobil vazokonstrikciu, otravu obličiek. hemoglobiriúriu alebo iné ťažkosti spojené s intravenóznym podaním syntetických alebo

Ί semisyntetických prenášačov kyslíka a krvných náhrad. Vynálezu teda zahrnuje a.j spôsob uskutočňovanie transfúzie netoxického polymér l.zovaného pyridoxylátového hemoglobinového produktu bez obsahu otrémy a tetraméru a to pacientovi, výhodne človekovi, v množstve až asi 5.0 litrov. Tento spôsob zahrnuje pripojení.e pacienta k lnfúznemu alebo inému zariadeniu, ktoré umožňuje uskutočniť infúziu alebo transfúziu.

Spôsob výroby podľa vynálezu je jedinečný v tom. že vedie k produktu, v ktorom obsah tetraméru nepresahuje asi J. %. výhodnejčie asi 0. 8 hmotnosti vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu v roztoku. Spôsob podľa vynálezu je tiež výhodný z toho hľadiska, že umožňuje získať konečný produkt. ktorý je v podstate bez obsahu mikrobiálnych a vírusových antigénov a patogériov. Obsah takýchto mikrobiálnych a vírusových antigénov a patogénov je zredukovaný na nedetegovateľné množstvo, to znamená, že produkt je, podľa analýzy uvedenej v kapitole 71 United States Pharmacopoeia, r. XXIII, sterilný. Príkladom uvedených antigénov a patogénov sú bakteriálne, rikeciálne, fungálne, protozénne, vírusové a iné organizmy. Najdôležitejšia je však skutočnosť, že spôsob výroby podľa vynálezu vedie k získaniu biologického produktu bez obsahu vírusov, ktoré spôsobujú hepatitídu a syndróm získaného zlyhania imunity (AIDS).

Pokiaľ ide o jeho fyziologické vlastností.. nespôsobuje biologický produkt podľa vynálezu pri infúzii v množstve až 5, U litrov vazokonstrlkcie, renálnu toxicitu, hemoglobinúriu ani iné komplikácie, opojené s intravenóznym podaním známych hemoglobínových roztokov, ktoré obsahujú fyziologicky neprijateľné množstvo tetramérneho hemoglobínu. Intravenózne podanie produktu podľa vynálezu nijako neznižuje produkciu moču a rýchlosť glomerulárnej filtrácie, nemá za následok extravazáciu do pobrušnicovej dubiny a zmenu zafarbenia produkovaného moču.

Spôsob výroby podľa vynálezu teda zaisťuje nebunkovú náhradu červených krviniek, ktorá je výhodná pri. ošetrení úrazu, pri. liečení infarktu myokardu, mŕtvice. akútnej anémie a porúch δ

zásobovania kyslíkom, napr. hypoxéinii, hypoxii alebo hypoxii v poslednom štádiu následkom zlyhania funkcie pľúc okysličovať krv. Produkt podľa vynálezu je takisto výhodný pri liečení stavov, ktorá vyžadujú prísun resuscitačných tekutín Cnapr. trauma, špecifický hemoragický šok), látok zväčšujúcich l.ntravaskulárny objem alebo pri výmennej transfúzii. Okrem použitia v klinickej praxi môže byt produkt podľa vynálezu takisto výhodne použitý na prechovávanie orgánov určených pre transplantácie.

Spôsob výroby podľa vynálezu zahrnuje nasledujúce stupne:

1. Odsatie červených krviniek a filtrácie

2. Premytie/lýza buniek

3. Tepelné spracovanie

4. Zahustenie ultrafiltráciou

5. Odplynenie

6. Chemická modifikácia

7. Prečistenie

8. UP-polykoncentrácia

9. Deoxidácia

10. Formulácia

Výhodnou východiskovou látkou pre výrobu podľa vynálezu je plná ľudská krv s vypršanou dobou exspirácie alebo koncentrované červené krvinky. Môže byť takisto použitá krv s nevypršanou dobou exspirácie. Výhodne sa použije taká plná krv, ktorej doba exspirácie, vyznačená na vrecku s darcovskou krvou, nevypršala pred viac ako 2 týždňami. Použitie krvi s dobou exspirácie, ktorá vypršala pred viac ako 2 týždňami, by totiž znamenalo vznik istých problémov pri extrahovaní hemoglobínu a odstraňovaní bunkových zvyškov, napr. stroinálriych proteínov a kontaminantov.

Všetky tu popísané postupy je možné aplikovať aj na krv iných cicavcov a to len s minimálnymi modifikáciami, ktoré vyplynú pre odborníka v odbore. Väčšina postupov sa pritom uskutočňuje pri teplotách od asi 2 °C do asi 8 °C, výhodne pri teplotách okolo 4 °C.

Počas odsávania červených krviniek a filtrácie sú červené krvinky aseptický extrahované z vrecka s darcovskou krvou tak. že krv neprichádza do styku so vzduchom a prechádza cez sériu filtrov. čím vzniká suspenzia červených krviniek so zníženým obsahom leukocytov a krvných doštičiek. Vzniknutá suspenzia sa potom premáva a dochádza k lýze buniek.

Suspenzia sa premyje IX roztokom chloridu sodného pod atmosférou oxidu uhoľnatého, čím sa odstráni zvyšok plazmových proteínov. Premyté červené krvinky sa potom spracujú vodou pre injekcie. čím dochádza k lýze buniek. Vzniknutá zmes sa potom prečisti filtráciou s priečnym tokom. Prečistený produkt sa potom spracúva tepelne, čím sa vyzrážajú ďalšie stromálne látky, ktoré sa potom odstránia filtráciou. Produktom tohoto stupňa je hemoglobínový roztok bez obsahu strúmy s obsahom celkového I lemoglobí nu asi 3 % C hmotn./obj.).

Tepelne spracovaný hemoglobínový roztok bez stromálnych kontaminantov s obsahom karboxyhemoglobínu sa zahusti a odplyní za vzniku hemoglobinového roztoku s obsahom deoxyhemoglobíriu. Odplynenie zahrnuje najprv sýtenie karboxyheinoglobínového roztoku kyslíkom počas asi 16 hodín. Vzniká roztok okysličeného hemoglobínu s obsahom karboxyhemoglobinu asi 7 X (vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu). Kyslík sa potom odstráni dusíkom, argónom alebo héliom, čím vzniká roztok s obsahom voľného hemoglobínu, to znamená hemoglobínu riezlúčeného, s obsahom oxyhemoglobíriu asi 7 X (vztiahnuté ria hmotnosť celkového hemoglobínu). Vzniknutý odplynený roztok sa prefiltruje a prevedie do nádoby, v ktorej je potom chemicky modifikovaný.

Po odplynení je hemoglobínový roztok bez obsahu stromálnych kontaminantov pyridoxylovaný pri použití pyridoxal-5'-fosfátu (P5P) v molárnom pomere pyridoxal-5'-fosfátu k hemoglobínu od asi i:1 do 3:1. Hemoglobínový roztok bez obsahu stromálnych kontaminantov môže byť pripadne pyridoxylovaný pri použití 2-Nor-2-formylpyridoxal-5'-fosfátu. K pyridoxylačriej zmesi sa ako ίο redukčné činidlo pridá kyanbúrhydrid sodný alebo výhodne bórhydrid sodný. Nadbytok činidla a soli sa odstráni dialýzou pri použití vody bez obsahu pyrogénu alebo výhodne diafiltráciou vodou pre injekcie. Pyridoxylátovaný hemoglobín sa potom polymerizuje roztokom glutaraldehydu.

Pyridoxylovaný hemoglobíriový roztok bez obsahu stromálnyeh kontaminantov sa polymerizuje vodným roztokom glutaraldehydu. DÍžka polymerizácie a množstvu pridaného glutaraldehydu pritom závisí od objemu hemogloblnového roztoku, požadovaného výťažku polymérov a požadovanej distribúcie molekulových hmotností. Všeobecne je možné povedať, že dlhšia doba polymerizácie zvyšuje výťažok a molekulovú hmotnosť polymérov. Výťažok približne 75 % (hmotnosť polyméru vzhľadom na hmotnosť celkového hemoglobínu) je dosiahnutý po asi 16 až 18 hodinách polymerizácie. Výhodne je polymerizáciu ukončiť vo chvíli, kedy roztok obsahuje asi 75 % hmotnosti polymérov, pričom tento okamih je indikovaný pomocou size-exclusion vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie. Koniec polymerizácie sa prípadne určí ako chvíľa. kedy roztok obsahuje asi 65 % polymérov, to znamená po asi 2,5 hodinách.

Polymerizačná reakcia sa ukončí prídavkom vodného roztoku glyciriu. Pufer musi byť pridaný tak rýchlo, ako len je to možné. Zosieťovaci proces sa potom stabilizuje čo najrýchlejším prídavkom vodného roztoku bňrhydridu sodného. Polymerizovaný roztok sa potom zahustí a diaflitruje pod atmosférou kyslíka s cieľom okysličenia roztoku. K roztoku sa potom pridáva voda a to až do chvíle, kedy roztok obsahuje asi 4 % hmotnosti hemoglobínu.

Polymerizáciou podľa vynálezu sa získajú polyméry, ktorých hmotnosti ležia v úzkom rozmedzí, ako je zrejmé z nižšie uvedeného obr. 3 a z príkladu 1.

Roztok polymerizovaného pyridoxylovariého hemoglobínu sa potom prečistí stĺpcovou chromatografiou alebo filtráciou (napr. membránovou filtráciou) alebo postupne obidvoma procesmi a to s cieľom odstránenia zvyškového nezpolymerizovariého (tetra11 merlckého) hemoglobínu z. roztoku. Prečistený roztok polymerizovaného hemoglobínu sa potom zahustí na asi. 6 % a to pri použití ultrafiltračriého aparátu.

Zahustený roztok sa potom zbaví kyslíka premývaním dusíkom. Denxldánla sa uskutočňuje pri. teplote 10 až 12 C a to do chvíle, kedy obsah oxyhemoglobínu klesne pod 16 %, vztiahnuté na hmotnosť * celkového hemoglobínu.

. Vzniknutý deaxidovaný prečistený roztok polymerizovaného hemoglobínu sa potom zahustí ultrafiltráciou pod atmosférou dusíka v chladenej nádobe. Hodnota pH sa upraví na asi. 6,8 až 9,0, obsah elektrolytov sa upraví podlá potreby tak, aby zodpovedal hodnotám normálnej plazmy. Pripadne môžu byť pridané bežné antioxidanty, napr. glutatión, askorbát alebo glukóza. Po tom. ako sa roztok zahustí na príslušnú hodnotu, výhodne asi 10 % hmotností polymerizovaného pyridoxylovaného prečisteného hemoglobínu bez obsahu tetramérov a stromálnych koritamiriantov, je sterilizovaný filtráciou a sterilné prevedený prevádzacím aparátom do vhodných farmaceutický prijatelných obalov.

Údaje o vzniknutom hemoglobínovom roztoku sú uvedené nižšie:

Polymérizovaný hemoglobín

Celk. obsah hemoglobínu^l ľlethemoglobin (.% z celk . Hb) ¹

Karboxyhemoglobin C X z celk. Hb)¹P_so CkPa)’

Osinolarita C mmol/kg) ^a

Sodík Cminol/1)³

Horčík Cmmol/1)³

Chloridy Cmmol/1)³

Volné železo ζρριη)“*

Distr. molekúl, hmotn. - pík 128 Kd (%)^sDistr. molekúl, hmotn. - pík 192 Kd <X)^H

9. 5 - 12, 0 menej ako 8, 0 menej ako 5, 0 3, 07 - 4. 27 280 - 360 135 - 155 3, 5 - 4, 5 85 - 110 menej ako 2 10 - 24 18 - 30

Distr. molekúl, hmotn. - pik 256 Kd <%)³	45 -	70
Tetramér C64K) CZ)⁵³	menej	ako □. 8
Endotoxín <EU/ml>^Ä	menej	ak ó 0, 03
Fosfolipidy Cng/Hb)⁷	menej	ako 50
Glyknlipldy CrigCHb)⁷	menej	ako 2

¹ Hladina w polymerizovanom hemoglobíne stanovená spektrofotometricky ^s Hladina v polymerizovanom hemoglobíne stanovená osmometricky ³ Hladina v polymerizovanom hemoglobíne stanovená iónovo selektívnou elektródou * Hladina v polymerizovanom hemoglobíne stanovená atómovou absorpciou ³ Stanovenie vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou slze exclusíon ^A Stanovenie pomocou LAL pri použití testovacej súpravy komerčne dostupnej od Associates of Cápe Cold; časti súpravy majú katalógové čísla 100-5. 800-1 a 3100-5.

τ Stanovenie vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou.

V nasledujúcej časti sú uvedené príklady realizácie podlá vynálezu. Ak nie stupňoch Celzia, hodnoty, napr.

je uvedené niečo iné, je teplota uvádzaná v Ak nie je uvedené niečo iné. sú percentné celk. hemoglobín CTHb), vyjadrené údajom hmotnosť/objem (w/v). Takisto je nutné poznamenať, že je možné uskutočňovať uvedené reakcie pri teplotách vyšších či nižších ako je uvedené, s výhradou, že je to všeobecne menej výhodné.

Ak riie je uvedené niečo iné, sú všetky nádoby a nádrže použité pre spôsob výroby podlá vynálezu vyrobené z nehrdzavejúcej ocele 31.6-L, pričom povrch týchto nádob a nádrži je dokonale vyleštený, čo uľahčuje a zrýchľuje ich čistenie. Všetky súčasti spájacieho vedenia a rúrky sú vyrobené takisto z uvedenej nehrdzavejúcej ocele alebo z teflónu či silikónu. Použité filtre a membrány sú komerčne dostupné od spoločnosti ňilliporc: Inc., Pall-Fíltrón alebo Cuno Inc.

Polčas vzniknutého produktu podľa vynálezu je určený in vivo a to pre cicavce. napr. Človeka. Všeobecne je krvná vzorka cicavca odobraná po uplynutí urCitej doby od infúzie, ktorou mu bol podaný produkt podľa vynálezu. Množstvo produktu sa potom urCi ceritrifugáciou krvnej vzorky a vyjadri sa ako množstvo plazmy, pričom sa spektrofotometricky stanov! hladina v plazme a potom sa vztiahne množstvo produktu. ktoré zastáva v danom organizme, na polCas uvedeného produktu.

Vysokotlaková kvapalinová size-exclusion chromatografia sa uskutočňuje nasledujúcim spôsobom:

Vzorka sa zriedi 0. 21*1 pufračným roztokom fosforečnanu draselného C pH = B, 9) na hodnotu 0,2 g/dl, prefiltruje sa cez 0,2 um filter a injekčné sa prevedie do chromatografického systému. zloženého z nasledujúcich súčasti (uvedené v poradi zodpovedajúcom smeru prietoku cez systém):

1. Čerpadlo Pharmacia, model 2248

- mobilná fáza: 0, 21*1 fosforečnan dr aselný, pH B. 9

	- prietok:	1, 0 inl/min
2.	Rúrka PEEK	alebo titánová	rúrka.	dĺžka	45 cm, 0, 01.0
	in.I.D.
3.	Vstrekovacia	dýza Rheodyne,	model	7725i.	s 200 ul

vzorkovou slučkou PEEK

4.	Rúrka	PEEK	alebo titánová	rúrka.	dĺžka	18 cm. 0. 010
	in.I.D	•
5.	Filter	0. 5 um	i, model. Λ431
6.	Rúrka	PEEK	alebo titánová	rúrka.	dĺžka	9 cm. 0. 010

in.I.D.

7. Kolóna Guard. Phenomeriex Blosep SEC S--3000. 75 x 7. 8 mm

8. Rúrka PEEK	alebo titánová	rúrka.	dĺžka	24 cm. 0. 010
	in.I.D.
9.	Analytická 7, 8 mm.	kolóna, Pheriomenex Blosep	SEC S	-3000. 600 x
10	.Rúrka PEEK in.I.D.	alebo titánová	rúrka.	dĺžka	23 cm, 0, 010

11.. UV-detektor Pharmacia Uvlcord SD dĺžka vlny: 280 nm prietoková komôrka: obj. 8 ul, dĺžka dráhy 2,5 mm rozsah: 2 AUFS časová konštanta: 1Π sekúnd

Absorpčný pík prd. 280 nm Je zaznamenaný pomocou Integrátora LKB 221, ktorý Integruje jednotlivé plochy píkov a vypočíta celkovú plochu hemoglobínu pre každý druh polyméru.

Nižšie uvedené príklady pomôžu viac pochopiť podstatu vynálezu.

Príklady realizácie vynálezu

Nasledujúce príklady majú len ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou patentových nárokov.

Príklad 1

Na obr. L sú znázornené krvné konzervy 20 ohsahujúce darcovskú krv (plnú krv alebo koncentrát červených krviniek) s vypršanou dobou exsplrácie. Sú umiestené vo vhodom aseptickom odsávacom zariadení 22. Príkladom takéhoto vhodného odsávacieho zariadenia je systém zložený z dvoch odsávacích jednotiek. Po tom, ako je vrecko s darcovskou krvou umiestené do odsávacej jednotky, prepichne vrecko ihla, pomocou ktorej je do vrecka prevedených asi 150 ml IX (hmotn./obj.) vodného roztoku chloridu sodného. Z uvedeného vrecka sa pri zníženom tlaku alebo vákuovo odsaje darcovská krv s vypršanou dobou exsplrácie. Odsatá krv potom prechádza cez filter 24 (hĺbka 100 um) a potom postupne cez dva filtre 26 (hĺbka 5 um). Prechodom cez 5 um filtre sú z krvi odstránené leukocyty. Obvykle sa odsaje asi 170 jednotiek krvi s vypršanou dobou exsplrácie, ktorá sa uvedeným spôsobom preflitruje a potom prevedie do nádrže 1, ako je znázornené na obr. 1. Filtre sa potom prepláchnu asi 75 litrami IX (hmotn./obj.) vodného roztoku chloridu sodného.

Pre tým, ako sa prevedie krv do nádrže 1, sa naplní táto nádrž asi. 70 litrami 12 vodného roztoku chloridu sodného. Po tom, ako sa teda celých 170 jednotiek krvi s vypršanou dobou expresie odsaje, prefiltruje a prevedie a po tom, ako sa prepi.áchriu všetky uvedené filtre, obsahuje nádrž asi 250 litrov 42 hemoglobínového roztoku. Počas odsávacej a filtračnej fázy je v nádrži 1 udržiavaný znížený tlak, to znamená vákuum, pri tlaku 2,56 až 3,72 kPa. Po tom, ako je do nádrže '1 prevedená všetka krv s vypršanou dobou exspirácie, je vákuum v nádrži 1 nahradené oxidom uholriatým.

Nádrž 1 sa pripojí k 0, 65 um tangenciálnemu prietokovému filtru 28 Cobr. 1). Pôvodný objem 250 litrov 4% hemoglobínového roztoku sa zahustí na približne 125 litrov 8% hemoglobínového roztoku mikrofiltráciou cez uvedený tangericiálny prietokový filter. pH hemoglobínového roztoku má v tomto okamihu hodnotu asi 6 až 6, 5. Po vyššie uvedenej zahusťovacej fáze sa roztok premyje 12 Chmotn./obj.) roztokom chloridu sodného. 125 litrov hemoglobínového roztoku sa obvykle premyje 8 obj. dielmi 12 roztoku chloridu sodného Cas:i. 1 000 litrov). Po premytí sa roztok zahustí na objem asi 70 litrov, čim vzniká asi 142 hemoglobínový roztok. Objem roztoku sa doplní na asi 180 litrov prídavkom vody pre injekcie CWFI). Prídavkom vody pre injekcie naberajú bunky objem a praskajú, pričom sa uvnlňuje hemoglobín do roztoku. Koncentrácia vzniknutého hemoglobínového roztoku je asi 5 2 celkového hemoglobínu.

Ešte v nádrží 1 sa vzniknutý roztok prečistí. Najprv sa zahusti na objem asi 50 litrov a filtrát sa prevedie do nádrže 2. Pri prechode filtrom sa na filtri zachytia stromálrie kontaminanty a časti bunkových stien. Zvyšných 50 litrov roztoku v nádrži 1 sa premyje Cdiafiltruje) asi 2.5 objemovými dielmi vody pre injekcie CWFI) a potom sa pridá do nádrže 1. Materiál, ktorý zostal v nádrži 1. sa potom zahustí na objem asi 20 litrov a filtrát sa pridá do nádrže 2. Celkovo je teda v nádrži 2 asi 280 litrov 3,32 hemoglobinového roztoku.

Vzniknutý hemoglobínový roztok bez obsahu stromálnych kontaminantov sa potom tepelne spracúva v nádrži 2 pri teplote asi 60 až 62 °C a to počas asi 10 hodín. Roztok sa pritom priebežne pretrepáva. Pri zahrievaní sa v roztoku pri teplote 55 ^C,Ľ tvorí zrazenina.

Vzniknutý 3. 3% hemoglobínový tepelne spracovaný roztok bez obsahu stromálnych kontaminantov sa potom prefiltruje cez 0,2uk filter 30 a 0. lum filter 32 a prevedie sa do nádrže 3. Prefiltrovaný hemoglobínový roztok sa potom zahustí tak. aby bol asi 18% a potom sa premyje a diafiltruje 4 objemovými dielmi vody pre injekcie (18% litrov). Zahustenie a diafiltrácia sú zavŕšené použitím ultrafíltra 34 (molekulová hmotnosť 10 kd (kilodalton)). Vo výstupnom lieviku 35, spojenom s ultrafiltrom 34, sa zhromažďuje filtrát. V tomto stupni obsahuje 45 litrov 18% hemoglobinového roztoku menej ako 50 rig fosfolipidov ria gram hemoglobínu, menej ako 2 ng glykolipidov na gram hemoglobínu, menej ako 1 % methemoglobínu a menej ako 0,03 endotoxínových jednotiek na mililiter pri pH v rozmedzí od 6 do 6, 5. Hemoglobín v roztoku je karboxyhemoglobín.

Vzniknutý karboxyhemoglobínový roztok sa potom prevedie do nádrže 4, kde je najprv karboxyhemoglobín oxidovaný a potom deoxidovaný. Nádrž 4 je vybavená rozstrekovačom, napojeným na prívody plynného kyslíka a dusíka, dávkovacím zariadením, umiesteným v hornej časti nádrže a prietokovým zberačom peny, napojeným na nádržku na penu Foam Can 1 tak. že pena vzniknutá v nádrži 4 sa prevádza do nádržky na penu Foam Can 36, v ktorej kondenzuje na kvapalinu a odtiaľ je prevedená späť do nádrže 4. Nádrž 4 ďalej obsahuje náplň krúžkov Pall, ktorá predstavuje asi jednu tretinu celkového objemu nádrže. Súčasťou nádržky na periu 36 je odplyňovací ventil. Roztok v nádrž j. 4 je 13% hemoglobínový roztok. Počas prvého oxidačné stupňa je kyslík do roztoku zavádzaný rýchlosťou, ktorá zaistí rovnomernú disperziu plynu v nádobe. Do tejto nádoby s objemom 200 litrov je plyn zavádzaný rýchlosťou 25 litrov za minútu. Oxidácia karboxyhemoglobínu sa uskutočňuje počas 1.6 hodín, takže výsledný roztok obsahuje menej ako 5 % karboxyhemoglobínu C vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu). Oxidácia sa uskutočňuje pri teplote asi 10 °C. Peria, vzniknutá v nádrži 4, sa zozbiera v nádržke 36 a po usadení sa vzniknutý roztok prevedie späĽ do nádrže 4.

Po oxidácii sa do roztoku podobným spôsobom zavádza plynný dusík a to počas asi 6 hodín, dokiaľ v roztoku nie je mene ako 10 % oxyhemoglobínu (vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu). Zavádzanie dusíka sa uskutočňuje pri teplote asi 10 °C a pH v rozmedzí od asi 6 do 6,5. Karboxyhemoglubin môže byť prípadne prevedený na deoxyhemoglobiri použitím membránového meniča. Je nutné poznamenať, že počas speňovacleho stupňa v podstate nedochádza, oproti očakávaniu, k denaturácii hemoglobínu. Vzniknutý roztok deoxyhemog]obinu je teraz pripravený pre chemickú modifikáciu.

Ako je znázornené na obr. 2, je deoxyhemoglobíriový roztok prevedený s cielom chemickej modifikácie do nádrže 5. Do tejto nádrže, obsahujúcej deoxyheinoglobínový roztok s teplotou asi 4 °C, je potom pridaný vodný roztok pyrldoxyl-5-fosfátu (P5P) (93.75 g/1) v inolárnom pomere P5P k hemoglobínu od 1«1 do 3sl. Výhodne je molárny pomer P5P k hemoglobínu asi 2:1. Pyrídoxylácia sa uskutočňuje pri teplote asi 4 °C. Roztok P5P sa obvykle pridáva počas 1. minúty a mieša sa počas 15 minút a potom sa k hemoglohínovému roztoku pridá roztok bórhydridu sodného/hydroxidu sodného pri molárnom pomere búrhydrid sodný s hemoglobín asi 20:1. Vhodný vodný roztok bórhydridu sodného/hydroxidu sodného obsahuje 0, 8 g hydroxidu sodného na 2 litre a 90, 8 bórhydridu sodného na 2 litre. Bórhydridový roztok sa pridá najrýchlejším možným spôsobom počas 1 minúty a potom sa zmes počas 1 hodiny mieša. Vzniknutých 50 litrov roztoku pyridoxyloveného hemoglobínu sa potom díafiltruje pri. použití 10 kd ultrafiltra 38. čim sa 4 objemovými dielmi vody pre injekcie odstránia prebytočné reaktanty. VO výpustnom lieviku 40, spojenom s ultraflitrom 38, sa zozbiera filtrát z filtra 38.

Po diafiltrácii 4 objemovými, dielmi, to znamená 200 litrami, vody pre injekcie, je hemoglobín polyinerizovaný. Do nádrže 5, obsahujúcej pyridoxylovariý hemoglobín, sa pridá voda pre injekcie v množstve dostačujúcom pre vznik 4, 5% hemoglobínového rriztoku C asi. 175 litrov hemoglobínového roztoku) . K roztoku pyridoxylovaného hemoglobínu sa potom pridá roztok glutaraldehydu • a to pri molárnom pomere glutaraldehydu k hemoglobínu asi 24: L.

Glutara'ldehydový roztok sa obvykle pridáva dávkovacím čerpadlom « počas asi 2,5 hodiny. Polymér izačriá reakcia sa pritom nechá prebiehať počas asi 18 hodín. Požadovaná distribúcia molekulových hmotností je pritom asi 75 % polyméru a asi 25 % tetraméru.

Vzniknuté polyméry majú molekulové hmotnosti nižšie aku 60U 000 s prevažujúcou frakciou molekulových hmotnosti v rozmedzí od 100 000 do 350 000.

Keď sa po asi 18 hodinách polymerizácie dosiahne požadovaná distribúcia molekulových hmotnosti, pridá sa k hemoglobínovému roztoku . vodný roztok glycíriu C asi 166 g/1) v molárnom pomere glycíri k hemoglobínu asi 140:1. Na obr. 3 je znázornený diagram stanovenia stop vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou polymerizovaného hemoglobínového produktu po prídavku gl.ycínu. Vzniknutý roztok sa potom počas asi 10 minút mieša a potom sa k nemu pridá vyššie popísaný roztok bérhydrldu sodného/hydroxidu sodného v molárnom pomere bórhydrid sodný:hemoglobín asi 28:.1.. Takto vzniknutá zmes sa potom počas asi. 1. hodiny mieša a potom sa zahustí na asi 50 litrov Cultrafliter 38) a premyje sa 4 objemovými dielmi C200 litrov) vody pre injekcie. K zahustenému roztoku sa pridá ďalší alikvot bórhydrí.du sodného vo vyššie

B uvedenom molárnom pomere a potom sa zmes opäť 1 hodinu mieša. Vzniknutý roztok sa premyje 4 objemovými dielmi, vody pre injekcie

V

C 200 litrov) za vzniku polymerizovaného pyridoxylovaného tepelne spracovaného hemoglobínu bez obsahu stromálriych kontaminantov.

Vzniknutá roztok sa oxiduje tým, že sa nechá stáť pod atmosférou kyslík a potom sa prevedie do čistiaceho systém 42. Prečistenie je možné takisto uskutočňovať stĺpcovou chromatografiou, filtráciou, výhodne membránovou filtráciou (diafiltráciou) alebo kombináciou filtrácie a stĺpcovej chromatografie.

Pri jednej z realizácií podľa vynálezu sa roztok prevedie do chromatografir:kej nádoby - nádrže 6- znázornenej na obr. 5. Pri tejto realizácii sa vzniknutý roztok oxyhemoglobinu zriedi v • nádrži Fi ria objem asi 200 litrov (4% hemoglobíriový roztok) a koncentrácia chlóridových aniónov sa upraví na 22 ml*l prídavkom i roztoku chloridu sodného. Úprava koncentrácie sodných katiónov nie je nutná.

Pri použití chromatografickej kolóny 44 sa potom chromatografuje päť 40-litrových alikvotov vzniknutého hemogloblnového roztoku. Kolóna 44 obsahuje aflnitný gél, ktorým je agarózový gél, upravený prídavkom žltého farbiva (komerčná dostupnosť: Affinity Chromatografphy, Ltd.. Mimetic Yellou č. 1) a ktorý vykazuje väčšiu afinitu k polyméru ako k tetraméru.

Chromatografia sa uskutočňuje nasledujúc J. m spOsobom: do kolóny 44 sa prevedie 40 litrov oxidovariého, polymerizovaného. pyridoxylovariého hemogloblnového roztoku bez obsahu stromálnyeh kontaminantov. Kolóna sa premyje asi 750 litrami 30 mM vodného nátriumchloridového pufra, čím sa odstráni tetramér. Kolóna sa potom premyje asi 250 litrami 300 mM vodného nátriumchloridového pufra, čím sa vymyje polymér. Polymérne frakcie sa zozbierajú v nádrži 7. Nepotrebné frakcie sa zozbierajú vo výpustnom lieviku 46. Kolóna sa regeneruje prídavkom 150 litrov 15 mM roztoku kyseliny chlorovodíkovej a 250 litrov 30 mM vodného roztoku chloridu sodného a potom sa do tejto kolóny prevedie ďalší alikvot (40 litrov) hemoglobíriového roztoku. Kolóna sa opäť premyje 30 mM chloridom sodným a 300 mM chloridom sodným. Do kolóny sa s cieľom chromatografického spracovania pridávajú ďalšie allkvoty hemoglobíriového roztoku, dokiaľ nie je nádrž 6 vyprázdnená.

Zozbierané frakcie v nádrži 7 sa ultrafiltrujú (zahustia) použitím filtra 48, spojeného s výpustným lievikom 50, na objem asi 40 litrov (6X hemoglobínový roztok). Zahustený hemoglobínový roztok f:a potom prevedie do nádrže 8, kde dochádza k deoxidácií.

Roztok sa pripadne prevedie do filtračnej recyklnčnej nádoby 10, ako je to znázornené na obr. 6. Hemoglobínový rozt.dk sa v nádrži 10 zriedi tak, že je obsah hemoglobínu v roztoku asi 4 X.

• Takýto roztok sa potom diaf litru je pri použití 10 ml*l chloridu sodného a filtra 52 (priepustnosť: do mol. hm. 300 000, komerčná » dostupnosť od spoločnosti Pall--Filtron) . Filtrácia prebieha do okamihu, kedy cez filter prejde asi 97 X hemoglobinového roztoku, ktorý sa zozbiera v nádrži 11. (Asi 3 X z celkového objemu roztoku, to znamená polyméry s vysokou molekulovou hmotnosťou, sa zachytia v nádrži 10). Obsah hemoglobínu sa určí spektrofotometricky pri použití kooximetra.

Nádrž 11 obsahuje roztok obsahujúci asi 2 až 4 X hemoglobínu a 7 až 10 tetraméru, 2 až 4X hemoglobínový roztok sa potom diafiltruje pri použití 10 ml*l chloridu sodného a filtra 54 (priepustnosť: do mol. hm. 100 000. komerčná dostupnosť od spol.

Pall-Filtrnn), ktorý je napojený na výpustný lievik 56. Filtrácia sa uskutočňuje do chvíle, kedy slze-exclusiori chromatografiou (kolóna BloSep SEC-S3000 600 x 7,8 mm) stanovený obsah tetraméru na hodnotu nižšiu ako 0,8 X hemoglobínu. Vzniknutý prečistený hemoglobínový roztok je najprv ponechaný v nádrži 11 a putom sa prevedie s cielom deoxidácia do nádrže 8.

Nádrž 8 môže byť rovnaká ako nádrž 4. výhodne je včak odlišná. Nádrž 8 je vybavená v podstate rovnako ak nádrž 4 na »

ubr. 1 a je napojená na nádržku s penou 58 rovnakým spôsobom ako nádrž 4 na nádržku na penu 36. Deoxidácia je ukončená po asi 2,5 »

hodinách zavedením dusíka pri teplote asi 10 °C a pH roztuku asi 7,5. Dusík je zavádzaný do roztoku do chvíle, kedy tento roztok obsahuje menej ako 16 X oxyheinoglobínu (vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu). Vzniknutý deoxyhemoglobínový roztok sa potom prevedie do nádrže 9, kde je formulovaný.

Vo ŕormulačnej nádrži 9 je najprv roztok zahustený ria asi 7% hemoglobínov]? roztok, ktorého pH sa pri 4 °Ľ upraví na hodnotu od asi 8,8 do 9,0. pH sa upraví 0, 21*1 roztoku hydroxidu sodného. K hemoglobínovéinu roztoku s pH 8, 8 až 9, 0 sa potom pridajú roztoky elek Ľrrilytov. Je tiež pridaná glukóza a glycín a to v takom množstvo, aby boli ich výsledné koncentrácie 5 g/l·. respektíve 1,75 g/J.. Do roztoku sa pridá takisto chlorid draselný a to takom množstve, aby bola koncentrácia draselných katiónov od asi 3,5 do 4, 5 ml*l. Ďalej sa pridá 31*1 chlorid sodný a to v takom množstve, aby bola koncentrácia chlór idových aniónov 85 až 110 mľl. Pridá sa ďalej laktát sodný a to v takom množstve, aby bola koncentrácia sodných katiónov 135 až 155 mľl. Napokon sa pridá 0,45 molárny roztok kyseliny askorbovej. čím sa zvýši koncentrácia tejto kyseliny v roztoku na asi 100 mg/l. Kyselina askorbová má funkciu konzervačnej a antioxidačriej látky pre ciele skladovania. Konečný hemog'J.obínový roztok má osmolaritu asi 280 až 360 mmol/kg.

Formulovaný hemoglobinový roztok sa potom zahustí pomocou filtra 60, spojeného s lapačom 62, ria 10X hemoglobinový roztok, ktorý je následne sterilizovaný filtráciou cez filter 64 a prevedený do aseptických presterílizovaných krvných korizierv.

V nižšie uvedenej tabuľke 1 sú uvedené charakteristiky produktu. pripraveného uvedeným spôsobom, šarže A. Tabulka 1 takisto zahrnuje charakteristiky produktov šarží B a C, pripravených vyššie uvedeným postupom.

Tabulka 1

Šar ža

Zložka	A	B	C
Hemoglobín (g/d)	10. 4	10. 2	10. 2
ľlethemoglobíri (%)	4.6	6. 0	5, 6
Karboxyhemoglobiri (%) P50 (kPa, pH 7.35-7.45. pCOa.	0. 2	1. 4	1. 5
4-66-5. 32 kPa)	3. 79	3. 56	3. 59
Osmolarlta (mmol/kg)	318	320	317
Sodík (mmol/1)	142	144	142
Draslík (mmol/1)	4. 0	4. 0	4. 0
Chloridy (inmol/l)	98	99	94
VoľĽné železo (ppm)	n, 7	1. 2	1. 0
Molekulová hmotnosť	128:16	128:11	128:16
(Z pri jedn. mol. hm., kd)	192:26	192:23	192:26
	256^R:58	256°»66	256®:58
Tetramér (X)	0,4	0, 3	0, 4
Eridotoxín (EU/ml)	menej ako	menej ako	menej
	0. 03	0. 03	ako 0. 03

Látka obsahuje takisto malé množstvo látok s vyššou molekulovou hmotnosťou

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vodný roztok pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobínu, vyznačujúci sa t ý m, že hemoglobínový prípravok obsahuje 16 % polymémeho hemoglobínu s molekulárnou hmotnosťou 128,26 % polymémeho hemoblobínu s molekulárnou hmotnosťou 192 a 58 % polymémeho hemoglobínu s molekulárnou hmotnosťou 256.
2. Vodný roztok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že je charakterizovaný:

(a) obsahom 9,5 až 12,0 g/dl celkového hemoblobínu;

(b) obsahom menším ako 8 % celkového metemoglobínu, vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu;

(c) obsahom menším ako 5% celkového karboxyhemoglobínu, vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu;

(d) disociáciou kyslík-hemoglobín pri tlakovom rozmedzí 3,07 až 4,27 kPa;

(e) osmolarítou v rozmedzí od 280 do 360 mmol/kg;

(f) koncentráciou sódnych iontov v rozmedzí od 135 do 155 mmol/kg;

(g) koncentráciou draselných iontov v rozmedzí od 3,5 do 4,5 mmol/kg;

(h) koncentráciou chloridových iontov v rozmedzí od 85 do 110 mmol/kg;

(i) obsahom voľného železa nižším ako 2,0 ppm;

(j) distribúciou molekulových hmotnosti pri piku 128 Kd od 10 do 24 %;

(k) distribúciou molekulových hmotností pri piku 192 Kd od 18 do 30 %;

(l) distribúciou molekulových hmotností pri piku 256 Kd od 45 do 70 %;

(m) celkovým obsahom tetrameru nižším ako 0,8 %;

(n) obsahom endotoxínu nižším ako 0,03 EU/ml;

(o) obsahom fosfolipidov nižším ako 50 ng/Hg; a (p) obsahom glypolipidov nižším ako 2 ng/Hg.
3. Vodný roztok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že je hemoglobín glutaraldehydém polymerizovaný hemoglobín s distribúciou molekulárnych hmotností l

znázornenou na obr. 4.
4. Spôsob prípravy roztoku pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce stupne:

(a) odstránenie leukocytov filtráciou zmesi obsahujúcej červené krvinky cez filter, ktorý má takú priemernú minimálnu veľkosť pórov, aby nedošlo na priechod leukocytov;

• (b) lýzu červených krviniek;

(c) pridanie oxidu uhoľnatého a zahrievanie produktu (b) na teplotu asi 60 až 62 stupňov C na dobu 10 hodín za vzniku tepelno spracovaného hemoglobínového roztoku;

(d) filtráciou tepelne spracovaného hemoglobínového roztoku za účelom odstránenia strómy a stromálnych kontamiriantov vyzrážaných pri zahrievaní;

(e) odplynenie tepelne spracovaného hemoglobínového roztoku zavádzaním kyslíka a následne dusíka do tepelne spracovaného roztoku pri teplote asi 10 stupňov C za vzniku peny;

(f) polymerizáciu roztoku pyridoxylovaného hemoglobínu za vzniku roztoku pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobínu;

(g) oxidáciu roztoku;

(h) prečistenie roztoku za účelom odstránenia tetramémeho hemoglobínu a zozbieranie prečisteného pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobín^ ktorý obsahuje, vztiahnuté na hmotnosť celkového hemoglobínu, menej ako 0,8% tetraméru;

(i) úpravu pH a hladiny elektrolytov v roztoku prečisteného pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobínu na fyziologické hodnoty.
5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačuj úci sa tým, že je odplynený roztok pyridoxylovaný uvedením tohto odplyneného roztoku do styku s pyridoxal-5-fosfátom v , molámom pomere pyridoxal-S-fosfát: hemoglobín od 1:1 do 3:1.
6. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že je odplynený roztok pyridoxylovaný uvedením tohto odplyneného roztoku do styku s pyridoxal-5-fosfátom v molámom pomere pyridoxal-5-fosfát:hemoglobín od 2:1.

t
7. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa pyridoxal-5-fosfát uvedie po dobu 1 hodiny do styku s hemoglobínom a borhydrídom.
8. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že je hemoglobín v pyridoxylovanom roztoku polymerizovaný uvedením tohto pyrídoxylovaného roztoku do • styku s glutaraldehydom v molámom pomere glutaraldehyd:hemoglobín od 24:1.
9. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že je pyridoxylovaný roztok uvedený do styku s glutaraldehydom po dobu 18 hodín a potom sa reakcia ukončí prudkým ochladením.
10 Spôsob prípravy roztoku pyrídoxylovaného polymerizovaného hemoglobínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce stupne:

(a) prietok krvi s vypršanou alebo nevypršanou dobou expirácie cez vhodné odsávacie zariadenie pri zníženom tlaku;

(b) odstránenie leukocytov z nasiatej krvi filtráciou zmesi obsahujúcej červené krvinky cez sadu filtrov, ktorých minimálna priemerná veľkosť pórov je taká, aby nedošlo k prechodu leukocytov;

(c) pridanie oxidu uhoľnatého k produktu (b) za vzniku hemoglobínového roztoku s pH nižším ako 7;

(d) premytie roztoku (c) 1% roztokom chloridu sodného za vzniku premytého roztoku;

(e) zriedenie roztoku (d) vodou za vzniku roztoku lýzovaných buniek;

B (í) filtráciu roztoku lýzovaných buniek cez filter za vzniku hemoglobínového roztoku bez , obsahu stromálnych kontaminantov a častí bunkových stien;

(g) zahrievanie a filtráciu hemoglobínového roztoku (f) na teplotu 60 až 62 stupňov C počas 10 hodín za vzniku tepelne spracovaného hemoglobínového roztoku bez obsahu stromálnych kontaminantov;

(h) zahustenie a diafiltrácia tepelne spracovaného hemoglobínového roztoku bez obsahu stromálnych kontaminantov za vzniku roztoku karboxyhemoglobínu;

(i) odplynenie roztoku karboxyhemoglobínu zavádzaním plynného kyslíka a potom dusíka do tepelne spracovaného hemoglobínového roztoku pri teplote 40 stupňov C za vzniku peny;

(j) pyridoxyláciu odplyneného hemoglobínového roztoku pri použití pyridoxal-5“fosfát:hemoglobín od 1:1 do 3:1 za vzniku roztoku pyridoxylovaného hemoglobínu;

(k) polymerizáciu roztoku pyridoxylovaného hemoglobínu pri použití vodného roztoku glutaraldehydu za vzniku roztoku pyridoxylovaného polymérneho hemoglobínu s distribúciou molekulových hmotností 65 až 75% polyméru a 25 až 35% tetraméru;

(l) oxidáciu a riedenie polymerizovaného roztoku do chvíle, kedy roztok neobsahuje viac ako 4% hmotnosti hemoglobínu;

(m) prečistenie roztoku (1) za účelom odstránenia tetramémeho hemoglobínu a zozbieranie prečisteného pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobínového roztoku, ktorý obsahuje menej ako 0,8% tetramémeho hemoglobínu.

(n) deoxidáciu prečisteného pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobínového roztoku zavádzaním plynného roztoku;

(o) úpravu pH a hladiny elektrolytov v roztoku prečisteného pyridoxylovaného polymerizovaného hemoglobínu na hodnotu 8,8 až 9,0; a (p) zahustenie a sterilizáciu roztoku (o).

1/6