PL187923B1

PL187923B1 - Wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL187923B1
Application number: PL32910897A
Authority: PL
Inventors: Richard E. Dewoskin; Marc D. Doubleday
Original assignee: Northfield Lab
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2004-11-30
Also published as: IL126376A0; US20020025343A1; AP9801353A0; ATE241646T1; WO1997035883A1; EP0928294A1; NZ332067A; EP0928294B1; PL329108A1; RO121089B1; CA2250274C; NO984473D0; BG63919B1; SK134398A3; JP2000507947A; IL126376A; DK0928294T3; AU2425397A; CN1219939A; UA64710C2

Abstract

1 . W odny roztw ór polim eryzow anej aldehydem glutarow ym hem oglobiny, z n a m ie n n y tym , ze zaw iera tetram er w ilosci co n ajwyzej 0,8% w agow o w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej w roztw orze, oraz hem oglobine, która w ykazuje dystrybucje m asy czasteczkow ej w ynoszaca 10 - 24% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 128000, w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, 18 - 30% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 192000, w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, 45 - 10% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej 2560 0 0 w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej. 14 Sposób w ytw arzania roztw oru pirydoksylow anej, polim eryzow anej hem oglobiny zaw ierajacej okolo 16% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 128000, okolo 26% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w yno- szacej 192000 1 okolo 58% w agow o polim eru hem oglobiny o m asie czasteczkow ej w ynoszacej 2 56000, przy czym zaw artosc pro- centow a poszczególnych polim erów hem oglobiny podano w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, który to roztw ór m ozna podaw ac pacjentow i-czlow iekow i - w ilosci do okolo 3 I bez pow odow ania pogorszenia w ydolnosci nerek, z n a m ie n n y tym , ze (a) z m ieszaniny zaw ierajacej czerw one cialka krwi usuw a sie leukocyty za p om oca filtracji przez filtr o m inim alnym srednim w ym iarze porów dostatecznym do uniem ozliw ienia przechodzenia leukocytów , (b) czerw one cialka poddaje sie lizie; (c) do produktu z etapu (b) dodaje sie tlenek w egla i ogrzew a sie do tem peratury 6 0 -6 2 °C przez okolo 10 godzin, z w ytw orze- niem poddanego obróbce cieplnej roztw oru hem oglobiny; (d) poddany obróbce cieplnej roztw ór hem oglobiny z etapu (c) filtruje sie usuw ajac zreby 1 zanieczyszczenia zrebow e, które ule- gly w ytraceniu podczas ogrzew ania, (e) poddany obróbce cieplnej roztw ór hem oglobiny odgazow uje sie przez rozproszenie tlenu i nastepnie przez roztw ór poddany obróbce cieplnej w tem peraturze okolo 10°C rozprasza sie azot z w ytw orzeniem piany 1 odgazow anego roztw oru poddanego obróbce cieplnej, (f) odgazow any roztw ór poddaje sie pirydoksylacji; (g) roztw ór pirydoksylow anej hem oglobiny poddaje sie polim eryzacji, (h) roztw ór pirydoksylow anej, polim eryzow anej hem oglobiny z etapu (g) natlenia sie, ( 1 ) roztw ór z etapu (h) oczyszcza sie usuw ajac z roztw oru hem oglobine tetram eryczna i zbiera sie oczyszczona polim eryzow ana hem oglobine p irydoksylow ana przy czym roztw ór ten zaw iera m niej niz 0,8% w agow o tetram eru hem oglobiny w stosunku do m asy hem oglobiny calkow itej, (j) roztw or oczyszczonej polim eryzow anej hem oglobiny pirydoksylow anej z etapu ( 1 ) odtlenia sie, (k) poziom pH 1 elektrolitów w roztw orze oczyszczonej polim eryzow anej hem oglobiny pirydoksylow anej doprow adza sie do w artosci fizjologicznych PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny i zastosowanie. Wodny roztwór hemoglobiny jest namiastką krwinek czerwonych, a więc bezkomórkową namiastką krwinek czerwonych, zawierającą w zasadzie wolny od tetramerów, usieciowany, polimeryzowany, roztwór hemoglobiny, wolny od zanieczyszczeń zrębowych.

Banki krwi od wielu lat dostarczają krwi pełnej do zastępowania własnej krwi pacjenta w czasie zabiegu chirurgicznego, po urazie lub w innych sytuacjach. Jednakże krew pełna uzyskiwana od dawców krwi nie nadaje się do pewnych zastosowań. Zastosowanie krwi pełnej nastręcza trudności zwłaszcza z powodu konieczności odpowiedniego doboru dawcy oraz z powodu problemów ze stabilnością i przechowywaniem produktów, jak również toksyczną spowodowaną wirusami i innymi substancjami zanieczyszczającymi. Problemy te mają szczególne znaczenie w sytuacjach nagłych, na przykład przy stosowaniu krwi przez siły zbrojne. W związku z tym włożono dużo wysiłku w opracowanie namiastek krwi pełnej uzyskiwanej od dawców krwi. Wynikiem tych wysiłków są rozmaite modyfikacje krwi pochodzącej od ludzi lub innych ssaków. Ze stanu techniki wiadomo, że hemoglobina pozbawiona zrębu ma właściwości transportu tlenu i odwracalnego wiązania z tlenem (lub ligandem). Ponieważ problemy z toksycznością uniemożliwiają zastosowanie hemoglobiny pozbawionej zrębu jako namiastki krwi, produkt ten wymaga dalszych modyfikacji dla opracowania nietoksycznego, korzystnego produktu farmaceutycznego.

Modyfikacje te obejmują (1) całkowite lub w zasadzie całkowite pozbawienie hemoglobiny zrębu i zrębowych substancji zanieczyszczających (2) pirydoksylację (3) polimeryzację lub usieciowanie (4) usuwanie tetrameru (5) modyfikację tlenkiem węgla lub innymi ligandami.

Jednakże roztwory hemoglobiny, wytworzone tymi sposobami, zdolne do przenoszenia tlenu w ilości dostatecznej do podtrzymania życia, wykazują liczne niepożądane działania i właściwości. Na przykład głównym działaniem niepożądanym jest zmniejszenie wydolności nerek. Uważano, że zmiany te związane są z obecnością niepożądanych substancji zanieczyszczających, takich jak endotoksyny bakteryjne lub fragmenty błon krwinek czerwonych (zrąb). Jakkolwiek takie substancje zanieczyszczające rzeczywiście powodują zaburzenia czynności

187 923 nerek, zastosowanie roztworów hemoglobiny w zasadzie wolnych od tych substancji zanieczyszczających również powoduje istotne zaburzenia czynności nerek. Zaburzenia czynności nerek przypisuje się obecności niepolimeryzowanego tetrameru hemoglobiny w ilości fizjologicznie niedopuszczalnej. Inne niepożądane działania wlewu hemoglobiny tetramerycznej obejmują skurcz naczyń, hemoglobinurię (wydalanie hemoglobiny z moczem), zmniejszenie częstości akcji serca, wzrost średniego ciśnienia tętniczego krwi oraz wynaczynienie podawanej substancji, zwłaszcza do jamy otrzewnej.

W praktyce żadna z obecnie znanych namiastek krwi, pochodnych hemoglobiny, nie umożliwiła całkowitego uniknięcia problemów toksyczności. Również czas półtrwania tych produktów po podaniu ich pacjentowi jest niedopuszczalnie krótki. Taki czas półtrwania wymaga wymiany objętości krwi w krótkich odstępach czasu. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania takich produktów hemoglobinowych nietoksycznych dla pacjentów, których czas półtrwania po podaniu jest dostatecznie długi. Oczywiście produkty te muszą być zdolne do odwracalnego transportu tlenu do tkanek w podobny sposób, jak krew pełna.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US-5464814 ujawniono sposób wytwarzania polimeru hemoglobiny o wąskim zakresie masy cząsteczkowej, przy czym średnia wynosi około 120000 (patrz kolumna 6, wiersze 32-38). Stwierdzono, że produkt ten jest nietoksyczny i zasadniczo wolny od tetramerów.

W europejskim opisie patentowym nr EP-361720 ujawniono roztwór hemoglobiny oparty na substytucie krwi otrzymanym z wolnej od zrębu hemoglobiny na drodze procesu, który jest inny od sposobu według niniejszego rozwiązania (patrz, str. 3, wiersze 29-46; str. 5, wiersze 1-7; i str. 6, wiersze 15-55). Polimeryzacja hemoglobiny PLP-TS musi być prowadzona beztlenowo (patrz, str. 5, wiersze 1-32). W opisie tym nie ujawniono dystrybucji masy cząsteczkowej ani zawartości tetrameru w polimeryzowanym produkcie.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr US-5194590 ujawniono nietoksyczny roztwór, zasadniczo wolnej od tetrameru, usieciowanej, polimeryzowanej hemoglobiny, która jest wolna od zrębu i innych zanieczyszczeń oraz sposób wytwarzania tego roztworu. Dystrybucja masy cząsteczkowej produktu, oparta na HPLC, wydaje się wynosić 120000-600000. Średnia masa cząsteczkowa wynosi około 120000 (patrz, kolumna 15, wiersze 10-30). Około 58% ma masę cząsteczkową wynoszącą 12000, 26% ma masę cząsteczkową wynoszącą 192000, 11% ma masę cząsteczkową wynoszącą 32000. Tak więc, dystrybucja masy cząsteczkowej jest inna od produktu według niniejszego rozwiązania.

Przedmiotem wynalazku jest wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, który według wynalazku zawiera tetramer w ilości co najwyżej 0,8% wagowo w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej w roztworze, oraz hemoglobinę, która wykazuje dystrybucję masy cząsteczkowej wynoszącą

- 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;

- 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;

- 70% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej 256000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.

Korzystnie, roztwór dodatkowo zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;

(b) całkowitą methemoglobinę w ilości mniejszej niż 8% całkowitej hemoglobiny;

(c) całkowitą karboksyhemoglobinę w ilości mniejszej niż 5% całkowitej hemoglobiny;

(d) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmola/1;

(e) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol/1;

(f) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;

Korzystnie, roztwór według wynalazku zawiera (g) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;

(h) całkowity tetramer w ilości mniejszej niż 0,8% wagowo w stosunku do hemoglobiny całkowitej;

187 923 (i) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1.

Korzystnie, roztwór według wynalazku dodatkowo zawiera (j) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb; i (k) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/Hb.

Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg.

Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa.

Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 15 godzin.

Korzystnie, roztwór według wynalazku wykazuje czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.

Korzystnie, roztwór według wynalazku można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi

- w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.

- w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, oraz tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.

Korzystnie, roztwór według wynalazku zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;

(d) dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa;

(e) osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg;

(f) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmol/1;

(g) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol/1;

(h) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;

(i) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;

(j) 10 - 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 128000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;

(k) 18 - 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;

(l) 45 - 70% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;

(m) całkowitą ilość tetrameru mniejszą niż 0,8%;

(n) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1;

(o) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb;

(p) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/HB.

Korzystnie, roztwór według wynalazku, w postaci preparatu, zawiera około 16% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 192000 i około 58% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 256000, przy czym wszystkie procenty podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.

- w ilości do około 1,5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny zawierającej około 16% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 i około 58% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000, przy czym zawartość procentową poszczególnych polimerów hemoglobiny podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, który to roztwór można podawać pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 3 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, który według wynalazku polega na tym, że

187 923 (a) z mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi usuwa się leukocyty za pomocą filtracji przez filtr o minimalnym średnim wymiarze porów dostatecznym do uniemożliwienia przechodzenia leukocytów;

(b) czerwone ciałka poddaje się lizie;

(c) do produktu z etapu (b) dodaje się tlenek węgla i ogrzewa się do temperatury 60-62°C przez około 10 godzin, z wytworzeniem poddanego obróbce cieplnej roztworu hemoglobiny;

(d) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny z etapu (c) filtruje się usuwając zręby i zanieczyszczenia zrębowe, które uległy wytrąceniu podczas ogrzewania;

(e) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny odgazowuje się przez rozproszenie tlenu i następnie przez roztwór poddany obróbce cieplnej w temperaturze około 10°C rozprasza się azot z wytworzeniem piany i odgazowanego roztworu poddanego obróbce cieplnej;

(f) odgazowany roztwór poddaje się pirydoksylacji;

(g) roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji;

(h) roztwór pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny z etapu (g) natlenia się;

(i) roztwór z etapu (h) oczyszcza się usuwając z roztworu hemoglobinę tetrameryczną i zbiera się oczyszczoną polimeryzowaną hemoglobinę pirydoksylowaną, przy czym roztwór ten zawiera mniej niż 0,8% wagowo tetrameru hemoglobiny w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;

(j) roztwór oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej z etapu (i) odtlenia się;

(k) poziom pH i elektrolitów w roztworze oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej doprowadza się do wartości fizjologicznych.

Korzystnie, sposób według wynalazku polega na tym, że hemoglobinę polimeryzuje się aldehydem glutarowym.

Korzystnie, sposób według wynalazku polega na tym, że dodatkowo (al) przeterminowaną lub nieprzeterminowaną krew przepuszcza się przez odpowiednie urządzenie aspirujące pod zredukowanym ciśnieniem, z wytworzeniem mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi;

(a2) w atmosferze tlenku węgla, produkt z etapu (b) przemywa się 1 % roztworem chlorku sodu z wytworzeniem roztworu hemoglobiny o pH 6,0 - 6,5;

i przemyty roztwór z etapu (a2) rozcieńcza się wodą z wytworzeniem roztworu komórek lizowanych;

roztwór lizowanych komórek filtruje się przez filtr z wytworzeniem roztworu hemoglobiny wolnej od zanieczyszczeń zrębowych i materiału ścianek komórkowych;

odgazowany roztwór pirydoksyluje się za pomocą pirydoksalo-5'-fosforanu w stosunku molowym pirydoksalo-5'-fosforanu do hemoglobiny wynoszącym od 1:1 do 3:1, z wytworzeniem pirydoksylowanej hemoglobiny;

roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji za pomocą wodnego roztworu aldehydu glutarowego z wytworzeniem roztworu polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej o dystrybucji masy cząsteczkowej wynoszącej około 65-75% polimeru i 25-35% tetrameru;

i oczyszczoną, polimeryzowaną hemoglobinę pirydoksylowaną odtlenia się za pomocą azotu.

Wyżej zdefiniowany wodny roztwór hemoglobiny jest przeznaczony do stosowania jako lek do leczenia pacjenta cierpiącego z powodu utraty krwi.

Tak więc, przedmiotem niniejszego wynalazku są namiastki hemoglobiny, nietoksyczne dla ludzi, przy czym ich czas półtrwania jest dostatecznie długi i wynosi co najmniej 15 godzin po podaniu człowiekowi. Produkty hemoglobinowe według niniejszego wynalazku są pozbawione zrębu, pirydoksylowane i polimeryzowane, jak również wolne od wirusowych i innych substancji zanieczyszczających. Ponadto produkty te są w zasadzie wolne od leukocytów (krwinek białych) i płytek krwi.

Tak więc, zakresem niniejszego wynalazku objęte są sposoby wytwarzania namiastek hemoglobiny według niniejszego wynalazku. Sposoby te obejmują usuwanie leukocytów i płytek

187 923 z krwi; płukanie i poddawanie lizie krwinek czerwonych; usuwanie zanieczyszczeń zrębowych i zrębu poprzez filtrację i obróbkę cieplną; wytwarzanie dezoksylowanej postaci hemoglobiny; pirydoksylację i polimeryzację; dalsze oczyszczanie i zatężanie; usuwanie tlenu. Powstały produkt hemoglobinowy można wytwarzać w takiej postaci, aby zapewnić produkt hemoglobinowy, w którym poziom elektrolitów pozostaje w granicach normy fizjologicznej.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest również wodny preparat pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny, przy czym hemoglobina stanowi hemoglobinę polimeryzowaną aldehydem glutarowym, zawierającą materiał tetrameryczny o profilu masy cząsteczkowej przedstawionym na fig. 3. Preparat ten można stosować do wytwarzania bezkomórkowej namiastki krwinek czerwonych. Według tej cechy wynalazku, preparat najpierw oczyszcza się w celu usunięcia tetrameru, a następnie łączy z odpowiednią ilością elektrolitów dla wytworzenia fizjologicznej dopuszczalnej bezkomórkowej namiastki krwinek czerwonych, którą można następnie stosować do leczenia pacjentów (ludzi), wymagających wlewu nośnika tlenu.

Wynalazek ilustruje rysunek, na którym:

fig. 1 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający część sposobu i wyposażenia, stosowanego w celu wytwarzania odtlenionego roztworu hemoglobiny, gotowego do pirydoksylacji i polimeryzacji;

fig. 2 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający część sposobu i wyposażenia do obróbki rozpoczynającej się od pirydoksylacji i polimeryzacji, w wyniku której uzyskuje się odtleniony, oczyszczony, pirydoksylowany, polimeryzowany produkt hemoglobinowy oraz część sposobu i urządzenia, stosowanego do wytwarzania z ostatecznego produktu hemoglobinowego preparatu o fizjologicznym poziomie elektrolitów;

fig. 3 stanowi obraz HPLC polimeryzowanego materiału po obróbce glicyną, przed oczyszczeniem. Produkt polimeryzowany wskazują piki w czasie retencji (RT) 15,57, 16,08, 17,00 i 18,19. Materiał tetrameryczny wskazują piki w RT 19,88 i 20,51. Polimer stanowi 76,2% tego materiału;

fig. 4 stanowi obraz HPLC produktu hemoglobinowego według niniejszego wynalazku. Produkt polimeryzowany wskazują piki w RT 15,7, 16,33, 17,32 i 18,56. Tetramer wskazuje pik w rT 21,18;

fig. 5 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający sposób oczyszczania przez chromatografię kolumnową według niniejszego wynalazku;

fig. 6 stanowi schematyczny diagram, przedstawiający sposób oczyszczania przez filtrację membranową według niniejszego wynalazku.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest bezkomórkowa namiastka krwinek czerwonych, zawierająca w zasadzie wolną od tetramerów, usieciowaną, polimeryzowaną, pirydoksylowaną hemoglobinę, wolną od zrębu, zanieczyszczeń zrębowych i innych substancji zanieczyszczających.

W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „usieciowana” oznacza chemiczne umieszczenie „mostków” cząsteczkowych na cząsteczce lub w cząsteczce, lub pomiędzy cząsteczkami, w celu zmiany kształtu, wielkości, czynności lub charakterystyki fizycznej cząsteczek. Cząsteczki usieciowane mogą być polimeryzowane lub niepolimeryzowane, to znaczy cząsteczki usieciowane mogą być tetrameryczne.

W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „tetramer” oznacza cząsteczki hemoglobiny o masie cząsteczkowej około 64 Kd; to znaczy, że pojęcie to odnosi się zarówno do natywnych, jak i wewnątrzcząsteczkowo usieciowanych cząsteczek hemoglobiny.

W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „w zasadzie wolny od tetrameru” oznacza taki poziom czystości w odniesieniu do zanieczyszczenia tetramerem, w którym nie stwierdza się pewnych reakcji biologicznych na tetramer podawany ssakowi. Głównym kryterium jest nieobecność zaburzeń czynności nerek przy podawaniu produktu we wlewie w ilościach farmaceutycznie skutecznych, to znaczy jest to poziom czystości wynoszący około 99% lub więcej (czyli obecne jest poniżej 1% tetrameru). Korzystny produkt według niniejszego wynalazku zawiera nie więcej niż około 0,8% tetrameru w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej (THb). Innymi słowy, w zasadzie wolny od tetrameru produkt według niniejszego wynalazku zawiera niepolimeryzowany tetramer hemoglobiny w ilości nie przekraczającej ilości fizjologicznie

187 923 dopuszczalnej. Szczególnie korzystne produkty według niniejszego wynalazku zawierają poniżej około 0,5% tetrameru; najbardziej korzystne produkty według niniejszego wynalazku zawierają około 0,3-0,4% tetrameru. Stwierdzono, że taka ilość tetrameru jest fizjologicznie dopuszczalna.

W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcia „produkt ultraoczyszczony” lub „produkt oczyszczony” mają to samo znaczenie, co pojęcie „w zasadzie wolny od tetrameru”.

W rozumieniu niniejszego opisu, % hemoglobiny całkowitej (THb) definiuje się jako ilość gramów hemoglobiny na 100 ml roztworu.

W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „roztwór polimeryzujący” oznacza roztwór zawierający środek „usieciowujący” lub „polimeryzujący”, taki jak aldehyd glutarowy, imidoestry, diaspiryna lub inny, w biochemicznie odpowiednim nośniku.

W rozumieniu niniejszego opisu, pojęcie „polimeryzowany” oznacza umieszczenie mostków cząsteczkowych między cząsteczkami lub podjednostkami tetramerycznymi, przy czym dochodzi do zwiększenia wielkości i masy powstałej polimeryzowanej cząsteczki w stosunku do hemoglobiny natywnej lub tetramerycznej. Hemoglobina polimeryzowana nie jest hemoglobiną tetrameryczną.

Za „roztwór hemoglobiny” w rozumieniu niniejszego opisu uważa się roztwór hemoglobiny tetramerycznej lub polimeryzowanych cząsteczek hemoglobiny, przy czym cząsteczki nie znajdują się wewnątrz krwinki czerwonej. Taki roztwór nie musi być wolny ani w zasadzie wolny od zrębu krwinek czerwonych lub zanieczyszczeń zrębowych. Jednakże korzystne roztwory polimeryzowanej hemoglobiny są wolne od zrębu krwinek czerwonych i zanieczyszczeń zrębowych.

Pojęcie „błona półprzepuszczalna” oznacza błonę przepuszczalną dla niektórych rodzajów cząsteczek i nieprzepuszczalną dla innych, i, między innymi, błonę działającą jako wybiórczy filtr wykluczający cząsteczki o pewnej masie cząsteczkowej.

Produkt wytwarzany sposobem według niniejszego wynalazku, roztwór polimeryzowanej pirydoksylowanej hemoglobiny, w zasadzie wolnej od tetramerycznej (natywnej, usieciowanej wewnątrzcząsteczkowo) hemoglobiny, zrębowych i różnych innych substancji zanieczyszczających, wytworzony z hemoglobiny tetramerycznej, poddanej obróbce cieplnej i inaktywacji wirusów, jest dopuszczalny fizjologicznie i korzystny w zastosowaniach terapeutycznych i klinicznych. Produkt wykazuje odwracalną zdolność wiązania tlenu, niezbędną dla właściwości transportu tlenu. W szczególności, produkt wykazuje dobrą charakterystykę ładowania i rozładowywania przy zastosowaniu, co koreluje z tym, że jego krzywa dysocjacji tlenu-hemoglobiny (P₅o) jest podobna, jak krwi pełnej. Produkt wiąże się z tlenem z dużym powinowactwem, w naczyniach włosowatych płuc, i następnie odpowiednio uwalnia tlen w tkankach organizmu. Zastosowanie produktu nie wymaga również badania zgodności z biorcą.

Produkt wykazuje również po podaniu ludziom czas półtrwania wynoszący co najmniej około 15 godzin, korzystniej, około 24 godziny. Niniejszy produkt hemoglobinowy można podawać we wlewie pacjentom do 3,0 1, a nawet do 5,0 1. Innymi słowy, produkt hemoglobinowy według niniejszego wynalazku można stosować do zastąpienia w zasadzie całej objętości krwi pacjenta (człowieka) bez powodowania skurczu naczyń, toksycznego wpływu na nerki, hemoglobinurii ani innych problemów związanych z dożylnym podawaniem syntetycznych lub półsyntetycznych nośników tlenu i namiastek krwi. Tak więc zakresem niniejszego wynalazku objęty jest sposób dokonywania przetoczenia pacjentowi, korzystnie, człowiekowi, pewnej ilości wolnego od zrębu, wolnego od tetrameru, polimeryzowanego, pirydoksylowanego produktu hemoglobino wego, nietoksycznego dla pacjenta, w ilości co najmniej około 5 1. Sposób ten obejmuje podłączenie pacjenta do urządzenia infuzyjnego lub innego podobnego urządzenia do wykonania wlewu łub przetoczenia u pacjenta.

Sposób według niniejszego wynalazku jest unikalny, ponieważ pozwala wytworzyć produkt, w którym poziom tetrameru nie przekracza około 1%, korzystniej, nie przekracza 0,8% masy całkowitej hemoglobiny w roztworze. Sposób według niniejszego wynalazku jest również korzystny, ponieważ produkt ostateczny jest w zasadzie wolny od antygenów i patogenów drobnoustrojów i wirusów. Takie antygeny i patogeny drobnoustrojów i wirusów są ograniczone do poziomu niewykrywalnego, to znaczy, że produkt jest jałowy przy przeprowadzeniu

187 923 analizy w sposób określony w Farmakopei Stanów Zjednoczonych, XXIII rozdział <Ί\>. Przykłady takich antygenów i patogenów stanowią na przykład bakterie, riketsje, grzyby, pierwotniaki, wirusy i inne drobnoustroje. Co najważniejsze, sposób zapewnia produkt biologiczny wolny od wirusów wywołujących wirusowe zapalenie wątroby i zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS).

W odniesieniu do właściwości fizjologicznych, produkt biologiczny według niniejszego wynalazku przy podawaniu go w postaci wlewu w ilościach do co najmniej 5 1, nie powoduje skurczu naczyń, toksycznego wpływu na nerki, hemoglobinurii ani innych problemów, pojawiających się przy dożylnym podawaniu znanych roztworów hemoglobiny, zawierających fizjologicznie niekorzystnie ilości hemoglobiny tetramerycznej. Podawanie dożylne produktu wytwarzanego niniejszym sposobem nie powoduje istotnego zmniejszenia wytwarzania moczu, istotnego zmniejszenia prędkości filtracji kłębuszkowej, istotnego wynaczynienia do jamy otrzewnej ani istotnej zmiany zabarwienia wytwarzanego moczu.

Tak więc, sposób według niniejszego wynalazku zapewnia bezkomórkową namiastkę krwinek czerwonych, korzystną w leczeniu urazów, zawału mięśnia serca, udaru, ostrego niedokrwienia i zaburzeń związanych z niedoborem tlenu, takich jak hipoksemia i hipoksja, lub końcowe stadia hipoksji spowodowane zaburzeniami czynności lub niewydolnością płuc, to znaczy niezdolnością do pełnego natlenienia krwi. Produkt jest również korzystny w leczeniu wszystkich chorób i stanów, wymagających podawania płynów (w celu resuscytacji) (na przykład uraz, a zwłaszcza wstrząs krwotoczny), podania płynów w celu wypełnienia łożyska naczyniowego lub transfuzji wymiennej. Oprócz zastosowania w leczeniu produkt może być korzystny w konserwacji narządów do przeszczepów.

Sposób według niniejszego wynalazku obejmuje następujące etapy:

1. aspiracj a i filtracj a krwinek czerwonych

2. płukanie/liza komórek

3. obróbka cieplna

4. zatężanie przez ultrafiltrację

5. odgazowywanie

6. modyfikacja chemiczna

7. oczyszczanie

8. wielokrotne zatężanie UP

9. odtlenianie

10. wytwarzanie preparatu

Korzystny materiał początkowy w sposobie według niniejszego wynalazku stanowi przeterminowana ludzka krew pełna lub koncentrat krwinek czerwonych (masa erytrocytama). Można również stosować krew nieprzeterminowaną. Korzystnie, w niniejszym procesie nie stosuje się krwi pełnej przechowywanej ponad dwa tygodnie po upływie terminu ważności wskazanego na opakowaniu. Zastosowanie krwi pełnej przeterminowanej o ponad dwa tygodnie powoduje dodatkowe trudności w ekstrakcji hemoglobiny i usuwaniu resztek komórkowych, takich jak białka zrębu i substancje zanieczyszczające.

Wszystkie sposoby opisane w niniejszym wynalazku odnoszą się również do krwi innych ssaków, przy zastosowaniu ewentualnie niewielkich modyfikacji, znanych specjalistom. Większość etapów przeprowadza się w temperaturze od około 2 do około 8°C, korzystnie około 4°C.

W czasie aspiracji i filtracji krwinek czerwonych krwinki czerwone w warunkach jałowych ekstrahuje się z woreczków, do których krew została pobrana od dawcy, bez wprowadzania powietrza do krwi, i przepuszcza przez serię filtrów dla uzyskania zawiesiny krwinek czerwonych o zmniejszonej zawartości leukocytów i płytek krwi. Powstałą zawiesinę poddaje się następnie płukaniu i lizie komórek.

Zawiesinę płucze się w atmosferze tlenku węgla około 1% roztworem NaCl dla usunięcia pozostałych białek osocza. Przepłukane krwinki czerwone traktuje się następnie wodą do wstrzyknięć dla uzyskania lizy komórek, a powstałą mieszaninę klaruje się urządzeniem do filtracji o skrzyżowanym przepływie. Sklarowany produkt poddaje się następnie obróbce cieplnej w celu strącenia dodatkowego materiału zrębowego, który usuwa się przez filtrację.

187 923

Produktem tego etapu jest roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny (SFH), której THb wynosi około 3% (stężenie wagowe). Po obróbce cieplnej roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny, zawierający karboksyhemoglobinę, zatęża się i odgazowuje w celu uzyskania roztworu SFH zawierającego dezoksyhemoglobinę. Odgazowanie obejmuje pierwszy etap saturacji roztworu karboksyhemoglobiny tlenem przez około 16 godzin dla wytworzenia roztworu zawierającego utlenowaną hemoglobinę i około 7% wagowo, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, karboksyhemoglobiny. Następnie tlen usuwa się azotem, argonem lub helem dla wytworzenia roztworu zawierającego wolną hemoglobinę, to znaczy hemoglobinę nie związaną w kompleksach i około 7% wagowo w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej oksyhemoglobiny. Powstały odgazowany roztwór filtruje się i przenosi do naczynia dla modyfikacji chemicznej.

Po odgazowaniu roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny poddaje się pirydoksylacji, stosując pirydoksalo-5'-fosforan (P5P) w stosunku molowym pirydoksalo-5'-fosforanu do hemoglobiny około 1:1-3:1. Zamiast tego wolną od zrębu hemoglobinę można pirydoksylować, stosując 2-Nor-2-formylopirydok.salo-5’-fosforan. Do mieszaniny pirydoksylującej dodaje się środek redukujący, taki jak cyjanoborowodorek sodowy lub, korzystnie, borowodorek sodowy. Nadmiar odczynników i soli usuwa się poprzez dializę przeciwko apirogennej wodzie lub, korzystnie, poprzez diafiltrację wodą do wstrzyknięć. Hemoglobinę pirydoksylowaną polimeryzuje się następnie z roztworem aldehydu glutarowego.

Roztwór wolnej od zrębu, pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji z zastosowaniem wodnego roztworu aldehydu glutarowego. Czas trwania polimeryzacji i ilość dodanego aldehydu glutarowego zależą od objętości roztworu hemoglobiny, pożądanej wydajności uzyskiwania polimeru i pożądanej dystrybucji masy cząsteczkowej. Na ogół dłuższy czas polimeiyzacji zwiększa wydajność i dystrybucję masy cząsteczkowej polimerów. Wydajność około 75% wagowo polimerów w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej uzyskuje się w czasie około 16-18 godzin. Korzystny koniec polimeryzacji definiuje się jako ten moment, w którym roztwór zawiera około 75% wagowo polimerów w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, co monitoruje się poprzez HPLC zależną od wielkości cząstki. Zamiast tego koniec definiuje się jako ten moment, w którym roztwór zawiera około 65% polimerów w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, to znaczy około 2,5 godziny. Reakcję polimeryzacji chłodzi się poprzez dodanie wodnej glicyny. Bufor należy dodawać jak najszybciej. Usieciowanie stabilizuje się następnie poprzez dodanie, znów jak najszybsze, wodnego roztworu borowodorku sodowego. Ten spolimeryzowany roztwór następnie zatęża się i poddaje diafiltracji w atmosferze tlenu, w celu natlenowania roztworu. Na koniec do roztworu dodaje się wodę, w takiej ilości, aby roztwór zawierał około 4% wagowo hemoglobiny.

Wynikiem polimeryzacji według niniejszego wynalazku jest większa wydajność wytwarzania polimerów o wąskim zakresie masy cząsteczkowej, jak to przedstawiono na fig. 3 i w przykładzie 1 poniżej.

Roztwór polimeryzowanej, pirydoksylowanej hemoglobiny następnie oczyszcza się poprzez chromatografię kolumnową, filtrację, na przykład filtrację membranową, lub oboma tymi sposobami w celu usunięcia z roztworu resztkowej, niepolimeryzowanej (tetramerycznej) hemoglobiny. Roztwór oczyszczonej, polimeryzowanej hemoglobiny zatęża się następnie do około 6%, stosując urządzenie do ultrafiltracji w przygotowaniu do wymiany gazowej.

Zatężony roztwór następnie odtlenia się azotem. Odtlenienie prowadzi się w temperaturze 10-12°C do momentu, w którym ilość oksyhemoglobiny w roztworze wynosi poniżej 16% wagowo hemoglobiny całkowitej.

Powstały roztwór odtlenowanej, oczyszczonej i polimeryzowanej hemoglobiny zatęża się następnie poprzez ultrafiltrację w atmosferze azotu w schłodzonym naczyniu. pH doprowadza się do wartości około 8,8-9,0, i ewentualnie poziom elektrolitów, w miarę potrzeby, doprowadza się do poziomu występującego w prawidłowym osoczu. Ponadto dodać można ewentualnie konwencjonalne przeciwutleniacze, takie jak glutation, askorbinian lub glukoza. Po zatężeniu roztworu do pożądanego poziomu, korzystnie około 10% wagowo polimeryzowanej, pirydoksylowanej, oczyszczonej, wolnej od tetrameru i zrębu hemoglobiny, roztwór wyjaławia się poprzez filtrację i przenosi w jałowym urządzeniu do przenoszenia do odpowiednich farmaceutycznie

187 923 dopuszczalnych pojemników. Poniżej przedstawiono charakterystykę powstałego roztworu hemoglobiny.

	Hemoglobina polimeryzowana
Hemoglobina całkowita (g/dl)¹	9,5-12,0
Methemoglobina (% Hb całkowitej/	<8,0
Karboksyhemoglobina (% Hb całkowitej)1	<5,0
P50 (kPa¹)	31-43
Osmolalność (mmol/kg)²	280-360
Sód (mmol/1)³	135-155
Potas (mmol/1)3	3,5-4,5
Chlorki (mmol/1/	85-110
Wolne żelazo (ppm)⁴	<2,0
Dystrybucja masy cząsteczkowej - pik 128 Kd (%/	10-24
Dystrybucja masy cząsteczkowej - pik 192 Kd (%)⁵	18-30
Dystrybucja masy cząsteczkowej - pik 256 Kd (%/	45-70
Tetrametr (64 K) (%)⁵	<0,8
Endotoksyny (EU/ml)⁶	<0,03
Fosfolipidy (ng/Hb/	<50
Glikolipidy (ng/Hb)⁷	<2

'Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony spektrofotometrycznie ‘Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez osmometrię ³Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony elektrodąjonospecyficzną ^Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez adsorpcję atomową ⁵Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez HPLC zaleznąod wielkości cząsteczki ⁶Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony przez LAL z zastosowaniem testu dostępnego w firmie Associates ofCape Cod, przy czym odczynniki testowe mają numery katalogowe 100-5, 800-1 i 3100-5 ⁷Poziom hemoglobiny polimeryzowanej wyznaczony w HPTLC.

Poniższe przykłady przedstawiają niektóre cechy niniejszego wynalazku.

Należy jednak rozumieć, że przykłady te mają na celu jedynie ilustrację, nie mają zaś znaczenia decydującego odnośnie do warunków i zakresu niniejszego wynalazku.

Temperaturę wyrażono w stopniach Celsjusza, jeżeli nie wskazano inaczej. Jeżeli nie wskazano inaczej, wszystkie odsetki, na przykład hemoglobiny całkowitej (THb) wyrażono w postaci stężenia wagowego. Należy również zauważyć, że podano typowe warunki reakcji (na przykład, temperaturę, czas reakcji); można również stosować warunki poza podanym zakresem, jakkolwiek zwykle nie jest to korzystne.

Jeżeli nie wskazano inaczej, wszystkie naczynia i zbiorniki stosowane w sposobie według niniejszego wynalazku wykonano ze stali nierdzewnej 316-L, korzystnie, z gatunku przeznaczonego do zastosowania farmaceutycznego takiej stali nierdzewnej, poddanej starannemu polerowaniu, co umożliwia jego łatwe i szybkie czyszczenie. Rozmaite rurki łączące wykonano z tej samej stali nierdzewnej lub z farmaceutycznego gatunku teflonu lub silikonu. Filtry i błony stosowane w sposobie według niniejszego wynalazku można nabyć w firmie Millipore Inc., Pall-Filtron lub Cuno Inc.

Czas półtrwania produktu według niniejszego wynalazku oznacza się in vivo u ssaków, na przykład u ludzi. Typowo, od ssaka pobiera się próbkę krwi po pewnym czasie od podania

187 923 produktu w postaci wlewu. Następnie określa się ilość produktu poprzez odwirowanie próbki krwi, wyznaczenie części osocza, jaką on stanowi, spektrofotometryczne oznaczenie poziomu hemoglobiny w osoczu i następnie skorelowanie ilości produktu pozostałego w organizmie ssaka z czasem półtrwania produktu.

Chromatografię HPLC zależną od wielkości cząstek według niniejszego wynalazku przeprowadzono w następujący sposób: próbkę rozcieńcza się, stosując 0,2m bufor fosforan potasowy o pH 6,9, do stężenia 0,2 g/dl, przefiltrowuje przez filtr 0,2μ i wstrzykuje do układu HPLC, utworzonego z następujących składowych (w kolejności przepływu przez układ):

1. Pompa model 2248, Pharmacia

- fazę ruchomą stanowi 0,2M fosforan potasowy o pH 6,9

- prędkość przepływu wynosi 1,0 ml/min

2. 45-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm

3. Urządzenie do wlewów Rheodyne, model 7725i, z pętlą na próbki PEEK o pojemności 100 μΐ

4. 18-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm

5. Filtr model Upchurch A431, 0,5μ

6. 9-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm

7. Kolumna Guard Phenomenex Biosep SEC S-3000 75 x 7,8 mm

8. 824-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm

9. Kolumna Phenomenex Biosep SEC S-3000 600 x 7,8 mm

10. 23-cm rurki PEEK lub tytanowe, średnica wewnętrzna 0,254 mm

11. Detektor Pharmacia Uvicord SD UV

- długość fali 280 nm

- kuweta przepływowa: objętość 8 μί, długość drogi 2,5 mm

- zakres: 2 aUfS

- stała czasowa: 10 sekund.

Szczytową absorbancję w 280 nm zapisuje się w integratorze LKB 2221, integrującym poszczególne pola pod krzywą w punkcie szczytowym i obliczającym pole hemoglobiny całkowitej dla każdego rodzaju polimeru.

Wynalazek można lepiej zrozumieć na podstawie poniższych nieograniczających przykładów.

Przykład 1

W odniesieniu do fig. 1, z torebki 20 z przeterminowaną krwią pobraną od krwiodawcy (krew pełna lub masa erytrocytama) umieszcza się w odpowiednim jałowym urządzeniu do aspiracji 22. Przykładem odpowiedniego urządzenia do aspiracji jest układ posiadający dwie stacje aspiracji. Po umieszczeniu torebki w stacji aspiracyjnej igła urządzenia do aspiracji przebija torebkę z krwią dawcy, wprowadzając około 150 ml 1% (stężenie wagowe) wodnego roztworu chlorku sodowego i aspiruje przeterminowaną krew z torebki w warunkach zmniejszonego ciśnienia lub próżni. Zaaspirowanąkrew przepuszcza się przez filtr 24 o głębokości 100μ, i następnie przez dwa filtry 26 o głębokości 5μ, po kolei. Kiedy krew przechodzi przez filtry o głębokości 5μ, dochodzi do usunięcia leukocytów z krwi. Typowo aspiruje się około 170 jednostek przeterminowanej krwi pełnej, poddaje się je filtracji i następnie przenosi do zbiornika 1, jak to przedstawiono na fig. 1. Filtry płucze się następnie około 75 l 1% (stężenie wagowe) wodnego roztworu chlorku sodowego.

Przed wprowadzeniem krwi do zbiornika 1, zbiornik 1 napełnia się około 70 l 1% wodnego roztworu chlorku sodowego. Po zaaspirowaniu całej ilości 170 jednostek przeterminowanej krwi pełnej, jej przefiltrowaniu i przeniesieniu i przepłukaniu filtru, zbiornik zawiera około 250 1 4% roztworu hemoglobiny całkowitej. W czasie etapów aspiracji i filtracji zbiornik 1 utrzymuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, na przykład w próżni, przy czym ciśnienie wynosi 27-37 kPa. Po przeniesieniu całości przeterminowanej krwi do zbiornika 1 próżnię wyłącza się i do zbiornika wprowadza tlenek węgla, tak że zbiornik zawiera atmosferę tlenku węgla.

Zbiornik 1 łączy się z filtrem 28 0,65μ, o zasilaniu stycznym, jak to przedstawiono na fig. 1. Początkową zawartość, to znaczy 250 1 4% roztworu hemoglobiny całkowitej, zatęża się do około 125 l 8% roztworu hemoglobiny całkowitej przez mikrofiltrację przez filtr o zasilaniu

187 923 stycznym. W tym mbmrneir pH roztworu hemoglobiny ynnbzl około 6-6,5. Po zatężeniu do 8% hemoglobiny całkowitej roztwór płucze się, dodając 1% (wagowo) roztwór chlorku sbdbyrgo, i następnie przez diafiltrację i usunięcie filtratu w tej samej ilości, co dodany roztwór chlorku zbObyrgb. 125 l roztworu hemoglobiny typowo płucze się bkbłb 8-krotną objętością 1% roztworu chlorku ubObwrgb (około 1000 l). Po przepłukaniu roztwór zatęża się do około 70 l, to znaczy około 14% hemoglobiny całkowitej, i dodaje się wodę do wstrzyknięć, tak aby objętość roztworu doprowadzić do około 180 l. Po dodaniu wody do wstrzyknięć komórki pęcznieją i pękają, uwalniając hemoglobinę do roztworu. Stężenie powstałego roztworu hemoglobiny wynosi około 5% hemoglobiny całkowitej (THb).

Powstały roztwór klaruje się, nadal w zbiorniku 1. Roztwór najpierw zatęża się do około 50 l, potem przenosi do zbiornika 2. Kiedy roztwór pompuje się przez filtr, zatrzymuje on substancje ąanireąnząezaJąer ze zrębu krwinek czerwonych i materiał z błony komórkowej. Pozostałe 50 l roztworu w zbiorniku 1 płucze się (poddaje diafiltraeji) około 2,5 objętością wody do wstrzyknięć. Tę 2,5-krotną objętość wody do wstrzyknięć do płukania dodaje się do zbiornika 2. Materiał pozostały w zbiorniku 1 zatęża się następnie do około 20 l i filtrat dodaje do zbiornika 2. Objętość pozostałą w zbiorniku 2 stanowi około 280 1 0,0% roztworu hemoglobiny całkowitej.

Powstały roztwór wolnej od zrębu hemoglobiny poddaje się następnie obróbce cieplnej w zbiorniku 2 w temperaturze około 60-62°C przez czas około 10 godzin. W tym czasie roztwór w umiarkowany sposób miesza się. W czasie ogrzewania roztworu i przechodzenia przez temperaturę około 55°C tworzy się strąt.

Powstały 0,0% roztwór hemoglobiny THb (stężenie wagowe), pozbawionej zrębu, filtruje się następnie przez 0,2μ filtr 00, następnie przez 0,1 μ, filtr 02 i przenosi do zbiornika 0. Przrflltroysnn roztwór hemoglobiny zatęża się następnie do około 18% THb, po czym płucze i poddaje diafiltracji czterema objętościami wody do yztrzn0olęć (180 l). Zatężanie i diafiltrację prowadzi się stosując ultrafiltr 04 do masy cząsteczkowej 10 kllodaltooów (kD). Dren 05 połączony z ultrafiltrem 04 zbiera filtrat. W tym mbmrkeir 45 l 18% roztworu hemoglobiny całkowitej zawiera 50 ng fosfolipidów na gram hemoglobiny, poniżej 2 ng glikolipidów os gram hemoglobiny, poniżej 1% methemoglobiny, poniżej około 0,00 jednostek rndbtokznnbwych rn0btbkznnn ma mililitr w pH 6-6,5. Hemoglobinę w roztworze stanowi 0arbbkzyhrmogtobina.

Powstały roztwór karbokuneembglbblnn przenosi się następnie do zbiornika 4, w którym 0arbb0znermbglobinę poddaje się najpierw natlenieniu, a potem odtlrnlrkiu. Zbiornik 4 wyposażony jest w pierścień rozpraszający gaz, do którego doprowadzany jest tlen i azot, z dna zbiornika do urządzenia aerozolowego z licznikiem, umieszczonego na szczycie zbiornika 4 i kolektor przelewu piany, podłączony do komory piany 1, tak że piana wytworzona w zbiorniku 4 podawana jest do komory piany 06, w której pianę Obodrosujr się do cieczy i podaje na powrót do zbiornika 4. Zbiornik 4 zawiera również zestaw pierścieni przesuwających, wypełniających około jednej trzeciej objętości zbiornika. Komora piany 06 zawiera wentyl gazu do usuwania gazu. Roztwór w zbiorniku 4 stanowi 10% roztwór hemoglobiny całkowitej.

W czasie pierwszego etapu natleniania tlen rozprasza się przez roztwór z prędkością wystarczającą do uzyskania jednolitej dyspersji gazu w naczyniu. Naczynie o objętości 200 l jest natryskiwane z prędkością około 25 1 gazu na minutę. Natlenienie karboksnhrmbglbbinn prowadzi się przez czas około 16 godzin, tak że powstały roztwór zawiera poniżej 5% karbo0snermbolbbion w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej. Natlenienie prowadzi się w temperaturze około 10°C. Piana wytwarzana w zbiorniku 4 jest zbierana w komorze piany 06, osiada i następnie powstały roztwór podaje się na powrót do zbiornika 4.

Po natlenieniu roztwór natryskuje się z podobną prędkością azotem przez okoto 6 godzin lub do momentu, gdy poniżej 10% bkznhrmogloblkn, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, pozostanie w roztworze. Natrysk azotem prowadzi się w temperaturze około 10°C przy pH okoto 6-6,5. Zamiast tego można dokonać konwersji OarboOsnermbglbblnn do Ο^bOznermbgtobmn, stosując wnmiroiaez membranowy. Należy zauważyć, że w zasadzie nie zachodzi denaturaj hemoglobiny, jak można by oczekiwać na tym etapie wytwarzania piany. Powstały bdtlrntony roztwór jest gotowy do modyfikacji chemicznej.

187 923

W odniesieniu teraz do fig. 2, roztwór dezoksyhemoglobiny przenosi się do zbiornika 5 dla modyfikacji chemicznej. Do zbiornika 5, zawierającego dezoksyhemoglobinę w roztworze o temperaturze około 4°C, dodaje się następnie wodny roztwór pirydoksalo-5-fosforanu (P5P) (93,75 g/l), w stosunku molowym P5P do hemoglobiny 1:1 -3:1. Korzystny jest stosunek molowy P5P do hemoglobiny 2:1. Pirydoksylację prowadzi się w temperaturze około 4°C. Roztwór P5P typowo dodaje się przez około 1 minutę i miesza przez około 15 minut, a następnie do roztworu hemoglobiny dodaje się roztwór borowodorku sodowego/wodorotlenku sodowego w stosunku molowym borowodorku sodowego do hemoglobiny wynoszącym około 20:1. Korzystny roztwór wodny borowodorku sodowego/wodorotlenku sodowego zawiera 0,8 g wodorotlenku sodowego na 2 1i 90,8 g borowodorku sodowego na 2 1. Roztwór borowodorku dodaje się jak najszybciej, przez czas około 1 minuty, i następnie miesza przez godzinę. Powstałe 50 l roztworu pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się następnie diafiltracji z zastosowaniem 10 kD ultrafiltru 38 dla usunięcia nadmiaru odczynników, czterema objętościami wody do wstrzyknięć. Dren 40 połączony z ultrafiltrem 38 zbiera filtrat z filtru 38.

Po tej filtracji czterema objętościami, to znaczy 200 l, wody do wstrzyknięć, hemoglobinę poddaje się polimeryzacji. Do zbiornika 5 zawierającego pirydoksylowaną hemoglobinę dodaje się wodę do wstrzyknięć w ilości wystarczającej do wytwarzania 4,5% roztworu hemoglobiny całkowitej (około 175 l roztworu hemoglobiny). Do roztworu pirydoksylowanej hemoglobiny dodaje się roztwór aldehydu glutarowego w stosunku molowym aldehydu glutarowego do hemoglobiny około 24:1. Roztwór aldehydu glutarowego typowo podaje się przez czas około 2-5 godzin pompą z dozownikiem, do roztworu hemoglobiny. Reakcję polimeryzacji prowadzi się przez około 18 godzin. Docelowa dystrybucja masy cząsteczkowej wynosi około 75% polimeru i 25% tetrameru. Polimery docelowe mają masę cząsteczkową poniżej 600000, przy czym dominująca frakcja masy cząsteczkowej znajduje się w zakresie 100000-350000.

Gdy reakcja polimeryzacji osiągnie docelową dystrybucję masy cząsteczkowej (po około 18 godzinach) do roztworu hemoglobiny dodaje się wodną glicynę (około 166 g/l) (w celu schłodzenia) w stosunku molowym glicyny do hemoglobiny wynoszącym 140:1. Por. fig. 3, która stanowi obraz HPLC powstałego polimeryzowanego schłodzonego glicyną produktu hemoglobinowego. Powstały roztwór miesza się następnie przez około 10 minut, po czym do roztworu hemoglobiny dodaje się roztwór borowodorku sodowego/wodorotlenku sodowego (o powyższym stężeniu) przy stosunku molowym borowodorku sodowego do hemoglobiny wynoszącym 28:1. Powstałą mieszaninę miesza się przez około 1 godzinę. Roztwór zatęża się następnie do około 50 l (ultrafiltr 38) i płucze czterema objętościami (200 l) wody do wstrzyknięć. Do zatężonego roztworu dodaje się dodatkową porcję borowodorku sodowego w tym samym stosunku molowym, jak wskazano powyżej, i całość ponownie miesza się przez 1 godzinę. Powstały roztwór płucze się czterema objętościami wody do wstrzyknięć (200 l), w wyniku czego uzyskuje się polimeryzowaną, pirydoksylowaną, wolną od zrębu hemoglobinę, poddaną obróbce cieplnej.

Powstały roztwór natlenia się przez pozostawienie roztworu w atmosferze tlenu i następnie przeniesienie do układu oczyszczania 42. Oczyszczanie można przeprowadzić poprzez chromatografię kolumnową, filtrację, korzystnie filtrację błonową (diafiltrację) lub połączenie diafiltracji i chromatografii kolumnowej.

W jednym z wykonań roztwór przenosi się do naczynia chromatograficznego, zbiornika 6, jak to przedstawiono na fig. 5. W tym wykonaniu powstały roztwór oksyhemoglobiny rozcieńcza się następnie do około 200 l (4% hemoglobiny całkowitej) w zbiorniku 6, a stężenie chlorków doprowadza się do 22 mM roztworem chlorku sodowego. Nie ma konieczności dostosowywania stężenia sodu.

Pięć próbek powstałego roztworu hemoglobiny, o objętości 40 l na próbkę, poddaje się następnie chromatografii z zastosowaniem kolumny 44. Kolumna 44 zawiera żel powinowactwa, który stanowi żel agarozowy, zmodyfikowany żółtym barwnikiem (dostępny w firmie Affmity Chromatography, Ltd., pod nazwą Mimetic Yellow Nr 1), który wykazuje wyższe powinowactwo do polimeru, niż do tetrameru.

Chromatografię prowadzi się w następujący sposób. 40 l roztworu natlenionej, polimeryzowanej, pirydoksylowanej, wolnej od zrębu hemoglobiny ładuje się na kolumnę 44, kolumnę

187 923 płucze się piętnastoma objętościami kolumny (około 750 l) 30 mM wodnego buforu NaCl w celu usunięcia tetrameru. Kolumnę płucze się następnie około 250 l 300 mM buforu chlorku sodowego dla wypłukania polimeru. Frakcje polimeru zbiera się do zbiornika 7. Frakcje niepożądane wysyła się do drenu 46. Po usunięciu poszczególnych próbek kolumnę regeneruje się roztworem 15 mM HC1 (150 l), ponownie zrównoważonego 30 mM wodnego NaCl (250 l) i na kolumnę ładuje się następną próbkę roztworu (40 l). Kolumnę ponownie płucze się 30 mM NaCl i następnie 300 mM NaCl. 40 1 próbki roztworu hemoglobiny dodaje się do kolumny i poddaje chromatografii aż do opróżnienia zbiornika 6.

Frakcje zebrane w zbiorniku 7 poddaje się ultrafiltracji (zatęża) stosując filtr 48, połączony z drenem 50 aż do objętości około 40 l (6% hemoglobiny całkowitej). Stężony roztwór hemoglobiny przenosi się następnie do zbiornika 8, wymiany gazowej, w celu odtlenienia.

Zamiast tego roztwór przenosi się do naczynia zwrotnego obiegu filtracyjnego 10, jak to przedstawiono na fig. 6. Hemoglobinę rozcieńcza się następnie do około 4% THb w zbiorniku 10. 4% roztwór THb poddaje się następnie diafiltracji, stosując 10 mM NaCl i filtr 52 (masa cząsteczkowa 300000), dostępny w handlu w firmie Pall-Filtron. Filtrację prowadzi się do momentu, gdy 97% materiału hemoglobinowego przejdzie przez filtr i do zbiornika 11 (około 3% materiału, to znaczy polimery o wysokiej masie cząsteczkowej, pozostaje w zbiorniku 10). Ilość hemoglobiny oznacza się spektrofotometrycznie, stosując kooksymetr.

Materiał powstały w zbiorniku 11 stanowi około 2-4% THb i zawiera około 7-10% tetrameru w stosunku do THb. 2-4% THb poddaje się następnie diafiltracji z użyciem 10 mM NaCl i filtr 54 (masa cząsteczkowa 100000), dostępny w handlu w firmie Pall-Filtron, połączony z drenem lub syfonem 56. Filtrację prowadzi się do momentu, w którym poziom tetrameru, oznaczony w chromatografii zależnej od wielkości cząstek, z zastosowaniem kolumny BioSep SEC-S3000 600 x 7,8 mm, wynosi poniżej 0,8% masy hemoglobiny wagowo. Powstały roztwór oczyszczonej hemoglobiny pozostaje początkowo w zbiorniku 11, po czym przenoszony jest do zbiornika 8 wymiany gazowej w celu odtlenienia.

Zbiornik 8 wymiany gazowej może stanowić ten sam zbiornik, co zbiornik 4, lub, korzystnie, inny zbiornik. Zbiornik 8 wymiany gazowej wyposażony jest w zasadzie tak samo, jak zbiornik 4 wymiany gazowej z fig. 1, i przyłączony do komory piany 58 w taki sam sposób, jak zbiornik 4 do komory piany 36. Odtlenienia dokonuje się w czasie około 2,5 godziny, stosując rozpraszanie azotu w temperaturze około 10°C i pH roztworu około 7,5. Rozpraszanie azotu prowadzi się do momentu, w którym poniżej około 16% oksyhemoglobiny, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, pozostaje w roztworze. Powstały roztwór dezoksyhemoglobiny przenosi się następnie do zbiornika 9 w celu wytworzenia preparatu.

W zbiorniku 9 do wytwarzania preparatu roztwór najpierw zatęża się do około Ί% hemoglobiny całkowitej, a pH doprowadza się do około 8,8-9,0 w temperaturze 4°C. pH doprowadza się do odpowiedniej wartości stosując 0,2M NaOH. Do roztworu hemoglobiny o pH 8,8-9,0 dodaje się następnie roztwory elektrolitów. Dodaje się glukozę i glicynę do uzyskania końcowego stężenia wynoszącego, odpowiednio, około 5 g/l i 1,75 g/l. Do roztworu dodaje się chlorek potasowy do uzyskania stężenia potasu wynoszącego od około 3,5 do 4,5 mM. Dodaje się wówczas 3M chlorek sodowy dla uzyskania stężenia chloru wynoszącego 85-110 mM. Następnie dodaje się mleczan sodowy dla uzyskania stężenia jonów sodowych 135-155 mM. Na koniec dodaje się 0,45-molowy roztwór kwasu askorbinowego dla podwyższenia stężenia kwasu askorbinowego do około 1000 mg/l. Kwas askorbinowy dodaje się jako środek konserwujący/przeciwutleniający do przechowywania. Ostateczna osmolalność roztworu hemoglobiny wynosi od około 280 do 360 mmol/kg.

Roztwór hemoglobiny w postaci preparatu zatęża się następnie do około 10% hemoglobiny całkowitej, stosując filtr 60 połączony z syfonem 62 i 10% roztwór hemoglobiny wyjaławia się poprzez filtrację przez filtr 64 i pakuje do wyjałowionych torebek w warunkach jałowych.

Charakterystykę produktu wytwarzanego w niniejszym przykładzie, serii A, przedstawiono w tabeli 1. W tabeli 1 przedstawiono ponadto charakterystykę serii B i C, wytwarzanych sposobem opisanym powyżej dla serii A.

187 923

Tabela 1

	Seria
Test	A	B	C
Hemoglobina, g/dl	10,4	10,2	10,2
Methemoglobina, %	4,6	6,0	5,6
Karboksyhemoglobina, %	0,2	1,4	1,5
P50 (Torr, pH 7,35-7,45, pCO₂ 47-53 kPa)	28,5	26,8	27,0
Osmolalność (mmol/kgl)	318	320	317
Sód (mmol/1)	142	144	142
Potas (mmol/1)	4,0	4,0	4,0
Chlor (mmol/1)	98	99	94
Wolne żelazo (ppm)	0,7	12	1 0
Dystrybucja masy cząsteczkowej - % dla	128:16	128:11	128:16
192:26	192:23	192:26
każdej masy cząsteczkowej (Kd)	256⁸:58	256⁸:66	256^s:58
Tetrametr, %	0,4	0,3	0,4
Endotoksyna, (EU/ml)	<0,03	<0,03	<0,03

⁸ Materiał zawiera również małą ilość materiału o wyższej masie cząsteczkowej

W powyższym opisie przedstawiono szczegółowy opis korzystnych wykonań niniejszego wynalazku, w celu ilustracji, a nie ograniczenia. Należy rozumieć, że wszelkie inne modyfikacje i sposoby równoważne niniejszego wynalazku, oczywiste dla specjalistów, są objęte jego zakresem według zastrzeżeń.

187 923

Λ u

Ο <Μ «5

Φ •η υ C <0 <ϋ Λί

α>

Q Ν

187 923

FIG. 4 FIGLI

o
o o	>1
m	fi
w	•rł
1
u	o
ω	r-ł
w	tP
	0 ε
u	φ
w	X!
o	•n
H	Φ
cq	fi
	<ΰ
U	o
	N
CU	>1
a	M
N <0	Φ
	«-4
Λ	O
O	CU

>, c

•rł Λ O ι—I

O

E

0)

Λ

•n

Φ fi rtJ

Z

O

N <0

M

Xł

O >1 h

Φ ε

o

CU

Φ fi

O

N ϋ

N

W >n

N υ

o

187 923

O

U hemoglobina

30ιιΜ N<jt I 300irt4 Nof. I 15ΠΜ IICL -

un o

Li>ιΛ >4 O <D r-1 £ CT •H O i ε o o PM X!

187 923

10nW NoC I I OrrM NoC I



		<	i Ιλ
		0 _J 1
		i ' L
		Λ ·Η t—1 i
			N G r-l \J

Ό C O -P r—I d Q ·&.

a a

ni b

id c

fd

fd	£ fd
c	Ó C
0	Ν Ή
N	>ιΛ
0	P 0
N	Φ r-l
w	ε tu
>1	•H 0
N	r-i ε
υ	o ω
o	Chx:

φ

CJ

P O <1) I-I ε

•H o ή ε

O Φ PU Λ

187 923 ο

Ό π3

Ό

Ο £

>ι £

Ο

C ο

Μ

Λί •Η

I

Μ

4J

•Η

Λ ζ Λ Ό a) α Μ ϊ Ο π) Ε-ι Ό

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wodny roztwór polimeryzowanej aldehydem glutarowym hemoglobiny, znamienny tym, że zawiera tetramer w ilości co najwyżej 0,8% wagowo w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej w roztworze, oraz hemoglobinę, która wykazuje dystrybucję masy cząsteczkowej wynoszącą

10 - 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;

18 - 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000, w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;

45 - 10% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej 256000 w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.
2. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;

(b) całkowitą methemoglobinę w ilości mniejszej niż 8% całkowitej hemoglobiny;

(c) całkowitą karboksyhemoglobinę w ilości mniejszej niż 5% całkowitej hemoglobiny;

(d) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmola/1;

(e) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol/1;

(f) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;
3. Roztwór według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera (g) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;

(h) całkowity tetramer w ilości mniejszej niż 0,8% wagowo w stosunku do hemoglobiny całkowitej;

i (i) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1.
4. Roztwór według zastrz. 3, znamienny tym, że dodatkowo zawiera (j) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb; i (k) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/Hb.
5. Roztwór według zastrz. 2, znamienny tym, że wykazuje osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg.
6. Roztwór według zastrz. 2, znamienny tym, że wykazuje dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa.
7. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 15 godzin.
8. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.
9. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.
10. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, oraz tym, że czas półtrwania roztworu u pacjenta-człowieka wynosi około 24 godziny.
11. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera (a) całkowitą hemoglobinę w ilości 9,5 - 12,0 g/dl;

(b) całkowitą methemoglobinę w ilości mniejszej niż 8% całkowitej hemoglobiny;

(c) całkowitą karboksyhemoglobinę w ilości mniejszej niż 5% całkowitej hemoglobiny;

(d) dysocjację tlen - hemoglobina wynoszącą 31 - 43 hPa;

(e) osmolalność wynoszącą 280 - 360 mmol/kg;

187 923 (f) stężenie sodu wynoszące 135 - 155 mmol/1;

(g) stężenie potasu wynoszące 3,5 - 4,5 mmol^^1;

(h) stężenie chlorku wynoszące 85 - 110 mmol/kg;

(i) całkowite wolne żelazo w ilości mniejszej niż 2,0 ppm;

Cj 10- 24% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 128000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;

(k) 18 - 30% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;

(l) 45 - 70% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000 w stosunku do masy całkowitej hemoglobiny;

(m) całkowitą ilość tetrameru mniejszą niż 0,8%;

(n) endotoksynę w ilości mniejszej niż 0,03 EU/1;

(0) fosfolipidy w ilości mniejszej niż 50 ng/Hb;

(р) glikolipidy w ilości mniejszej niż 2 ng/HB.
12. Roztwór według zastrz. 1, znamienny tym, że w postaci preparatu zawiera około 16% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 192000 i około 58% polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej około 256000, przy czym wszystkie procenty podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej.
13. Roztwór według zastrz. 12, znamienny tym, że roztwór można podawać we wlewie pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 1,5 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek.
14. Sposób wytwarzania roztworu pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny zawierającej około 16% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 128000, około 26% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 192000 i około 58% wagowo polimeru hemoglobiny o masie cząsteczkowej wynoszącej 256000, przy czym zawartość procentową poszczególnych polimerów hemoglobiny podano w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej, który to roztwór można podawać pacjentowi-człowiekowi - w ilości do około 3 1 bez powodowania pogorszenia wydolności nerek, znamienny tym, że (a) z mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi usuwa się leukocyty za pomocą filtracji przez filtr o minimalnym średnim wymiarze porów dostatecznym do uniemożliwienia przechodzenia leukocytów;

(b) czerwone ciałka poddaje się lizie;

(с) do produktu z etapu (b) dodaje się tlenek węgla i ogrzewa się do temperatury 60-62°C przez około 10 godzin, z wytworzeniem poddanego obróbce cieplnej roztworu hemoglobiny;

(d) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny z etapu (c) filtruje się usuwając zręby i zanieczyszczenia zrębowe, które uległy wytrąceniu podczas ogrzewania;

(e) poddany obróbce cieplnej roztwór hemoglobiny odgazowuje się przez rozproszenie tlenu i następnie przez roztwór poddany obróbce cieplnej w temperaturze około 10°C rozprasza się azot z wytworzeniem piany i odgazowanego roztworu poddanego obróbce cieplnej;

(f) odgazowany roztwór poddaje się pirydoksylacji;

(g) roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji;

(h) roztwór pirydoksylowanej, polimeryzowanej hemoglobiny z etapu (g) natlenia się;

(1) roztwór z etapu (h) oczyszcza się usuwając z roztworu hemoglobinę tetrameryczną i zbiera się oczyszczoną polimeryzowaną hemoglobinę pirydoksylowaną, przy czym roztwór ten zawiera mniej niż 0,8% wagowo tetrameru hemoglobiny w stosunku do masy hemoglobiny całkowitej;

(j) roztwór oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej z etapu (i) odtlenia się;

(k) poziom pH i elektrolitów w roztworze oczyszczonej polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej doprowadza się do wartości fizjologicznych.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że hemoglobinę polimeryzuje się aldehydem glutarowym.

187 923
16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że dodatkowo (al) przeterminowaną lub nieprzeterminowaną krew przepuszcza się przez odpowiednie urządzenie aspirujące pod zredukowanym ciśnieniem, z wytworzeniem mieszaniny zawierającej czerwone ciałka krwi;

(a2) w atmosferze tlenku węgla, produkt z etapu (b) przemywa się 1 % roztworem chlorku sodu z wytworzeniem roztworu hemoglobiny o pH 6,0 - 6,5;

i przemyty roztwór z etapu (a2) rozcieńcza się wodą z wytworzeniem roztworu komórek lizowanych;

roztwór lizowanych komórek filtruje się przez filtr z wytworzeniem roztworu hemoglobiny wolnej od zanieczyszczeń zrębowych i materiału ścianek komórkowych;

odgazowany roztwór pirydoksyluje się za pomocą pirydoksalo-5'-fosforanu w stosunku molowym pirydoksalo-5'-fosforanu do hemoglobiny wynoszącym od 1:1 do 3:1, z wytworzeniem pirydoksylowanej hemoglobiny;

roztwór pirydoksylowanej hemoglobiny poddaje się polimeryzacji za pomocą wodnego roztworu aldehydu glutarowego z wytworzeniem roztworu polimeryzowanej hemoglobiny pirydoksylowanej o dystrybucji masy cząsteczkowej wynoszącej około 65-75% polimeru i 25-35% tetrameru;

i oczyszczoną, polimeryzowana hemoglobinę pirydoksylowaną odtlenia się za pomocą azotu.
17. Wodny roztwór hemoglobiny zdefiniowany w zastrz. 1 do stosowania jako lek do leczenia pacjenta cierpiącego z powodu utraty krwi.