WO1999016862A1 - Bacterie du genre lactobacillus helveticus ayant une grande capacite de production de tripeptides, produit laitier fermente et son procede de preparation - Google Patents

Bacterie du genre lactobacillus helveticus ayant une grande capacite de production de tripeptides, produit laitier fermente et son procede de preparation Download PDF

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lactic acid
fermented milk
milk
fermented
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PCT/JP1998/000481
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Naoyuki Yamamoto
Natsue Kawakami
Yuu Ishida
Hirokazu Yada
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Calpis Co., Ltd.
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel lactococcus chinoreles henoreticus (hereinafter, referred to as a novel lactococcus chinoreles henoreticus) capable of producing a specific tripeptide with high efficiency when cultured in an animal milk medium and having a high extracellular proteinase activity.
  • the present invention relates to a lactic acid bacterium belonging to Lactobac il lushel vet icus), a fermented milk product containing the lactic acid bacterium, and a method for producing the same.
  • Lata tobacillus helveticus has long been used as a typical lactic acid bacteria starter for dairy milk products for the production of fermented milk and the like. Lactobacillus helveticus has strong proteolytic activity, and extracellular proteinase, which has particularly high activity, plays an important role in the fermentability of animal milk. That is, extracellular proteinase decomposes animal milk proteins to produce various peptide fragments. The generated peptides are affected by the action of the peptidases, and become smaller peptides. It is known that some of the peptides produced in the medium by the action of the proteases are taken up into the lactic acid bacteria and used as a nitrogen source.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • peptides intended to inhibit the enzyme activity of ACE and to suppress a rise in blood pressure many types of effective peptides have already been reported, such as those derived from milk proteins, soybean proteins, or degradation products of fish meat proteins.
  • LA Val-Pro-Pro and lie-Pro-Pro (hereinafter abbreviated as VPP and IPP, respectively) as peptides having ACE inhibitory activity in fermented milk of Cutovacillus helveticus. Lactopeptides) are known.
  • SHR spontaneously hypertensive rat
  • ratatotribeptide-containing fermented milk obtained by fermenting animal milk and the like with the conventional ratatobacillus helveticus strain has a high acidity due to the large amount of lactic acid produced as the fermentation progresses. Therefore, it is difficult to eat and drink directly, and there is a problem in that the ratatotriptide content ratio is extremely reduced by dilution.
  • fermented milk with a high ratio of lacto-lipeptide to the amount of lactic acid produced can be produced, even if a small amount of fermented milk is added to various foods and drinks, it can be converted to lacto-lipeptide.
  • Products that are easy to eat and drink while maintaining the resulting functionality can be easily manufactured and provided to consumers.
  • a lactic acid bacteria strain that produces a high proportion of lactotripeptide is not known.
  • An object of the present invention is to provide a novel lactic acid bacterium strain capable of producing a large amount of lactopeptide with high efficiency with respect to the amount of lactic acid produced.
  • Another object of the present invention is to provide a ratatotripeptide having a function of lowering blood pressure and the like, which is expected to have a stress relieving effect, and a lactic acid bacteria strain capable of producing this lactotripeptide in a large amount. It is an object of the present invention to provide a fermented milk product which can be easily supplied to food and a method for producing the same.
  • the culture solution contains 60 g / m1 or less of Vapor Pro-Pro in terms of the amount of peptides Vapor Pro-Pro and lie-Pro-Pro.
  • a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus helveticus which is produced above and has an extracellular proteinase activity of 400 UZOD 590 or more is provided.
  • a lactic acid bacterium belonging to the above-mentioned Lata tobacillus helveticus wherein the strain is Lata tobacillus helveticus CM4 (Deposit No .: F ERM BP-606) 0, a lactic acid bacterium belonging to Lata tobacillus helveticus having a deposit date of August 15, 1997) is provided.
  • a lactic acid bacterium belonging to the Lactobacillus helveticus which is a chromosomal DNA which produces a DNA fragment of 15 to 17 kb when cut with restriction enzymes PstI and Ec0RI.
  • the present invention provides a lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus helveticus having the following.
  • a fermented milk product containing a fermented milk containing the lactic acid bacterium and a polypeptide selected from the group consisting of Val-Pro-Pro, lie-Pro-Pro, and a mixture thereof.
  • a culture medium containing a food material selected from the group consisting of peptides, proteins containing a sequence of Val-Pro-Pro and lie-Pro-Pro, and a mixture thereof is fermented by the lactic acid bacterium.
  • Fermented milk including process A method of manufacturing a product is provided.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of an agarose gel electrophoresis analysis of fragments of chromosomal DNA of various ratatobacillus helveticus strains in Example 2.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is a lactic acid bacterium belonging to Rata tobacillus helveticus.
  • cultivated as animal medium containing 9% by weight of non-fat milk solids as a medium tripeptides VPP and IPP are added to the culture solution.
  • VPP and IPP are added to the culture solution.
  • the ratato tripeptide productivity is a parameter for distinguishing the conventional lactic acid bacterium belonging to Lactobacillus helveticus from the lactic acid bacterium of the present invention.
  • % of the lactic acid bacterium of the present invention which can obtain 60 ⁇ g Zml or more of lactotriptide in terms of VPP, which cannot be obtained with conventional lactic acid bacteria, when using animal milk containing Things. Therefore, usually, the lower the proportion of non-fat milk solids in the culture medium, the lower the production of lactopeptides, and conversely, the higher the percentage, the higher the production.
  • the productivity of lactopeptide used as the above parameter is determined after inoculation of lactic acid bacteria into animal milk containing 9% by weight of non-fat milk solids, such as milk, goat milk, horse milk, or skim milk thereof.
  • the fermented milk cultured at 37 ° C for 24 hours was collected in 1 ml, and centrifuged at 15, OOO rpm for 10 minutes to measure the amount of VPP and IPP in the supernatant, and converted to the amount of VPP. Value You. Since the ACE inhibitory activity per weight of IPP is 1.7 times that of VPP, the VPP conversion amount can be calculated by the following formula.
  • the upper limit of the amount of lactopeptide production is not particularly limited, but may be obtained when all Val-Pro-Pro and lie-Pro-Pro sequences contained in the protein in the medium are cut out as tripeptides.
  • the amount is the upper limit.
  • the extracellular proteinase activity was determined by the method of Yamamoto et al. (Yam araoto, N. et al., J. Biochem. 1993) based on the method of Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. 143 3410 (1984)). ) 114, 740), when the amount of enzyme that produces 1% fluorescence intensity is 1 UZO D59 ( ).
  • the upper limit of the extracellular proteinase activity is not particularly limited, but usually is 8 0 0 UZO D 590.
  • the lactic acid bacterium of the present invention has a large production ratio of lactopeptide relative to the ratio of lactic acid produced during fermentation. Fermented milk rich in lipeptides can be obtained. Lactic acid derived from such fermentation is D-lactic acid, and the ratio of lactopeptide production to the amount of DL-lactic acid produced in fermentation by the lactic acid bacteria of the present invention is 1 m of fermented milk obtained. It is preferable that the amount of lactotripeptide is 30 ⁇ g or more in terms of VPP, based on 0.1 ng of DL-lactic acid. The upper limit of lactopeptide production is not particularly limited. However, it is possible to produce up to about 0.1 Olg of D-lactic acid in terms of VPP per m 1 of fermented milk obtained.
  • the relationship between the amount of DL-lactic acid generated and the production of ratatotripeptide is approximately proportional.
  • the production amount of DL-lactic acid in the solution is 0.02 g
  • the production amount of lactotriptide is preferably 60 / Zg or more in terms of VPP.
  • lactotripeptide is preferably used with respect to 0.01 g of D-lactic acid per 1 m1 of fermented milk obtained. Only less than 30 ⁇ g / 1 can be obtained in terms of VPP.
  • Lactobacillus helveticus CM 4 strain was deposited as FE RM BP-6600 (Deposit date 1997.8.15) by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Has been deposited. Lactobacillus helveticus CM4 strain has the following mycological properties.
  • Lactopeptide productivity Two types of tripeptides (VPP and IPP) were converted to 60 parts per billion (PPP) in fermented broth cultured at 37 ° C for 24 hours using 9% by weight skim milk. Produce 1 ⁇ g or more The lactotripeptide productivity of 8) is a value measured using skim milk as the solid content of non-fat milk.
  • the lactic acid bacterium strain of the present invention can be obtained, for example, by the screening method described below and the measurement of spore germ proteinase activity.
  • VPP equivalent Select a strain of 50 ⁇ g 1 or more.
  • the strain selected by the secondary screening is cultured in 9% by weight non-fat milk medium while maintaining the pH at 6, so that sodium citrate becomes 1% by weight after sampling in the mid-log phase. And centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes to collect the cells. Next, after washing the cells with 50 mM M / 3-daricellophosphate, the cells were suspended in 50 mM Tris-hydrochloric acid (pH 7.8) buffer and the turbidity ( OD590 ) 1 Adjust the cells The surface proteinase activity is measured. It can be confirmed that the measurement results correlate with the ratatopeptide high-producing strain selected in the secondary screening.
  • Lactic acid bacteria belonging to Rata tobacillus helveticus selected by the above method can be distinguished from other lactic acid bacteria strains by the ratat tripeptide productivity, extracellular proteinase activity and the like. .
  • the lactic acid bacterium of the present invention has the above-mentioned ratatotriptic productivity, extracellular proteinase activity, and preferably, when cut with restriction enzymes PstI and EcoRI, a DNA fragment of 15 to 17 kb. With the resulting chromosomal DNA. Therefore, by determining whether or not it has a chromosomal DNA that produces such a DNA fragment, it can be more clearly distinguished from other strains belonging to the same species.
  • the measurement of the DNA fragment of 15 to 17 kb was carried out by extracting chromosomal DNA of lactic acid bacteria by the method of Leenhouts et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Environmental Microbiol. 56: 2726). Then, digestion with EcoRI and Pstl is performed, 0.8% agarose gel electrophoresis is performed, and the electrophoresis pattern can be analyzed. At this time, the presence of the ⁇ phage DNA restriction enzyme Hind digestion product or the like as a DNA size marker can be clearly confirmed by parallel electrophoresis.
  • the fermented milk product of the present invention contains, as an essential component, fermented milk containing the lactic acid bacterium and a tripeptide selected from the group consisting of VPP, IPP, and a mixture thereof. That is, a fermented milk containing lact tribeptide and the lactic acid bacterium obtained by fermenting a medium containing a food material consisting of a peptide and / or a protein containing the sequences of VPP and IPP with the lactic acid bacterium of the present invention. What is necessary is just to contain.
  • the content ratio of the polypeptide to the fermented milk product can be appropriately selected according to the type of the fermented milk product, the fermented product is contained as it is, the fermented product is diluted, and the refined product is contained. But it is good.
  • the fermented milk product of the present invention contains DL-lactic acid derived from fermentation.
  • the fermented milk product of the present invention preferably contains lact tripeptide in a range of 30 to 50 ⁇ g in terms of VPP based on 0.001 g of the DL-lactic acid.
  • the relationship between the amount of DL-lactic acid and the amount of lactopeptide is approximately proportional. Therefore, when the fermented milk contained in the fermented milk product is concentrated, for example, when the amount of DL-lactic acid in the fermented milk product is 0.02 g,
  • the amount of peptide is preferably in the range of 60 to 100 ⁇ £ in terms of VPP.
  • the amount of D-lactic acid in the fermented milk product is 0.05 g
  • the amount of lactotripeptide will be 15 to A range of 25 ⁇ g is preferred.
  • the fermented milk product of the present invention may contain lactic acid, which is used as a food additive for adjusting the acidity, and this lactic acid and D-lactic acid derived from the fermentation are distinguished. Is what is done.
  • the lactic acid bacteria in the fermented milk product of the present invention may be those that have been sterilized after fermentation or those that have lived without being sterilized.
  • Examples of the fermented milk product of the present invention include yogurt, milky lactic acid bacteria drinks, cheese, processed foods containing sour milk, health foods containing sour milk, and the like. Therefore, in the fermented milk product of the present invention, in addition to the above-mentioned fermented milk as an essential component, various materials usually blended to make these products can be appropriately compounded.
  • the form of the fermented milk product of the present invention may be any of solids such as powder, granules and tablets; and fluids such as paste, gel and liquid.
  • the method for producing a fermented milk product of the present invention includes a step of fermenting a medium containing a food material selected from the group consisting of peptides, proteins and mixtures thereof containing VPP and IPP as constituent units with the lactic acid bacteria. No.
  • the food material to be contained in the medium may be any containing peptide and Z or protein containing VPP and IPP as constituent units, such as animal milk, milk casein, corn, corn protein, and the like.
  • Examples include wheat, wheat protein, soybean, soymilk, defatted soybean, soybean protein, and mixtures thereof.
  • animal milk such as cow's milk, goat's milk, horse's milk, or skim milk thereof.
  • non-fat milk solids is not particularly limited, but is usually 5 to 20% by weight.
  • Inoculum when inoculating the lactic acid bacteria in a medium is not particularly limited, normally, it is the specific food material 1 g per Lactobacillus Number 1 0 5 to 1 0 7 extent in the medium.
  • the fermentation conditions include a fermentation temperature of 25 to 50 ° C, preferably 30 to 45 ° C, and a fermentation time of 6 to 30 hours, preferably 10 to 24 hours.
  • the pH conditions are preferably in the range of pH 3.0 to 4.0, particularly preferably in the range of pH 3.0 to 3.5.
  • the fermentation is preferably performed such that the amount of ratatotripeptide in the obtained fermented milk is 60 ⁇ g Zm 1 or more in terms of VPP.
  • the amount of ratatotripeptide in the obtained fermented milk is 60 ⁇ g Zm 1 or more in terms of VPP.
  • fermentation is performed at 25 to 40 ° C for 12 to 48 hours to obtain ratatopeptide.
  • Fermented milk containing the amount of 70 ⁇ g ⁇ 1 or more in terms of VPP is obtained.
  • the proportion of non-fat milk solids in the culture medium is approximately proportional to the amount of lactotriptide produced.
  • ratatotriptide can be obtained under the fermentation conditions in an amount of about 33.3 ⁇ g / m 1 or more in terms of VPP.
  • the fermented milk obtained by the fermentation can be diluted, purified, or contained in the product as needed, but if necessary, cooled to about 5 ° C and stored, and then mixed with other components. It can be blended and made into products such as chilled products. In addition, heat sterilization treatment or the like can be carried out, and if necessary, powdered by spray drying or the like to obtain commercial products at normal temperature. Since the fermented milk product of the present invention contains fermented milk obtained by fermentation with the lactic acid bacteria, the ratio of lactolipeptide to the amount of lactic acid is high, and it is possible to easily produce a product that is easy to eat and drink. It is possible to expect that ratatotripeptides can exhibit blood pressure lowering action, anti-stress action, etc. by ingesting them into humans.
  • the lactic acid bacterium of the present invention can produce a large amount of ratatotriptide by culturing a specific food material as a culture medium, so that the blood pressure lowering activity caused by ratatotriptide, It is effective for the production of various fermented milk products, functional foods, health foods, foods for specified health use, special-purpose foods for the elderly, or these materials that exhibit stress-relaxing effects.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • CM strains have been deposited under the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as a deposit number: FERM BP-6060; ATCC 15009, NCD0-099 , JCM1006, ATCC10797, JCM1062, JCM1103, JCM1120 and JCM1004 are known strains. In the example Other strains were selected from the applicant's strain collection.
  • Lactobacillus helveticus 36 strains isolated from various dairy products were tested for the ACE inhibitory activity of the fermented milk by the following method. Each Lactobacillus helveticus strain was cultured in a 9% by weight skim milk medium at 37 ° C for 24 hours, added to a fresh medium at 3% by weight, and further cultured at 37 ° C for 24 hours. After completion of the fermentation, the lactic acidity (% by weight), the amount of peptide in whey (mgZml), the number of bacteria, and the ACE inhibitory activity (UZml) were measured. Table 1 shows the results. The fermentability of 7 out of 36 strains was extremely weak. There were 15 strains that produced lactic acid acidity of 1.6% by weight or more, and among them, 8 strains were selected from which the whey in fermented milk had an ACE inhibitory activity of 40 U / ml or more.
  • ACE inhibitory activity was performed based on the method of Cushman and Cheung (Cushman, D.W. and Chen, H.S., Pharmacol., 2-1637 (1971)). Immediately, the supernatant (whey) was prepared by centrifuging various fermented milks at 15,000 rpm for 5 minutes. After appropriately diluting the whey to a measurable magnification, transfer 800 to a test tube, and then use 0.1 M borate buffer as a substrate.
  • the enzyme activity unit was calculated by the following formula, with the amount giving 50% inhibition of ACE activity as 1 unit.
  • Enzyme amount (unit) ((A—B) Z (A—C)) X 100 X 1/50
  • the peptide was quantified by the OPA method (Charch, F. et al., J. Dairy. Sci. 1219 (183)). In preparing the calibration curve, a tryptic digest of casein was used as a standard substance.
  • VPP and IPP in the fermented milk were measured for the eight strains using fermented milk having a high ACE inhibitory activity.
  • the VPP-equivalent amount of lactotripeptide was the highest for the CM4 fermented milk, and was 78.5 ⁇ g Zm1 whey.
  • the average of the other seven strains was 34.2 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 whey.
  • the extracellular proteinases of the 16 strains having relatively good fermentability test results shown in Table 1 were obtained by the method of Twining et al. (Twining, S. Anal. Biochem. JL43 3410 (1984)). (Yamamoto, N. et al., J. Biochem. (1993) 114, 740). That is, various strains were cultured in 9% by weight non-fat dry milk while maintaining the pH at 6.0, and the cells were collected in the middle of the logarithmic growth phase. Sodium nutate was added to a final concentration of 1%, the milk medium was clarified, and the cells were collected by centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes.
  • the cells were suspended in a 50 mM buffer solution of Tris-HCl pH 7.8, and the turbidity ( ⁇ D 590, ie, (Measured by absorption at 590 nm).
  • fluorescein-casein manufactured by Sigma 20 ⁇ l, add 30 ⁇ l of the cell suspension, incubate at 42 ° C for 1 hour, add 5% trichloroacetic acid to 1 ⁇ l After adding 20 ⁇ l, the mixture was allowed to stand at room temperature for about 20 minutes, and centrifuged at 15,500 rpm for 10 minutes.
  • the supernatant 61 was added to 3 ml of 500 mM Tris-HCl pH 8.3, and the fluorescence intensity was measured.
  • fluorescence intensity fluorescence at 525 nm generated at an excitation wavelength of 49 O nm was measured.
  • the activity was defined as the amount of enzyme that produces 1% fluorescence intensity under the above reaction conditions as one unit, and the number of units of extracellular proteinase was determined for each unit. Table 3 shows the results. Table 3
  • Lactobacillus helveticus CM 4 strain had the highest activity of 450 U ZODO. Meanwhile, the active average of other 1 6 strains 1 4 1 U ZO D 59. And about one-third that of the four CM strains.
  • chromosomal DNA was analyzed by the method of Leenhouts et al. (Leenhouts, K. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56: 2726). ), Digested with several restriction enzymes, electrophoresed on 0.8% agarose gel, and analyzed the migration pattern.
  • the DNA fragment cut with EcoRI and PstI showed a characteristic DNA fragment on the chromosome of CM4 strain (arrow 1 in FIG. 1). This fragment was not found in the chromosomes of strains other than CM4, and a shorter fragment was found in most strains (arrow 2 in FIG. 1).
  • restriction enzymes Hi of ⁇ phage DNA are used as DNA size markers.
  • Simultaneous electrophoresis of nd HI digests (from low mobility, 23 lkb, 9.4 kb, 6.6 kb, 4.4 kb, 2.3 kb, and 2.0 kb) The molecular weight was measured to be about 16 kb.
  • the CM4 strain had a chromosomal DNA which yielded a DNA fragment of about 16 kb by digestion with EcoRI and Pstl.
  • the other strains other than the CM4 strain each had a chromosomal DNA that commonly generates a DNA fragment having a molecular weight of about 13 kb.
  • Fermented milk was produced using the four strains of Ratatobacillus helveticus CM selected in Example 1.
  • Four CM strains were cultured at 37 ° C for 12 hours using 100 g of 9% by weight non-fat milk, and inoculated into 3 kg of the same medium, and cultured at 37 ° C for 12 hours.
  • 100 kg of 9% by weight skim milk was fermented at 32 ° C for 20 hours.
  • the fermented milk at the end of the fermentation contained 74.8 jug / m 1 of lactotriptide.
  • the lactic acid content was 1.9% by weight.
  • the drill link yogurt has a flavor mild not preferred, at p H 3. 6, the viable cell number of CM4 is 4. was 6 X 1 0 8 or g.
  • Example 3 To 2.6.5 kg of the fermented milk obtained in Example 3, 4 5. O kg of muddyiyu sugar, 4.7 kg of high maltose liquid sugar and 13.8 kg of water were added, and 3% by weight was stirred. 10 kg of high methoxy pectin solution was added. Get The mixed solution was homogenized using a laboratory homogenizer (manton-gorlin, model 15M-8BA) at a processing pressure of 150 kg gZ cm 2 and a processing flow rate of 250 ml. Processing was performed. Vanilla flavor was added to the homogenized solution and sterilized at 85 ° C. The sterilized fermented milk was hot-filled into a 200 1 glass bottle. When the amount of ratatotripeptide in the obtained sterilized fermented milk product was measured, it was found that the amount of lactotripeptide contained in the fermented milk compounding amount before sterilization was contained. The lactic acid content was 0.5% by weight.

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Description

明 細 書
ト リべプチド高生産性ラタ トバチルス · ヘルべチカス乳酸菌及び発酵 乳製品及びその製造法
技術分野
本発明は、 獣乳培地中において培養した際に、 特定の ト リペプチド を高効率で産生することができ、 かつ菌体外プロティナーゼ活性が高 レヽ新規なラク 卜ノくチノレス · へノレべチカス（Lactobac i l lus he l vet i cus) に属する乳酸菌、 該乳酸菌を含む発酵乳製品及びその製造法に関する。 背景 術
ラタ トバチルス · ヘルべチカスは、 古くから代表的な酪農乳製品用 乳酸菌スターターと して、 発酵乳等の製造に用いられている。 ラク ト バチルス · ヘルべチカスは強い蛋白分解活性を有し、 特に高い活性を 有する菌体外プロティナーゼは、 獣乳の発酵性に対して重要な働きを する。 即ち、 菌体外プロティナ一ゼは獸乳蛋白質を分解し各種のぺプ チド断片を生成する。 生成されたべプチドはぺプチダーゼ群の作用を 受けて、 さらに低分子のペプチドになる。 蛋白質分解酵素群の作用に より培地中に生成したぺプチドの一部は、 乳酸菌菌体内へ取り込まれ て、 窒素源と して利用されることが知られている。 一方、 培地中に生 成したぺプチドには、 血圧上昇作用の原因物質であるアンギオテンシ ン変換酵素（Angiotensin Convert ing Enzyme、 以下 A C Eと称す） に 対して阻害活性を有するものが存在することが報告されている （J . Dairy Sc i . 78： 777-783 (1995) ) 0
A C Eの酵素活性を阻害し、 血圧上昇を抑制することを目的と した ペプチドについては、 既に乳蛋白質、 大豆蛋白質又は魚肉蛋白質分解 物等から、 多くの種類の有効ペプチドが報告されている。 例えば、 ラ ク トバチルス · ヘルべチカス発酵乳中の A C E阻害活性を有するぺプ チドと して、 Val - Pro- Pro及び l i e-Pro- Pro (以下、 それぞれ V P P及 び I P Pと略す。 またこれらを合わせてラク ト トリぺプチドと称す。 ） が知られている。 更にこれらラク ト ト リべプチドは強い血圧降下作用 を有することが自然発症高血圧ラッ ト （ S H R )を用いた実験により 確認されている（J . Dairy Sci . 78： 1253- 1257 ( 1995) )。
しかしながら、 獣乳等を従来のラタ トバチルス . ヘルべチカス株に より発酵させて得たラタ ト ト リべプチド含有発酵乳は、 発酵の進行に 従い多量に生成される乳酸に起因して高い酸度を示すため、 直接飲食 することは困難であり、 希釈することによってラタ ト ト リぺプチド含 有割合が極端に減少するという問題がある。
そこで、 生成乳酸量に対するラク ト ト リべプチドの含有割合が高い 発酵乳を製造することができれば、 各種の飲食品へ発酵乳を少量配合 することによつても、 ラク ト ト リべプチドに起因する機能性を維持し たまま飲食しやすい形態の製品を簡便に製造し消費者へ提供すること が可能になる。 しかしながら、 ラク ト ト リペプチドを高い割合で産生 する乳酸菌株については知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、 生成乳酸量に対して髙効率でラク ト ト リぺプチド を大量に生産しうる新規な乳酸菌株を提供することにある。
本発明の別の目的は、 血圧降下活性等の機能を有し、 ス ト レス緩和 作用が期待されるラタ ト ト リペプチドと、 このラク ト トリペプチドを 大量に生産しうる乳酸菌株を含み、 飲食に供し易い発酵乳製品及びそ の製造法を提供することにある。
本発明によれば、 以下の菌学的性質を有し、 無脂乳固形分を 9重量 %含む獣乳を培地と して培養した際に、 培養液中に ト リぺプチド Va卜 Pro- Pro及び lie- Pro - Proを、 Vaト Pro- Pro換算量で 6 0 g /m 1以 上生産し、 且つ菌体外プロティナーゼ活性 4 0 0 UZOD590以上を 示すラク トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸菌が提供される。 形態学的性質
1 ) 細胞の形状 ； 桿菌
2 ) 運動性 ； なし
3 ) 胞子の有無 ； なし
4 ) グラム染色性 ； 陽性
生理学的性質
1 ) カタラーゼ ； 陰性
2 ) イ ン ドール生成 ； 陰性
3 ) 硝酸塩の還元 ； 陰性
4 ) 酸素に対する態度 ； 通性嫌気性菌
5 ) グルコースによりホモ乳酸発酵により DL—乳酸を生成し、 ガスの産生はない ；
6 ) 各種炭水化物の分解性
グノレコース ； +
ラタ トース ； +
マンノース ； +
フラク トース ； +
ガラク トース ； +
シユークロ一ス ； ―
マル ]—ス ； 一
キシロース ； 一 ラムノ一ス ； 一
セノレビ才ース ； 一
ト レノヽ口—ス ；
メルビ -：一ス ； ―
ラフイ ノース ； ―
スタキ才ース ； 一
マンニ トール ； - ソルビ トール ； 一
ユースク リ ン ； 一
サリ シン ； 一
また本発明によれば、 前記ラタ トバチルス · ヘルべチカスに属する 乳酸菌であって、 ラタ トバチルス · ヘルべチカス CM 4株 （工業技術 院生命工学工業技術研究所 寄託番号 ： F ERM B P— 6 0 6 0, 寄 託日 1997.8.15) であるラタ トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸 菌が提供される。
更に本発明によれば、 前記ラク トバチルス · ヘルべチカスに属する 乳酸菌であって、 制限酵素 P s t I及ぴ E c 0 R Iによって切断する と、 1 5〜 1 7 k bの D N A断片を生じる染色体 D N Aを有するラク トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸菌が提供される。
また本発明によれば、 前記乳酸菌と、 Val- Pro- Pro、 lie- Pro- Pro及 びこれらの混合物からなる群より選択される ト リぺプチドとを含む発 酵乳を含有する発酵乳製品が提供される。
更に本発明によれば、 Val-Pro-Pro及び lie- Pro- Proの配列を含むぺ プチド、 タンパク質及びこれらの混合物からなる群より選択される食 品素材を含む培地を、 前記乳酸菌により発酵させる工程を含む発酵乳 製品の製造法が提供される。
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 2における、 各種ラタ トバチルス · ヘルべチカス株 の染色体 D N Aの断片のァガロースゲル電気泳動による分析結果を示 す写真である。
発明の好ま しい実施の熊様
本発明の乳酸菌は、 ラタ トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸菌 であり、 無脂乳固形分を 9重量％含む獣乳を培地と して培養した際に、 培養液中にト リペプチド V P P及び I P Pを、 V P P換算量で 6 0 μ gZm l以上、 好ましくは 7 0 μ 8/πι 1 以上生産し、 且つ菌体外プ ロティナーゼ活性 4 O O UZO D O以上、 好ましくは 4 3 O UZO D 590以上を示すことを特徴とする。 このラタ ト ト リべプチドの生産 性の規定は、 従来のラク トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸菌と 本発明の乳酸菌とを区別するためのパラメーターであって、 例えば、 無脂乳固形分 9重量％を含む獣乳を用いた場合には、 従来の乳酸菌で は得られない V P P換算量で 6 0 μ gZm l以上のラク ト トリべプチ ドが得られるという本発明の乳酸菌の特性を規定したものである。 従 つて、 通常、 培養する培地中の無脂乳固形分の含有割合が少なくなれ ばラク ト トリぺプチドの生産量も少なくなり、 逆に多くなれば多くな るものである。
前記パラメーターと して用いるラク ト ト リぺプチドの生産性は、 無 脂乳固形分 9重量％を含む獣乳、 例えば牛乳、 山羊乳、 馬乳又はこれ らの脱脂乳等に乳酸菌を接種後、 3 7°Cで 2 4時間培養した発酵乳を l m l と り、 そのまま 1 5， O O O r p mで 1 0分間遠心分離して得 た上清中の V P P及び I P P量を測定し、 V P P量に換算した値であ る。 換算は、 I P Pの重量当りの A C E阻害活性が V P Pの 1 . 7倍 であることから、 以下の式により V P P換算量が求められる。
ラク ト ト リべプチド換算量（V P P換算/ z gZml) = I P P量（/ g/ml) X I . 7 + V P P量（μ g/ml)
ラク ト ト リぺプチドの生産量の上限は特に限定されないが、 培地中 の蛋白質に含まれる全ての Val- Pro- Pro及び lie- Pro- Proの配列がトリ ペプチドと して切り出された際の量が上限となる。
前記菌体外プロティナーゼ活性は、 Twiningらの方法（Twining, S. A nal.Biochem. 143 3410 (1984) )をもとにした Yamamotoらの方法（Yam araoto,N.ら J.Biochem. (1993)114, 740)に従った反応条件において、 1 %の蛍光強度を生じる酵素量を 1 UZO D59()と した場合の値であ る。 この菌体外プロティナーゼ活性の上限も特に限定されないが、 通 常は 8 0 0 UZO D 590である。
本発明の乳酸菌は、 発酵に際して生成される乳酸量の割合に対して ラク ト ト リぺプチドの生産割合が多いため、 従来の乳酸菌で発酵させ た際と同様な乳酸量に対してラタ ト ト リべプチドを多く含む発酵乳を 得ることができる。 このような発酵に由来する乳酸は Dい乳酸であつ て、 本発明の乳酸菌による発酵において生成する DL-乳酸の量に対す るラク ト ト リぺプチドの生産割合は、 得られる発酵乳 1 m 1 あたり、 DL-乳酸 0 . O l gに対し、 ラク ト ト リペプチドが V P P換算量で 3 0 μ g以上生産されるのが好ましい。 またラク ト ト リぺプチド生産量 の上限は特に限定されないが、 得られる発酵乳 1 m 1 あたり、 Dい乳 酸 0 . O l gに対し V P P換算量で 程度まで生産することが 可能である。 この生成する DL-乳酸量とラタ ト ト リべプチド生産量と の関係は略比例関係になる。 従って、 例えば、 得られる発酵乳 l m l 中の DL-乳酸の生成量が 0 . 0 2 gである場合には、 ラク ト トリぺプ チドの生産量は、 V P P換算量で 6 0 /Z g以上となる生産量が好まし い。 これに対し、 従来のラク トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸 菌による発酵では、 得られる発酵乳 1 m 1 あたり、 Dい乳酸 0 . 0 1 gに対して、 ラク ト トリペプチドは、 好ましくても V P P換算量で 3 0 μ g / 1未満得られるに過ぎない。
本発明の乳酸菌の一例と して、 ラク トバチルス · ヘルべチカス CM 4株が工業技術院生命工学工業技術研究所 寄託番号 ： F E RM B P - 6 0 6 0 (寄託日 1997.8.15)と して寄託されている。 ラク トバチル ス · ヘルべチカス CM 4株は、 以下に示す菌学的性質を有する。
菌学的性質 ：
1 . 形態学的性質
1 ) 細胞の形状 ； 桿菌
2 ) 運動性 ； なし
3 ) 胞子の有無 ； なし
4 ) グラム染色性 ； 陽性
2. 生理学的性質
1 ) カタラーゼ ； 陰性
2 ) イ ン ドール生成 ； 陰性
3 ) 硝酸塩の還元 ； 陰性
4 ) 酸素に対する態度 ； 通性嫌気性菌
5 ) グルコースによりホモ乳酸発酵により D L—乳酸を生成し、 ガスの産生はない。
6 ) 各種炭水化物の分解性
グノレコース ； + ラタ トース ； +
マンノース ； +
フラク トース ； +
ガラク トース ； +
シユーク ロース ； 一
マルトース ； 一
キシロース ； 一
ラムノース ； 一
セノレビオース ； ―
卜 レノヽ口 —ス ； 一
メノレビオース ； 一
ラフイ ノース ； 一
スタキ才ース ； 一
マンニ ト一ノレ ； ―
ソルビトール ； 一
ユースク リ ン ； 一
サリ シン ； 一
以上の菌学的性質を光岡らの方法（臨床検査 18、 1163(1974))により 同定すると公知株ラク トバチルス ♦ヘルべチカス NCD0- 099と同一であ る。 但し、 光岡らの方法に記載されていない下記の性質については明 らかに NCD0- 099とは異なっている。
7) 菌体外プロティナーゼ活性 ； 400 U/OD59o以上の活性
8) ラク ト ト リぺプチド生産性 ； 9重量％脱脂乳を用い 3 7°Cで 2 4時間培養した発酵液中に 2種のトリベプチド （V P P及ぴ I P P) を、 V P P換算量で 6 0 μ g 1以上生産する なお、 8 ) のラク ト トリペプチド生産性は、 無脂乳固形分と して脱 脂乳を用いて測定した値である。
本発明の乳酸菌株は、 例えば以下に示すスク リ一ユング方法及び菌 隊がいプロティナーゼ活性の測定により得る'ことができる。
( 1 ) 一次スク リーニング
(AC E阻害活性の高い発酵乳の選択）
9重量％脱脂乳培地を用いてスク リ一ユング株を 3 7°C、 2 4時間 培養する。 培養終了後に乳酸菌数、 乳酸酸度、 AC E阻害活性を測定 する。 乳酸菌数 1 X 1 08個ノ111 1以上、 乳酸酸度 1 . 6重量％以上、 AC E阻害活性 4 0ユニッ トノ m 1以上の菌株を選択する。 なお、 A C E阻害活性は、 Cush赚と Cheungの方法（Cushman，D.W. and Cheung, H.S. Pharmacol., 20 1637 (1971) )に基づいて測定する。
( 2 ) 二次スク リーユング
(ラタ ト トリぺプチド髙生産性株の選択）
一次スク リーニングにより選択された菌株の培養液を遠心分離機に て 1 5， 0 0 0 r p m、 1 0分間処理後の上清を用いて、 H P L Cに より ラク ト トリぺプチドの定量分析を行う。 ラク ト トリぺプチド含量
(V P P換算量） 5 0 μ g 1以上の菌株を選択する。
( 3 ) 菌体外プロティナーゼ活性の測定
二次スク リーニングにより選択された菌株を 9重量％脱脂乳培地中 で p H 6に維持しながら培養して、 対数増殖期中期でサンプリ ング後 に、 クェン酸ナト リ ウムを 1重量％になるように添加し、 5， 0 0 0 r p m、 1 0分間の遠心分離を行い菌体を回収する。 次いで、 5 0 m M/3—ダリセロ リン酸にて菌体を洗浄後に、 菌体を 5 0 mMトリス塩 酸 （p H 7. 8) 緩衝液に懸濁して、 濁度（OD 590) 1に調整し菌体 表面のプロティナーゼ活性を測定する。 測定結果は、 二次スク リ一二 ングにおいて選択されるラタ ト ト リぺプチ ド高生産株と相関すること が確認できる。
以上の方法により選択されたラタ トバチルス · ヘルべチカスに属す る乳酸菌株と他の乳酸菌株との識別は、 前記ラタ ト ト リペプチド生産 性、 菌体外プロティナ一ゼ活性等から同定することができる。
本発明の乳酸菌は、 前記ラタ ト トリぺプチド生産性、 菌体外プロテ ィナーゼ活性を有する他、 好ましくは制限酵素 P s t I及び E c o R I によって切断すると、 1 5〜 1 7 k bの DNA断片を生じる染色体 DNAを有する。 従って、 このような DN A断片を生じる染色体 DN Aを有するか否かを測定することによって、 同種に属する他の菌株と より明確に識別することができる。
前記 1 5〜 1 7 k bの DNA断片の測定は、 具体的には、 乳酸菌の 染色体 D N Aを Leenhoutsらの方法（Leenhouts, K. (1990) Appl.Enviro n. Microbiol. 56:2726)で抽出し、 E c o R I と P s t lによる切断 を行い、 0. 8 %のァガロースゲル電気泳動し、 その泳動パターンの 分析により行うことができる。 その際、 DNAのサイズマーカーとし て、 λファージ DNAの制限酵素 H i n d Π分解物等を平行して泳動 することにより、 明確にその存在が確認できる。
本発明の発酵乳製品は、 前記乳酸菌と、 V P P、 I P P及びこれら の混合物からなる群より選択される ト リペプチドとを含む発酵乳を必 須の構成成分と して含有する。 即ち、 V P P及び I P Pの配列を含む ぺプチド及び 又はタンパク質からなる食品素材を含む培地を、 前記 本発明の乳酸菌により発酵させて得た、 ラク ト ト リベプチドと前記乳 酸菌とを含む発酵乳を含有するものであれば良い。 従って、 乳酸菌と、 ト リぺプチドとの含有割合は発酵乳製品の種類に応じて適宜選択する ことができ、 発酵物をそのまま含有させたもの、 希釈して含有させた もの、 更には精製して含有させたものでも良い。
本発明の発酵乳製品は、 発酵に由来する DL-乳酸を含む。 本発明の 発酵乳製品は、 この DL-乳酸 0 . O l gに対して、 ラク ト ト リべプチ ドを V P P換算量で 3 0〜 5 0 μ gの範囲含むのが好ましい。 この DL -乳酸量とラク ト ト リぺプチド量との関係は略比例関係になる。 従つ て、 発酵乳製品中に含まれる発酵乳が濃縮されたものである場合には、 例えば、 発酵乳製品中の DL-乳酸量が 0 . 0 2 gである場合、 ラク ト ト リぺプチド量は、 V P P換算量で 6 0〜 1 0 0 μ £の範囲が好まし い。 逆に希釈された発酵乳を用いた場合には、 例えば、 発酵乳製品中 の Dい乳酸量が 0 . 0 0 5 gである場合、 ラク ト トリペプチド量は、 V P P換算量で 1 5 ~ 2 5 μ gの範囲が好ましい。 なお、 本発明の発 酵乳製品には、 酸度を調整するために食品添加物と して使用されるい 乳酸を添加することができるが、 このい乳酸と、 前記発酵に由来する Dい乳酸は区別されるものである。
本発明の発酵乳製品中の乳酸菌は、 発酵終了後に殺菌されたもので あっても殺菌せずに生きた菌のものでもいずれでも良い。
本発明の発酵乳製品と しては、 ヨーグルト、 乳性乳酸菌飲料、 チー ズ、 酸乳配合の加工食品、 酸乳配合の健康食品等が挙げられる。 従つ て、 本発明の発酵乳製品は、 必須の構成成分と しての前記発酵乳の他 に、 これらの製品とするために通常配合される各種材料を適宜配合す ることができる。 本発明の発酵乳製品の形態と しては、 粉末状、 顆粒 状、 錠剤等の固体 ； ペース ト状、 ゲル状、 液状等の流体のいずれであ つても良い。 本発明の発酵乳製品の製造法は、 V P P及び I P Pを構成単位とし て含むぺプチド、 タンパク質及びこれらの混合物からなる群より選択 される食品素材を含む培地を、 前記乳酸菌により発酵させる工程を含 む。
前記培地に含有させる食品素材と しては、 V P P及び I P Pを構成 単位と して含むぺプチド及び Z又はタンパク質を含むものであれば良 く、 例えば、 獣乳、 乳カゼイン、 トウモロコシ、 コーン蛋白、 小麦、 小麦蛋白、 大豆、 豆乳、 脱脂大豆、 大豆蛋白又はこれらの混合物等が 挙げられる。 特に、 牛乳、 山羊乳、 馬乳又はこれらの脱脂乳等の獣乳 を含有した食品素材の使用が好ましい。 獣乳を用いる場合の無脂乳固 形分の含有割合は特に限定されないが、 通常、 5〜 20重量％である。 前記乳酸菌を培地に接種する際の接種量は特に限定されないが、 通 常、 培地中の前記特定の食品素材 1 g当り乳酸菌数 1 05〜 1 07個程 度である。
前記発酵の条件と しては、 発酵温度は 2 5 ~ 50°C、 好ましくは 3 0〜 4 5 °Cであり、 発酵時間は 6〜 3 0時間、 好ましくは 1 0 ~ 24 時間である。 p H条件は、 好ましくは p H 3. 0〜4. 0、 特に好ま しくは p H 3. 0〜 3. 5の範囲である。
前記発酵は、 好ましくは、 得られる発酵乳中のラタ ト ト リペプチド 量が V P P換算量で 6 0 μ g Zm 1以上となるよう行う ことが好まし い。 具体的には例えば培地と して無脂乳固形分 9重量％の牛乳を使用 した場合、 2 5〜 4 0 °Cで 1 2〜 4 8時間発酵させることにより、 ラ タ ト ト リぺプチド量を V P P換算量で 70 μ g Ζπι 1以上含有する発 酵乳が得られる。 但し、 培地中の無脂乳固形分の割合と生産されるラ ク ト トリぺプチド量とは略比例関係にあり、 例えば無脂乳固形分 5重 量％の食品素材を使用した場合、 V P P換算量で約 3 3 . 3 μ g / m 1 以上のラタ ト ト リぺプチドを、 前記発酵の条件により得ることがで きる。
前記発酵により得られた発酵乳は、 必要に応じて希釈、 精製したり、 若しくはそのまま製品に含有させることができるが、 必要に応じ約 5 °Cに冷却し保存した後、 他の成分との配合などを行い、 チルド商品等 の製品とすること もできる。 また、 加熱殺菌処理等を行い、 必要に応 じて噴霧乾燥等により粉末化して常温流通商品とすること もできる。 本発明の発酵乳製品においては、 前記乳酸菌による発酵により得ら れる発酵乳を含有するので、 乳酸量に対するラク ト ト リべプチド含有 割合が高く、 飲食に供し易い製品を簡便に製造することができ、 しか もヒ トに摂取させることによって、 ラタ ト ト リペプチドに起因する血 圧降下作用、 抗ス ト レス作用等の発現が期待できる。
本発明の乳酸菌は、 特定の食品素材を培地と して培養することによ りラタ ト ト リべプチドを大量に産生することができるので、 ラタ ト ト リぺプチドに起因する血圧降下活性、 ス トレス緩和作用等を示す各種 発酵乳製品、 機能性食品、 健康食品、 特定保健用食品、 高齢者用の特 別用途食品又はこれらの材料の生産に有効である。 以下実施例により さらに詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定 されるものではない。
なお、 実施例中のラク トバチルス ' ヘルべティカス株のうち、 C M 4株は工業技術院生命工学工業技術研究所 寄託番号 ： FERM BP- 6060 と して寄託されており、 ATCC 15009、 NCD0-099、 JCM1006、 ATCC10797 , JCM1062、 JCM1 103、 JCM1120及び JCM1004は公知株である。 実施例中の これ以外の株は、 出願人が保有する菌株コレクシヨンより選択された ものである。
実施例 1
(AC E阻害活性の高い発酵乳を与える菌株の選択）
各種酪農製品から分離されたラク トバチルス · ヘルべティカス 3 6 株について、 その発酵乳の AC E阻害活性を以下の方法で調べた。 各 ラク トバチルス · ヘルべチカス株を 9重量％脱脂粉乳培地で 3 7°C、 24時間培養し、 新しい同培地に 3重量％添加し、 さらに 3 7°C、 2 4時間培養した。 発酵終了後、 乳酸酸度 （重量％) 、 ホエー内のぺプ チド量 （m gZm l ) 、 菌数及び AC E阻害活性 （UZm l ) を測定 した。 結果を表 1に示す。 3 6株中 7株については発酵性が極めて弱 かった。 乳酸酸度生成量が 1. 6重量％以上のものは 1 5株であり、 その中から発酵乳内ホエーの AC E阻害活性が 4 0 U/m l以上のも の 8株を選択した。
(発酵乳内 AC E阻害活性の測定法）
AC E阻害活性の測定は、 Cushmanと Cheungの方法（Cushman, D.W. a nd Cheung, H.S, Pharmacol., 2ϋ 1637 (1971) )に基づいて行った。 即 ち、 各種発酵乳を 1 5， 000 r p m、 5分間の遠心により上清 （ホ エー） を調製した。 そのホェ一を、 測定可能な倍率に適宜希釈した後、 その 8 0 1 を試験管に移し、 次に基質と して 0. 1 Mホウ酸緩衝液
(0. 3 M N a C l を含む、 p H 7. 3 ) で 5 mMに調製したヒプ リル · ヒスチジン · ロイシン（Hip- His-Leu、 シグマ社製） 0. 2m l を加えて、 さらに酵素溶液 （ 0. 1 UZm 1、 シグマ社製） 20 μ 1 を添加して 3 7 °Cで 3 0分間反応させた。 その後、 1 N塩酸を 2 50 μ 1加えて反応を停止させた後、 1. 7 m 1 の酢酸ェチルを加えて約 2 0秒間撹拌した。 次いで 3， 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心分離し、 酢酸ェチル層 （上層） 1 . 4 m l を回収し、 1 2 0°Cで 4 0分間加熱 し、 溶媒を除去した。 溶媒除去後、 蒸留水 l m l を加えて、 約 2 0秒 間撹拌し抽出されたヒプリル酸の 2 2 8 nmにおける吸収の値を測定 した。 酵素活性ュニッ トは A C E活性の 5 0 %阻害を与える量を 1ュ ニッ トと して、 下記式により算出した。
酵素量（ュニッ ト） = ((A— B)Z(A— C)) X 1 0 0 X 1 / 5 0
A ： 試料を含まない場合の 2 2 8 n mの吸光度
B ： 試料を添加した場合の 2 2 8 n mの吸光度
C ： 酵素及び試料を添加しない場合の 2 2 8 n mの吸光度
(発酵乳内べプチド量の定量法）
ペプチドの定量は O P A法 （Charch，F. ら J. Dairy. Sci. 1219(1 83))により行った。 検量線の作成には、 標準物質と して、 カゼイン の ト リプシン分解物を用いた。
6
Figure imgf000018_0001
(ラク ト ト リぺプチド生産性の高い菌株の選択）
続いて、 上記 AC E阻害活性の高い発酵乳使用菌株 8株について、 発酵乳内の V P P及び I P Pを測定した。
発酵乳 1 m l を、 そのまま 1 5， O O O r p mで 1 0分間遠心分離 し、 その上清即ちホエーを回収した。 このホエー 0 . 3 m 1 を Sep- Pa k Cartridge (ウォーターズ社製） に吸着させ、 蒸留水で洗浄した。 メタノール 5 m 1 で溶出し、 遠心処理下で減圧、 乾燥させた。 乾燥物 を 0 . 3 m 1 の 0 . 0 5 %ト リ フルォロ酢酸の水溶液に溶解し、 以下 の条件で H P L C (高速液体クロマ トグラフィー） 分析した。 結果を 表 2に示す。 使用機種 ：
日立 L 4 0 0 0 U Vディテクター （ 2 1 5 n mで検出） L 6 2 0 0イ ンテリ ジェン トポンプ L 5 0 3 0カラムォーヴン （ 3 5 °C) 分離条件 ： 流速 0 . 5 m 1 分 溶離液 ： 0 . 3 M N a C l 、 0 . 0 5 % ト リフルォロ酢酸の水溶液 カラム ： Asahipak GS320 ( Φ 3.9 X 600mm)
I P Pの重量当りの A C E阻害活性は V P Pの 1 . 7倍であること から、 I P P量及び V P P量からラク ト ト リペプチドを以下の式によ り V P P換算量として求めた。 結果を表 2に示す。 ラク ト ト リペプチド換算量 （V P P換算/ g Zm l ) = I P P量 g /m 1 ) X I . 7 + V P P量 （ /z gノ m 1 ) 表 2 ペプチド量 （ " g /m 1 ホエー） 酸度
菌株 VPP IPP VPP換算ラク ト (重量 %)
トリぺプチド量
分離株 17 15.2 11.1 34.0 1.5
分離株 19 11.2 7.3 23.7 1.4
分離株 20 13.0 8.1 26.8 1.6
分離株 21 16.6 11.4 36.0 1.6
分離株 22 15.8 12.1 36.3 1.5
分離株 24 12.6 8.7 27.4 1.6
JCM1006 12.9 9.3 28.6 1.3
CM4 38.5 23.5 78.5 1.9 ラク ト ト リペプチドの V P P換算量は、 CM4株発酵乳のもので最 も高く、 7 8. 5 μ g Zm 1 ホエーであった。 それ以外の 7株の平均 値は 3 4. 2 μ § /πι 1 ホエーであった。
(菌体外プロティナーゼ活性の測定）
表 1に示しす発酵性についての試験結果が比較的良好であった株 1 6株の菌体外プロティナーゼを、 Twiningらの方法（Twining, S. Anal. Biochem. JL43 3410 (1984) )をもとにした Yamamotoらの方法（Yamamot o，N.ら J. Biochem. (1993)114， 740)に従って行った。 即ち、 各種菌株 を 9重量％脱脂粉乳中で p Hを 6 . 0に維持して培養し、 対数増殖期 の中期で集菌した。 タエン酸ナト リ ゥムを終濃度 1 %になるよ うに添 加し、 乳培地を透明化し、 5， 0 0 0 r p mで 1 0分間の遠心分離を 行い菌体を回収した。 次に、 5 0 mM /3—グリセ口 リ ン酸により菌体 を洗浄後、 菌体を 5 0 mMの ト リ ス塩酸 p H 7. 8の緩衝液に懸濁し 濁度 （〇 D 590即ち 5 9 0 n mの吸収で測定） を 1 に合わせた。 0. 4 %のフルォレセイン—カゼイン （シグマ社製） 2 0 μ 1 に菌体懸濁 液 3 0 μ 1 を加え 4 2 °Cで 1時間インキュベー ト し、 5 % ト リ ク ロ 口 酢酸を 1 2 0 μ 1加え室温にて約 2 0分間放置し、 1 5， 0 0 0回転 で 1 0分間の遠心分離を行った。 上清 6 0 1 を 3 m l の 5 0 0 mM ト リス塩酸 p H 8. 3に加え、 蛍光強度を測定した。 蛍光強度は励起 波長 4 9 O n mで生じる 5 2 5 nmの蛍光を測定した。 活性は上記反 応条件で、 1 %の蛍光強度を生じる酵素量を 1ユニッ トと定義し、 そ れぞれの菌体外プロティナーゼのュニッ ト数を求めた。 結果を表 3に 示す。 表 3
Figure imgf000021_0001
ラク トバチルス · ヘルべチカス CM 4株の活性が最も高く 4 50 U ZOD oであった。 一方、 その他の 1 6株の活性平均値は 1 4 1 U ZO D59。と CM 4株に比べ約 3分の 1程度であった。
荬施例 2
実施例 1で選択したラタ トバチルス · ヘルべチカス 3 6株の中から 選択した 1 1株について、 染色体 D N Aを Leenhoutsらの方法（Leenho uts,K. (1990) Appl. Environ. Microbiol. 56 : 2726)で抽出し、 いくつ かの制限酵素による切断を行い 0. 8 %のァガロースゲル電気泳動し、 その泳動パターンの分析を行った。
その結果、 E c o R I と P s t I とにより切断した DNA断片につ いて CM 4株の染色体について特徴的 DN A断片が認められた （図 1 中矢印 1 ) 。 CM4以外の菌株の染色体にはこの断片は認められず、 ほとんどの株でそれより短い断片が認められた （図 1中矢印 2) 。 こ こで DNAのサイズマーカーとして λファージ DNAの制限酵素 H i n d HI分解物 （移動度の低いものから 2 3. l k b、 9. 4 k b、 6. 6 k b、 4. 4 k b、 2. 3 k b及び 2. 0 k b ) を同時に電気泳動 し、 特徴的断片の分子量を測定したところ約 1 6 k bであった。 従つ て、 CM4株は E c o R I と P s t l とによる切断によって、 分子量 約 1 6 k bの DN A断片を生じる染色体 DN Aを有することが確認さ れた。 また、 CM4株以外の他の株は、 それぞれ共通して分子量約 1 3 k bの DN A断片を生じる染色体 DN Aを有することが確認された。
実施例 3
実施例 1で選択されたラタ トバチルス · ヘルべチカス CM 4株を用 いて発酵乳の製造を行った。 CM 4株を 9重量％脱脂乳 1 00 gを用 いて 3 7 °C、 1 2時間培養したものを、 新しい同培地 3 k gに接種し、 3 7°C、 1 2時間培養した。 培養終了した発酵乳全量をスターター (CM4株の菌数 6. 3 X 1 08個 Zm l ) と して用い、 9重量％脱 脂乳 1 00 k gを 3 2 °C、 20時間発酵させた。 発酵終了時の発酵乳 中には、 ラク ト トリぺプチドが 74. 8 ju g /m 1含まれていた。 ま た、 乳酸量は 1. 9重量％であった。
得られた発酵乳 4 3 k gにグラニユウ糖 4 k g、 水 3 k g、 ハイメ トキシぺクチン 0. 1 5 k gを加えた後に均質化して、 ドリ ンクョー ダルト 5 0 k gを得た。 このドリ ンクヨーグルトはマイルドな好まし い風味を有し、 p H 3. 6で、 CM4の生菌数は 4. 6 X 1 08個 gであった。
14
実施例 3で得られた発酵乳 2 6. 5 k gにダラ二ユウ糖 4 5. O k g、 ハイマルトース液糖 4. 7 k g、 水 1 3. 8 k gを加えて、 撹拌 しながら 3重量％ハイメ トキシぺクチン溶液 1 0 k gを加えた。 得ら れた混合液をラボラ ト リ一ホモゲナイザー （マントンゴーリ ン社製、 形式 1 5M— 8 BA) を用いて、 処理圧力 1 5 0 k gZ c m2、 処理 流量 2 5 0 0 m lノ分で均質化処理を行った。 均質化処理液にバニラ 系香料を加えて 8 5 °C達温殺菌を行った。 殺菌処理発酵乳を 200 1 用ガラス壜に熱時充填した。 得られた殺菌処理発酵乳製品中のラタ ト ト リペプチド量を測定したところ、 殺菌前の発酵乳配合量中に含まれ るラク ト ト リペプチド相当量が含まれていた。 また乳酸量は 0. 5重 量％であった。

Claims

請 求 の 範 囲
1) 以下の菌学的性質を有し、 無脂乳固形分を 9重量％含む獣乳を培 地と して培養した際に、 培養液中に ト リぺプチド Val- Pro- Pro及び lie- Pro- Proを、 Val- Pro- Pro換算量で 6 0 μ g / 1 以上生産し、 且つ菌体外プロティナーゼ活性 4 0 0 UZO D590以上を示すラク トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸菌 ：
形態学的性質
1 ) 細胞の形状 ； 桿菌
2 ) 運動性 ； なし
3 ) 胞子の有無 ； なし
4 ) グラム染色性 ； 陽性
生理学的性質
1 ) カタラーゼ ； 陰性
2 ) イ ン ドール生成 ； 陰性
3 ) 硝酸塩の還元 ； 陰性
4 ) 酸素に対する態度 ； 通性嫌気性菌
5 ) グルコースによりホモ乳酸発酵により D L—乳酸を生成し、 ガスの産生はない ；
6 ) 各種炭水化物の分解性
グノレコース ； +
ラク トース ； +
マンノース ； +
フラク トース ； +
ガラク トース ； +
シユ ーク ロース ； 一 マル 卜ース ； ―
キシロース ； 一
ラムノース ； 一
セノレビ才一ス ； 一
ト レノヽロ一.ス ； ―
メノレビオース ； 一
ラフイ ノース ； 一
スタキ才ース ； 一
マンニ ト一ノレ ； ―
ソルビ トール ； 一
ユースク リ ン ； 一
サリ シン ； 一。
2) 請求の範囲 1に記載のラク トバチルス · ヘルべチカスに属する乳 酸菌であって、 ラク トバチルス · ヘルべチカス C M 4株 （工業技術 院生命工学工業技術研究所 寄託番号 ： F E R M B P— 6 0 6 0 ) であるラタ トバチルス · ヘルべチカスに属する乳酸菌。
3) 請求の範囲 1に記載のラタ トバチルス ·ヘルべチカスに属する乳 酸菌であって、 制限酵素 P s t I及び E c o R I によって切断する と、 1 5〜 1 7 k bの D N A断片を生じる染色体 D N Aを有するラ タ トバチルス ·ヘルべチカスに属する乳酸菌。
4) 請求の範囲 1に記載の乳酸菌と、 Val- Pro- Pro、 lie-Pro- Pro及び これらの混合物からなる群より選択される ト リペプチドとを含む発 酵乳製品。
5) 前記発酵乳製品が DL-乳酸を含み、 発酵乳製品が、 Dい乳酸 0 . 0 1 gあたり前記ト リぺプチドを Val- Pro-Pro換算量で 3 0〜 5 0 μ g含む請求の範囲 4に記載の発酵乳製品。
6) 前記請求の範囲 1に記載の乳酸菌が生きた菌である請求の範囲 4 に記載の発酵乳製品。
7) 発酵乳製品が、 ヨーグルト、 乳清乳酸菌飲料、 チーズ、 酸乳配合 の加工食品及び酸乳配合の健康食品からなる群より選択される請求 の範囲 4に記載の発酵乳製品。
8) Val -Pro-Pro及び l i e- Pro-Proを構成単位と して含むペプチド、 タ ンパク質及びこれらの混合物からなる群より選択される食品素材を 含む培地を、 請求の範囲 1に記載の乳酸菌により発酵させる工程を 含む請求の範囲 4に記載の発酵乳製品の製造法。
9) 前記食品素材が、 獣乳、 乳カゼイン、 トウモロコシ、 コーン蛋白、 小麦、 小麦蛋白、 大豆、 豆乳、 脱脂大豆、 大豆蛋白及びこれらの混 合物からなる群より選択される請求の範囲 8に記載の製造法。
10) 前記発酵を、 温度 2 5〜 5 0 °Cで 6〜 6 0時間行なう請求の範囲 8に記載の製造法。
1 1 ) 前記発酵を、 得られる発酵乳中に生産される トリペプチド Val - Pro-Pro及び l i e— Pro— Proの量力 SVal -Pro—Pro換算量で 6 0 μ g / m
1以上となる条件で行なう請求の範囲 8に記載の製造法。
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